Procédé de préparation d'un vaccin staphylococcique
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un vaccin staphylococcique.
Au cours des dernières soixante années, on s'est efforcé à de nombreuses reprises de préparer des produits biologiques capables d'immuniser contre les infections staphylococciques. Ces produits, dont certains se trouvent dans le commerce, ont donné des résultats incertains, nuls ou désappointants. Actuellement, le problème posé par les infections staphylococciques est même plus sérieux que durant les dernières vingt-cinq années. Ceci est particulièrement surprenant, car on a développé des agents immunisants satisfaisants qui protègent contre d'autres infections bactériennes, telles que la fièvre typhoïde, la diphtérie, la coqueluche, le tétanos, la pneumonie, etc.
On a découvert qu'un vaccin staphylococcique remarquable peut être préparé par un procédé caractérisé en ce que l'on extrait les cellules intactes d'une souche UC76, Smith, S193N4, H & D, Castellani,
MCD 138, SK4473, K6, K93, ou K93M de staphylocoque doré avec du phénol pour dénaturer et rendre insolubles les protéines indésirables et on extrait la matière antigène au moyen d'un liquide aqueux en opérant de façon à obtenir une solution aqueuse de cette matière pratiquement exempte de substances insolubles et renfermant au plus une faible proportion de phénol.
Les deux traitements peuvent être effectués simultanément ou, de préférence, le traitement au phénol est effectué avant l'extraction par le solvant aqueux. Parmi les souches particulières de staphylocoque doré utilisables Idans ce procédé, les souches K93M, MCD138, S193N4 et UC76 sont préférées. Toutes les souches de staphylocoque doré mentionnées ont été déposées dans la collection de cultures de Parke, Davis & Company à Détroit (Michigan, U. S. A.) et dans la collection de cultures du Laboratoire des fermentations, Northern Utilization Research and Development Division, U. S.
Department of Agriculture, Peoria (lilinois, U. S. A.) sous les nombres indiqués dans la table suivante.
No dans la collection No dans la collection
Souches Parke, Davis & Co. du Northern Utilization
Research Laboratory
UC76 05068 NRRL B-2467
Smith 05067 NRRL B-2468
S193N4 05089 NRRL B-2469
H & D 05087 NRRL B-2471
Castellani 05088 NRRL B-2472 MCD138 05085 NRRL B-2473
SK4473 05086 NRRL B-2474
K6 05090 NRRL B-2475
K93 05091 NRRL B-2476
K93M 05092 NRRL B-2477
Les cellules intactes des souches particulières mentionnées ci-dessus de staphylocoque doré, utilisées comme matière de départ, peuvent être vivantes (capables de se reproduire), tuées (incapables de se reproduire) ou être un mélange des deux, c'est à-dire être partiellement tuées . La méthode précise employée pour obtenir les staphylocoques tués ou partiellement tués n'a pas une importance déterminante.
Parmi les méthodes d'inactivation utilisables pour l'obtention d'une matière de départ tuée ou partiellement tuée , on peut mention ner la chaleur (environ 600 C pendant 1 h à 1 1/2 h), la ss-propiolactone (0,1 à O,20/o à 370 C pendant 2 h) et le phénol (10/o à 25oC pendant environ 18 h).
Le solvant aqueux employé pour l'extraction est de préférence de l'eau, bien que des solutions aqueuses de sels physiologiquement acceptables, tels que le sérum physiologique, la solution saline équilibrée de Hank, etc., conviennent également. La quantité de solvant aqueux n'est pas critique, mais il est préférable qu'elle ne dépasse pas celle qui est nécessaire à une extraction efficace de l'antigène désiré.
Si l'on emploie une quantité excessive de solvant aqueux, l'activité par millilitre du vaccin final est trop faible et nécessite l'administration d'un volume exagéré de vaccin. De même, la quantité de phénol employé pour le traitement n'est pas critique. Lorsque les deux traitements ont lieu simultanément, la quantité de phénol doit être suffisante pour donner naissance à une phase phénolique, mais insuffisante pour dissoudre la totalité du solvant aqueux présent. Lorsque le traitement phénolique est effectué préalablement à l'extraction par le solvant aqueux, la phase phénolique doit contenir suffisamment d'eau pour liquéfier le phénol, mais pas assez pour provoquer la séparation d'une phase aqueuse, c'est-à-dire qu'elle doit contenir entre environ 5 et 30 o/o d'eau.
Comme les cellules intactes des staphylocoques de départ sont humides et contiennent de l'eau, il n'est en général pas nécessaire d'ajouter beaucoup d'eau au phénol pour le liquéfier. Le mode opératoire préféré et normal est d'employer du phénol contenant finalement au plus 15 oxo d'eau environ. L'examen de la phase phénolique révèle qu'elle ne contient qu'une très faible proportion de protéines et pratiquement pas de matière antigène. Le phénol agit mécaniquement en rompant la paroi cellulaire et en libérant l'antigène en vue de son extraction par le solvant aqueux, et dénature simultanément la majeure partie des protéines de manière à les rendre insolubles, tant dans le phénol que dans le solvant aqueux.
I1 convient que le vaccin aqueux final ne contienne pas plus d'environ 0,2 O/o de phénol. Un excès de phénol susceptible d'être entraîné dans le produit final peut etre éliminé par dialyse ou par extraction par un solvant organique volatil et non miscible à l'eau, tel que l'éther ou le chloroforme, suivie de l'élimination sous vide du solvant organique restant éventuellement dissous dans la solution aqueuse.
Lorsque les deux traitements du procédé sont effectuées non simultanément, le phénol peut également être éliminé en cours de traitement en procédant comme suit: les cellules de staphylocoque sont traitées au phénol et le phénol est séparé des solides insolubles par centrifugation, filtration, décantation, etc. Les solides insolubles sont ensuite lavés avec un solvant organique volatil du phénol, par exemple l'éther, le chloroforme, l'éthanol absolu, l'acétone, etc., et le solvant organique volatil, subsistant éventuellement dans les solides insolubles dans le phénol après le lavage, est évaporé préalablement à l'extraction des solides insolubles par le solvant aqueux.
Si nécessaire, le pH du vaccin final est réglé a une valeur de 6 à 8, -de préférence à environ 7,2.
Si le vaccin n'est pas isotonique, il est de préférence rendu isotonique par addition de chlorure de sodium.
Le vaccin final peut être stérilisé par diverses méthodes. Par exemple, il peut être stérilisé par la chaleur, par irradiation ultraviolette ou par addition d'agents chimiques de conservation. Il est préférable d'ajouter un agent de conservation dans le vaccin terminé.
Parmi les agents de conservation utilisables, on peut citer le thimerosal (1:10.000), le chlorure de benzé thorium (1 : 20.000) ou le phénol (0,2 e/o).
Le vaccin staphylococcique aqueux obtenu par le procédé selon l'invention est exempt de solides non dissous ainsi que de composants du milieu de culture utilisé pour la production des staphylocoques. I1 est non viable et contient très peu d'azote en comparaison avec les cellules de départ. Par administration par voie parentérale, il produit régulièrement un fort degré d'immunité, non seulement contre l'infection par la souche de Staphylococcus aureus utilisée pour sa préparation, mais également contre l'infection par d'autres souches de Staphylococcus aureus. Le vaccin est exceptionnel en ce que la quantité d'anticorps protecteurs dont il provoque la formation peut être mesurée dans des animaux d'expérience, et l'efficacité de sa protection contre des doses d'épreuves massives de diverses souches de staphylocoque doré est clairement démontrée.
Le vaccin ne produit aucune réaction locale ou générale indésirable après l'administration.
Exemple 1
On a ensemencé 250 ml d'un bouillon de culture stérile ayant la composition suivante:
Peptone tirée de la caséine par digestion pancréatique ( Trypticase ) 17,0 g
Produit de digestion papaique de farine
de tourteau de soja ( Phytone ) 3,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Phosphate dipotassique 2,5 g
Dextrose 2,5 g
Eau 1000,0 g dans un ballon de 500 ml, avec une quantité transportée par une boucle de platine d'une culture mère de la souche UC76 de staphylocoque doré et la culture a été incubée à 370 C en conditions d'asepsie pendant 6 h.
On a ajouté une prise de 30 mi de cette culture de 6 h de staphylocoque doré UC76 à chacun de trois ballons de 6 litres contenant 3 litres du milieu de culture stérile décrit ci-dessus, et les cultures ensemencées ont été incubées à 37O C en conditions d'asepsie pendant 24 h. On a ajouté 30 mi de phénol aqueux à 30 o/o à chacune des cultures pour réduire la viabilité des staphylocoques et les cultures ont été laissées au repos à température ordinaire pendant 16 à 18 h. On a réuni les cultures, on a prélevé un échantillon de 10 ml et on a constaté qu'il contenait encore des staphylocoques vivants.
La culture réunie a été refroidie à +4 à + 100 C et centrifugée dans une centrifugeuse Sharples au débit de 225 ml/min et à 25.000 t/min. Les cellules entassées et humides ont été retirées de la centrifugeuse et pesées. Le poids trouvé est de 8,2 g, correspondant approximativement à 3,43 X 101" organismes. On a prélevé un petit échantillon (0,2753 g) des cellules humides et on l'a séché pendant la nuit dans une étuve à 1050 C pour doser l'eau présente dans la masse cellulaire humide. Le poids des cellules sèches s'est élevé à 27,8 O/o du poids des cellules humides.
Les 8,2 g de cellules humides de la souche UC76 de staphylocoque doré ont été placés dans un mélangeur Waring et 50 g de phénol cristallin ont été ajoutés avec 10 mi d'eau. Le phénol s'est liquéfié. Le mélange a été brassé à température ordinaire pendant 10 minutes. La température finale du mélange boueux gris a été de 410 C. Le mélange ne s'est pas séparé au repos. Il a été refroidi (volume 50 mi) à +10oC et centrifugé pendant 60 minutes à 4000 t/ min. Le mélange centrifugé était composé de deux couches, une couche supérieure de coloration ambrée foncée, et un précipité gris, fortement aggloméré. Le liquide supérieur (51 mi) a été séparé et jeté.
On a ajouté 60 ml de phénol à 83 o/o (50 g de phénol et 16 mi d'eau) au précipité gris et on a brassé le mélange pendant une minute dans un mélangeur
Waring, obtenant ainsi une suspension gris clair d'un volume de 61 mi. On a centrifugé la suspension à + 100 C pendant 60 minutes à 4000 t/min et on a séparé le liquide (54 ml) recouvrant le précipité, et on l'a jeté. On a suspendu le précipité dans 25 ml d'eau distillée et on a dialysé la suspension à + 40 C contre de l'eau de conduite courante. Pendant la dialyse, le sac de dialyse a été maintenu en mouvement. On a poursuivi la dialyse contre l'eau de conduite courante pendant environ trois jours.
On a placé le sac de dialyse dans de l'eau distillée au repos à +40C et on a poursuivi la dialyse pendant environ 24 h avec un changement de l'eau distillée.
On a fait passer la suspension du sac de dialyse à un récipient gradué et on a rincé le sac avec un ml d'eau distillée. On a ajouté l'eau de rinçage à la suspension ; volume total 31 ml ; pH 5,9. On a transféré la suspension dans un flacon de 50 ml et on a lavé le récipient gradué avec un ml d'eau distillée.
On a ajouté l'eau de lavage à la suspension et on a congelé le mélange. On a dégelé le mélange (volume 28 ml), on a ajusté le pH à une valeur de 6,0 à 7,5 par addition de trois gouttes d'hydroxyde de sodium 1N et trois gouttes d'hydroxyde de sodium 0,1N. On a secoué énergiquement le mélange à la main, on l'a centrifugé pendant 2 h à une tempéra turne de + 4 à +10 C à 7. 710 X G et pendant encore 1 1/2 h à 12.100 X G. Un très léger trouble a subsisté dans le liquide surnageant. Ce liquide aqueux, consistant en le vaccin désiré, a été séparé du précipité; volume 21 mi; pu 7,7.
Un dosage de l'activité immunisante de ce vaccin contre la souche UC76 de staphylocoque doré chez des souris Carworth Farms No 1 a montré que le produit avait une activité de 15.500 PD50 par ml contre une infection de 10.000 LD50. Ce dosage a été effectué comme décrit ci-dessous.
Pour l'inoculation, on a divisé 105 souris albinos Carworth Farms N" 1 (18 à 22 g) en sept groupes de 15 souris chacun. Aux souris de chaque groupe on a inoculé par voie sous-cutanée 0,2 ml de dilutions variables physiologiquement salines et stériles, du vaccin. Les dilutions de vaccin utilisées pour chaque groupe ont été les suivantes.
Groupe 1 - 0,2 ml d'une dilution 1 à 100
Groupe 2 - 0,2 ml d'une dilution 1 à 300
Groupe 3 - 0,2 mi d'une dilution 1 à 1000
Groupe 4 - 0,2 mi d'une dilution 1 à 3000
Groupe 5 - 0,2 ml d'une dilution 1 à 10.000
Groupe 6 - 2 mi d'une dilution 1 à 30.000
Groupe 7 - 0,2 ml d'une dilution 1 à 100.000
Sept jours plus tard, on a infecté les souris de chaque groupe, ainsi que trente souris d'un groupe témoin, par injection intrapéritonéale de 10.000 LD50 de la souche UC76 de staphylocoque doré (0,5 ml d'une dilution de 1 à 100.000 d'une culture de 6 h de staphylocoque doré UC76 dans le bouillon décrit ci-dessus). On a observé les souris pendant cinq jours et on a noté les morts.
On a calculé le pourcentage de survivants dans chaque groupe, et à partir de ces taux de survivance, on a calculé la dilution protectrice pour 50 o/o des souris (PD50) par la méthode de Miller et Tainter, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 57 pp. 264 et suiv. (1944).
Les taux de survivance dans cette épreuve sont indiqués dans la table suivante:
Groupe Dilution de 0,2 ml Morts aux jours indiqués Pourcentage
de vaccin utilisé après l'infection de survivants O i 2 3 4
Témoin non traité 0 30 0 0 0 0
1 1- 100 0 0 0 0 0 100
2 1- 300 0 0 0 0 0 100
3 1- 1.000 0 0 1 0 0 93,3
4 1- 3.000 0 4 3 0 0 53,3
5 1- 10.000 0 15 0 0 0 0
6 1- 30.000 0 15 0 0 0 0
7 1-100.000 0 15 0 0 0 0
Il ressort de la table ci-dessus que toutes les souris témoins sont mortes en 24 h environ, et qu'un peu plus de 50 O/o des souris ont été protégées. par 0,2 ml du vaccin dilué à 1 pour 3.000. La valeur
PD50 réelle du vaccin a été calculée à partir de ces chiffres, et on a obtenu 3.100 pour 0,2 mi, soit 15.500 par ml.
L'opération de dialyse de l'exemple ci-dessus peut être supprimée, à condition de laver à l'éther le précipité insoluble dans le phénol et de laisser l'éther éventuellement présent dans le solide s'évaporer avant d'effectuer l'extraction à l'eau.
Exemple 2
On a ensemencé chacune de 10 éprouvettes contenant 10 ml d'un bouillon de culture stérile ayant la même composition que celui de l'exemple 1, avec une quantité transportée par une bouole de platine d'une culture mère de la souche UC76 de staphylo coque doré et on a incubé à 370 C dans. des condi- tions d'asepsie pendant 6 h.
On a utilisé des prises de 2 mi de ces cultures vivantes pour ensemencer chacun de 43 flaçons de Roux contenant chacun 200 ml d'un milieu de culture solide, stérile, ayant la composition suivante:
Peptone tirée de la caséine par digestion
pancréatique ( Trypticase ). 15,0 g
Produit de digestion papaïque de la farine
de tourteau de soja ( Phytone ) 5,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Agar-agar 15,0 g
Eau distillée 1000,0 g
Les cultures ensemencées ont été incubées à 370 C dans des conditions d'asepsie pendant 18 h.
On a enlevé les staphylocoques dorés UC76 vivants de la surface des 43 cultures en lavant avec la quantité minimum de solution saline physiologique stérile et on a centrifugé la suspension résultante pendant 1 h à 4000t/min. On a jeté le liquide surnageant et on a suspendu les cellules entassées (40,1 g (poids humide) (environ 1,8 X 1010 organismes)) dans 219 mi d'eau distillée; volume de la suspension 245 ml. On a prélevé un échantillon de 9 ml et on a divisé les 236 ml restants de la suspension en deux parties égales.
On a mélangé chaque portion de 118 ml de la suspension aqueuse de cellules vivantes de staphylocoque doré UC76 avec 256,3 g de phénol et 156 ml d'eau, dans un mélangeur Waring pendant 8 minutes. La température est montée de 150 C à 360 C. On a réuni les mélanges ainsi obtenus et on a refroidi à 100 C; volume 800ml. ll s'est formé deux couches. On a centrifugé le mélange à + 100 C pendant 60 minutes à 4000 t/min, ce qui a provoqué la séparation de quatre phases: une phase aqueuse au sommet, une phase de précipité d'interface en dessous de la phase aqueuse, une phase phénolique en dessous de la phase de précipité d'interface et une phase de précipité en dessous de la phase phénolique.
On a chassé la phase aqueuse par siphonnage et on l'a conservée à +40 C. On a chassé la phase phénolique par siphonnage et on l'a jetée. On a réuni la phase de précipité d'interface avec la phase de précipité et on a dilué avec les 10 ml d'eau distillée utilisés précédemment pour rincer les récipients lors du transfert. On a mélangé les précipités et l'eau de lavage réunis avec la phase aqueuse et on a centrifugé la suspension résultante à 4000 t/min pendant 2 h. On a séparé la phase aqueuse (volume 400 mi) et on l'a dialysée contre de l'eau de conduite courante à + 40 C. Pendant la dialyse, on a maintenu le sac de dialyse en mouvement. On a continué la dialyse contre l'eau de conduite courante pendant environ deux jours.
On a ensuite transféré le sac de dialyse dans de l'eau distillée au repos à + 40 C et on a continué la dialyse pendant environ deux jours avec un changement de l'eau distillée. La matière dialysée, qui avait un volume de 450 ml, était limpide et incolore. On a ajouté 3,825 g de chlorure de sodium au vaccin aqueux pour le rendre physiologique et on a réglé le pH à 6,9-7,2 par addition de 0,15 ml de solution d'hydroxyde de sodium 0,îN.
On a transféré le vaccin dans un flacon stérile de 500 ml, on a ajouté du thimerosal en concentration de 1 pour 10.000 et on a laissé reposer le vaccin jusqu'au lendemain à température ordinaire. On a prélevé un échantillon de 30 mi pour contrôler la stérilité et pour doser l'activité immunisante par la méthode décrite dans l'exemple 1. On a conservé le restant du vaccin à + 40 C et, après des contrôles finals de stérilité, de sécurité et d'activité, on en a rempli des flacons à capuchon de caoutchouc d'une contenance de 10,5 ml. Les épreuves de stérilité dans un milieu d'acide thioglycolique liquide ont indiqué que le vaccin était stérile.
Le dosage de l'activité immunisante par la méthode décrite dans l'exemple 1 a montré que le vaccin avait une activité de 975
PD50 par ml contre une infection de 10.000 LD50 avec la souche UC76 de staphylocoque doré.
Si désiré, l'opération de dialyse du mode opératoire ci-dessus peut être supprimée en extrayant la phase aqueuse (vol. 400 ml) avec plusieurs portions d'éther, puis en débarrassant la solution aqueuse de l'éther dissous par évaporation sous vide.
Des vaccins. semblables à ceux décrits dans les exemples 1 et 2 peuvent être préparés en remplaçant la souche UC76 de staphylocoque doré, utilisée pour inoculer les milieux nutritifs des exemples précédents, par n'importe laquelle des souches suivantes de staphylocoque doré: Smith, S193N4, H & D,
Castellani, MCD 138, SK4473, K6, K93, et K93M.