Verfahren zur Reinigung von Duodenal-Meparinoiden
Das durch das Verfahren nach der USA-Patentschrift Nr. 3 000 787 erhaltene Duodenal-Heparinoid ist eine biologisch aktive Standart-Zubereitung, die aus dem Duodenum verschiedener Tiere (Rind, Schwein usw.) gewonnen und hauptsächlich aus sulfonierten Polysacchariden zusammengesetzt ist.
Als Ergebnis ist nun die Möglichkeit entdeckt worden, die verschiedenen Fraktionen des Heparinoids mit Hilfe verschiedener Reinigungsverfahren zu erhalten.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Auftrennung von Duodenal-Heparinoiden in biologisch aktive und inaktive Fraktionen ist gekennzeichnet durch die Verwendung von Salzen von quaternären Ammoniumbasen bzw. Zinksalzen oder Bariumsalzen als Fällungsmittel für die biologisch aktiven Fraktionen.
Besondere Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens sind in den nachfolgenden Beispielen ausführlich beschrieben.
Beispiel I a) Reinigung des Standardpräparates durch Behand lung mit Phenol
250 g Standard- Ateroid (eingetr. Warenzeichen) (standarisiert auf 0,82/mgA.L.U., l/mgA. C. U., 55. 8/mg L.S.U., 10 mg/mg A.U.) werden in 90 0/obigem Phenol suspendiert, um eine Lösung von 5 Gew.- /o/Vol. zu erhalten. Die Suspension wird mit Unterbrechungen 48 Stunden lang geschüttelt und dann zentrifugiert. Die in Phenol (welches inaktiv ist) lösliche Fraktion wird verworfen und die in Phenol unlösliche Fraktion wird 4-5 mal mit Äthylalkohol (200 ml für jede Waschung) gewaschen, worauf 2 Waschungen mit Äthyläther (200 ml für jede Waschung) folgen.
Nach dem Trocknen erhält man ein elfenbeinweisses Pulver (Gewicht 68 g), das in destilliertem Wasser gelöst wird, um eineLösungvon 10 Gew.- 0/olVol. zu erhalten. Mit Hilfe von Zellophan -beu- teln wird die wässrige Lösung 48 Stunden lang in fliessendem, entionisiertem Wasser dialysiert, wonach das Dyalisat filtriert wird. Der unlösliche Rückstand wird verworfen, die klare Lösung mit 3 Vol-Teilen Aceton oder Äthanol behandelt und der Inhalt mit Essigsäure auf ein PH von 5 eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren aus Aceton oder Alkohol abgetrennt, dreimal mit Äthanol (100 ml für jede Waschung) und zweimal mit äthyläther gewaschen und dann unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Das erhaltene Material (25.5 g) hat das Aussehen eines weissen Pulvers. Die Ausbeute beträgt 10 o/o des Ausgangsproduktes, und der Titer der biologischen Aktivität lautet wie folgt:
AL U. (antilipaemische Einheit) 3,45/mg
AC U. (anticholesterinaemische Einheit) 3,22/mg
LS U. (lipasemische Einheit) 450 /mg
A. U. (Uronsäure) 112 /mg
Daraus kann man ersehen, dass die lipasemische Aktivität und der Uronsäuregehalt völlig wiedererlangt sind. b) Reinigung durch Verwendung von quaternären
Ammoniumbasen ba) Cetavlon -Harze. (eingetr. Warenzeichen)
5 g des nach Beispiel 1 erhaltenen Produktes werden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst.
Jeglicher unlösliche Rückstand, der möglicherweise vorhanden ist, wird durch Zentrifugieren entfernt, dann wird eine Lösung von 2.5 0/cigem Cethyl-Trimethylammoniumbromid (mit einem PH von ungefähr 5.5) der klaren Lösung zugefügt, bis die Fällung beendet ist. Die so erhaltene reichlich flockige Ausfällung wird von einer gelben Flüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen und dann in einer 10 0/obigen alkoholischen Lösung dispergiert. Die Dispersion wird 3-4 Tage lang mit einem sulfonierten Harz in Berührung gebracht, mit Unterbrechungen geschüttelt (bis zur Klar heit) und dann durch Filtrieren vom Harz getrennt.
Schliesslich wird das Duodenal-Heparinoid mit 5 Vol. Teilen Aceton ausgefällt oder lyophylisiert. Die Ausbeute beträgt 15.5 O/o; der Gehalt an Uronsäure beträgt 230 Teile/Tausend. Die ultravioletten und infraroten Spektralangaben sind miteingeschlossen. bb) Hyamin -Zink-Salze
100 g Ateroid (Standardpräparat) werden in 2 1 destilliertem Wasser bei 40 C dispergiert; die Dispersion mit 50 0/obiger NaOH-Lösung auf ein PH von 12,5 eingestellt, und anschliessend eine 10 0/obige Hyaminlö sung (Diisobutyl-phenoxy-äthoxyäthyl-dirnethyl-benzyl- ammoniumchlorid) zugefügt, bis die Fällung beendet ist.
Der p-Wert wird dann mit Essigsäure auf 4.5 gesenkt, und durch Filtrieren erhält man einen Nie der schlag, der, zweimal mit Wasser gewaschen, in 11 1.75 mol. NaCl-Lösung bei 400 C suspendiert wird.
250 ml Aceton werden hinzugefügt, der Inhalt wird über Cellit in einem Büchner-Trichter filtriert, und dann werden weitere 1250 ml Aceton zu der klaren Lösung hinzugefügt. Anschliessend wird filtriert, die Acetonlösung entfernt und der Niederschlag mit einer Aceton Wasser-Mischung von 4:1 gewaschen. Nun wird der Niederschlag getrocknet, zuerst mit einer Alkohol Äther-Mischung von 3:1, zum Schluss unter Vakuum bei 500 C. Hierdurch erhält man ungefähr 20 g, die in 500 ml einer 10 0/siegen ZnCl2-Lösung suspendiert und 5 Stunden lang geschüttelt werden. Die Suspension wird zentrifugiert, und der Niederschlag dreimal mit einer 10 0/obigen Zinkchlorid-Lösung (100 ml für jede Waschung) gewaschen; dann werden alle Waschungen vereinigt.
Das Zentrifugat, bestehend aus Nucleinsäuren und Spuren von Heparinoid-Substanzen (HZ/a bezeich nest), zeigt folgende Charakteristiken:
EMI2.1
<tb> <SEP> MboM
<tb> <SEP> 0
<tb> <SEP> N <SEP> S <SEP> P <SEP> (a) <SEP> 20D <SEP> ° <SEP> V <SEP> °
<tb> 13,11 <SEP> Spuren <SEP> 8,72 <SEP> +76 <SEP> 0,23 <SEP> 0,30 <SEP> 17 <SEP> 1,5
<tb>
Nach dem Zentrifugieren werden die vereinten Waschlösungen mit 1.5 Vol.-Teilen Aceton gefällt, die Suspension wird nochmals zentrifugiert, der Feststoff dreimal mit Äthanol gewaschen und mit Athyläther entwässert. Hierdurch werden 2.3 g eines Produktes isoliert, das aus den Zinksalzen der gesamten Polysaccharide besteht.
Dieses Produkt wird in 100 mol Wasser suspendiert, dem 50 ml einer 100/oigen Natriumcarbon- atlösung zugefügt werden. Das Produkt wird wieder zentrifugiert, die überstehende Lösung mit Essigsäure auf einen p-Wert von 6 gebracht und mit 2 Vol.-Teilen Methanol ausgefällt.
Es wird entwässert und mit Alkohol-Äther auf übliche Weise getrocknet, worauf man ein Material erhält (HZ/6 bezeichnet), das aus 1.8 g des Natriumsalzes zweier verschiedener sulfonierter Polysaccharide zusammengesetzt ist und folgende Charakteristiken besitzt:
EMI2.2
<tb> <SEP> b <SEP> W <SEP> tt <SEP> bX
<tb> N0/o <SEP> SO/o <SEP> PO/o <SEP> (a)20D <SEP> °
<tb> 3,36 <SEP> 5,30 <SEP> Spuren <SEP> +20 <SEP> 4,1 <SEP> 3,9 <SEP> 618 <SEP> 208
<tb>
Um die Trennung der beiden Polysaccharide zu erreichen, geht man von dem Zinksalz aus, das in 60 cm3 Wasser dispergiert und auf 80" C erhitzt wird.
20 ml einer 25 0/obigen Essigsäure gibt man zu der wässrigen Dispersion und unmittelbar danach 80 ml einer Lösung von Bariumacetat in 25 0/obiger Essigsäure (die auf 80" C vorerhitzt war). Dann wird schnell auf 10 C abgekühlt, zentrifugiert und der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, die mit dem Symbol (O) bezeichnet ist. Der Niederschlag wird mit einer Lösung von 5 /o Bariumacetat in 25 0/obiger Essigsäure (zwei Waschungen mit je 30 ml) gewaschen, dann wird er in 50 ml Wasser suspendiert und mit 50 ml einer 10 0/obigen Natriumcarbonat-Lösung behandelt.
Nach dem Zentrifugieren wird das gesammelte Bariumcarbonat mit 20 ml einer 5 0/obigen Natriumcarbonat-Lösung gewaschen, die gesammelten alkalischen Waschlösungen (0) werden auf ein PH von 6 mit Essigsäure gebracht und mit zwei Vol.-Teilen Methanol ausgefällt. Dadurch werden 0,6 g eines Produkts erhalten (HZ/Bt bezeichnet), das folgende Charakteristiken besitzt:
EMI2.3
<tb> <SEP> bD <SEP> W <SEP> bD <SEP> bD
<tb> NO/o <SEP> SO/o <SEP> P0/o <SEP> (a)20D <SEP> <
<tb> 2,34 <SEP> 8,18 <SEP> Spuren <SEP> +20 <SEP> 8,2 <SEP> 10 <SEP> 1265 <SEP> 240
<tb>
Die überstehende Flüssigkeit (bezeichnet als: 0) wird mit 200 ml Methanol ausgefällt, der Niederschlag in 50 ml Wasser suspendiert, dem 50 ml einer 10 0/obigen Natriumcarbonat-Lösung zugefügt werden.
Danach verfährt man weiter wie beim Produkt HZ/B. Man erhält 1.150 g eines Produkts (HZ/B2 bezeichnet) mit folgenden Charakteristiken:
EMI2.4
<tb> <SEP> iD <SEP> S <SEP> ç <SEP> M
<tb> NO/o <SEP> SOlo <SEP> P0/o <SEP> (a)20u <SEP> ° <SEP> °, <SEP> z <SEP> ; <SEP> D
<tb> 4,85 <SEP> 3,08 <SEP> Spuren <SEP> +22,5 <SEP> 1,98 <SEP> 2 <SEP> 154 <SEP> 202
<tb>
Beispiel 2
Reinigung durch Verwendung von Zinksalzen
Fraktion A:
1000 g eines Standard-Duodenal Heparinoids werden in 11 1 einer 10 0/obigen Zinkchlorid-Lösung gelöst und 7 Stunden lang geschüttelt. Dann wird zentrifugiert, der ungelöste Niederschlag wird entfernt, und 7500 ml Aceton werden unter Schütteln in die klare Lösung gegossen. Der Niederschlag wird gesammelt und mit Aceton und Äther entwässert.
Nach dem Trocknen in einem Ofen unter Vakuum erhält man 190 g der Fraktion A.
Fraktion B:
190 g Fraktion A, suspendiert in 1800 ml Wasser, werden unter Schütteln auf 80" C erhitzt. 600 ml Essigsäure werden dann hinzugefügt und unmittelbar danach noch 2400 ml einer Lösung von 10 o/o Bariumacetat in 25 0/obiger Essigsäure (vorerhitzt auf 80 ). Dann wird schnell auf 10 C abgekühlt und zentrifugiert. Der feste Rückstand wird gesammelt und zweimal gewaschen, indem man ihn in einer Lösung von 5 O/o Bariumacetat in 25 0/obiger Essigsäure dispergiert (jedesmal 250 ml). Nach jedem Waschen wird der Rückstand zentrifugiert, und schliesslich wird der erhaltene feuchte Niederschlag in 11 Wasser suspendiert.
Während des Schüttelns werden 1000 ml einer 10 0/obigen Natriumcarbonat-Lösung in die Suspension gegossen. Der End-pB-Wert der Lösung muss zum Schluss basisch sein. Die Suspension wird dann zentrifugiert, bis die überstehende Flüssigkeit vollkommen klar ist. Der erhaltene Niederschlag (Bariumcarbonat) wird zweimal durch Dispergieren mit Hilfe einer 5 0/obigen Natriumcarbonat-Lösung gewaschen (jedesmal 250 ml). Nach jedem Waschen wird zentrifugiert. Schliesslich wird der Niederschlag verworfen. Die erhaltenen basischen, klaren Waschwasser werden vereint und mit Essigsäure auf ein PH von 6 gebracht, dann wird gefällt, wobei 2 Vol.-Teile Methanol verwendet werden.
Der Niederschlag wird mehrere Male mit Methanol gewaschen, um alles Natriumacetat abzuscheiden; dann wird mit Äther entwässert und in einem Ofen unter Vakuum bei 50 C getrocknet. 20.875 g der Fraktion B werden erhalten. Fraktion B ist ein beträchtlich unreines Produkt, das Phosphor-Verbindungen und Spuren von Proteinen enthält. Von dieser Fraktion aus wird die Fraktionierung des Polysaccharids begonnen.
Fraktion C1:
30 g Fraktion B werden in 6 1 einer 10 0/oigen Zinkchlorid-Lösung suspendiert und 5 Stunden lang geschüttelt. Dann wird zentrifugiert und der Rückstand zweimal gewaschen, indem man ihn jedesmal in 100 ml einer 50/oigen Zinkchlorid-Lösung dispergiert. Nach jedem Waschen wird zentrifugiert, und dann werden die klaren Lösungen vereinigt. Der feste Rückstand (hauptsächlich aus einer Phosphor-Verbindung mit Eigenschaften ähnlich denen der Nucleinsäuren zusammengesetzt) wird entfernt (11.6 g). Die erhaltene Flüssigkeit wird gemessen, und dann wird ihr unter Schütteln langsam Methanol zugefügt (9 Vol.-Teile Methanol auf 11 Vol.-Teile Lösung).
Nun lässt man 1 Stunde stehen, entfernt den Niederschlag durch Zentrifugieren, entwässert und trocknet ihn wie üblich. 6.1 g der Fraktion Ct werden erhalten.
Fraktion C2 :
Aceton wird den Methanol-Flüssigkeiten zugesetzt (von denen die Fraktion Ct durch Zentrifugieren abgetrennt worden ist), bis alle festen Bestandteile gefällt sind. Gewöhnlich ist die zugeführte Menge an Aceton der vorher benutzten Menge Methylalkohol äquivalent.
Der durch Zentrifugieren gewonnene feste Teil wird entwässert und wie üblich getrocknet. 12.log der Fraktion C2 werden erhalten.
Fraktion D1 :
5.750 g der Fraktion Cl, gelöst in 150 ml Wasser (das auf 80" C erhitzt worden ist), werden mit 50 ml Essigsäure und unmittelbar danach mit 200 ml einer Lösung von 10 O/o Bariumacetat in 25 0/obiger Essigsäure (ebenfalls auf 800 C vorerhitzt) behandelt. Dann wird schnell auf 100 C gekühlt und das Verfahren wie für Fraktion B weitergeführt, wobei die Waschungen mit entsprechenden Mengen einer Lösung von 5 o/o Bariumacetat in 250/oiger Essigsäure durchgeführt werden.
Der feuchte Niederschlag wird in 70 ml Wasser suspendiert und mit 70 ml einer 10 0/obigen Natriumcarbonat Lösung behandelt. Der entstandene Niederschlag aus Bariumcarbonat wird gewaschen und die gesammelte Waschflüssigkeit mit 2 Vol.-Teilen Methanol behandelt, wonach der erhaltene Niederschlag entwässert und getrocknet wird. Auf diese Weise werden 3.880 g der Fraktion Dj isoliert.
Fraktion D2 :
10.640 g der Fraktion C werden in 220 cm3 Wasser (das auf 800 C erhitzt worden ist) suspendiert; sie werden anschliessend mit 73 ml Essigsäure und dann mit 290 ml einer Lösung von 10 ovo Bariumacetat in 25 Obiger Essigsäure behandelt. Das Verfahren wird wie für Fraktion Dt weitergeführt: 7.700 g der Fraktion D2 werden gesammelt.
Fraktion E1:
3.880 g der Fraktion Dt werden in 680 cm3 einer 10 0/obigen Zinkchlorid-Lösung suspendiert. Dann wird annähernd eine halbe Stunde geschüttelt, worauf man eine völlig klare Lösung erhält. Ein gleiches Volumen Methanol wird hinzugefügt, der Niederschlag zentrifugiert und das Verfahren wie üblich weitergeführt, wobei man 3.800 g der Fraktion E1 erhält.
Fraktion E2 :
7.700 g der Fraktion D2 werden in 1400 ml einer 10 0/oigen Zinkchlorid-Lösung suspendiert und eine halbe Stunde lang geschüttelt. 2.800 ml Methanol werden der klaren Lösung zugefügt. Der Niederschlag wird wie oben gesammelt, wobei man 6.650 g der Fraktion E2 erhält.
Fraktion F1:
3.800 g der Fraktion E1 werden in 90 ml Wasser suspendiert, das auf 800 C erhitzt worden ist. 30 ml Essigsäure werden zugefügt und dann 120 ml einer Lösung von 10 o/o Bariumacetat in 25 0/obiger Essigsäure (vorerhitzt auf 80" C). Dann wird schnell gekühlt und das Verfahren wie für Fraktion B weitergeführt. Der feuchte Niederschlag, suspendiert in 70 ml Wasser, wird mit 70 ml einer 10 0/obigen Natriumcarbonat-Lösung behandelt. Der Bariumcarbonat-Niederschlag wird gewaschen, die gesammelten Waschwässer werden mit 2 Vol.-Teilen Methanol gefällt und der erhaltene feste Bestandteil gesammelt, entwässert und getrocknet. 2.900 g der Fraktion F1 (fit) werden erhalten.
Die analytischen Daten sind folgende:
EMI3.1
<tb> <SEP> M <SEP> 6 <SEP> M <SEP> M
<tb> NO/o <SEP> So <SEP> P'/o <SEP> (a) <SEP> zu
<tb> 2,68 <SEP> 4,9 <SEP> Spuren <SEP> 650/o <SEP> 1,5 <SEP> 1,2 <SEP> 200 <SEP> 94
<tb>
Fraktion F2 :
6.650 g der Fraktion E2 werden in 150 ml Wasser suspendiert, das auf 800 C erhitzt worden ist. 50ml Essigsäure werden hinzugefügt und dann 170 ml einer Lösung von 10 O/o Bariumacetat in 25 0/obiger Essigsäure.
Das Verfahren wird wie für Fraktion F1 weitergeführt und 5.075 g der Fraktion F2 (FF2) werden gesammelt.
Man erhält folgende analytische Daten:
EMI3.2
<tb> <SEP> MM <SEP> M <SEP> 6
<tb> <SEP> Wo <SEP> g
<tb> NO/o <SEP> S <SEP> O/o <SEP> P <SEP> 01o <SEP> ((W)20D
<tb> <SEP> 0 < <SEP>
<tb> 2,29 <SEP> 8,48 <SEP> Spuren <SEP> +40 <SEP> 2,35 <SEP> 2,75 <SEP> 822 <SEP> 260
<tb>
Fraktion F3 :
1 Vol.-Teil Methanol wird zu den vereinten essigsauren Mutterlaugen der Fraktionen Dt und D2 hinzugefügt; durch Zentrifugieren sammelt man dann einen Niederschlag, der in 100 ml Wasser suspendiert wird.
70 ml einer 10 0/eigen Natriumcarbonat-Lösung werden der Suspension zugefügt (wobei das Pu deutlich basisch wird). Dann zentrifugiert man, wäscht den Niederschlag und entfernt ihn. Die vereinten Waschwässer werden mit Essigsäure auf ein p, von 6 gebracht; dann werden sie mit 2 Vol.-Teilen Methanol behandelt, wobei man einen Niederschlag erhält, der aus 2.240 g der Fraktion F5 (FFa) besteht. Die essigsauren Mutterlaugen, aus denen die Bariumsalze beider Fraktionen FJ und F2 erhalten worden sind, bilden keinerlei Niederschlag.
Die analytischen Daten der Fraktion F3 sind folgende:
EMI4.1
<tb> <SEP> M <SEP> bO <SEP> M <SEP> ba
<tb> N <SEP> 0/o <SEP> S <SEP> O/o <SEP> P <SEP> OIO <SEP> (a) <SEP> 2QD <SEP> °
<tb> 3,16 <SEP> 4,78 <SEP> Spuren <SEP> +100 <SEP> 3,3 <SEP> 3,3 <SEP> 346W <SEP> 180
<tb>