Procédé de production de substances mitotiques
La présente invention a pour objet un procédé de production de substances mitotiques à partir d'algues d'eau douce.
On a constaté depuis de nombreuses années que certaines algues et les produits qu'elles secrètent sont susceptibles d'exercer une action sur des cellules végétales ou autres, et notamment sur d'autres algues ou sur des bactéries, ou encore sur les champignons inférieurs.
Les algues et les substances élaborées par les algues peuvent tre soit indifférentes, soit toxiques, soit au contraire favorables à la multiplication cellulaire.
Dans certains cas, cette action est inhibitrice, c'està-dire que l'action est antibiotique ou abiotique. Des études de cette nature ont été poursuivies par de nombreux auteurs, et notamment par Monsieur Lefevre et
Mademoiselle Jakob (Annales de la station centrale d'hydrobiologie appliquée, tome IV, 1952 - Thèse de
Mademoiselle Jakob présentée à la Faculté des Sciences de l'Université de Paris, 1961).
Dans d'autres cas, l'action est au contraire mitotique, c'est-à-dire favorable à la multiplication cellulaire. Les recherches sur ces dernières propriétés n'avaient pas encore permis de déterminer quels sont les meilleurs produits de départ, les milieux de culture les mieux appropriés et les conditions opératoires les plus avantageuses.
La présente invention résulte des recherches entreprises pour déterminer ces facteurs physico-chimiques susceptibles de donner des cultures abondantes fournissant des filtrats actifs dans le minimum de temps. I1 ne suffit pas, en effet, d'accroître le rapidité de production des algues par des moyens bien connus en eux-mmes, car les filtrats de telles cultures se sont révélés posséder des activités très irrégulières.
Les algues visées dans la présente invention fournissent des substances actives, mais celles-ci ne sont produites en qualité et en quantité appréciables que si elles sont cultivées sur un milieu spécial et dans des conditions de température et d'éclairement déterminées. Les recherches qui ont abouti à la présente invention ont permis de sélectionner comme produits de départ des algues récoltées dans les collections d'eau douce (source, étangs, etc.) et notamment les algues rencontrées dans les griffons des sources thermales. Dans ces griffons, on constate en effet presque toujours la présence de magmas constitués de plusieurs espèces d'algues plus ou moins enchevtrées.
I1 avait été constaté précédemment que, en isolant tout d'abord les diverses souches en les cultivant sur un milieu bien connu en soi, désigné ci-après comme milieu L + C et en opérant à la température du laboratoire et à da lumière du jour, la croissance des algues est lente: cette lenteur est due surtout à la température inférieure à celle à laquelle les algues sont habituées, et à la trop faible minéralisation du milieu.
Le milieu
L + C répond à la composition suivante:
nitrate de potassium... 100 mg
phosphate bipotassique . . 40 mg
sulfate de magnésium.... 30 mg
nitrate de calcium..... 100 mg
perchlorure de fer Codex. 1 goutte
extrait de Sphégnum . . 20 cm3
extrait de terre de jardin 40 cm3 eau bidistillée . . 1000 cm5
Les nouvelles recherches effectuées pour déterminer les conditions optimales fournissant des filtrats actifs dans le minimum de temps, ont montré que le milieu de culture utilisé devait tre uniquement minéral ce qui donne les meilleurs résultats en particulier avec les algues données ci-après à titre d'exemple:
Cyanophycées, espèces Phormidium, Hormidium,
Oscillatoria, Cylindrospermum, Lyngbya.
Parmi elles, les plus avantageuses actuellement reconnues sont les Cyano phycées, Phormidium uncinatum, ambiguum, Cebennense et Oscillatoria brevis en provenance de sources thermales.
Les souches de ces algues ont été déposées à l'Algothèque du Centre National de la Recherche Scientifique.
Le procédé de culture que comprend la présente invention est caractérisé en ce au'on effectue un isolement de souches d'algues réputées actives sur un milieu L +
C répondant à la composition suivante: nitrate de potassium 100 mg, phosphate bipotassique 40 mg, sulfate de magnésium 30mg, nitrate de calcium 100mg, perchlorure de fer Codex 1 goutte, extrait de Sphagnum 20 cm3, extrait de terre de jardin 40 cm3 et eau bidistillée 1000 ml, on ensemence copieusement, avec ledit isolement, ledit milieu solidifié par addition d'agar-agar, on cultive les algues sur ce milieu pendant plusieurs jours sous un éclairement continu de 12 à 15 heures sur 24, fourni par des lampes à incandescence et à une température d'environ 350 C, jusqu'au développement convenable des algues,
on effectue un prélèvement d'algues sur cette préculture sur milieu solidifié L + C, le prélèvement servant à l'ensemencement d'un nouveau milieu liquide L H exclusivement minéral répondant à la composition suivante: nitrate de calcium I g, chlorure de calcium 35 mg, sulfate de calcium 100 mg, sulfate de magnésium 50 mg, bicarbonate de sodium 100 mg, chlorure de magnésium 50 mg, nitrate de potassium 75 mg, phosphate bipotassique 300 mg, silicate de sodium 100mg, nitrate de sodium 25 mu, phosphate disodique 1 mg, chlorure de potassium 10 mg, eau bidistillée 1000 ml, oligo-éléments de fer: citrate de fer 3,25 mg, sulfate de fer 1,25 mg, perchlorure de fer (solution Codex) 1,25 mg, oligo-éléments divers:
sulfate de cuivre 0,06 mg, molybdate d'ammonium 0,12 mg, sulfate de zinc 0,12 mg, chlorure de cobalt 0,12 mg, nitrate de manganèse 0,12 mg et acide citrique 0,12 mg, on conduit cette sub-culture dans ce milieu liquide LH dans les mmes conditions d'éclairement et de température que précédemment pour permettre le bon développement de la masse algale, on disperse cette masse lorsqu'elle est suffisante, dans le mme milieu liquide pour obtenir une purée qui sert d'inoculum pour la culture définitive, on réalise cette dernière dans des bouteilles contenant le mme milieu LH dans les mmes conditions d'éclairement et de température que précédemment mais avec un apport d'un mélange d'air et de gaz carbonique dans le milieu de culture mme, et, en fin de culture au bout d'une période voisine de 30 jours,
on recueille le jus de culture par filtration stérile du contenu des boîtes de culture.
On a décrit ci-après un exemple de réalisation du procédé de l'invention.
Pour la première culture sur milieu solide, la quantité d'agar-agar ajoutée à ce milieu LH est avantageusement de 8 à 10g par litre de milieu; l'agar-agar bien lavé est solubilisé par ébullition. On répartit ce milieu solide en boîtes de Pétri de 10 cm flambées et on passe à l'autoclave.
L'ensemencement des souches obtenues à la manière usuelle sur milieu (L + + C) doit tre copieux, de l'ordre de 1 cm3, pour accélérer le développement; il est effectué en chambre stérile. Les boîtes sont soumises ensuite à un éclairement de 1500 à 1800 lux fournis par des lampes à incandescence et faisant de 12 à 15 heures d'éclairement sur 24 à une température voisine de 350 C.
Dans ces conditions, le développement des algues sur milieu solide est maximum en 12 à 15 jours.
Dans le procédé décrit, on utilise ces algues pour l'obtention de jus concentrés par cultures accélérées en passant en milieu liquide.
On peut opérer comme suit:
Dans un premier temps, des fioles d'Erlenmeyer de 1500 cm3 bouchées coton cardé sont garnies de 500 cm3 de milieu LH et stérilisées à l'autoclave. On fragmente stérilement le contenu des cultures en boîtes obtenues en milieu solide et on le répartit dans les Erlenmeyer à raison d'environ 1/2 boîte par fiole.
Les fioles sont ensuite soumises aux mmes conditions de température et de lumière que les cultures sur milieu solide.
Lorsque la culture est bien développée, ce qui demande environ 30 jours, on s'assure par examen microscopique qu'elle est exempte de contamination. Dans un deuxième temps, on dissocie la masse algale à l'aide d'un disperseur électrique (en chambre stérile) et on l'additionne de milieu LH jusqu'à obtention d'une purée fluide qui sert au dernier ensemencement qui constitue le troisième temps de la culture en milieu liquide.
Dans des bouteilles de 4 litres dites à pénicilline stériles, qui seront décrites plus loin, on distribue le milieu L H à raison de 1,5 litre par bouteille que l'on inocule chacune avec 50 cc de la purée fluide obtenue au deuxième temps.
Les bouteilles sont rangées dans une pièce privée de lumière du jour, éclairée par lampes à incandescence (1500 à 1800 lux) pendant 15 heures sur 24 et maintenues à une température voisine de 35O C. Une partie de la chaleur nécessaire est fournie par l'éclairage mme.
Pendant les 9 heures d'obscurité, la température baisse donc de quelques degrés dans la pièce, mais ceci présente l'intért de rétablir le rythme nycthéméral rencontré dans la nature.
On constate que le passage au disperseur ne détériore pas les algues qui sont extrmement résistantes: désséchées, pulvérisées grossièrement au mortier et con 'servées ainsi pendant plus d'un an à la température du laboratoire, elles redonnent des cultures florissantes si on les ensemence sur milieu nutritif.
On maintient aussi constant que possible le niveau de liquide dans les bouteilles en évitant les contaminations par rentrée d'air et on opère sous la pression faible, de l'ordre de 150 g environ, d'un mélange d'air additionné de 2 oxo de gaz carbonique, ledit mélange étant filtré et amené à un taux d'humidité correspondant à sa saturation de vapeur pour pallier une trop forte évaporation dans les bouteilles de cultures.
Pour récolter les jus obtenus après décantation en fin de culture, on filtre d'abord grossièrement en chambre stérile sur filtres papier bien lavés et stérilisés, ceci pour éliminer les algues pouvant tre en suspension. On passe ensuite les jus sur filtres bactériologiques et on les recueille en ballons stériles munis d'un dispositif permettant de maintenir la stérilité pendant la concentration.
I1 y a intért à pousser la concentration, réalisée avantageusement sous vide dans un évaporateur, car elle facilite l'analyse chimique des filtrats et l'extraction éventuelle des substances actives.
Dans la mise en oeuvre du procédé ci-dessus, on utilise avantageusement des bouteilles à pénicilline bou chées par des bouchons à deux trous; par l'un des trous passe un tube plongeur coudé, fermé à une extrémité et dont la plus grande longueur repose sur la paroi de la bouteille mise à plat. Le tube plongeur est percé latéralement de quatre trous.
Le deuxième trou du bouchon est traversé par un autre tube non plongeur portant extérieurement un réfrigérant de Vigreux, long de 15 cm environ et terminé par un tube d'échappement calibré très étroit, afin de maintenir autant que possible le niveau du liquide dans les bouteilles tout en évitant les contaminations par rentrée d'air.
Le passage du mélange d'air et de co2 est assuré par le tube plongeur, où arrive un courant d'air comprimé additionné de 2 0/o de CO2 et distribué à raison de 1 litre de mélange par minute et par litre de milieu de culture sous une pression de 150 g.
Le mélange air-CO2 est assuré d'une façon homogène et régulière par exemple par passage dans un débitmètre Houdec.
La flitration du mélange distribué aux cultures est assurée par un filtre à grande capacité et fine porosité.
On prévoit naturellement tous dispositifs accessoires nécessaires pour régulariser le débit du mélange gazeux et le distribuer également dans les boîtes.
Dans les conditions indiquées, la durée de culture permettant d'obtenir des filtrats très actifs est d'environ 30 jours en hiver. Elle peut tre moindre au printemps et en été.
En effet, il a été observé que, toutes conditions de température et de lumière restant constantes, les algues se multiplient au laboratoire environ deux fois moins vite en hiver qu'en été et fournissent de décembre au début de mars des substances moins actives, c'est-à-dire qu'il apparaît comme impossible de forcer la nature au-delà d'une certaine limite, qui assure normalement aux algues un repos hivernal.
Il faut insister sur ce que l'utilisation de la lumière et le brassage du milieu par un mélange d'air et de gaz carbonique ont été utilisés antérieurement pour des cultures accélérées d'algues, mais l'ensemble des conditions formant le procédé selon l'invention doivent absolument tre observées pour obtenir une production importante de jus actifs. En particulier le rapport existant entre l'éclairement et la température constitue un facteur important qui ne peut varier que dans d'étroites limites.
Pour déterminer et vérifier les qualités stimulantes des jus obtenus par le procédé décrit, on a recherché à établir un test approprié. On a envisagé d'utiliser des tests de croissance de tissus végétaux, des tests de croissance de tissus embryonnaires, des tests par dosages néphélométriques de cultures de bactéries. Il a été mis au point un test particulier, savoir le test mitose de Cosmarium Lundellii qui montre beaucoup plus directement que les précédents les qualités mitotiques des jus obtenus. Ce test permet de mettre en évidence les qualités stimulantes des jus de certaines cultures d'algues ainsi que de déterminer le moment où la culture présente son efficacité maximale.
Il repose sur l'observation que, dans un milieu aussi minéralisé que le milieu de culture LH, certaines algues d'eau douce, telles que Desmidiacées, protococcales, etc. sont incapables de vivre, mais que ce milieu leur permet cependant de vivre et de se multiplier s'il est très dilué.
Or, il a été découvert que, si l'on inocule ces algues d'eau douce, dans le milieu LH dilué au 1/2 par de l'eau bidistillée, elles meurent rapidement, et par contre, qu'il suffit d'ajouter à ce milieu quelques gouttes d'un jus actif des algues d'eaux thermales, par exemple de certaines cyanophycées, pour que l'effet lethal soit immédiatement suspendu et que la multiplication devienne possible et mme excellente.
Les recherches montrent que:
10 le temps qui s'écoule entre l'introduction du jus dans les boîtes-test et le moment où l'on observe les premières multiplications est fonction de l'activité du jus,
20 le nombre de multiplications observées dans les bouteilles pour une mme quantité de jus ajouté est également fonction de l'activité de ce jus.
Ces constatations permettent donc:
a) d'apprécier si une algue est capable de produire un jus actif, ce qui permet de sélectionner les souches les plus intéressantes,
b) de déterminer le moment où la culture présente son maximum d'activité,
c) d'essayer les différentes fractions extraites des jus bruts par voie chimique pour déterminer celles qui sont actives.
La méthode d'essai des jus bruts ou concentrés obtenus par le procédé décrit ci-dessus, consiste essentiellement à compléter à un mme volume, par les jus à essayer, un certain nombre de boîtes de Pétri contenant chacune une quantité différente de milieu LH dilué au 1/2, à inoculer toutes les boîtes avec une goutte normale d'une suspension algale test, à exposer à la lumière et à la température convenables, puis à examiner l'effet de l'inoculation pour déterminer l'activité des jus en fonction du temps et de la concentration nécessaires pour produire de nombreuses divisions des cellules de la suspension.
La durée de l'incubation est au plus de 24 heures, le plus souvent comprise entre 15 et 18 heures et pouvant descendre à 6 heures pour certains opérateurs.
La suspension algale test est préparée à partir d'une algue desmidiacée, le Cosmarium Lundellii var. ellipticum, souche Lefevre, isolée au laboratoire de Cryptogamie du Museum en 1928 et conservée à l'algothèque du Centre National de la Recherche Scientifique; cette algue se multiplie sans perte apparente de vitalité sur milieu L + C. I1 est bon de rappeler ici certaines caractéristiques de cette algue qui sont à la base du procédé d'essai décrit ci-dessus: ledit Cosmarium est d'assez grandes dimensions; long de 68 à 73 microns, large de 53 à 55 microns. I1 est donc aisé d'étudier son comportement en culture à faible grossissement, c'est-à-dire avec un objectif permettant l'examen direct dans des boîtes de Pétri sous une épaisseur de 4 à 5 mm de liquide.
Sa multiplication a lieu par division: les deux hémisomates s'écartent mais restent réunis par une sorte de pont très étroit. Une cloison apparaît au milieu de ce pont . A ce moment les deux hémisomates sont individualisés. Chaque moitié du pont s'accroît alors en un bourgeonnement qui reproduit morphologiquement et cytologiquement l'hémisomate auquel il est attaché. En 2 heures et demie, la multiplication est terminée; deux
Cosmarium ont surgi de cette division. Ils restent plusieurs heures en contact par les hémisomates néoformés, puis se séparent.
Le nombre des divisions présentes dans une culture test est donc très facile à déterminer en comptant les cellules en contact et non encore séparées.
On a constaté que le nombre des divisions en un temps donné et dans des conditions déterminées de température et de lumière est en rapport direct avec l'activité du jus de culture soumis à l'essai.
Pour des mesures précises, il y a lieu d'établir les tests sous des conditions constantes de température et de lumière; habituellement 22-240 C et 1200 lux. Dans ces conditions la réponse peut tre obtenue en 24 ou 36 heures, souvent beaucoup moins. Un observateur exercé peut parfois apprécier l'activité d'un jus en 5 à 6 heures.
La sensibilité du test dépend en partie de la façon dont les Cosmariums destinés à l'inoculation ont été cultivés; l'exemple suivant est apparu comme donnant les meilleurs résultats:
Les Cosmariums sont ensemencés en boîtes de Pétri de 10 cm de diamètre, sur milieu L + C gélosé à 8 %o.
Lorsque la culture est en multiplication active, on la recouvre d'environ 15 cm3 de L + C liquide stérile. Les
Cosmariums se détachent de la gélose (on aide ce détachement en agitant un peu la boîte) et se mettent en suspension dans L + C liquide qu'on recueille alors dans un petit Erlenmeyer également stérile.
On dilue cette suspension avec du L + C jusqu'à ce qu'une goutte normale contienne environ 50 Cosmariums.
La suspension est prte à l'ensemencement. Elle est valable environ trois jours si elle est maintenue à la lumière du jour. Après ce temps elle doit tre renouvelée.
En utilisant cette suspension algale, on peut tester l'activité des jus de culture soit bruts, soit concentrés.
Dans l'un et l'autre cas, les jus sont préalablement filtrés sur filtres bactériens. On peut alors opérer de la façon suivante:
a) jus bruts
On prépare 6 séries de 3 boîtes de Pétri de 6 cm de diamètre.
Dans la première série on introduit 9,5 cm3 de LH dilué au t/2 d'eau bidistillée. dans la 2e série. . . . . . . 9 cm3
dans la 3e série...... 8 cm3 dans la 4e série...... 7 cm3
dans la 5e série. . . . . . 6 cm3
dans la 6e série. . 5cm3
On complète à 10 cm3 dans toutes les boîtes avec le jus brut à tester. On agite un peu les boîtes pour opérer le mélange.
On inocule toutes les boîtes avec une goutte normale de la suspension algale test préalablement préparée. On expose en lumière et température convenables.
b) jus concentrés
On prépare 5 séries de trois boîtes mais on les garnit toutes de 10 cm8 de LH dilué au t/2.
Dans la première série on ajoute 1 goutte de jus concentré; dans la seconde, 2 gouttes; dans la 3e, 4 gouttes; dans la 4e, 6 gouttes et dans la dernière, 10 gouttes. On ensemence et on expose comme précédemment.
Dans l'un et l'autre cas, jus bruts ou jus concentrés, on fait un témoin; trois boîtes sont garnies de 10 cm3 de LH t/2 et inoculés d'une goutte de la suspension de
Cosmarium.
L'examen des tests se fait in situ: un objectif X4 avec oculaire X13 ou X15 est très suffisant pour:
- apprécier l'état des cellules,
- observer et, si nécessaire, compter les divisions.
L'examen microscopique des tests peut, normalement, s'interpréter comme suit:
a) en moins de 24 heures, les cellules des témoins en
LH l/2 seul doivent tre mortes et en partie lysées,
b) si le jus est peu actif les cellules des séries t/2 cm8 (jus brut) ou 1 goutte (jus concentré) sont lysées dans les 24 heures, comme celles des témoins.
On cherche alors dans les séries à plus forte concentration celles où les cellules ne sont pas lysées et celles où elles commencent à entrer en division.
S'il faut monter à 3 cm3 ou 6 gouttes pour observer ce résultat, on peut conclure que le jus est très peu actif.
I1 en est de mme si les divisions ne se déclenchent qu'au bout de 36, 48 heures ou mme plus. I1 arrive que, mme à 5 cm3 ou 10 gouttes, les cellules soient lysées.
Le jus est alors considéré comme totalement inactif,
c) lorsqu'un jus est nettement actif, les cellules sont en parfait état à t/2 cm3 ou à 1 goutte au bout de 24 heures et on observe une quantité croissante de divisions au fur et à mesure qu'on monte dans les séries plus concentrées en jus,
d) si le jus est très fortement actif, de très nombreuses cellules sont déjà en division au bout de 24 heures dans les séries 1/2 cm3 ou 1 goutte, mais dans ce cas, il ne faut pas s'attendre à ce que le nombre de multiplications soit proportionnel à la concentration en produit actif.
En effet, il y a un seuil d'action: les Cosmariums ne pouvant fournir, au maximum, qu'une division par 24 heures; s'ils se multiplient tous à la dose de 1/2 cm3 ou de 1 goutte, il leur sera impossible de se multiplier plus souvent mme si on force la dose en produit actif.
En résumé, l'activité d'un jus est mesurée à la fois par la concentration et par le temps nécessaires au déclenchement de nombreuses divisions. Le laps de temps d'incubation de 24 heures est un maximum. La réponse est parfois obtenue en 15 à 18 heures. Un observateur exercé peut souvent en 3 à 6 heures, d'après l'état des cellules inoculées, prévoir si un jus sera actif et son degré d'activité.
Les nombreux essais effectués sur des jus ou des fractions de jus séparées par chromatographie et électrophorèse ont montré la très grande fidélité et la rapidité du test précité.
Les jus de culture bruts selon l'invention se présentent sous forme d'un liquide clair parfois très légèrement ambré. Après concentration, ils deviennent très fortement ambrés, parfois brunâtres.
Après filtration bactériologique, ces jus se conservent plusieurs semaines à la température du laboratoire et plus d'une année en chambre froide à + 5o C sans perdre leurs propriétés biologiques.
Ces propriétés sont atténuées par une ébullition de 60 minutes.
Les jus sont fluorescents en lumière de Wood. Les jus bruts, mme lyophilisés, sont solubles dans l'eau, ils sont incomplètement solubles dans les solvants habituels, tels que l'éther éthylique, benzène, chloroforme, éther de pétrole, acétone etc. Les jus bruts concentrés ne sont pas complètement solubles dans l'alcool absolu.
Les substances actives contenues dans les jus favorisent hautement la multiplication cellulaire, que ces cellules soient des bactéries, des algues ou qu'elles constituent des tissus animaux ou végétaux. C'est ainsi que l'on a constaté ce qui suit, sur des tissus de tubercules de topinambour sur milieu de culture habituel additionné de jus obtenu selon l'invention; des fragments de topinambour persaient 20 mg au départ et au bout de 3 semaines, les témoins ont augmenté normalement de 200mg en poids tandis que les fragments de topinambour traités par les jus de cultures d'algues stérilisés par filtration avaient augmenté en poids de 10 à 25 o/o environ de plus que les témoins, la dose de jus d'algues étant de 20 cm3 par litre.
Les jus ont agi à la fois sur la division et sur le grandissement des cellules. Des constatations analogues ont été faites avec les jus provenant d'algues d'eau douce.
Le procédé décrit de culture des algues permet donc d'obtenir des algues, des jus et des extraits utilisables pour augmenter les rendements des cultures, vivrières ou autres, et permet également d'obtenir des substances hautement mitotiques.
On peut donc à partir des algues extraire des produits intéressant l'industrie chimique, notamment l'in- dustrie agricole.
Mais les propriétés mitotiques dont on vient de signaler l'existance vis-à-vis des cellules végétales, se révèlent également très intéressantes en ce qui concerne d'autres cellules et notamment les cellules animales. Les algues et/ou les substances qu'elles secrètent peuvent constituer le principe actif de composition destinées au traitement des plaies et des ulcères. On connaît déjà l'action des algues dans ce domaine mais la mise en ceuvre des moyens visés dans la présente invention permet d'obtenir des résultats plus importants et plus constants. En particulier les jus de culture obtenus à partir des cyanophycées donnent de très bons résultats. Après filtration, ces jus peuvent tre concentrés, lyophilisés et conservés en ampoules stériles scellées sous vide.
Le test au Cosmarium permet de s'assurer pour une mme algue de départ de la constante du jus et de sa reproductibilité.
Un jus de culture (algues Cyanophycées précitées) d'activité reconnue et définie, concentré après la stérilisation et mis en ampoules, a été essayé quant à son activité vis-à-vis de cultures de fibroplastes embryonnaires de poulet. On a observé que la zone de croissance de ces cultures était deux fois plus grande que celle des cultures témoins, après culture le nombre de mitoses des cultures traitées était environ deux fois plus élevé que celui trouvé chez les témoins. On n'a pu noter aucune différence dans le compte différentiel des phases entre les cultures témoins et les cultures traitées.
On a également remarqué une intense production de macrophages en dehors de la zone de croissance dans les cultures ayant reçu le produit
Il importe de remarquer que les milieux de culture sont stériles, ne contiennent que des sels chimiques à la concentration de 2 g pour 1000 dans l'eau bidistillée.
Dans le cas de milieux solides, il s'y ajoute de 8 à 10 g d'agar-agar. On ajoutera que l'ensemble est stérilisé avant la distribution en chambre stérile et sous U. V., dans des boîtes de Pétri flambées. I1 en résulte que les milieux sur gélose ne peuvent apporter aucun germe pathogène. Il en est de mme pour les jus lyophilisés livrés sous ampoules scellées.
Les essais ont été effectués avec des jus obtenus dans les conditions détaillées plus haut à partir des algues
Cyanophycées, Phormidium uncinatum, ambiguum, cebennense et d'Oscillatoria brevis en provenance de sources thermales.
Les produits du procédé ont été utilisés en employant les cultures brutes des algues Cyanophycées sur gélose, le gel obtenu par dispersion des cultures brutes en boîtes, les extraits concentrés de jus de culture lyophilisés et placés en ampoules sous vide stériles, ou les extraits concentrés des jus de culture lyophilisés et incorporés dans un excipient, en vue d'obtenir une pommade.
Toutes ces compositions constituent diverses formes de présentation des produits du procédé car elles contiennent les substances actives élaborées par les algues au cours de leur culture. Ces compositions peuvent tre obtenues par exemple à partir de jus bruts concentrés ou non, lyophilisés et solubilisés ou non au moment de l'emploi, par incorporation de ces compositions à un véhicule liquide, un gel ou une crème, et à partir des cultures sur milieu solide.
Des applications de cultures d'algues sur milieux solides ont été tentées sur animaux.
Des résultats favorables ont été obtenus sur un bélier dans un abcès de la région thermale avec épaississement considérable du derme, noyau profond et induré paraissant correspondre à l'existence d'abcès secondaires en évolution; sur une chatte ovariectomisée risquant de succomber à une péritonite gangréneuse, et sur une chatte souffrant d'un eczéma infecté des membres postérieurs et de la queue.
On a également procédé à de nombreux essais sur des tres humains et on a obtenu de très bons résultats.
Le produit a été appliqué pour le traitement de différentes plaies (fist