Zusatzpatent zum Hauptpatent Nr. 426 795 Verfahren zur Herstellung von Retroandrostanderivaten Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in 17-Stellung eine Oxogruppe aufweisenden Retro- steroiden der Androstanreihe. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
dass man ein 20- Ketosteroid der Retrop.regnanreihe der aeroben enzy matischen Oxydation mittels Fusarium solani unter wirft.
Als Retrosteroide werden im folgenden solche Ster- oide bezeichnet, bei welchen die am C-Atom 10 befind- liehe Methylgruppe die a-Konfiguration und das am C-Atom 9 befindliche Wasserstoffatom (bzw. ein 9- Substituent) die ss-Konfiguration aufweist.
Steroide der Pregnanreihe mit retro-Konfiguration werden dement sprechend im folgenden als Retropregnane bzw. als 9ss,10a-Pregnane bezeichnet. Derartige Retrosteroide
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sind z. B. aus, der belgischen Patentschrift Nummer 577 615 bekanntgeworden.
Die erfindungsgemässe Einwirkung der Enzyme von Fusarium solani (z. B. des unter der ATCC Nr. 12 823 registrierten Pilzstammes) auf 20=Ketosterolde der Retropregnanreihe bewirkt den Abbau der 17-Seiten- kette. Bei längerer Enzymeinwirkung kann sich aus dem D-Ring des Ausgangssteroids ein ö-Lactomüng bil den.
So kann z. B. aus, dem 44,E-9ss,l0a-Pregnadien- 3,20-dion (I) (4E-Retroprogesteron) durch Inkubation mit Fusanum solani gemäss nachfolgendem Reaktions- schema das d4,6-9ss,l0a-Androstaden-17ss-ol-3-on (II), das 44>6-9ss, l0a-And'ros,tadien-3,17-dion (III) und das 46-9ss,
10a-Testolakton (IV) erhalten werden. überraschenderweise bewirkt die erfindungsgemässe enzymatische Oxydation von in 1,2-Stellung hydrierten Steroiden der Retropregnanreihe selbst bei längerdau- ernder Inkubation keine nennenswerte Dehydrierung in 1,2-Stellung,
wie dhes in der normalen Reihe der Fall ist.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten 20-Ketosteroide der Retropregnanreihe können gesättigt sein oder Dop pelbindungen enthalten, beispielsweise in einer oder mehreren der Stllungen 1,4,5,6,7,8,9(11) und 15, vor zugsweise in 4-Stellung und gegebenenfalls einer wei teren Stellung [wie z.
B. zusätzlich in 1-, 6-, 1,6-, 1,6,9- (11)- oder in 6,9(11)-Stelllung]. Die Ausgangsstoffe können ausser der 20- Oxogruppe noch weitere Substi tuenten im Ringsystem oder in der Seitenkette enthal ten.
Beispiele solcher Substituenten sind: Freie oder geschützte Oxogruppen, freie oder geschützte Hy- droxygruppen, Halogenatome (wie Fluor- oder Chlor atome) oder niedere Alkylgruppen. Eine geschützte Oxogruppe ist insbesondere eine ketalisierte Oxogruppe, wie z.
B. die Äthylendloxygruppe. Eine geschützte Hy- droxygruppe ist beispielsweise eine veresterte Hydroxy- gruppe (verestert z.
B. mit einer niederaliphatischen, aromatischen oder heterocyelischen Carbonsäure, wie Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure, Furancarbon- säure) oder eine verätherte Hydroxygruppe, wie die Tetrahydropyranyloxy-,
Benzyloxy- oder Triphenyl- methoxygruppe. Bevorzugte Ausgangsstoffe sind solche 20-Ketosteroide der Retropregnanreihe, welche in 3- Stellung eine Oxo- oder Hyd'roxygruppe und wenigstens in 4-Stellung eine Doppelbindung aufweisen, wie das 44-9ss,10a-Pregnen-3,20-dion (Retroprogesteron),
und das A4,1,-9ss,l0a-Pregnadien 3,20-dion (d6-Retroproge- steron).
Als Nährmedien für die Züchtung von Fusarium solam können die für die Entwicklung dieses Mikro organismus an sich bekannten Nährlösungen verwendet werden, z. B.
Nährlösungen mit einem Gehalt an einer Stickstoff- und Kohlenstoffquelle sowie anorganischen Salzen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise er wähnt:
Peptone, Maisquellwasser, Sojaprodukte, Hefe extrakte, Aminosäuren, Proteinhydrolysate, Nitrate und Ammoniumsalze. Als Kohlenstoffquellen kommen assi- milierbare Kohlehydrate, wie Glucose, Saccharose, so wie Aminosäuren in Betracht. Es können auch synthe- tische Nährlösungen verwendet werden.
Die Züchtung des erfindungsgemäss für den Selten- kettenabbau eingesetzten Mikroorganismus (Fusarium solani) erfolgt unter aeroben Bedingungen, zweckmässig im Submersverfahren, beispielsweise in Schüttelkultur oder in Fermentern unter Rühren und Belüftung. Zweck mässig arbeitet man wie folgt:
Die Nährlösung wird nach der Sterilisation angeimpft, z. B. mit einer vor gängig hergestellten Schüttelkolben-Kultur oder einer Mycel-Sporensuspension von Fusarium solani und hier auf 6-72 Stunden, vorzugsweise 24-48 Stunden, bei 15A.0 C, vorzugsweise zwischen 24 und 30 C, unter Belüftung geschüttelt bzw. gerührt.
Nach diesem Vor- wachstum erfolgt unter sterilen Bedingungen die Zugabe des zu oxydierenden Retrosteroidg in Form einer Lö sung, z. B. in Aceton, Methanol oder Äthanol. Die In- kubationsdauer kann 1-8 Tage oder auch länger, z. B. bis zu 25 Tagen, betragen.
Der Verlauf der Fermen tation fässt sich durch Entnahme von Proben und deren dünnschichtehromatographische Untersuchung kontrol lieren. Die Isolierung der Verfahrensprodukte kann, nach an sich bekannten Methoden erfolgen, wie Chromato- graphie, Gegenstromverteilung und fraktionierte Kri- stallisation.
Die Verfahrensprodukte können als Zwischenpro- dukte zur Herstellung von Heilmitteln verwendet wer den. Zum Teil sind die Verfahrensprodukte selbst physiologisch aktiv (z.
B. anaboliseh oder antiandrogen). <I>Beispiel 1</I> 4 Liter einer Nährlösung, enthaltend 20 g Saccha- rose, 3 g Hefeextrakt, 1 g Glykokoll, 1 g Natriumnitrat, 1 g primäres Kaliumphosphat, 0,5g Magnesiumsulfat, 0,5g Kaliumchlorid und 10 mg Eisensulfat pro 1000 ml destilliertes Wasser,
werden in einem Schüttelgefäss 45 Minuten bei 120 C sterilisiert. Die Lösung, deren pH- Wert 5,0 beträgt, wird hierauf mit einer Mycel-Sporen- suspension angeimpft, welche ab einer Bierwürze Schrägagarkultur von Fusarium :sol'ani gewonnen wurde. Das Gärgemisch wird unter Belüftung bei 24-28 C mechanisch geschüttelt.
Nach 48 Stunden werden 2 g 44,6-9ss,10-a-Pregnadiern-3,20-dioni-(d6-Retroprogesteron) in 40 ml Aceton zugegeben. Dann wird die Kultur 8 Tage lang unter gleichbleibenden. Bedingungen weiter gezüchtet.
Zwei auf die vorstehend beschriebene Art erhaltene Kulturen werden vereinigt und die Gärbrühe (total 8 Liter) vom Mycel abgetrennt. Die Gärbrühe wird zu nächst mit 8 Litern,
dann noch dreimal reit je 4 Litern Essigester extrahiert. Dass abgetrennte Mycel wird mit 3 Litern Essigester ausgerührt. Die vereinigten Extrakte werden mit einer wässrigen 10 % igen Kochsalzlösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und schliesslich unter reduziertem Druck eingedampft.
Der öligeRTI ID="0002.0229" WI="37" HE="4" LX="1351" LY="1421"> Eindampfungsrückstand (total 4,6 g) wird in 100 ml Essigester-Benzol (1 : 1) gelöst und mit 5 g Aktivkohle behandelt. Nach Filtiration durch ein Filter aus Diatomeenerde erhält: man eine hellgelbe, klare Lösung, welche auf Grund des Plattenchromatogramms (Systeme Benzol Aceton 7 : 3 und 4 :
1 auf Kieselgel) zur Hauptsache d4,6-9ss,l0a-Androstadien-3,17-dion und 44,6-9ss, l0a-Androstadien17ss-o1-3-on enthält.
Das hellgelbe Filtrat wird nun unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft und im System Ben- zol-Aceton 9 : 1 an 300 ml Kieselgel (Merek 0,05 bis 0,2 mm)
chromatographiert. Es werden 100 Fraktionen zu 10 ml gesammelt. Jede zweite Fraktion wird plat- tenchromatographisch untersucht. Die übereinstimmen- den Fraktionen werden vereinigt und unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft. Die Fraktionen 1-15 enthalten Verunreinigungen in geringer Menge.
Die Fraktionen 16-25 enthalten 1,75 g nahezu reines All;- 9ss, l0a-And'rostadien-3,17-diion. Nach zweimaliger Kri- stallisation aus Methylenchlorid-Methanol-Isopropyl- äther erhält :man diese Substanz in analysenreinem Zu- stand mit dein: Schmelzpunkt 193-196 C;
J max. (U. V.) = 285 my; s = 25 700.
Die Fraktionen 30-34 enthalten 0,21 g 44,6-9ss,10a- Androstadien-17ss-ol-3-on vom Schmelzpunkt 169 bis <B>1711</B> (nach zweimaliger Kristallisation aus Methylen chlorid-Aceton-Isopropyläther). Amax. (U. V.) = 285 my; s = 27 500.
Aus den Fraktionen 26-29 erhält man 0,27 g eines Gemisches der vorgenannten 17-Hyd'roxy- und 17-Keto- verbind'ungen. Das hellgelbe Öl wird in 200 ml Benzol gelöst und mit einem Äquivalent Chromsäure in 50 % iger Essigsäure versetzt.
Das, Gemisch wird 10 Stunden ge- schüttelt, hierauf die organische Phase abgetrennt und diese mit Wasser, dann mit gesättigter Bicarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen, schliesslich über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhält so weitere 0,19 g d-l@',-9/i,10a-And'ros:tadiien 3,17-dion.
<I>Beispiel 2</I> Vier mit Rührwerk versehene Fernenter werden mit je 6 Litern des, im Beispiel 1 beschriebenen Nährmedi- ums unter Zusatz eines Schaumbekämpfungsmittels (Sili- conöl) beschickt.
Nach Sterilisation wird dass Nähr medium mit einer 3 Tage alten Schüttelkolben-Kultur von Fusarium solani angeimpft und die Kultur unter Rühren und Belüften bei 28 C 48 Stunden wachsen gelassen. Es bildet sich dabei bereits eine reichliche Menge Mycel. In jeden Fernenter werden nun 1,5 g 4 ,6-9ss,l0a-Pregnadien-3,20-dion (A6-Retroprogesteron) in. 40 ml Aceton gegeben.
Nach abgeschlossener Um- setzung wird die Fermentation unterbrochen (im vor liegenden Versuch waren für die einzelnen Ansätze In kubationszeiten von 2-6 Tagen für die Umsetzung er forderlich).
Nach Abtrennung des Mycels werden die Gärbrühen gemäss Beispiel 1 extrahiert und aufgearbeitet (die einzelnen Rohextrakte zeigten bei der platttenchro- matographisch.en Prüfung keinerlei Unterschiede be züglich der Zusammensetzung und wurden deshalb ver- einigt). Man erhält 10,
05 g eines gelben 61s, welches an 600 ml Kieselgel chromatographiert wird. Als. Elur ierungsmittel dient Benzol-Aceton 4:1. Es werden Fraktionen zu 25 ml gesammelt.
Die Fraktionen l-26 enthalten Verunreinigungen. Aus dien Fraktionen 28 bis 52 erhält man durch mehrmalige Kristallisation aus Methylenchlorid-Me)thanol-Isopropyläther 495 mg rei nes 44,6-9ss,10a-Androstadien 3,17-dion vom Schmelz punkt 192-195 C.
Aus den Fraktionen 90-105 kön nen durch fraktionierte Kristallisation aus Methylen- chlorid-Methanol und Methylenchloxid-MlthanolIso- propyläther 230 mg reines 44,6-9ss, l0a-Androstadien- 17f ol-3-on vom Schmelzpunkt 168-170 C isoliert werden.
Aus den Mutterlaugen dieser Fraktionen kann durch weitere Kristallisation das dG-9ss,l0a-Tesitolakton isoliert werden. Schmelzpunkt 192-194 C; A max. (U. V.) = 286 mu; e = 25 000.
<I>Beispiel 3</I> 10 Erlenmeyerkolben ä 500 ml werden mit je 100' ml einer Nährlösung der im Beispiel 1 angegebenen Zusam mensetzung beschickt, mit Wattepfropfen verschlossen und bei 120 C 20 Minuten sterilisiert. Dann wird mit einer ab einer :
Schrägagar-Kultlur von Fusarium solani auf Bierwürze-Agar gewonnenen Sporenmycel-Suspen sion angeimpft. Die zur besseren Durchlüftung mit Schikanen versehenen Kolben werden auf einer rotie- renden Schüttehnaschine bei 24-28 C geschüttelt.
Nach 66 Stunden Wachstumszeit werden pro Kolben 20 mg 44-9/3,10a-Pregnen-3,20-dio#n (Retroprogesteron) in 1 ml Aceton unter aseptischen Bedingungen zugegeben. Die dünuschichtchromatographische Kontrolle der Fermen tation nach 24, 48 und 96 Stunden zeigte, dass das ein gesetzte Retroprogesteron schon nach 24 Stunden prak tisch vollständig zum 44-9ss,10a-Androsten-3,17-dion abgebaut wird.
Dasselbe Resultat wird erhalten, wenn man wie oben beschrieben vorgeht, aber eine Nährlösung ver wendet, welche 15 g Pepton, 3 g Trockenrückstand aus Maisquellenwasser und 50 mg Glucose in, 1000 ml Lei tungswasser enthält und mit Natriumhydroxyd auf ein pH von 6,5 eingestellt ist.
<I>Beispiel 4</I> 6 Liter einer Nährlösung (15 g Pepton, 3 g Trocken rückstand aus Maisquellwasser, 50 mg Glucose pro 1000 ml Waliser, mit Natniumhydraxyd auf pH = 6,5 eingestellt)
werden unter Zusatz eines Schaumbekämp- fungsmittels in einem mit Rühren versehenen und beliif- teten Fernenter unter sterilen Bedingungen mit einer 3 Tage alten Schüttelkolben-Kultur von Fus.arnum solani angeämpft. Nach 46stündigem Wachstum.
bei 28 C wer den 1,2 g 44-9ss,10a-Pregnen-3,20-dion (Retroproge- steron), gelöst in 40 ml Aceton, zugegeben. Nach 48 Stunden (End-pH = 4,6) wird die Gärbrühe filtriert und das Filtrat, wie im Beispiel 1 beschrieben, extra hiert.
Der Rohextrakt wird in 60 ml. Aceton gelöst und in der Wärme mit 1,2 g Aktivkohl-, behandelt. Nach Filtration und Eindampfen erhält man 2,28 g eines gel ben Öls. Dieses wird in wenig Benzol gelöst und an 400 ml Kieselgel chromatographiert. Es werden Frak tionen zu 10 ml aufgefangen.
Die Fraktionen 1-116 enthalten insgesamt 780 mg Verunreinigungen. Die Fraktionen 1l7-170 (Benzol-2% Aceton) enthalten 490 mg plattenchromatographissch einheitliches 44-9ss, 10a-Androsten-3,
17-dion. Schmelzpunkt 155-156'C (nach mehrmaliger Umkristallisation aus Methylen- ch'lorid Isopropyläther); A, max. (U. V.) = 241 rau; e = 16 500.
Aus den Fraktionen 186-244 (Benzol-Ace- ton 9 : 1) erhält man 540 mg einheitliches 44-9ss,10ce- Androsten-17ss-o#l#3-on. Schmelzpunkt 154-155 C (aus Methylenchlorid - Isopropyläther); .1 max. (U. V.) _ 241 m,u; e <I>=</I> 16 000.
<I>Beispiel S</I> 1,2 g 44-9ss,10a-Pregnen 3,20-dion (Retroproge- steron) werden, wie im Beispiel 4 beschrieben, jedoch unter Verlängerung der Inkubationszeit auf 7 Tage (nach Steroidzugabe), derRTI ID="0003.0227"WI="22" HE="4" LX="1511" LY="1656"> enzymatischen Oxydation un- terworfen. Dabei erhält man 1,12 g einheitliches 44- 9ss,10a-And'rosten-3,17-d'ion (aus,
der Gärbrühe konnte bei diesem Versuch kein 44-9ss,10a-Androsten 17ss-ol- 3-on isoliert werden).
Additional patent to main patent No. 426 795 Process for the production of retroandrostane derivatives The invention relates to a process for the production of retro steroids of the androstane series which have an oxo group in the 17-position. The method according to the invention is characterized in that
that a 20-ketosteroid of the retrop.regnan series is subjected to aerobic enzymatic oxidation by means of Fusarium solani.
In the following, those steroids are referred to as retrosteroids in which the methyl group located on carbon atom 10 has the α configuration and the hydrogen atom located on carbon atom 9 (or a 9 substituent) has the ß configuration.
Accordingly, steroids of the pregnancy series with a retro configuration are referred to below as retropregnanes or as 9ss, 10a-pregnanes. Such retro steroids
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are z. B. from, the Belgian patent specification number 577 615 became known.
The action according to the invention of the enzymes of Fusarium solani (for example the fungus strain registered under ATCC No. 12 823) on 20 = ketosterolde of the retropregnan series causes the degradation of the 17 side chain. With prolonged action of the enzyme, an δ-lactomüng can form from the D-ring of the parent steroid.
So z. B. from the 44, E-9ss, 10a-Pregnadiene-3,20-dione (I) (4E-retroprogesterone) by incubation with Fusanum solani according to the following reaction scheme, the d4,6-9ss, 10a-Androstaden-17ss -ol-3-on (II), the 44> 6-9ss, l0a-And'ros, tadien-3,17-dione (III) and the 46-9ss,
10a-testolactone (IV) can be obtained. Surprisingly, the enzymatic oxidation according to the invention of steroids of the retropregnan series hydrogenated in the 1,2-position does not cause any significant dehydration in the 1,2-position, even after prolonged incubation.
as is the case in the normal series.
The 20-ketosteroids of the Retropregnan series used as starting materials can be saturated or contain double bonds, for example in one or more of the positions 1,4,5,6,7,8,9 (11) and 15, preferably in the 4-position and possibly a further position [such.
B. additionally in 1-, 6-, 1,6-, 1,6,9- (11) - or in 6,9 (11) position]. In addition to the 20-oxo group, the starting materials can also contain further substituents in the ring system or in the side chain.
Examples of such substituents are: free or protected oxo groups, free or protected hydroxyl groups, halogen atoms (such as fluorine or chlorine atoms) or lower alkyl groups. A protected oxo group is in particular a ketalized oxo group, such as.
B. the Äthylendloxygruppe. A protected hydroxy group is, for example, an esterified hydroxy group (esterified e.g.
B. with a lower aliphatic, aromatic or heterocyclic carboxylic acid, such as acetic acid, propionic acid, benzoic acid, furancarboxylic acid) or an etherified hydroxyl group, such as the tetrahydropyranyloxy,
Benzyloxy or triphenyl methoxy group. Preferred starting materials are those 20-ketosteroids of the retropregnan series which have an oxo or hydroxy group in the 3-position and a double bond in at least the 4-position, such as 44-9ss, 10a-pregnene-3,20-dione (retroprogesterone) ,
and the A4,1, -9ss, 10a-pregnadiene 3,20-dione (d6-retroprogestone).
The nutrient solutions known per se for the development of this microorganism can be used as nutrient media for the cultivation of Fusarium solam, e.g. B.
Nutrient solutions containing a nitrogen and carbon source and inorganic salts. Examples of nitrogen sources are:
Peptones, corn steep liquor, soy products, yeast extracts, amino acids, protein hydrolysates, nitrates and ammonium salts. Assimilable carbohydrates such as glucose, sucrose and amino acids come into consideration as carbon sources. Synthetic nutrient solutions can also be used.
The microorganism (Fusarium solani) used according to the invention for the degradation of rare chains is cultivated under aerobic conditions, expediently in the submerged process, for example in shaking culture or in fermenters with stirring and aeration. It is practical to work as follows:
The nutrient solution is inoculated after sterilization, e.g. B. with a previously produced shake flask culture or a mycelium spore suspension of Fusarium solani and here for 6-72 hours, preferably 24-48 hours, at 15A.0 C, preferably between 24 and 30 C, shaken or with aeration touched.
After this pre-growth, the retrosteroid to be oxidized is added under sterile conditions in the form of a solution, e.g. B. in acetone, methanol or ethanol. The incubation period can be 1-8 days or longer, e.g. B. up to 25 days.
The course of fermentation can be controlled by taking samples and examining them using thin-layer chromatography. The process products can be isolated by methods known per se, such as chromatography, countercurrent distribution and fractional crystallization.
The products of the process can be used as intermediate products in the manufacture of medicinal products. Some of the process products are themselves physiologically active (e.g.
B. anabolic or antiandrogenic). <I> Example 1 </I> 4 liters of a nutrient solution containing 20 g sucrose, 3 g yeast extract, 1 g glycocolla, 1 g sodium nitrate, 1 g primary potassium phosphate, 0.5 g magnesium sulphate, 0.5 g potassium chloride and 10 mg Iron sulfate per 1000 ml of distilled water,
are sterilized in a shaker at 120 C for 45 minutes. The solution, the pH of which is 5.0, is then inoculated with a mycelium spore suspension which was obtained from Fusarium: sol'ani from a wort slant culture. The fermentation mixture is shaken mechanically at 24-28 C with aeration.
After 48 hours, 2 g of 44.6-9ss, 10-α-pregnadier-3,20-dioni- (d6-retroprogesterone) in 40 ml of acetone are added. Then the culture is kept constant for 8 days. Conditions further bred.
Two cultures obtained in the manner described above are combined and the fermentation broth (total 8 liters) is separated from the mycelium. The fermentation broth is initially 8 liters,
then extracted three more times 4 liters of ethyl acetate each time. The separated mycelium is stirred with 3 liters of ethyl acetate. The combined extracts are washed with an aqueous 10% sodium chloride solution, then dried over sodium sulfate and finally evaporated under reduced pressure.
The oily RTI ID = "0002.0229" WI = "37" HE = "4" LX = "1351" LY = "1421"> evaporation residue (total 4.6 g) is dissolved in 100 ml of ethyl acetate-benzene (1: 1) and treated with 5 g of activated charcoal. After filtering through a filter made of diatomaceous earth, a light yellow, clear solution is obtained which, based on the plate chromatogram (systems benzene acetone 7: 3 and 4:
1 on silica gel) mainly contains d4,6-9ss, l0a-androstadien-3,17-dione and 44,6-9ss, l0a-androstadien17ss-o1-3-one.
The light yellow filtrate is then evaporated to dryness under reduced pressure and in the benzene-acetone 9: 1 system on 300 ml of silica gel (Merek 0.05 to 0.2 mm)
chromatographed. 100 fractions of 10 ml are collected. Every second fraction is examined by plate chromatography. The matching fractions are combined and evaporated to dryness under reduced pressure. Fractions 1-15 contain small amounts of impurities.
Fractions 16-25 contain 1.75 g of almost pure all; -9ss, 10a-and'rostadien-3,17-diion. After two crystallizations from methylene chloride-methanol-isopropyl ether, this substance is obtained in an analytically pure state with: melting point 193-196 C;
J max. (U.V.) = 285 my; s = 25 700.
Fractions 30-34 contain 0.21 g 44.6-9ss, 10a-androstadien-17ss-ol-3-one with a melting point of 169 to 1711 (after two crystallizations from methylene chloride-acetone-isopropyl ether ). Amax. (U.V.) = 285 my; s = 27,500.
From fractions 26-29, 0.27 g of a mixture of the aforementioned 17-hydroxy and 17-keto compounds is obtained. The light yellow oil is dissolved in 200 ml of benzene and treated with one equivalent of chromic acid in 50% acetic acid.
The mixture is shaken for 10 hours, then the organic phase is separated off and this is washed with water, then with saturated bicarbonate solution and again with water, finally dried over sodium sulphate and concentrated to dryness under reduced pressure. This gives a further 0.19 g of d-l @ ', - 9 / i, 10a-And'ros: tadiien 3,17-dione.
<I> Example 2 </I> Four Fernenter provided with a stirrer are each charged with 6 liters of the nutrient medium described in Example 1 with the addition of a foam control agent (silicone oil).
After sterilization, the nutrient medium is inoculated with a 3-day-old shake flask culture of Fusarium solani and the culture is allowed to grow for 48 hours at 28 ° C. with stirring and aeration. A large amount of mycelium is already being formed. 1.5 g of 4, 6-9ss, 10a-pregnadiene-3,20-dione (A6-retroprogesterone) in 40 ml of acetone are then added to each distal enter.
After the conversion is complete, the fermentation is interrupted (in the present experiment, incubation times of 2-6 days were necessary for the conversion for the individual batches).
After the mycelium has been separated off, the fermentation broths are extracted and worked up according to Example 1 (the individual crude extracts showed no differences whatsoever with regard to the composition in the plate-chromatographic test and were therefore combined). You get 10,
05 g of a yellow 61s, which is chromatographed on 600 ml of silica gel. When. Benzene-acetone 4: 1 serves as the eluent. 25 ml fractions are collected.
Fractions I-26 contain impurities. From fractions 28 to 52, by repeated crystallization from methylene chloride-methanol-isopropyl ether, 495 mg of pure 44.6-9ss, 10a-androstadiene 3,17-dione with a melting point of 192-195 ° C. are obtained.
230 mg of pure 44.6-9ss, 10a-androstadien-17fol-3-one with a melting point of 168-170 ° C. can be isolated from fractions 90-105 by fractional crystallization from methylene chloride-methanol and methylene oxide-methanol isopropyl ether .
The dG-9ss, 10a-tesitolactone can be isolated from the mother liquors of these fractions by further crystallization. Melting point 192-194 C; A max. (U.V.) = 286 mu; e = 25,000.
<I> Example 3 </I> 10 Erlenmeyer flasks of 500 ml each are charged with 100 ml of a nutrient solution of the composition given in Example 1, sealed with cotton plugs and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. Then with one from one:
Slant agar culture of Fusarium solani on wort agar inoculated spore mycelium suspension. The flasks, which are provided with baffles for better ventilation, are shaken on a rotating shaker at 24-28 ° C.
After a growth time of 66 hours, 20 mg of 44-9 / 3,10a-pregnen-3,20-dio # n (retroprogesterone) in 1 ml of acetone are added to each flask under aseptic conditions. The thin-layer chromatographic control of the fermentation after 24, 48 and 96 hours showed that the retroprogesterone used was almost completely degraded to 44-9ss, 10a-androstene-3,17-dione after 24 hours.
The same result is obtained when proceeding as described above, but using a nutrient solution which contains 15 g of peptone, 3 g of dry residue from corn spring water and 50 mg of glucose in 1000 ml of tap water and adjusted to a pH of 6.5 with sodium hydroxide is.
<I> Example 4 </I> 6 liters of a nutrient solution (15 g peptone, 3 g dry residue from corn steeple, 50 mg glucose per 1000 ml Welsh, adjusted to pH = 6.5 with sodium hydroxide)
are fumed under sterile conditions with a 3-day-old shake flask culture of Fus.arnum solani with the addition of a foam control agent in a ventilated distal vent that is provided with stirring. After 46 hours of growth.
at 28 ° C., 1.2 g of 44-9ss, 10a-pregnen-3,20-dione (retroprogesterone), dissolved in 40 ml of acetone, are added. After 48 hours (final pH = 4.6) the fermentation broth is filtered and the filtrate, as described in Example 1, is extracted.
The crude extract is dissolved in 60 ml. Acetone and treated with 1.2 g of activated charcoal while warm. After filtration and evaporation, 2.28 g of a yellow oil are obtained. This is dissolved in a little benzene and chromatographed on 400 ml of silica gel. Fractions of 10 ml are collected.
Fractions 1-116 contain a total of 780 mg of impurities. The fractions 1l7-170 (benzene-2% acetone) contain 490 mg plate chromatographically uniform 44-9ss, 10a-androstene-3,
17-dione. Melting point 155-156'C (after repeated recrystallization from methylene chloride isopropyl ether); A, max. (U.V.) = 241 rough; e = 16,500.
From fractions 186-244 (benzene-acetone 9: 1), 540 mg of a uniform 44-9ss, 10ce-androstene-17ss-o # l # 3-one are obtained. Melting point 154-155 C (from methylene chloride - isopropyl ether); .1 max. (U.V.) _ 241 m, u; e <I> = </I> 16 000.
<I> Example S </I> 1.2 g 44-9ss, 10a-pregnen 3,20-dione (retroprogesterone) are, as described in example 4, but with an extension of the incubation time to 7 days (after steroid addition) , derRTI ID = "0003.0227" WI = "22" HE = "4" LX = "1511" LY = "1656"> subjected to enzymatic oxidation. This gives 1.12 g of uniform 44- 9ss, 10a-and'rosten-3,17-d'ion (from,
no 44-9ss, 10a-androstene 17ss-ol-3-one could be isolated from the fermentation broth in this experiment).