CH442616A - Verfahren zur Herstellung von Tetracyklin - Google Patents

Description

  Verfahren     zur    Herstellung von     Tetracyklin       Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel  lung von     Tetracykhn    durch     submerse    Fermentation       eines    flüssigen     Nährmediums    mit     assimilierbaren    Koh  lenstoff- und Stickstoffquellen, mit Zusatz von Mine  ralnährsalzen, unter     aeroben    Bedingungen, mit Hilfe  von     Chlortetracyklin    sowie auch     Tetracyklin    produzie  renden Mikroorganismen des Genus     Streptomyces    und  durch Isolierung des Antibiotikums aus der fermentier  ten Brühe.  



  Die Mikroorganismen des Genus     Streptomyces,     welche unter     bestimmten        Bedingungen        Chlortetracyklin     erzeugen,     sind.        unter        anderen        Bedingungen        befähigt,        das          Tetracyklin    zu produzieren.

   Die gewünschte überwie  gende hohe     Tetracyklinbildung    kann beispielsweise  durch Entfernung von Chlorionen aus dem Nährme  dium (kanadisches Patent Nr. 542 622) oder durch  Zugabe von     Chlorierungsinhibitoren    des     Tetracyklin-          moleküls    - sog.     Antimetaboliten    - zum Nährmedium  erreicht werden.

   Die eine Gruppe dieser     Inhibitoren     stellen anorganische Bromsalze (kanadisches Patent  Nr. 602 697) dar, welche als     kompetitive    Hemmstoffe  gegenüber Chlorionen wirken, die andere Gruppe bil  den Verbindungen, welche in ihrem Molekül meistens       Stickstoff        und    Schwefel     enthalten    (J. J.     Goodman    und       Mitarb.,    J.     Bacteriol.    78, 432, 1959<B>)</B>.  



  Die Wirkung dieser organischen     Antimetabolite    auf  den     Chlorierungsprozess    des     Tetracyklinmoleküls    be  sitzt den Charakter einer nicht     kompetitiven        Inhibie-          rung,    welche in der Weise wirkt, dass die Kupferionen,  welche die     Koenzyme    der für die     Chlorierung    verant  wortlichen Enzyme bilden, in Form eines     Chelates    ge  fällt     werden    (J. J.     Goodman    und     Mitarb.,    J.     Bacteriol.     78, 432, 1959).

   Durch Zugabe dieser Stoffe zu den,  für die Erzeugung von     Chlortetracyklin    geeigneten  Nährmedien, wird das gegenseitige Verhältnis der bei  der Fermentation entstandene Antibiotika zugunsten  des     Tetracyklins    verschoben, und zwar sogar in Gegen  wart von hohen     Chlorionenkonzentrationen.    Bei einer  wirtschaftlichen Herstellung von     Tetracyklin    ist es       allerdings        erforderlich,    diese     organischen        Anthnetabolite       zu den Nährmedien in derart hohen Konzentrationen  zuzugeben,

   dass die Menge des     Tetracyklins    im     fer-          mentierten        Medium        mindestens        90        %        der        Gesamtaus-          beute    an beiden Antibiotika ausmacht. In diesen Kon  zentrationen beeinflussen die     Antimetabolite    durch ihre  toxische Wirkung auf den Mikroorganismus die Pro  duktion der Antibiotika, wodurch ihre Gesamtausbeute  vermindert wird.

   Infolgedessen ist ein     Antimetabolit     für die Produktion des     Tetracyklins        umso        geeigneter,     desto stärker seine     chlorierungsinhibierende        Wirkung          und    desto     niedriger    seine Toxizität     ist.     



  Es ist ferner bekannt, dass     Benzylrhodanid    die Bil  dung des     Chlortetracyklins    und des     Tetracyklins    be  schleunigt und die Gesamtausbeuten erhöht. Der  Mechanismus dieser Wirkung wurde studiert und die  wahrscheinliche Hypothese vorgeschlagen (J.     Hogtälek,          Folia        microbIologica    9, 78, 89, 96, 1964).  



  Es wurde nun festgestellt, dass durch Zugabe des       Benzylrhodanids,    zu Medien, welche einen organischen       Antimetabolit    enthalten, nicht nur die Gesamtausbeute  der Antibiotika bei der Fermentation erhöht wird,       sondern.    auch der eigentliche     Chlorierungsprozess        des          Tetracyklinmolieküls        beeinflusst        wird.        Einerseits        wird          die    Toxizität der     benutzten        organischen        Anthnetabolite       <RTI  

   ID="0001.0097">   vermindert,        andererseits        wird        ihr        hemmwirkender    Ein  fluss auf die     Chlorierung        potenziert,

      so     dass    bei     einer     bestimmten Konzentration des     Antimetabolites    nach       Zusatz    von     Benzylrhodanid        we'ite're    Verschiebung     des          Verhältnisses    von     Tetracyklin    zu     Chlorhetracyklin        zu-          gunsten    des     Tetracyklins        erfolgt.     



  Dieser     Erkenntnis    hat man     sich    bei der Ausarbei  tung des Verfahrens     zur        Herstellung    von     Tetracyklin          gemäss        Erfindung    bedient, die dadurch     gekennzeichnet     ist,

       dass    man die Fermentation     meinem        Nährmedium     mit Zugabe von     einem    oder von mehreren     Chlorierungs-          inhibitoren    des     Tetracyklinmoleküls        und    von     Benzoyl          rhodanid        durchführt.     



  Die Fermentation kann man in einem Nährmedium  mit Zugabe eines     Chlorierungsinhibitors    in einer       Menge        von        0,0001        bis        0,05        %        und        des    Benzylrhoda-           nids        in        einer        Menge        von        0,0001        bis        0,

  002        %        durchfüh-          ren.     



  Als einen     Chlorierungsinhibitor    kann man     3-Mer-          capto-5-hydroxy-6-methyl-1,2,4-triazin,        3-Mercapto-          5-hydroxy-6-benzyl-1,2,4-triazin    oder     2-Mercapto-          benzthiazol    verwenden.  



  Statt genannter Verbindungen lassen sich auch     In-          hibitoren    vom anderen Typ verwenden, wie     z.B.          5-Vinylthiooxazolidin    oder natürliche aus den Pflanzen  des Genus     Brassica    oder     Cruciferae    gewonnene     Inhibi-          toren.     



  Durch Zugabe des     Benzylrhodanids    zu einem  Nährmedium, welches einen organischen     Inhibitor    in  bestimmter Konzentration enthält, wird also eine  höhere     Tetracyklinausbeute    erreicht, als es bloss der  gleichmässigen Stimulierung der Produktion jedes von  beiden Antibiotika im Sinne des     obengesagten,    entspre  chen würde.  



       Durch        gemeinsame    Anwendung :eines     bestimmten     organischen     Chlorierungsinhibitors    und des     Benzylrho-          danids    wird die     antimetabolische        Wirklichkeit    :des     Inhi-          bitors    günstig     beeinflusst,    denn     seine        Toxizität    wird  vermindert und seine Hemmwirkung gesteigert.

      <I>Beispiele</I>       1.        Ein        Nährmedium,        enthaltend    4     %        Saecharose,       3     %        Sojamehl,        0,5        %        Ammoniumsulfat,        0,5        %        Calci-          umcarbonat,        0,2        %        Melasse,        0,

  4        %        Maisquellwasser,          65        %        Trockensubstanz        und        0,038        %        NaC1,        wurde        mit     5 0/a einer 24stündigen Kultur eines     Streptomyces          aureofaciens-Stammes,    welche im Nährmedium glei  cher Zusammensetzung ohne     NaCI-Zusatz    gezüchtet  worden war, beimpft.

   Die Kultivierung wurde in einem  101     Fermentationsgefäss    unter Belüftung und Rühren  bei 30  C 84-92 Stunden lang     durchgeführt.    In     Kon-          trollmedien    ohne Zusatz von     Antimetaboliten    und ohne       Benzylrhodanid        wurde        eine        Ausbeute        von        0,1        bis        0,2        %          Chlortetracyklin    erreicht.

   Neben der Gesamtkonzentra  tion der     Tetracyklinantibiotika    während der Fermenta  tion wurde gegen Ende der Fermentation auch das  Verhältnis von     Tetracyklin    zu     Chlortetracyklin    mit       chrömatographischer    Methode und durch Vergleich  mit einer Reihe von Standerden ermittelt.

       Benzylrho-          danid    (BR) wurde in Form einer sterilen Lösung in  Essigsäure in ausgewählte     Fermentationsgefässe        zuge-          geben,        in        einer        Menge        von        0,0004        %,

          was        zur        maxi-          malen        Stimulierung    der     Gesamtausbeuten    genügend       war.        Als        Antimetabo:

  lit    wurde das     3-Mercapto-5-hydro-          6        m@ethyl-1,2,4-triazonin,    welches starke     chlorierungs-          inhibierende        Wirkung    aufweist,

       benutzt.    Es wurde     zum.          sterilisierten        Nährmedium    in     Form    einer     wässrigen     sterilen Suspension     in.    verschiedenen Konzentrationen       zugesetzt.     
EMI0002.0130     
  
    <I><U>Tabelle <SEP> I</U></I>
<tb>  Konzentration <SEP> Die <SEP> Gesamtausbeute <SEP> in <SEP> Medien <SEP> Die <SEP> Gesamtausbeute <SEP> der <SEP> Antibiotika <SEP> Verhältnis
<tb>  des <SEP> Inhibitors <SEP> ohne <SEP> BR <SEP> in <SEP> Medien <SEP> mit <SEP> BR <SEP> CTC <SEP> :

   <SEP> TC'
<tb>  im <SEP> Medium <SEP> (o/o) <SEP> (in <SEP> o/o <SEP> der <SEP> Kontrolle <SEP> ohne <SEP> BR) <SEP> (in <SEP> 1/o <SEP> der <SEP> Kon- <SEP> (in <SEP> o <SEP> /o <SEP> der <SEP> Kontrolle
<tb>  trolle <SEP> ohne <SEP> BR) <SEP> mit <SEP> BR)
<tb>  0 <SEP> 100 <SEP> (Kontrolle <SEP> ohne <SEP> BR) <SEP> 250 <SEP> 100 <SEP> (Kontrolle <SEP> mit <SEP> BR) <SEP> <B>90:</B> <SEP> 10
<tb>  0,004 <SEP> 80 <SEP> 230 <SEP> 92 <SEP> <B>10:</B> <SEP> 90
<tb>  0,008 <SEP> 34 <SEP> 150 <SEP> 60 <SEP> 5 <SEP> : <SEP> 95
<tb>  In <SEP> Medien <SEP> mit <SEP> und <SEP> ohne <SEP> Benzylrhodanid <SEP> war <SEP> das <SEP> Verhältnis <SEP> CTC <SEP> : <SEP> TC <SEP> dasselbe.

         Aus den Ergebnissen geht hervor, dass die durch  toxische Wirkung des     Antimetabolits    verursachte     Inhi-          bierung    der Gesamtausbeute bei hohen Konzentratio  nen desselben durch die Gegenwart den     Benzylrhoda-          nids    etwa um eine Hälfte herabgesetzt wird.  



  2. Die Fermentation wurde in derselben Weise wie  im Beispiel 1 durchgeführt. Statt des     Triazinderivates     wurde als     Antimetabolit        2-Mercaptobenzthiazol        (MBT)     verwendet.

    
EMI0002.0140     
  
    <I><U>Tabelle <SEP> II</U></I>
<tb>  Konzentra- <SEP> Die <SEP> Gesamt- <SEP> Die <SEP> Gesamt- <SEP> Verhältnis <SEP> CTC <SEP> : <SEP> TC
<tb>  tion <SEP> MBT <SEP> im <SEP> ausbeute <SEP> der <SEP> ausbeute <SEP> der <SEP> in <SEP> Medien
<tb>  Medium <SEP> (o/o) <SEP> Antibiotika <SEP> Antibiotika
<tb>  in <SEP> Medien <SEP> in <SEP> Medien
<tb>  ohne <SEP> BR <SEP> mit <SEP> BR
<tb>  (in <SEP> % <SEP> der <SEP> (in <SEP> % <SEP> der
<tb>  Kontrolle <SEP> Kontrolle
<tb>  ohne <SEP> BR) <SEP> ohne <SEP> BR) <SEP> ohneBR <SEP> mit <SEP> BR
<tb>  0 <SEP> 100 <SEP> 239 <SEP> 95:5 <SEP> 85:15
<tb>  0,01 <SEP> 110 <SEP> - <SEP> 35:65 <SEP>   0,015 <SEP> 26 <SEP> - <SEP> 20:80 <SEP>   0 <SEP> 100 <SEP> 545 <SEP> 95:5 <SEP> 95:5
<tb>  0,0055 <SEP> 230, <SEP> - <SEP> 95:5 <SEP>   0,0060 <SEP> 250 <SEP> 370 <SEP> 35:65 <SEP> 25:

  75
<tb>  0 <SEP> 100 <SEP> 274 <SEP> 95:5 <SEP> 90:10
<tb>  0,0080 <SEP> 182 <SEP> 272 <SEP> 35:65 <SEP> 15:80       Aus den Ergebnissen geht hervor, dass     2-Mercap-          tobenzthiazol    zum Unterschied von anderen     Antimeta-          boliten    schon in niedrigeren Konzentrationen die Ge  samtausbeute der     Tetracyklinantibiotika    erhöht.  



  Die     gleichzeitige    Gegenwart von     2-Mercaptob@enz-          thialzol    und     Benzylrhodanid        bewirkt        synergistisch    die  Verschiebung der Verhältnisse von     Tetracyklin    zu       Chlortetracyklin    zugunsten des     Tetracyklins.  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Tetracyklin durch submerse Fermentation eines flüssigen Nährmediums mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, mit Zusatz von Mineralnährsalzen, unter aeroben Be dingungen, mit Hilfe von Chlortetrac;

   ,klin sowie auch Tetracyklin produzierenden Mikroorganismen des Genus Streptomyces und durch Isolierung des Antibio tikums aus der fermentierten Brühe, dadurch gekenn zeichnet, dass man die Fermentation in einem Nährme dium mit Zugabe von einem oder von mehreren Chlo- rierungsinhibitoren des Tetracyklinmoleküls und von Benzyirhodanid durchführt. UNTERANSPRÜCHE 1.

   Verfahren nach Patentanspruch dadurch gekenn- zeichnet, dass man die Fermentation in einem Nährme dium mit Zugabe eines Chlorierungsinhibitors in einer Menge von 0,0001 bis 0,05 % und des Benzylrhoda- nids in einer Menge von 0,001 bis 0,002<B>%</B> durchführt. 2. Verfahren nach Patentanspruch dadurch gekenn zeichnet, dass man als Chlorierungsinhibitor 3-Mercap- to-5-hydroxy-6-methyl-1,2,4-triazin verwendet. 3.

   Verfahren nach Patentanspruch dadurch gekenn- zeichnet, dass man als Chlorierungsinhibitor 3-Mercap- to-5-hydroxy-6-benzyl-1,2,4-triazin verwendet. 4. Verfahren nach Patentanspruch dadurch gekenn zeichnet, dass man als Chlorierungsinhibitor 2-Mercap- tobenzthiazol verwendet.