CH444097A - Procédé d'obtention d'une cellulase - Google Patents
Procédé d'obtention d'une cellulaseInfo
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Description
Procédé d'obtention d'une cellulase La présente invention -se rapporte à un procédé d'obtention d'une préparation de cellulase très pure, à partir d'un milieu de culture solide, composé de son de blé, ensemencé par un micro-organisme du groupe dit Aspergillus Noir tel que l'Aspergillus piger. Par la suite,
un tel milieu de culture sera désigné sous le terme koji , employé communément au Japon pour de tels milieux.
Dans le cas où l'on extrait le koji de son. de blé d'un Aspergillus Noir, par exemple l'Aspergillus piger, avec l'eau, la solution extraite a, en général, une cou leur brun noirâtre due à l'influence des spores noirs et à l'humidité du milieu de culture. En outre, l'extrait est difficile à clarifier, même par centrifugation et même si la centrifugation est réalisée à grande vitesse.
Il en résulte que la préparation de cellulase brute précipitée par un solvant organique hydrophyle tel que l'éthanol a une couleur noire ou blanc cendré et ceci diminue la valeur du produit.
D'autre part, il est bien connu qu'une préparation enzymatique blanche peut être obtenue en traitant ]'extrait coloré selon des procédés classiques de décoloration antérieurement à la précipitation par un agent organique hydrophyle. Cependant, ces procédés réduisent généralement l'activité enzymatique de la cel lulase.
Il serait .donc utile de pouvoir, d'une part, décolorer et purifier la solution d'enzyme brute de la cellulase extraite du koji de son de blé ensemencé par un micro- organisme du groupe Aspergillus Noir, tel que l'Asper gillus uiger, et, d'autre part, obtenir l'enzyme avec une activité relativement élevée si on la compare à celle de l'enzyme préparée à partir d'une solution extraite par l'eau.
On doit noter qu'au Japon on désigne par koji p le nom d'un milieu de culture solide ou d'un milieu solide cultivé, sur lequel on fait croître un champignon, pour la production de ferments. En général, le koji est constitué par du riz, du blé, du soja, du son de blé, ou leurs mélanges humidifiés par de l'eau, stérilisés et ense mencés par les spores de champignons et encastrés sur des plateaux en bois ou en métal et la culture est pour suivie à une température et avec une teneur en humidité convenables.
Selon l'invention, le procédé pour obtenir une pré paration de cellulase décolorée de grande pureté et à activité accrue est caractérisé en ce qu'on ,ensemence un milieu de culture solide, humide, par une couche d'Aspergillus piger produisant de la cellulase, on incube ce dit milieu de culture et on soumet ce dit milieu incubé à un séchage pendant 2 à 4 heures à 55-65 C, on le soumet ensuite à une extraction par solvant et on sépare la cellulase de la solution ainsi obtenue.
Dans l'exemple de réalisation préféré, on emploie un micro-organisme producteur de cellulase et très actif, l'Aspergillus piger TPR-3801. Le koji de son de blé incubé est extrait après séchage avec de l'acide lactique, de l'acide acétique ou de l'acide chlorhydrique 1/10- 1/50M. La solution d'enzyme est obtenue à l'état très clair. La solution d'enzyme ainsi obtenue est traitée par un solvant organique hydrophile pour précipiter la pré paration d'enzyme.
Le traitement de séchage est nécessaire pour obte nir un résultat satisfaisant car il améliore l'effet de déco loration. En outre, si le traitement de séchage est réa lisé pendant plusieurs heures entre 55 et 650 C, on ne trouve qu'une réduction faible de l'activité enzymatique. Dans le cas où l'on extrait le son de blé cultivé avec de l'acide après le traitement de séchage, on trouve un résultat plus efficace lorsqu'on utilise de l'acide dilué que, lorsque l'on utilise de l'acide concentré.
Le séchage selon des caractéristiques de la présente invention est également indispensable dans le cas où l'extraction du koji incubé est effectuée avec de l'eau. L'activité sur la cellulose et le degré de décoloration de la solution de cellulase brute et de la préparation de cellulase obtenue par extraction avec de l'eau ou des acides après séchage sont indiqués dans le tableau.
EMI0002.0003
<I>Tableau <SEP> _.</I>
<tb> Activité <SEP> sur <SEP> la <SEP> cellulose <SEP> et <SEP> degré <SEP> de <SEP> décoloration <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> brute <SEP> de <SEP> cellulase <SEP> et <SEP> de <SEP> la <SEP> cellulase <SEP> obtenue <SEP> par
<tb> extraction <SEP> avec <SEP> l'eau <SEP> ou <SEP> avec <SEP> un <SEP> acide <SEP> après <SEP> séchage.
<tb> Activité <SEP> de <SEP> la
<tb> solution <SEP> brute <SEP> Rendement <SEP> Activité <SEP> de <SEP> la <SEP> Récupération <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<tb> Procédé <SEP> d'extraction <SEP> d'enzyme <SEP> en <SEP> cellulase <SEP> cellulase <SEP> de <SEP> l'activité <SEP> Couleur
<tb> Extraction <SEP> par <SEP> l'eau <SEP> sans <SEP> séchage
<tb> préalable <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 14 <SEP> 550 <SEP> u/100 <SEP> ml <SEP> 0,6890 <SEP> g/100 <SEP> ml <SEP> 9 <SEP> 580 <SEP> u/g <SEP> 45,4'% <SEP> noir
<tb> Extraction <SEP> par <SEP> l'eau <SEP> après <SEP> séchage <SEP> 13 <SEP> 810 <SEP> u/100 <SEP> ml <SEP> 0,5396 <SEP> g/100 <SEP> ml <SEP> 13 <SEP> 050 <SEP> u/g <SEP> 51,0% <SEP> blanc
<tb> cendré <SEP> .
<tb> Extraction <SEP> avec <SEP> l'acide <SEP> acétique
<tb> après <SEP> séchage. <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 14 <SEP> 070 <SEP> u/100 <SEP> ml <SEP> 0,5382 <SEP> g!100 <SEP> ml <SEP> 14 <SEP> 630 <SEP> u/g <SEP> <B>56,0%</B> <SEP> blanc
<tb> Extraction <SEP> avec <SEP> l'acide <SEP> lactique
<tb> après <SEP> séchage. <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 13 <SEP> 950 <SEP> u/100 <SEP> ml <SEP> 0,5058 <SEP> g/100 <SEP> ml <SEP> 14 <SEP> 290 <SEP> u/g <SEP> 51,8'% <SEP> blanc
<tb> Note. <SEP> - <SEP> <SEP> u/100 <SEP> mi<B> </B> <SEP> = <SEP> unité <SEP> par <SEP> 100 <SEP> millilitres
<tb> - <SEP> <SEP> u/g <SEP> <SEP> = <SEP> unité <SEP> par <SEP> gamme
<tb> A <SEP> titre <SEP> comparatif La quantité d'eau ou d'acide est 5 fois la quantité du son de blé en poids et la perte en quantité du son de blé cultivé provoquée par le séchage est réglée par l'augmentation du volume de l'extrait.
Après extraction pendant 3 heures à 301), le pH de l'extrait est réglé à 5,50 avant que l'éthanol ne soit ajouté à l'extrait de solution jusqu'à 70'% en poids de la concentration fi- nale à la température de 0o C.
Comme on l'a décrit ci-dessus, la solution enzyma tique brute qui est extraite par l'eau du koji cultivé, après avoir été séché, est plus el.aire que la solution extraite directement du koji par l'eau.
La préparation d'enzyme décolorée est obtenue sous forme très purifiée à partir de la solution d'enzyme de sorte que la récupération de l'activité enzymatique de la préparation d'enzyme obtenue selon des caractéristiques de la présente invention est plus grande que celle de l'enzyme obtenue par un procédé classique.
L'invention est décrite avec plus de détails dans les exemples suivants qui sont prévus pour illustrer l'inven tion.
<I>Exemple 1</I> Cinq parties en poids de son de blé et 1 partie en poids de paille menue sont mélangées avec 3 parties en poids d'eau et 90 kg du milieu solide ainsi préparé sont stérilisés pendant 30 mn à 1250 C pour former le koji. Après refroidissement à 400 C, 0,
5 % en poids de koji ensemencé par l'espèce dit Aspergillus piger TPR- 3801 est ensemencé dans le milieu stérilisé. Le son de blé ensemencé est placé dans un incubateur pendant 72 heures à 300 C.
Le koji obtenu est séché pendant 3 heures à 60o C = agitation et on lui ajoute<B>265 1 de</B> solution d'acide ue 1/50M dans laquelle le koji est alors immergé pendant 3 heures à 30,) C. Après quoi, il est filtré au moyen d'une centrifugeuse dite Sharples et 1701 de so lution brute d'enzyme sont ainsi obtenus.
Le pH de la solution d'enzyme est réglé à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique et de l'éthanol à 95 '% est lentement ajouté jusqu'à 70 % en poids de la concen- <RTI
ID="0002.0070"> tration finale à 00 C, après quoi, le tout est laissé à reposer toute la nuit.
Il se forme alors un précipité qui est centrifugé au moyen d'une centrifugeuse dite Sharples, rassemblé, puis lavé avec de l'éthanol à 99 % et séché à 300 C dans le vide. Par suite,
on obtient 850g de préparation d'enzyme blanche ayant 14 290 unités par gramme à partir de l'extrait quia une unité d'activité sur la cellu lose égale à 13 900 unités par 100 millilitres. La récu- pération de l'activité s'élève à 51,2 %.
<I>Exemple 2</I> Cinq parties de son de blé et 1 partie de menue paille sont mélangées à 3 parties d'eau pour former le koji. 90 kg du milieu solide ainsi préparé sont stérilisés pendant 30 mn à 1250 C et, après avoir été refroidi à 400 C, ils sont ensemencés par 0,
5 % en poids de koji ensemencé par de l'Aspergillus piger TPR-3081. Le blé ensemencé est placé dans un incubateur pendant 72 heures à 300 C.
Le koji ainsi obtenu est immergé après séchage en tièrement dans 2501 d'une solution d'acide acétique 1/50M pendant 3 heures à 30o C et filtré ; on obtient ainsi 1601 de la solution d'enzyme brute.
L'activité sur la cellulose de la solution d'enzyme est 10 650 unités/100 ml. Le processus se déroule comme dans l'exemple 1 et on obtient 1114 g d'enzyme blanche ayant une activité de 8360 unités/grammes. La- récupération de l'activité s'élève à 54,6 0/0.
<I>Exemple 3:</I> A un milieu cultivé de la même manière que dans l'exemple 1, on a ajouté après séchage 2501 de solution d'acide chlorhydrique 1/30M dans laquelle le milieu est immergé complètement pendant 3 heures à 300 C. Le rendement de la solution d'enzyme brut est 1601. L'ac tivité sur la cellulose de la solution d'enzyme est 10 890 unités/100 ml.
Le processus se déroule comme dans l'exemple 1 et on obtient- 1130 g de préparation d'enzyme blanche ayant une activité de 8250 unités/gramme. La récupé ration de l'activité s'élève à 53,4 0/0.
L' unité d'activité sur la cellulose des prépara tions d'enzyme obtenue dans les exemples 1, 2 et 3 est calculée comme suit L'activité qui réduit de moitié la viscosité de 25 ml de 0,8 ()/o en poids de carboxyméthylcellulose (substrat) pendant 1 mn à une température de 401, C est consi dérée comme étant égale à une unité. Le substrat est fabriqué en ajoutant une solution tampon d'acide acé tique 0,1 M à une solution aqueuse à 1,6 % en poids de carboxyméthylcellulose à volumes égaux.
En conséquence, lorsque A milligrammes d'un échantillon d'enzyme réduisent de moitié la visco sité du substrat indiqué ci-dessus pendant T seconde, l'activité sur la cellulose de cet enzym@e par gramme est calculée selon la formule suivante Unité d'activité sur la cellulose
EMI0003.0010
Claims (1)
- REVENDICATION Procédé pour obtenir une cellulase décolorée de grande pureté et à activité accrue sur la cellulose, ca- ractérisé en ce qu'on ensemence un milieu de culture solide, humide, par une souche d'Aspergillus niger pro duisant de la cellulase, on incube ce dit milieu de cul ture et on soumet ledit milieu incubé à un séchage pen dant 2 à 4 heures à 55-65 C, on le soumet ensuite à une extraction par solvant et on sépare la cellulase de la solution ainsi obtenue. SOUS-REVENDICATIONS 1.Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'extraction par solvant se fait au moyen d'eau. 2. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'extraction par solvant s'effectue à l'aide d'un acide dilué choisi dans le groupe se composant d'acide lac tique, d'acide acétique et d'acide chlorhydrique, l'acide ayant une concentration comprise entre 1/10 M et 1/ 50 M. 3. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le micro-organisme est l'Aspergillus piger TPR- 3801.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CH636764A CH444097A (fr) | 1964-05-15 | 1964-05-15 | Procédé d'obtention d'une cellulase |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CH444097A true CH444097A (fr) | 1967-09-30 |
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ID=4308465
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| CH636764A CH444097A (fr) | 1964-05-15 | 1964-05-15 | Procédé d'obtention d'une cellulase |
Country Status (1)
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|---|---|
| CH (1) | CH444097A (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997013862A1 (fr) * | 1995-10-13 | 1997-04-17 | Gist-Brocades B.V. | Cellulases fongiques |
-
1964
- 1964-05-15 CH CH636764A patent/CH444097A/fr unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997013862A1 (fr) * | 1995-10-13 | 1997-04-17 | Gist-Brocades B.V. | Cellulases fongiques |
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