Procédé de préparation de vaccins antigènes somatiques
La présente invention concerne la production de vaccins antigènes somatiques. Ces vaccins antigènes somatiques sont des préparations de bactéries inactivées lysées qui favorisent ou suscitent la formation d'anticorps lors de leur administration.
Un procédé typique de préparation de vaccins bac tériens consiste à cultiver des bactéries sur un milieu de culture convenable, à récolter la culture résultante, à étalonner ou normaliser la concentration des organismes et ensuite à inactiver ou à détruire les bactéries par la chaleur, par un antiseptique ou par ces deux moyens à la fois.
Des vaccins bactériens peuvent être préparés à partir de souches de bactéries de laboratoire ou de bactéries provenant directement du corps animal ou humain recevant le vaccin. Dans ce dernier cas on les désigne sous le nom de vaccins autogènes. Des vaccins renfermant plusieurs souches de bactéries sont appelés vaccins poly- valents. Des vaccins renfermant des bactéries appartenant à deux ou plusieurs espèces sont dits vaccins mixtes.
On peut également préparer des vaccins à partir de fractions de bactéries ou d'exsudats bactériens. Les toxoïdes de la diphtérie et du tétanos sont des exemples de ces derniers. Dans le cas de la présente invention, les bactéries sont totalement lysées de sorte que tous les antigènes bactériens internes et externes sont présents sous une forme efficace. Ce type de vaccin peut être appelé vaccin antigène somatique. Les vaccins préparés par la présente invention peuvent être du type monovalent, polyvalent ou mixte.
La titulaire au cours de recherches antérieures, avait déjà mis au point un procédé de préparation de vaccins antigènes somatiques dans lequel on opère la lyse de cellules mortes de bactéries pathogènes en les soumettant à l'action d'un enzyme protéolytique tel que la Dornase (désoxyribonucléase) qui provoque la lyse des cellules sans destruction du pouvoir antigénique.
L'invention montre que la lyse des cellules peut être grandement facilitée si l'on cultive les cellules dans un milieu renfermant un constituant à base d'amino acides ou des constituants qui favorisent le développement des parois de cellules affaiblies. Il en résulte que les bactéries affaiblies sont très facilement lycées une fois qu'elles ont été inactivées par un antiseptique ou un bactéricide approprié tel que le a Thimerosal > . Le mot Thimero- sal est la dénomination commerciale de l'éthyl mercurithiosalicylate de sodium et on le préfère pour le moment comme antiseptique ou agent de destruction ;
on peut toutefois en utiliser d'autres, tels que le thymocrésol, le chlorure de benzalconium et le phénol. Dans la présente invention on a utilisé le Thimerosal > vendu par la Société Eli Lilly and Company sous la marque déposée Merthiolate .
L'utilisation de glycine pour la rupture des cellules de bactéries a déjà été décrite par E. S. Maculla et P. B.
Cowles dans Science, Vol. 107, p. 376 (1948). Dans cette publication la glycine est ajoutée, à des concentrations relativement élevées, à la masse des cellules après la récolte. L'examen microscopique révèle toutefois que la rupture est minime et les extraits obtenus sont probablement dus à l'élution de la substance intracellulaire dans la solution de glycine. Dans un mode de réalisation pré féré de la présente invention, la glycine est ajoutée au départ au milieu de culture de manière que les bactéries résultantes présentent des parois de cellules particulièrement sensibles à la lyse. En effet, on a constaté que dans certains cas ces cellules subissaient une autolyse suffisante pour éviter ainsi des traitements secondaires.
Des essais de préparation de vaccins antigènes somatiques par la technique de Maculla et Cowles n'ont pas été fructueux. A titre de comparaison, on a réalisé une série d'essais avec certains organismes staphylococciques en ajoutant de la glycine à des cultures vivantes à des concentrations de 0, 5 à 3, 5 %. On a effectué un autre essai avec des organismes de la typhoïde et, dans ce cas, on a utilisé une concentration de 7, 5 % de glycine.
Aucune lyse des cellules n'a pu être mise en évidence au cours de ces essais et aucune rupture véritable des cellules n'a pu être enregistrée bien que l'on estime que la concentration d'azote protéinique a augmenté dans le liquide surnageant. Des contrôles d'efficacité ultérieurs sur des animaux expérimentaux ont révélé que ni les vaccins de staphylocoques ni les vaccins de la typhoïde préparés de cette manière ne présentaient une activité immunisante sensible.
La présente invention a donc pour objet un procédé perfectionné pour la production de vaccins antigènes somatiques dans lequel on inactive et lyse une culture de bactéries, les bactéries étant cultivées sur un milieu de culture renfermant un ou plusieurs des aminoacides utilisés ou associés à la synthèse de structures cellulaires par lesdites bactéries en une quantité suffisante pour donner lieu à la formation de bactéries plus sensibles à la lyse.
Un important mode de réalisation de la présente invention consiste à préparer un vaccin de mastite pouvant être utilisé pour l'immunisation des vaches contre la mastite. La mastite ou mammite est habituellement provoquée par des organismes staphylococciques ou streptococciques ou par un mélange des deux types. La mastite peut également être provoquée, en partie au moins, par d'autres organismes tels que l'Escherichia coli. Le vaccin de mastite de la présente invention peut par conséquent être un vaccin staphylococcique, un vaccin streptococcique, un vaccin streptococcique et staphylococcique mixte ou l'un de ces trois vaccins auquel a été ajouté le vaccin E. coli antigène somatique.
On prépare le vaccin E. coli antigène somatique de la présente invention en réalisant, en combinaison, une croissance initiale dans de la glycine et une lyse consécutive activée par un enzyme protéolytique approprié, tel que par exemple la Pronase) > (marque déposée). Un autre mode de réalisation de l'invention consiste à préparer un vaccin antigène somatique avec le Clostridium. Par exemple, le vaccin de Clostridium chauvoei pour le charbon du bétail a été préparé suivant une méthode identique à celle du vaccin E. coli et essayé avec succès.
Selon une caractéristique complémentaire de la présente invention, un procédé de préparation de vaccins antigènes somatiques de bactéries telles que Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria et Clostridium comprend les stades de croissance des bactéries dans un milieu renfermant de la glycine, à une concentration favorisant la lyse de 0, 01-5 % environ en poids.
Selon une autre caractéristique de l'invention, dans un procédé de préparation d'un vaccin antigène somatique de bactéries telles que Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria et Clostridium, la glycine se trouve dans le milieu de culture à un taux suffisant pour assurer la formation de bactéries possédant des parois de cellules affaiblies, ce qui facilite la lyse de telles cellules une fois que les bactéries ont été inactivées par des antiseptiques appropriés. Le milieu de culture devra de préférence contenir entre environ 0, 1 et environ 5 % en poids de glycine.
Les vaccins antigènes somatiques ont été préparés et contrôlés conformément à l'invention présentement dé- crite. On donne ci-après certains exemples de préparation typiques et des contrôles d'essai qui ont été effectués sur ces préparations. Ces exemples et contrôles sont purement illustratifs.
Les souches bactériennes mentionnées dans le présent exposé sont toutes déposées à la Culture Collection of the Laboratory of Hygiène. Department National Health and Welfare) > , Ottawa. Canada, sous les numéros et lettres de référence indiqués.
Sans que des remarques théoriques puissent être considérées comme susceptibles de limiter l'invention. on pense que le degré élevé de pouvoir antigénique résul- tant de la mise en oeuvre de la présente invention est dû à la rétention dans le vaccin de ces substances antigènes qui semblent être responsables de l'immunité. Les vaccins sont en général relativement limpides avec absence presque totale de dépôt et de cellules entières.
On peut faire varier dans de larges limites la concentration optimale en glycine, en fonction de l'organisme.
Pour la plupart des organismes examinés la concentration optimale se situe entre environ 0. 1 et 5 % en poids.
D'une manière générale on a observé que plus le taux d'aminoacide pouvant être utilisé sans influer défavora- blement la croissance est élevé, plus la lyse est rapide.
Bien que le milieu utilisé pour la préparation des vaccins de quelques-uns des exemples qui suivent soit un milieu de Frantz modifié [Watson & Scherp, J. Immunol. 81, p. 331 (1958)] il va sans dire que, dans certaines conditions, on pourra préférer d'autres milieux.
Solution A :
Acides Casamino (Tech) DIFCO 10 g
Cystine (solution à 1, 2'Vo dans du HCI
0, 1 N) 1 ml
KC1 0, 09 g
Na2HPO4. 12H, O 6, 5 g
Rouge Phénol solution à 0, zoo 8, 0 ml
Eau distillée q. s. p. 1000ml
Solution B :
MgSO4. 7HaO 2, 4 g
Glucose 20 g
Eau distillée q. s. p. 1000ml
Les acides Casamino sont un hydrolysat de caséine renfermant une substance à bas poids moléculaire. Chaque solution a été ajustée à PH 7, 4 avec NaOH et mise à l'autoclave pendant 15 mn à 1210 C. Normalement. lorsqu'on utilise le milieu de Frantz la solution B est ajoutée aseptiquement à la solution A à raison de 25 ml/l pour les utilisations générales.
L'expérience a montré que certaines espèces de bactéries se comportent mieux lorsqu'on fait varier cette proportion ; on a par exemple trouvé qu'il est préférable d'utiliser les proportions suivantes pour les divers organismes ci-après :
Neisseria-50 ml de B pour 1 litre de A
Staphylococcus-15 ml de B pour 1 litre de A
Streptococcus-40 ml de B pour 1 litre de A
Exemple 1 :
Priparatioti d'rtn vaccita mening=ococciqrte
Les cultures de germes ont été transférées directement à partir d'ampoules lyophilisées dans des flacons renfermant 250 ml du milieu de 1'exemple 1 et mis à l'incubation pendant une nuit à 370 C (environ 18 heures) sur un agitateur à secousses réglé à 40 t/mn. 20 ml provenant desdits flacons ont été transplantés dans des flacons de 1 litre contenant 500 ml du milieu de Frantz modifié renfermant 1 % en poids/volume de glycine. La glycine peut être ajoutée à la solution A au moment de la fabrication ou de façon aseptique au mélange avant l'ensemencement. Les flacons ensemencés ont été mis à incuber de la même manière que les flacons de germe sur un agitateur à secousses à raison de 40 t/mn pendant 18 à 20 heures.
Après l'incubation, les flacons ont été retirés de l'incubateur et une solution 1 : 100 de < Mer- thiolate > a été ajoutée à chaque flacon de 500 ml en vue d'une concentration finale en Merthiolate de 1 : 10000. On a ensuite laissé reposer les flacons pendant une semaine à la température ordinaire. Pendant ce temps, le vaccin qui, au départ, donne une valeur au néphélomètre équivalant à 3 à l'échelle Mc Farland, s'était complètement clarifié et indiquait zéro. Les vaccins ont été ensuite contrôlés quant à leur stérilité, leur innocuité, leur toxicité, leur action pyrogénique, et leur efficacité (voir exemple 3).
Meningococcus est le nom commun du Neisseria meningitidis de la famille Neisseriaceae. Pour cet exemple, on a utilisé les souches méningococciques suivantes :
M1027 (S. Branham)
Zl (Lapeyssonie) M129 (Lapeyssonie)
La méthode d'essai pour le vaccin méningococcique consistait à immuniser 60 souris, en utilisant 20 souris pour chacune des 3 dilutions séparées comme indiqué dans le tableau 1. Vingt souris ont été conservées comme témoins. Deux à trois semaines plus tard, les animaux ont été traités par une souche méningococcique vivante virulente (Neisseria meningitidis) et les animaux mis en observation pendant une semaine. Les résultats d'un essai typique sont consignés dans le tableau 1.
La souche utilisée pour cette expérience était la souche Zl. On a utilisé une culture cultivée sur milieu de
Frantz pendant 4 heures sur agitateur à secousses et portée à l'incubation à 370 C. La dose à injecter a été mise en suspension dans de la mucine à 4 % et a été administrée par voie intrapéritonéale à raison de 1, 0ml par souris.
Tableau 1
Tués
Dilution 24 h 48 h 72 h 144 h Survivants Vaccins de Meningo non dilué 0/20 2/20 2/20 2/20 18/20
PSA ? 1 1-5 3/20 6/20 6/20 6/20 14/20
Lots 2 et 3 réunis 1-10 6/20 7/20 9/20 10/20 10/20 Vaccins de Meningo non dilué 2/18 2/18 2/18 2/18 16/18
PSA ? 1 1-5 0/20 0/20 0/20 0/20 20/20
Lots 4 et 5 réunis 1-10 5/20 11/20 11/20 11/20 9/20
Témoins 15/20 18/20 18/20 18/20 2/20
Les résultats du tableau 1 indiquent que ce vaccin antigène somatique a conféré une bonne protection aux souris.
Exemple 2 :
Preparation de vaccins staphylococciques
Des vaccins staphylococciques ont été essentiellement préparés comme dans 1'exemple 1, mais on a trouvé que dif férentes concentrations de glycine étaient nécessaires pour une lyse optimale des différentes souches comme indiqué ci-après :
/o de souches
Groupe de phage No de souche Type de phage /0 de glycine dans le vaccin humain
I 584763 (80/81) 3, 5 30
II 596535 (3A/3B/3C) 3, 5 30
III 596510 7/47/53/54/75 + 3, 5 30
IV 596297 42D 4, 5 5
M ? 6032 KS6 3, 5 5
On a constaté que les vaccins staphylococciques conservaient leur efficacité après séjour à l'autoclave à 1200 C et sous 1, 4 kg/cm2 pendant 15 minutes.
Exemple 3
Préparation d'un vaccin de mastite
Ce vaccin qui est une combinaison d'organismes staphylococciques et streptococciques est préparé de façon différente en ce sens que les organismes ont été cultivés sur un milieu solide plutôt que dans un fluide. Les germes de souches ont d'abord été cultivés sur agar nutritif à 2 % pendant environ 18 heures à 37 C et la culture a été extraite par lavage soit avec de l'eau distillée stérile soit avec une solution saline à 0, 5 %. La lyse est plus longue avec la solution saline. Les organismes récoltés ont une concentration d'environ 3 X 101 organismes par ml et fournissent une valeur de 10 au néphélometre de Me Farland.
Il est bien évident que des cellules peuvent être cultivées en bouillon nutritif plutôt que sur agar solide, auquel cas la concentration des cellules peut être de l'ordre d'environ 1 X lot-1 X 109 par ml. Les cellules étaient presque complètement lysées entre les 7 et 10 jours qui ont suivi l'addition du < (Merthiolate) jusqu'à une concentration finale de 1 : 10000. La concentration de glycine optimale pour la réalisation de la lyse varie avec l'organisme.
Selon l'expérience acquise les concentrations en glycine les plus appropriées pour diverses souches cultivées sur de l'agar sont les suivantes :
"/o de souches
dans le vaccin
de mastite
Souche de Staphylocoque 584763
3, 0 lo glycine 15
Souche de Staphylocoque 596535
3, 0 O/o glycine 10
Souche de Staphylocoque 596510
3, 0 /0 glycine 15
Souche de Staphylocoque 6032
3, 5"/o glycine 20
Souche de Staphylocoque 596297
3, 5% glycine 10
Souche sur chien de Staphyloco
que-1, 5% glycine 10
Souche de Streptocoque A 36
(1118)-1, 0 /0 glycine 10
Souche de Streptocoque C (1628)
1. 5"/o glycine 10
Si,
d'autre part, on supprime les organismes streptococciques A36 (1118) et 30C (1628) une combinaison convenable serait :
"/o de souches
dans le vaccin
de mastite
Souche 584763-3, 0 O/o glycine 15
596535-3, 0 /0 glycine 15
) s 596510-3, 0 /0 glycine 25
6032-3, 5 O/o glycine 30
596297-3, 5 le glycine 10
Souche sur chien de Staphyloco
que-1,
5 O/o glycine 5
Exemple 4
Preparation d'un vaccin streptococcique
Souches humaines utilisées Type A 36 1118
Type A 19 616
Type A 12 602
Des ampoules lyophilisées ont servi à ensemencer des flacons de bouillon à base d'infusion de coeur et ont été cultivées à 37 C pendant une nuit. 10 ml de culture ont été ajoutés à chacun des lots de 500 ml de milieu de
Frantz renfermant 2 % de glycine et ils ont été mis à incuber pendant 20 heures à 37 C sur un agitateur à secousses. On a procédé au dénombrement des organismes vivants et ajouté suffisamment de solution mère de Merthiolate 1 : 100 pour avoir une concentration finale de 1 : 10000.
Les flacons ont été maintenus à la température ambiante jusqu'à achèvement de la lyse, ce qui a nécessité 7 à 10 jours. Les contrôles de stérilité, de toxicité, de sécurité et d'efficacité ont été effectués après que les organismes eurent été complètement lyses.
Les tableaux suivants 2 et 3 sont des exemples de résultats obtenus au cours d'essais réalisés sur des lapins avec du vaccin de mastite préparé à la fois à partir d'organismes staphylococciques et streptococciques. On a utilisé quatre lapins par lot individuel. Chaque lapin a reçu 1 ml de vaccin par voie intramusculaire et 0, 2 ml par voie intradermique dans chacun des 5 points sur le dos du lapin. Deux semaines plus tard, deux des animaux d'essai ont reçu par voie intradermique une dose de 0, 1 ml de 15 souches différentes de staphylocoques et les deux autres ont reçu par voie intradermique une dose de 0, 1 ml de 15 souches streptococciques différentes. Quatre lapins témoins (non vaccinés) ont reçu la même dose des mêmes souches en même temps et par la même voie que les animaux vaccinés. Deux ont reçu des staphylocoques et les deux autres des streptocoques.
Les lapins ont été mis en observation pendant 2 à 4 jours. Au bout de cette période. les lapins témoins présentaient une grande surface nécrosée à l'endroit de chaque injection alors que les points d'injection des lapins immunisés étaient clairs ou relativement clairs.
Dans les tableaux suivants, on a indiqué les résultats des dimensions des zones obtenues dans un des présents essais. Les dimensions sont exprimée en millimètres.
x indique la présence de pus et de nécrose.
Tableau 2
Lapins vaccinés avec un vaccin staph. (humain) et ayant reçu 15 souches staphylococciques, à une dilution 1 : 75, à partir d'ampoules lyophilisées. 0, 1 ml par point.
Lapins témoins Staph. PSA vaccin lot 7-3 (séché)
Lapin N > 4 Lapin N 3 Lapin N 5 Lapin N 6
Staphylocoque Staphylocoque Staphylocoque Staphylocoque 20x 10 20x 25x 15x 20x 0 0 0 0 0 0 15x 15x 25x20x 20x 25x050005 15x 10 25x 15 10 25x 0 0 0 5 0 0 20x 20x 25x 15x 15 25x 5 0 5 5 5 5 25x 25x 20x 25x 25x 15x 10 10 0 5 5 0
Tableau 3
Des lapins vaccinés avec du vaccin de mastite et auxquels ont été injectées par voie intradermique 15 souches staphylococciques ou 15 souches streptococciques.
Lapins vaccinés
avec du vaccin de mastite
Lapins témoins Vaccin No 4-3G
Staphylocoque Streptocoque Staphylocoque Streptocoque
lOx 25x 20x 20x 15 10 0 0 10 20x 0 5
25x 30x 0 30x 25x 20 10 10 5 0 10 5
5 50x 10 10 15 10 10 5 5 0 0 0
35x 20x 40x 10 20x lOx 10 0 5 0 0 0 40x 30x 30x 25x 20x 15 5 5 5 0 0 0
Observé une rougeur Pas de rougeur
Injection de 15 souches de Staphylocoques, dilution 1 : 75 0, 1 ml par point.
Injection de Streptocoques, dilution 1 : 50 0, 1 ml par point.
Il est évident que l'on obtient un degré de protection élevé avec les vaccins de la présente invention. On a constaté que les vaccins antigènes somatiques préparés à l'aide du procédé de la présente invention sont plus efficaces que les vaccins conventionnels correspondants entièrement bactériens et provoquent moins de réactions secondaires chez l'homme que les vaccins conventionnels entièrement bactériens.
La méthode d'essai pour le vaccin méningococcique consistait à immuniser 60 souris, en utilisant 20 souris pour chacune des 3 dilutions séparées comme indiqué dans le tableau 1. Vingt souris ont été conservées comme témoins. Deux à trois semaines plus tard, les animaux ont été traités par une souche méningococcique vivante virulente (Neisseria meningitidis) et les animaux mis en observation pendant une semaine. Les résultats d'un essai typique sont consignés dans le tableau 1.
Exemple 5
Préparation d'un vaccin streptococcique
Souches humaines utilisées Type A 36 1118
Type A 19 616
Type A 12 602
Des ampoules lyophilisées ont servi à ensemencer des flacons de bouillon à base d'infusion de coeur et ont été cultivées à 37O C pendant une nuit. 10 ml de culture ont été ajoutés à chacun des lots de 500ml de milieu de
Frantz renfermant 2 % de glycine et ils ont été mis à incuber pendant 20 heures à 37 C sur un agitateur à secousses. On a procédé au dénombrement des organismes vivants et ajouté suffisamment de solution mère de (Merthiolate)) I : 100 pour avoir une concentration finale de 1 : 10000. Les flacons ont été maintenus à la température ambiante jusqu'à achèvement de la lyse, ce qui a nécessité 7 à 10 jours.
Les contrôles de stérilité, de toxicité, de sécurité et d'efficacité ont été effectués après que les organismes eurent été complètement lyses.
Exemple 6
Des souches d'Escherichia coli (E. coli) ont été cultivées sur un milieu de Frantz modifié comme dans 1'exemple 1. On a ajouté au milieu suffisamment de glycine pour avoir une concentration de 1, 5 % de poids/volume. L'incubation a été effectuée à 37 C pendant 18 à 24 heures sur un agitateur à secousses. On a ensuite ajouté du Merthiolate > pour avoir une concentration finale de 1 : 10000. Les cultures ont été ensuite remises à l'incubation sur un agitateur à secousses pendant 18 à 24 heures. Des contrôles de viabilité ont été effectués à ce stade pour s'assurer de l'inactivation de toutes les bactéries.
Pendant qu'elles se trouvaient encore sur l'agitateur à secousses on a ajouté aux flacons en une ou deux fois un enzyme protéolytique provenant du
Streptomyces griseus. Entre les additions on a ajouté avec agitation pendant 24 heures un total de 10 microgrammes de l'enzyme. On a poursuivi l'agitation pendant 1 à 3 jours jusqu'à achèvement de la lyse. On a recueilli un vaccin relativement limpide qui a été reconnu efficace pour la protection des souris contre le traitement par des souches d'E. coli homologues de la souche du vaccin. Dans le tableau 4, on donne un exemple d'un essai typique. Ce vaccin peut être ajouté en faible proportion à un vaccin de mastite étant donné que l'E. coli peut, dans certains cas, être responsable de la mastite bovine.
Il peut également trouver une utilisation chez l'homme pour la lutte contre la diarrhée infantile provoquée par FE. coli.
Résultats Tableau 4
Souche d'Escherichia coli Résultats de l'injection
Souche ? Vaccin Injection Nombre de souris Survivants
A 634760 0-26 0-26 10 9
Témoin-0-26 10 0
B 634760 0-26 0-26 9 7
Témoin-0-26 10 0 Exerttple 7
PrÚparation du vaccin du charbon
Germe
Cinq souches de Clostridium chauvoei à savoir u WHW . F) > . Deal, Oklahoma et Tosper ont été cultivées en bouillon de foie au thioglycolate pendant 24 heures à 37O C. Ces cultures de germe ont été ensuite utilisées pour l'ensemencement du milieu de production à raison de 1. 0 ml par 100 ml de milieu.
La composition du milieu de production est la suivante :
IngrÚdients % en poids/volume Tryptone 4, 0
Chlorure de sodium 0, 5
Extrait de levure 0, 5 (Amber X)
L-Cystéine 0, 05
Glycine 0, 25-0, 75 (varie selon la souche) MgSOX. 7HaO 0,
Dextrose 0, 5 (ajouté de façon aseptique à partir
d'une solution mère stérile à 50 il0).
Le pH a été ajusté à 7. 8 avec NaOH5N avant mise à l'autoclave pendant l5 mn à 121 < C en vue de la stérilisation.
Référence J. Comp. Path. 67. 157 (1957) Prodluction
Les cultures de production ont été cultivées pendant 24 heures à 37 C et ensuite inactivées à l'aide de formaline a 0. 5 %. On a ajouté alors de la o Pronase à raison de 5. 0 mcg/ml Ó partir d'une solution mère renfermant 0. 25 mg/ml. Après addition de l'enzyme. le pH a été ajusté à 0. 8L avec NaOH5N. On a activé pendant une heure à 45"C dans un bain d'eau et laissé à la température ambiante pendant 7 à 10 jours, on a examiné journellement les variations de pH et ajusté au besoin. et on a suivi la progression de la lyse.
Lorsque la lyse a été totale. le lysat a été contrôlé de la manière habituelle quant à sa stérilité. sa sécurité et son efficacité.
Contrôle-Efficacité
Cinq cobayes ont été vaccinés par voie intramusculaire avec 1, 0 ml de vaccin de Clostridium chauvoei préparé à partir de cellules entièrement lycées comme décrit plus haut. Dix jours plus tard. on a administré par la meme voie une injection de rappel de I ml. Dix jours après l'injection de rappel. ces cinq cobayes ont reçu par voie intramusculaire, en même temps que cinq cobayes témoins non vaccinés, 0, 5 ml d'une suspension titrée de spore de Clostridium chauvoei renfermant 10 M. L. D. dans 0. 5 ml de suspension. Quatre (80 %) des cinq cobayes vaccinés ont survécu. Tous les cinq cobayes non vaccinés sont morts.
Exemple 8 Lyse avec d'arrtres aminoacides
Alors que la glycine est un aminoacide préféré, d'autres aminoacides peuvent accélérer la lyse de cellules bactériennes de la même manière pour fournir des vaccins utiles, comme l'indique le tableau 5.
Tableau 5
Nombre d'organismes
Souche Staph. Souche Staph.
Aminoacide Concentration"/o N"584763 N"596297 Lyse L.-Arginine 1. 7, 107 8, 5-10+
Acide D. L-Aspartique 2, 5 1 107 3 107
L-Histidine 1, 5 1 X 10 8 X 10-
D. L-Valine 3, 0 5 Y 108-10+
L-proline 3, 0 2 X106X10-
Glycine (témoin) 3, 5 2 L 107 12 vx lOi
D'autres souches de bactéries ayant été utilisées pour la préparation de vaccins utiles sont les suivantes :
Staphylococcus 1645, 591714, 598022, 597497, 595354,
598074, 6003.
Streptococcus 1510T35, 589T1, 601T11, 618T22,
599T9.
Meningococcus D2 (Lapeyssonnie), Ml 11, N1 (Lapeys
sonnie), 962 (Brannon), M132 (Lapeys sonnie).
Des bactéries présentant un intérêt particulier sont celles des familles : Micrococcaceae, Lactobacteriaceae.
Bacillaceae et Enterobacteriaceae. Dans ces familles on trouve les espèces Neisseria. Staphylococcus. Streptococcus, Escherichia et Clostridium.
Process for the preparation of somatic antigen vaccines
The present invention relates to the production of somatic antigen vaccines. These somatic antigen vaccines are preparations of lysed inactivated bacteria which promote or induce the formation of antibodies upon administration.
A typical method of preparing bac terial vaccines consists of growing bacteria on a suitable culture medium, harvesting the resulting culture, calibrating or normalizing the concentration of the organisms, and then inactivating or destroying the bacteria by heat, by heat. antiseptic or by both means.
Bacterial vaccines can be prepared from strains of laboratory bacteria or bacteria derived directly from the animal or human body receiving the vaccine. In the latter case, they are referred to as autogenous vaccines. Vaccines containing more than one strain of bacteria are called multipurpose vaccines. Vaccines containing bacteria belonging to two or more species are called mixed vaccines.
Vaccines can also be prepared from bacterial fractions or bacterial exudates. Examples of the latter are diphtheria and tetanus toxoids. In the case of the present invention, the bacteria are completely lysed so that all internal and external bacterial antigens are present in an effective form. This type of vaccine may be called a somatic antigen vaccine. The vaccines prepared by the present invention can be of the monovalent, polyvalent or mixed type.
During previous research, the holder had already developed a process for the preparation of somatic antigen vaccines in which the lysis of dead cells of pathogenic bacteria is carried out by subjecting them to the action of a proteolytic enzyme such as Dornase ( deoxyribonuclease) which causes cell lysis without destruction of antigenicity.
The invention shows that the lysis of cells can be greatly facilitated if the cells are cultured in a medium containing an amino acid component or components which promote the development of weakened cell walls. As a result, the weakened bacteria are very easily leached once they have been inactivated by an appropriate antiseptic or bactericide such as α Thimerosal>. The word Thimerosal is the trade name for sodium ethyl mercurithiosalicylate and is presently preferred as an antiseptic or destroying agent;
however, others can be used, such as thymocresol, benzalkonium chloride and phenol. In the present invention, use was made of Thimerosal> sold by the company Eli Lilly and Company under the registered trademark Merthiolate.
The use of glycine for the disruption of bacterial cells has already been described by E. S. Maculla and P. B.
Cowles in Science, Vol. 107, p. 376 (1948). In this publication glycine is added, in relatively high concentrations, to the cell mass after harvest. Microscopic examination, however, reveals that the rupture is minimal and the extracts obtained are probably due to the elution of the intracellular substance in the glycine solution. In a preferred embodiment of the present invention, the glycine is added initially to the culture medium so that the resulting bacteria exhibit cell walls particularly sensitive to lysis. In fact, it has been observed that in certain cases these cells undergo sufficient autolysis to thus avoid secondary treatments.
Attempts to prepare somatic antigen vaccines by the technique of Maculla and Cowles have not been successful. For comparison, a series of tests with some staphylococcal organisms were performed by adding glycine to live cultures at concentrations of 0.5 to 3.5%. Another test was performed with typhoid organisms and in this case a 7.5% concentration of glycine was used.
No cell lysis could be demonstrated during these tests and no true cell disruption could be recorded although it is believed that the protein nitrogen concentration in the supernatant liquid was believed to have increased. Subsequent efficacy checks in experimental animals revealed that neither the staphylococcus vaccines nor the typhoid vaccines prepared in this way showed substantial immunizing activity.
The present invention therefore relates to an improved process for the production of somatic antigen vaccines in which a culture of bacteria is inactivated and lysed, the bacteria being cultured on a culture medium containing one or more of the amino acids used or associated with the synthesis of cellular structures by said bacteria in an amount sufficient to give rise to the formation of bacteria more sensitive to lysis.
An important embodiment of the present invention is to prepare a mastitis vaccine which can be used for the immunization of cows against mastitis. Mastitis or mastitis is usually caused by staphylococcal or streptococcal organisms or by a mixture of the two types. Mastitis can also be caused, at least in part, by other organisms such as Escherichia coli. The mastitis vaccine of the present invention may therefore be a staphylococcal vaccine, a streptococcal vaccine, a mixed streptococcal and staphylococcal vaccine, or one of these three vaccines to which the E. coli somatic antigen vaccine has been added.
The somatic antigen E. coli vaccine of the present invention is prepared by performing, in combination, initial growth in glycine and subsequent lysis activated by a suitable proteolytic enzyme, such as, for example, Pronase)> (registered trademark). Another embodiment of the invention is to prepare a somatic antigen vaccine with Clostridium. For example, the Clostridium chauvoei vaccine for anthrax in cattle has been prepared by the same method as the E. coli vaccine and tested with success.
According to a complementary characteristic of the present invention, a process for preparing somatic antigen vaccines of bacteria such as Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria and Clostridium comprises the stages of growth of bacteria in a medium containing glycine, at a concentration which promotes lysis of About 0.01-5% by weight.
According to another characteristic of the invention, in a process for preparing a somatic antigen vaccine of bacteria such as Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria and Clostridium, the glycine is found in the culture medium at a level sufficient to ensure the formation of bacteria with weakened cell walls, which facilitates lysis of such cells after the bacteria have been inactivated by appropriate antiseptics. The culture medium should preferably contain between about 0.1 and about 5% by weight of glycine.
Somatic antigen vaccines have been prepared and tested in accordance with the present invention. Some typical preparation examples and test controls which have been carried out on these preparations are given below. These examples and controls are purely illustrative.
The bacterial strains mentioned in this presentation are all deposited in the Culture Collection of the Laboratory of Hygiene. Department National Health and Welfare)>, Ottawa. Canada, under the reference numbers and letters indicated.
Without theoretical remarks being able to be considered as likely to limit the invention. The high degree of antigenicity resulting from the practice of the present invention is believed to be due to the retention in the vaccine of those antigenic substances which appear to be responsible for immunity. Vaccines are generally relatively clear with almost total absence of deposit and whole cells.
The optimal glycine concentration can be varied within wide limits, depending on the organism.
For most of the organisms examined the optimum concentration is between about 0.1 and 5% by weight.
In general it has been observed that the higher the level of amino acid which can be used without adversely affecting growth, the faster the lysis.
Although the medium used for the preparation of the vaccines of some of the examples which follow is a modified Frantz medium [Watson & Scherp, J. Immunol. 81, p. 331 (1958)] it goes without saying that, under certain conditions, other media may be preferred.
Solution A:
Casamino Acids (Tech) DIFCO 10 g
Cystine (1, 2'Vo solution in HCI
0.1 N) 1 ml
KC1 0.09 g
Na2HPO4. 12H, O 6.5g
Red Phenol solution 0, zoo 8, 0 ml
Distilled water q. s. p. 1000ml
Solution B:
MgSO4. 7HaO 2, 4 g
Glucose 20 g
Distilled water q. s. p. 1000ml
Casamino acids are a casein hydrolyzate containing a low molecular weight substance. Each solution was adjusted to PH 7.4 with NaOH and autoclaved for 15 min at 1210 C. Normally. when Frantz's medium is used, solution B is added aseptically to solution A at a rate of 25 ml / l for general uses.
Experience has shown that certain species of bacteria behave better when this proportion is varied; for example, it has been found that it is preferable to use the following proportions for the various organisms below:
Neisseria-50 ml of B for 1 liter of A
Staphylococcus-15 ml of B for 1 liter of A
Streptococcus - 40 ml of B for 1 liter of A
Example 1:
Priparatioti d'rtn vaccita mening = ococciqrte
The seed cultures were transferred directly from lyophilized ampoules to flasks containing 250 ml of the medium of Example 1 and incubated overnight at 370 C (about 18 hours) on a shaker shaker set. at 40 rpm. 20 ml from said vials were transplanted into 1 liter vials containing 500 ml of modified Frantz medium containing 1% w / v glycine. Glycine can be added to Solution A at the time of manufacture or aseptically to the mixture prior to seeding. The seeded vials were incubated in the same manner as the germ vials on a shaker at 40 rpm for 18-20 hours.
After the incubation, the vials were removed from the incubator and a 1: 100 solution of <Methiolate> was added to each 500 ml vial for a final Merthiolate concentration of 1: 10,000. then left the vials to stand for a week at room temperature. During this time, the vaccine, which initially gave a nephelometer value equivalent to 3 on the Mc Farland scale, had completely clarified and indicated zero. The vaccines were then checked for their sterility, their harmlessness, their toxicity, their pyrogenic action, and their effectiveness (see example 3).
Meningococcus is the common name for Neisseria meningitidis of the Neisseriaceae family. For this example, the following meningococcal strains were used:
M1027 (S. Branham)
Zl (Lapeyssonie) M129 (Lapeyssonie)
The test method for the meningococcal vaccine was to immunize 60 mice, using 20 mice for each of the 3 separate dilutions as shown in Table 1. Twenty mice were kept as controls. Two to three weeks later, the animals were treated with a live virulent meningococcal strain (Neisseria meningitidis) and the animals observed for one week. The results of a typical test are reported in Table 1.
The strain used for this experiment was the Zl strain. A culture grown on medium was used.
Frantz for 4 hours on a shaker and brought to incubation at 370 C. The dose to be injected was suspended in 4% mucin and was administered intraperitoneally at a rate of 1.0 ml per mouse.
Table 1
You are
Dilution 24 h 48 h 72 h 144 h Survivors Undiluted Meningo vaccines 0/20 2/20 2/20 2/20 18/20
PSA? 1 1-5 3/20 6/20 6/20 6/20 14/20
Lots 2 and 3 combined 1-10 6/20 7/20 9/20 10/20 10/20 Undiluted Meningo vaccines 2/18 2/18 2/18 2/18 16/18
PSA? 1 1-5 0/20 0/20 0/20 0/20 20/20
Lots 4 and 5 together 1-10 5/20 11/20 11/20 11/20 9/20
Witnesses 15/20 18/20 18/20 18/20 2/20
The results in Table 1 indicate that this somatic antigen vaccine conferred good protection on mice.
Example 2:
Preparation of staphylococcal vaccines
Staphylococcal vaccines were prepared essentially as in Example 1, but it was found that different concentrations of glycine were required for optimal lysis of the different strains as indicated below:
/ o strains
Phage group Strain number Phage type / 0 of glycine in human vaccine
I 584763 (80/81) 3, 5 30
II 596535 (3A / 3B / 3C) 3, 5 30
III 596510 7/47/53/54/75 + 3, 5 30
IV 596297 42D 4, 5 5
M? 6032 KS6 3, 5 5
It was found that the staphylococcal vaccines retained their effectiveness after being in an autoclave at 1200 ° C. and under 1.4 kg / cm2 for 15 minutes.
Example 3
Preparing a mastitis vaccine
This vaccine which is a combination of staphylococcal and streptococcal organisms is prepared differently in that the organisms were grown on a solid medium rather than in a fluid. Strain germs were first cultured on 2% nutrient agar for about 18 hours at 37 ° C and the culture was extracted by washing either with sterile distilled water or with 0.5% saline. Lysis takes longer with saline solution. The harvested organisms have a concentration of about 3 X 101 organisms per ml and provide a value of 10 for the Me Farland nephelometer.
Obviously, cells can be grown in nutrient broth rather than solid agar, in which case the concentration of cells can be on the order of about 1 X lot-1 X 109 per ml. Cells were almost completely lysed between 7 and 10 days after addition of <(Merthiolate) to a final concentration of 1: 10,000. The optimum glycine concentration for performing lysis varies with the organism. .
According to experience, the most suitable glycine concentrations for various strains grown on agar are as follows:
"/ o of strains
in the vaccine
mastitis
Staphylococcus strain 584763
3.0 lo glycine 15
Staphylococcus strain 596535
3.0 O / o glycine 10
Staphylococcus strain 596510
3, 0/0 glycine 15
Staphylococcus strain 6032
3, 5 "/ o glycine 20
Staphylococcus strain 596297
3, 5% glycine 10
Staphyloco dog strain
que-1, 5% glycine 10
Streptococcus strain A 36
(1118) -1, 0/0 glycine 10
Streptococcus C strain (1628)
1.5 "/ o glycine 10
Yes,
on the other hand, one suppresses the streptococcal organisms A36 (1118) and 30C (1628) a suitable combination would be:
"/ o of strains
in the vaccine
mastitis
Strain 584763-3, 0 O / o glycine 15
596535-3, 0/0 glycine 15
) s 596510-3, 0/0 glycine 25
6032-3, 5 O / o glycine 30
596297-3, 5 glycine 10
Staphyloco dog strain
that-1,
5 O / o glycine 5
Example 4
Preparation of a streptococcal vaccine
Human strains used Type A 36 1118
Type A 19 616
Type A 12 602
Lyophilized ampoules were used to inoculate vials of heart infusion broth and were grown at 37 ° C overnight. 10 ml of culture was added to each of the 500 ml batches of
Frantz containing 2% glycine and they were incubated for 20 hours at 37 ° C on a shaker. Enumeration of living organisms was carried out and sufficient 1: 100 Merthiolate stock solution added to achieve a final concentration of 1: 10,000.
The vials were kept at room temperature until complete lysis, which took 7-10 days. Tests for sterility, toxicity, safety and efficacy were performed after the organisms had been completely lysed.
The following Tables 2 and 3 are examples of results obtained in tests carried out on rabbits with mastitis vaccine prepared from both staphylococcal and streptococcal organisms. Four rabbits were used per individual batch. Each rabbit received 1 ml of vaccine intramuscularly and 0.2 ml intradermally in each of the 5 spots on the rabbit's back. Two weeks later, two of the test animals received a dose of 0.1 ml intradermally of 15 different strains of staphylococci and the other two received a dose of 0.1 ml intradermally of 15 different streptococcal strains. . Four control (unvaccinated) rabbits received the same dose of the same strains at the same time and by the same route as the vaccinated animals. Two received staphylococci and the other two received streptococci.
The rabbits were observed for 2-4 days. At the end of this period. the control rabbits showed a large necrotic area at the site of each injection while the injection sites of the immunized rabbits were clear or relatively clear.
In the following tables, the results of the dimensions of the zones obtained in one of the present tests have been indicated. Dimensions are expressed in millimeters.
x indicates the presence of pus and necrosis.
Table 2
Rabbits vaccinated with a staph vaccine. (human) and having received 15 staphylococcal strains, at a dilution of 1:75, from lyophilized ampoules. 0.1 ml per point.
Witness rabbits Staph. PSA vaccine lot 7-3 (dried)
Rabbit N> 4 Rabbit N 3 Rabbit N 5 Rabbit N 6
Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus 20x 10 20x 25x 15x 20x 0 0 0 0 0 0 15x 15x 25x20x 20x 25x050005 15x 10 25x 15 10 25x 0 0 0 5 0 0 20x 20x 25x 15x 15 25x 5 0 5 5 5 5 25x 25x 20x 25x 25x 15x 10 10 0 5 5 0
Table 3
Rabbits vaccinated with mastitis vaccine and injected intradermally with 15 staphylococcal strains or 15 streptococcal strains.
Vaccinated rabbits
with mastitis vaccine
Control rabbits Vaccine No 4-3G
Staphylococcus Streptococcus Staphylococcus Streptococcus
lOx 25x 20x 20x 15 10 0 0 10 20x 0 5
25x 30x 0 30x 25x 20 10 10 5 0 10 5
5 50x 10 10 15 10 10 5 5 0 0 0
35x 20x 40x 10 20x lOx 10 0 5 0 0 0 40x 30x 30x 25x 20x 15 5 5 5 0 0 0
Observed redness No redness
Injection of 15 strains of Staphylococci, dilution 1: 75 0, 1 ml per point.
Injection of Streptococci, dilution 1: 50 0, 1 ml per point.
It is evident that a high degree of protection is obtained with the vaccines of the present invention. It has been found that the somatic antigen vaccines prepared using the method of the present invention are more effective than the corresponding conventional all-bacterial vaccines and cause fewer side reactions in humans than the conventional all-bacterial vaccines.
The test method for the meningococcal vaccine was to immunize 60 mice, using 20 mice for each of the 3 separate dilutions as shown in Table 1. Twenty mice were kept as controls. Two to three weeks later, the animals were treated with a live virulent meningococcal strain (Neisseria meningitidis) and the animals observed for one week. The results of a typical test are reported in Table 1.
Example 5
Preparation of a streptococcal vaccine
Human strains used Type A 36 1118
Type A 19 616
Type A 12 602
Lyophilized ampoules were used to inoculate vials of heart infusion broth and were cultured at 37O C overnight. 10 ml of culture was added to each of the 500 ml batches of
Frantz containing 2% glycine and they were incubated for 20 hours at 37 ° C on a shaker. Enumeration of living organisms was carried out and sufficient stock solution of (Merthiolate)) I: 100 added to have a final concentration of 1: 10,000. The vials were kept at room temperature until the lysis was complete. which took 7 to 10 days.
Tests for sterility, toxicity, safety and efficacy were performed after the organisms had been completely lysed.
Example 6
Strains of Escherichia coli (E. coli) were grown on a modified Frantz medium as in Example 1. Sufficient glycine was added to the medium to have a concentration of 1.5% w / v. Incubation was carried out at 37 C for 18-24 hours on a shaker. Merthiolate> was then added to make a final concentration of 1: 10,000. The cultures were then returned to incubation on a shaker for 18-24 hours. Viability checks were performed at this stage to ensure the inactivation of all bacteria.
While still on the shaker, a proteolytic enzyme from the vial was added once or twice to the vials.
Streptomyces griseus. Between the additions a total of 10 micrograms of the enzyme was added with stirring for 24 hours. Stirring was continued for 1 to 3 days until the lysis was complete. A relatively clear vaccine was collected which was found to be effective in protecting mice against treatment with strains of E. coli homologous to the vaccine strain. In Table 4, an example of a typical test is given. This vaccine can be added in a small proportion to a mastitis vaccine since E. coli can, in some cases, be responsible for bovine mastitis.
It may also find use in humans for the control of childhood diarrhea caused by FE. coli.
Results Table 4
Escherichia coli strain Results of the injection
Strain? Vaccine Injection Number of surviving mice
A 634 760 0-26 0-26 10 9
Witness-0-26 10 0
B 634 760 0-26 0-26 9 7
Witness-0-26 10 0 Exerttple 7
Preparation of anthrax vaccine
Germ
Five strains of Clostridium chauvoei namely u WHW. F)>. Deal, Oklahoma and Tosper were cultivated in thioglycolate liver broth for 24 hours at 37O C. These germ cultures were then used for inoculating the production medium at a rate of 1.0 ml per 100 ml of medium.
The composition of the production medium is as follows:
Ingredients% w / v Tryptone 4.0
Sodium chloride 0, 5
Yeast extract 0.5 (Amber X)
L-Cysteine 0.05
Glycine 0.25-0.75 (varies by strain) MgSOX. 7HaO 0,
Dextrose 0.5 (aseptically added from
of a sterile stock solution at 50 µl).
The pH was adjusted to 7.8 with 5N NaOH before autoclaving for 15 min at 121 ° C for sterilization.
Reference J. Comp. Path. 67. 157 (1957) Production
Production cultures were grown for 24 hours at 37 C and then inactivated with 0.5% formalin. 0 Pronase was then added at a rate of 5. 0 mcg / ml from a stock solution containing 0.25 mg / ml. After addition of the enzyme. the pH was adjusted to 0.8L with 5N NaOH. It was activated for one hour at 45 ° C in a water bath and left at room temperature for 7-10 days, the changes in pH were examined daily and adjusted as necessary, and the progress of lysis was followed. .
When the lysis has been complete. the lysate was checked in the usual way for sterility. its safety and effectiveness.
Control-Effectiveness
Five guinea pigs were vaccinated intramuscularly with 1.0 ml of Clostridium chauvoei vaccine prepared from fully lyced cells as described above. Ten days later. a booster injection of 1 ml was administered by the same route. Ten days after the booster injection. these five guinea pigs received intramuscularly, along with five unvaccinated control guinea pigs, 0.5 ml of a titrated suspension of Clostridium chauvoei spore containing 10 M. L. D. in 0.5 ml of suspension. Four (80%) of the five vaccinated guinea pigs survived. All five unvaccinated guinea pigs died.
Example 8 Lysis with amino acid stops
While glycine is a preferred amino acid, other amino acids can accelerate the lysis of bacterial cells in the same way to provide useful vaccines, as shown in Table 5.
Table 5
Number of organizations
Staph strain. Staph strain.
Amino acid Concentration "/ o N" 584763 N "596297 Lysis L.-Arginine 1.7, 107 8, 5-10 +
D. L-Aspartic Acid 2.5 1 107 3 107
L-Histidine 1.5 1 X 10 8 X 10-
D. L-Valine 3, 0 5 Y 108-10 +
L-proline 3.0 2 X106X10-
Wisteria (control) 3, 5 2 L 107 12 vx lOi
Other strains of bacteria which have been used for the preparation of useful vaccines are as follows:
Staphylococcus 1645, 591714, 598022, 597497, 595354,
598074, 6003.
Streptococcus 1510T35, 589T1, 601T11, 618T22,
599T9.
Meningococcus D2 (Lapeyssonnie), Ml 11, N1 (Lapeys
sonnie), 962 (Brannon), M132 (Lapeys sonnie).
Bacteria of particular interest are those of the families: Micrococcaceae, Lactobacteriaceae.
Bacillaceae and Enterobacteriaceae. In these families we find the Neisseria species. Staphylococcus. Streptococcus, Escherichia and Clostridium.