CH453379A - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation

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CH453379A
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sep
fermentation
glutamic acid
microorganism
nutrient medium
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CH498165A
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Johanides Vera Ing Dr
Suput Jelena Dipl-Pharm
Nevenka Dipl Ing Adler
Menzura Dipl Ing Drazic
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Pliva Pharm & Chem Works
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14Glutamic acid; Glutamine

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Description


      Verfahren        zur    Herstellung von     L-Glutaminsäure    durch Fermentation    Das Verfahren     betrifft    die Herstellung von     L-Glut-          aminsäure    durch Fermentation.

   Dieses Verfahren ist da  durch     gekennzeichnet,    dass der Mikroorganismus     Gaffkya          tibisci    unter     aeroben    Bedingungen in einem flüssigen       Nährmedium        kultiviert    wird, das eine vom Mikro  organismus     assimilierbare        Kohlenstoff-    und Stickstoff  quelle, ein     Mineralsalz    ;sowie einen Wachstumsfaktor  aufweist.  



  Der neue Mikroorganismus ist in der öffentlichen         Sammlung    der technologischen Fakultät bei der     Lehr-          kanzel    für Mikrobiologie der Universität Zagreb,  Jugoslawien, unter der Nummer 4004 hinterlegt.  



  Der Mikroorganismus     Gaffkya        tibisci    stellt eine neue  Gattung dar und seine Charakteristiken sind neben  denen einer beschriebenen Gattung dieses Stammes,       Gaffkya        homari        (Bergey's    Manual of     Deter.        Bact.,          Seventh    Edition) in folgender Tabelle angeführt:

    
EMI0001.0027     
  
    <I><U>Tabelle <SEP> 1</U></I>
<tb>  Charakteristik <SEP> Gaffkya <SEP> tibisei <SEP> Gaffkya <SEP> homari
<tb>  1. <SEP> Morphologie <SEP> der <SEP> Zellen <SEP> Koki. <SEP> Bilden <SEP> ausgeprägte <SEP> Tetraden. <SEP> Koki. <SEP> Bilden <SEP> ausgeprägte <SEP> Tetraden.
<tb>  Ansammlungen <SEP> ebenfalls <SEP> aus <SEP> Tetraden
<tb>  bestehend.
<tb>  2. <SEP> Grösse <SEP> der <SEP> Zellen <SEP> Durchmesser: <SEP> 0,8-1,1 <SEP> Durchmesser: <SEP> 0,8-1,1
<tb>  3. <SEP> Beweglichkeit <SEP> keine <SEP> keine
<tb>  4. <SEP> Färbung <SEP> nach <SEP> Gram <SEP> positiv <SEP> positiv
<tb>  5. <SEP> Kolonien <SEP> auf <SEP> Agar <SEP> rund, <SEP> klein, <SEP> 1-2 <SEP> mm <SEP> im <SEP> Durchmesser, <SEP> rund, <SEP> klein, <SEP> 1-2 <SEP> mm <SEP> im <SEP> Durchmesser,
<tb>  konvex. <SEP> Farbe:

   <SEP> ohne <SEP> Pigment, <SEP> gelblich <SEP> gräulich-weiss, <SEP> gewölbt
<tb>  bis <SEP> gelb, <SEP> von <SEP> der <SEP> Temperatur <SEP> der
<tb>  Kultivierung <SEP> abhängig
<tb>  6. <SEP> Schräges <SEP> Agar <SEP> Wachstum <SEP> mässig, <SEP> punktförmig <SEP> Wachstum <SEP> schwach, <SEP> punktförmig
<tb>  7. <SEP> Nahrhaftes <SEP> Bouillon <SEP> Trübe <SEP> mit <SEP> ausgeprägtem <SEP> Niederschlag <SEP> schwaches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> körnigem
<tb>  am <SEP> Boden, <SEP> kein <SEP> Oberflächenwachstum <SEP> Niederschlag, <SEP> kein <SEP> Oberflächenwachstum
<tb>  B. <SEP> Verflüssigung <SEP> der <SEP> Gelatine <SEP> keine <SEP> keine
<tb>  9. <SEP> Lackmusmilch <SEP> schwach <SEP> alkalisch <SEP> schwach <SEP> sauer
<tb>  10. <SEP> Indolbildung <SEP> keine <SEP> keine
<tb>  11.

   <SEP> Kartoffel <SEP> kein <SEP> Wachstum <SEP> kein <SEP> Wachstum
<tb>  12. <SEP> Bildung <SEP> von <SEP> H2S <SEP> keine <SEP> keine
<tb>  13. <SEP> Hydrolyse <SEP> der <SEP> Stärke <SEP> keine <SEP> keine
<tb>  14. <SEP> Methylrot <SEP> negativ <SEP> negativ
<tb>  15. <SEP> Voges-Proskauer-Reaktion <SEP> negativ <SEP> negativ       
EMI0002.0001     
  
    <I>Fortsetzung <SEP> Tabelle <SEP> 1</I>
<tb>  Charakteristik <SEP> Gaffkya <SEP> tibisci <SEP> Gaffkya <SEP> homari
<tb>  16. <SEP> Nitratreduktion <SEP> negativ <SEP> negativ
<tb>  17. <SEP> Urease <SEP> negativ <SEP> negativ
<tb>  18. <SEP> Ausnützung <SEP> von <SEP> NH4H2PO4 <SEP> nützt <SEP> aus <SEP> nützt <SEP> nicht <SEP> aus
<tb>  als <SEP> einzige <SEP> Stickstoffquelle
<tb>  19. <SEP> Verhältnis <SEP> zum <SEP> freien <SEP> aerob <SEP> aerob, <SEP> fakultativ <SEP> anaerob
<tb>  Sauerstoff
<tb>  20.

   <SEP> Temperaturoptimum <SEP> 28-37  <SEP> C <SEP> 30-35  <SEP> C
<tb>  21. <SEP> Blutagar <SEP> (menschlich) <SEP> keine <SEP> Hämolyse <SEP> beta-Hämolyse
<tb>  22. <SEP> Für <SEP> Wachstum <SEP> benötigte <SEP> Thiamin* <SEP> Byotin, <SEP> Ca-panthotenat, <SEP> Thiamin,
<tb>  Stoffe <SEP> Nicotinsäure <SEP> und <SEP> gewisse <SEP> Aminosäuren
<tb>  23. <SEP> Pathogene <SEP> Eigenschaften <SEP> gegen <SEP> Meerkrebs <SEP> nicht <SEP> geprüft. <SEP> gegen <SEP> Meerkrebs <SEP> pathogen
<tb>  Koagulasetest <SEP> negativ
<tb>  24. <SEP> Herkunft <SEP> Erde <SEP> am <SEP> Fluss <SEP> Tisa <SEP> kranker <SEP> Meerkrebs
<tb>  (Homarus <SEP> americanus, <SEP> Maine)
<tb>  mit <SEP> Auxonographiemethode <SEP> geprüft.

         Die Bildung der Säure und des Gases aus     Zuckerund    Alkohol ist in Tabelle     Il*    dargestellt:  
EMI0002.0004     
  
    <I>Tabelle <SEP> 11</I>
<tb>  Fermentation <SEP> von <SEP> Zucker <SEP> Gaffkya <SEP> tibisci <SEP> Gaffkya <SEP> homari <SEP> Gaffkya <SEP> tibisci <SEP> Gaffkya <SEP> homari
<tb>  und <SEP> Alkohol <SEP> Säure <SEP> Gas
<tb>  Glukose <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP>   Arabinose <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft
<tb>  Ramnose <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft
<tb>  Xylose <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft
<tb>  Fructose <SEP> + <SEP> nichtgeprüft <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft
<tb>  Galaktose <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft
<tb>  Mannose <SEP> 

  - <SEP> nicht <SEP> geprüft <SEP> - <SEP> nicht <SEP> geprüft
<tb>  Saccharose <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP>   Laktose <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP>   Maltose <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP>   Raffinose <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP>   Glycerol <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP>   Mannitol <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP>   Dulcitol <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>   Die <SEP> Bildung <SEP> der <SEP> Säure <SEP> und <SEP> des <SEP> Gases <SEP> wurde <SEP> auf <SEP> dem <SEP> Nährboden <SEP> folgender <SEP> Zusammensetzung <SEP> geprüft:
<tb>  <B>NH;H2P04</B> <SEP> 1,0 <SEP> g, <SEP> KCl <SEP> 0,2 <SEP> g, <SEP> MgS04 <SEP> . <SEP> 7H20 <SEP> 0,2 <SEP> g, <SEP> Zucker <SEP> 10,0 <SEP> g, <SEP> Wasser <SEP> bis <SEP> 1000 <SEP> ml, <SEP> Phenolrot <SEP> 0,025 <SEP> g.

         Aus den angeführten Angaben und Tabellen geht  hervor, dass     Gaffkya        tibisci    eine neue, bisher unbeschrie  bene Gattung darstellt, und es ist festgestellt worden,  dass sie sich von der     Gaffkya        homari    dadurch unter  scheidet, dass sie saures     Ammoniumphosphat    als     einzige     Nährquelle ausnützen kann, dass sie auf dem     Blutagar     keine     Hämolyse    verursacht, und dass sie     Laktose,        Raf-          finose    bzw.     Mannitol    nicht in die Säure abbaut.  



  Als     Kohlenstoffquelle    kann die Unterlage Zucker,  sowie Glucose, Fructose,     Saccharose    und     Maltose    oder  die diese Substanz enthaltenden Rohstoffe sowie Me  lasse,     Hydrol,        hydrolysierte    Maisstärke und dergleichen  enthalten.     Der    Mikroorganismus kann eine organische  (Harnstoff) oder     anorganische    (Ammoniak, Ammonium-    salze wie     Ammoniumsulfat,        Ammoniumchlorid,        Ammo-          niumphosphat    u. a.)     Stickstoffquelle    ausnützen.

   An  Mineralsalzen sind im Nährboden gewöhnlich Kalium  phosphat und     Magnesiumsulfat    sowie     Thiamin    als       Wachstumfaktor    oder     Thiamin    enthaltende Stoffe, wie  z. B. Fleischextrakt, Hefeextrakt,     fermentierter    Mais  extrakt     (corn        steep        liquor)    enthalten.  



  Der Mikroorganismus     Gaffkya        tibisci    kann die     L-          Glutaminsäure    im Nährboden unter Mischen,     submers     unter     aeroben    Bedingungen herstellen. Die optimale  Temperatur für die maximale Ansammlung der     L-Glut-          aminsäure    im Nährboden liegt zwischen 28 und 33  C,  bei einem     pH-Wert    von 6,5 bis 9, in einem Zeitraum  von 2 bis 3 Tagen.

        Nach der Fermentation kann die Biomasse vom  fermentierten Nährboden durch Zentrifugieren oder Fil  tration abgeschieden und die hergestellte     L-Glutamin-          säure    durch Verdampfung und     Ansäuerung    mit Mineral  säuren auf den     isoelektrischen    Punkt isoliert werden.  Die     L-Glutaminsäure    kristallisiert aus der Lösung bei  erniedrigter Temperatur. Die reine     L-Glutamins:äure     kann aus dem fermentierten Nährboden auch mittels       Ionenaustauscher    nach einem bekannten, in der Lite  ratur beschriebenen Verfahren, ausgeschieden werden.  



  Die Herstellung der     L-Glutaminsäure    gemäss dieser       Erfindung    wird durch folgende Beispiele erläutert.  <I>Beispiel 1</I>  1.     Vorfermentor     Aus einer von 20 bis 24 Stunden alten, auf dem  schrägen     Agar    bei 30 bis 32  C gezüchteten Kultur von       Gaffkya        tibisoi    wird eine Suspension hergestellt, mit  welcher ein     Vorfermentor    folgender     Zusammensetzung       Glukose 1 g       Kaseinhydrolysat    4 g  Hefeextrakt 3 g  Wasser bis zu 1000 ml  inokuliert wird.    Die Kultur wird in Schüttelapparat     etwa    24 Stunden  bei 32  C gezüchtet.  



  2.     Fermentor     Mit 5 % vom     Inokulum    aus dem     Vorfermentor    wird  der     Fermentor    folgender Zusammensetzung    Glukose 50 g  Harnstoff 8 g  KH2P04 0,5 g       MgS04    - 7 1-120 0,1 g       FeC13    - 6     H20    0,05 g       Wasser    bis zu 1000 ml    mit einem mit     Natriumhydroxyd    auf 7,0 bis 7,2 einge  stellten     pH-Wert    geimpft.  



  In die     Erlenmeyerkolben    von 500 ml Inhalt wird  je 50 ml Nährboden gegeben und unter     Schütteln    im  Schüttelapparat wird die Fermentation 72 Stunden bei  30 bis 32  C ausgeführt. Aus dem fermentierten 3 mg  der     Glutaminsäure    pro ml enthaltenden Nährboden wird  die Biomasse durch     Zentrifugieren    abgeschieden und  durch Verdampfen auf ein kleineres Volumen     eingeengt.     Der     pH-Wert    wird durch Zugabe von     Salzsäure    auf den       isoelektrischen    Punkt eingestellt     (pH-Wert    3,2).

   Die L  Glutaminsäure wird durch Kühlung auf 5  C aus der  Lösung     kristallisiert.     



  <I>Beispiel 2</I>  Der     Vorfermentor    wird analog dem Beispiel 1 her  gestellt und der     Fermentor    folgender Zusammensetzung         Hydrolysierte    Maisstärke  (als Glukose gerechnet) 100 g  Harnstoff 5 g       Ammoniumsulfat    1 g  Hefeextrakt 2 g  Wasser bis zu 100 ml  der     pH-Wert    des Nährbodens 7,2, mit derselben Menge  (5 %) inokuliert.  



  50 ml dieses Nährbodens werden in     einem        500-ml-          Erlenmeyerkolben    auf den Schüttelapparat gebracht und  3 Tage bei 30 bis 32  C fermentiert. Während der       Fermentation    wird der     pH-Wert    alle 4 Stunden mit der  Zugabe von 12 %     iger        Ammoniaklösung    auf den an  fänglichen     pH-Wert        eingestellt.     



  Der fermentierte Nährboden enthält nach der be  endigten Fermentation 3     mg/ml    der     L-Glutaminsäure.     Er wird auf ein kleineres Volumen eingeengt und durch  den schwach basischen     Ionenaustauscher         Amberlit          IR-4B     gelassen.

       Die        L-Glutaminsäure    wird auf dem  Harz     adsorbiert    und nach dem Auswaschen mit Wasser       mittels    verdünnter     Salzsäure        eluiert.    Aus diesem     Eluat     kristallisiert durch Kühlung die     L-Glutaminsäure.    Die  Kristalle werden durch Zentrifugieren oder Absaugen  abgeschieden. Anstatt     Ionenaustauscher         Amberlit          IR-4B     kann      Amberlit        IRA-400         verwendet    werden.

Claims (1)

  1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Gaffkya tibisci unter aeroben Bedin gungen in einem flüssigen Nährmedium kultiviert wird, das eine vom Mikroorganismus assimilierbare Kohlen stoff- und Stickstoffquelle, ein Mineralsalz sowie einen Wachstumsfaktor aufweist. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Fermentation bei Temperaturen von 28 bis 33 C, einem pH-Wert von 6,5 bis 9 und im Zeitraum von 48 bis 72 Stunden ausgeführt wird. 2.
    Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass das: Nährmedium als Kohlenstoff quelle Glukose, Fructose, Saccharose, Maltose oder Glycerin, als Stickstoffquelle Harnstoff bzw. die vom Mikroorganismus assimilierbaren Ammoniumsalze, und als Mineralsalze saures Kaliumphosphat und Magne- siumsulfat enthält. 3.
    Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch ge kennzeichnet, dass das Nährmedium als Wachstums faktor Thiamin oder Thiamin enthaltende Stoffe, wie Hefeextrakt, fermentierten Maisextrakt oder Fleisch extrakt, enthält.
CH498165A 1964-04-13 1965-04-08 Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation CH453379A (de)

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