CH455148A - Verfahren zur Vermehrung des Tollwutvirus - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur Vermehrung des Tollwutvirus
Vakzinen für die Immunisierung von Hunden gegen Tollwut werden üblicherweise aus Virus erzeugt, das an Embroyonal-Hühnereier adaptiert und in diesen gezüchtet wird. Dieses Verfahren wird durch Schwierigkeiten bei der Trennung des gewünschten Virus von den Eikomponenten beeinträchtigt und Vakzinen, die nach diesem bekannten Verfahren gebildet worden sind, behalten einen hohen Anteil von Hühnerprotein bei, der oft unerwünschte Nebenwirkungen herbeiführt.



  Ferner ist es schwierig, Verunreinigungen, wie andere Viren oder Organismen der Pleuro-Pneumonia-Type, von dem durch Eipassage vermehrten Virus zu entfernen. Obwohl das   Eivermehrungsverfahren    gegenüber älteren Methoden, bei welchen lebende Tiernervengewebe angewendet werden, Vorteile aufweist, ist es nicht wirtschaftlich, und das dabei erhaltene Erzeugnis ist in vieler Hinsicht zu beanstanden.



   Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist, auf wirtschaftliche Weise eine Tollwutvakzine des lebenden Tollwutvirus zu erzeugen, welche im wesentlichen von durch übermässige Mengen von Protein oder Nervengewebe bewirkten Nebenerscheinungen frei ist, wenn man von einem Tollwutvirus ausgeht, das erfindungsgemäss vermehrt worden ist.



   Das Verfahren gemäss der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Tollwutvirus, das adaptiert worden ist, so dass es in Hühnerembryozellkulturen zu wachsen vermag, in Gegenwart von Hühnerembryozellen vermehrt wird, wobei die Hühnerembryozellen wenigstens während des letzten Vermehrungsschrittes in einem synthetischen, proteinfreien Unterhaltsmedium gehalten werden.



   Es ist ein signifikanter Vorteil der Erfindung, dass dieses Verfahren die Ernte des Virus nach einfachen Standardverfahren, wie Gefrieren, Auftauen und anschliessende Trennung einer Suspension des Virus von den Zellbruchstücken, ermöglicht, wodurch die umständlichen Verfahren vermieden werden, die sonst zur Erzeugung von Vakzinen aus Eikulturen notwendig sind.



   Es wurde ferner gefunden, dass es möglich ist, die Menge an verunreinigenden Viren und anderen Organismen in dem Tollwutvirus wesentlich zu vermindern, indem bei dem Verfahren gemäss der Erfindung ein Tollwutvirus verwendet wird, das zwecks Reinigung einer oder mehreren Verdünnungspassagen in einer Hühnerembryokultur in einem synthetischen, proteinfreien Unterhaltsmedium unterworfen worden ist.



   Bei der Durchführung der Erfindung wird das adaptierte lebende Tollwutvirus z. B. in einer Gewebekultur von Hühnerembryozellen vermehrt. Ein Verfahren zur Herstellung solcher Gewebekulturen besteht im Zerhacken und Dispergieren von 7 bis 10 Tage alten Hühnerembryos zur Gewinnung einer Hühnerembryozellendispersion. Die Dispersion wird dann in Kulturbehälter gebracht, die mit einem natürlichen Nährboden versehen sind, der das Wachstum und die Vermehrung der Zellen zu unterhalten in der Lage ist; die Dispersion wird unter Wachstumsbedingungen gehalten. Wenn ein guter Einschichtwuchs der Hühnerem  bryozeilen    erhalten ist, kann ein Impfmaterial des Tollwutvirus in die Gewebekultur eingeführt werden.

   Wird in dieser Weise gearbeitet, so wird der Nährboden wenigstens für die letzte Vermehrungsstufe durch ein synthetisches   UnterhaMsmedium    ersetzt. Ist anderseits ein guter Einschichtwuchs der Hühnerembryozellen erreicht, so kann der Nährboden abgegossen und das synthetische Unterhaltsmedium entweder vor oder nach einer Beimpfung mit dem lebenden Tollwutvirus zugefügt werden.



   Es ist erforderlich, dass das Tollwutvirus, welches beim Verfahren gemäss der   Erfindung    verwendet wird, nicht ein gewöhnlicher (Strassen-) Stamm ist, sondern ein adaptiertes Virus, das in Hühnerembryozellkulturen zu wachsen vermag. Eine solche Adaptation kann beisplielsweise durch eine Vermehrung aufeinanderfolgender Passagen in Kücken durch Intracerebralbeimpfung erreicht werden. Vorzugsweise wird jedoch ein Tollwutvirus verwendet, das auf diese Weise adaptiert und dann weiter adaptiert worden ist, indem eine   Mehrzahl von aufeinanderfolgenden Passagen in Embryonaleiern vorgenommen wurde.



   Eine von verunreinigenden Viren und anderen Organismen im wesentlichen freie Vakzine kann gebildet werden, wenn das angewendete Tollwutvirus einer oder mehreren Verdünnungspassagen unterworfen worden ist. Bei einer solchen Verfahrensweise wird das geerntete Virus verdünnt und dann in einer Hühnerembryokultur in einem synthetischen, proteinfreien Unterhaltsmedium vermehrt. Zur Gewährleistung eines hohen Reinigungsgrades ist es zweckmässig, solche Verdünnungspassagen wenigstens dreimal und vorzugsweise wenigstens zehnmal zu wiederholen.

   Diese Methode der Verdünnungspassagen kann am wirksamsten unter Erreichung eines hohen Reinheitsgrades ausgeführt werden, indem zuerst eine Verdünnung des geernteten Virus in aufeinanderfolgenden Zehnfachstufen erfolgt, worauf man mit einem Teil jeder solchen Verdünnung ein Hühnerembryozellgewebe beimpft und das Virus von dem am meisten verdünnten Impfmaterial, das Wachstum zeigt, für weitere Reihenpassagen oder für die Herstellung der Vakzine verwendet.



  Zweckmässigkeitshalber wird diese letztere Passagentechnik im Rahmen der Erfindung als  Grenzverdünnungspassage  bezeichnet.



   Ausgezeichnetes Wachstum von Tollwutvirus wird im allgemeinen beobachtet, wenn die Vermehrung in dem letzten Vermehrungsschritt oder in den Verdünnungspassagen bei einer Temperatur von 34 bis   37     C ausgeführt wird, obwohl vorzugsweise eine Temperatur von etwa 350 C Anwendung findet. Die Zeitdauer, die erforderlich ist, um eine zufriedenstellende   Vermeh    rung des Virus sicherzustellen, variiert in Abhängigkeit von den Bedingungen, unter welchen die Embryozellen gehalten werden. Im allgemeinen kann eine erwünschte Proliferation innerhalb von 4 bis 14 Tagen erreicht werden, obwohl es bevorzugt wird, das Virus nach 7 bis 9 Tagen zu ernten.



   Die Vermehrung des Tollwutvirus in Hühnerembryozellgewebekulturen wird üblicherweise nicht durch irgendwelche beobachtbare   cytopathologische    Wirkungen an den Zellen feststellbar sein. Das Wachstum des Virus kann aber durch Intracerebralbeimpfung von Mäusen mit Reihenverdünnungen der Flüssigkeiten aus den Kulturröhrchen nach Bebrütung des Virus   feste    stellt werden.



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Hühnerembryogewebekultur durch Zerkleinerung von Hühnerembryos (nach Entfernung der Augen) und anschliessend der Dispergierung der Zellen derselben durch Trypsinisation hergestellt. Teile der entstehenden Zellsuspension werden in einen Kul  turb eh älter    gebracht, der mit einem geeigneten Nährboden beschickt ist, wie z. B. einer Lösung von Lactalbuminhydrolysat in Earle's Grundsalzlösung, die mit einem tierischen Serum, wie z. B. inaktiviertem   Kaibse-    rum, verstärkt ist, und die geeignete Antibioticis enthält, um eine bakterielle Verunreinigung zu unterdrükken.

   Sobald sich ein gutes Einschichtwachstum der Hühnerembryogewebezellen eingestellt hat, wird der Nährboden dekantiert und die Zellschicht der Gewebekultur wird mit einem Impfmaterial des Ei-adaptierten Flury-Stammes des Tollwutvirus benetzt. Der Flury Stamm, auf welchen hier Bezug genommen ist, ist ein ursprünglich gewöhnlicher (Strassen) Stramm, der durch 138 aufeinanderfolgende Passagen unter Intracerebralbeimpfung von Kücken modifiziert worden ist. Bei sol chen Arbeitsweisen ist es zur Erzielung guter Ausbeute an vermehrtem Virus zweckmässig, die Konzentration des Virus und bzw. oder des   Eimaterials    in dem Impfmaterial zu kontrollieren.

   Gute Ergebnisse wurden er zielt, wenn ein Impfmaterial Anwendung fand, das aus einer Suspension von etwa   10/o    Embryomaterial aus einer   Aktivkultur    des Flury-Stammes des Tollwutvirus in Embryonaleiern bestand.



   Gemäss dieser bevorzugten Ausführungsform wird anschliessend an das Benetzen der Hühnerembryozellschicht mit der Suspension des aktiven Virus der Kulturbehälter geschlossen und eine Zeit lang stationär gehalten, um die Absorpltion des Virus durch die Zellen zu begünstigen. Anschliessend wird ein synthetisches Unterhalsmedium, wie z. B. das Medium 199 von Morgan, Morton und Parker, oder Eagle's Grundmedium, dem beimpften Kulturbehälter zugesetzt und der Behälter wird etwa 4 bis 14 Tage, vorzugsweise etwa 7 bis 9 Tage, bei einer Temperatur von etwa   350 C gehalten, um eine Vermehrung des Virus zu    bewirken.

   Anschliessende Passagen des entstehenden vermehrten Virus können nach der nachfolgend beschriebenen Adsorptionstechnik oder durch Einführung einer kleinen Menge des geernteten Virus aus einer   vorhergehenden    Gewebekulturpassage in das Kulturröhrchen erhalten werden. Ein  synthetisches, proteinfreies Unterhaltsmedium  ist ein Nährboden, der in der Lage ist, künstlich erhaltene Zellen ohne solche Mengen von Ergänzungsstoffen, wie Serum oder andere aus lebenden Tieren erhaltene proteinartige Materialien, deren Anwesenheit nach Impfung der Vakzinen feststellbar ist, im Zustand für eine Vermehrung des Virus zu erhalten. Er besteht in der Regel im wesentlichen aus Aminosäuren, Purinen, Zuckern, Vitaminen und anorganischen Salzen.



   Zur Herstellung der Vakzinen kann das Virus, das durch eine Reihe von Passagen in Hühnerembryogewe  bekultur    gebildet worden ist, in irgendeiner geeigneten Weise geerntet werden. Nach einer bevorzugten Arbeitsweise wird das Unterhaltsmedium, das einen Teil des gebildeten Virus   enthält,    von der Gewebekultur etwa 7 Tage nach der Beimpfung der Gewebekultur mit dem Virus dekantiert. Nach der Dekantation wird ein entsprechendes Volumen eines   geeigneten    Vakzinstabilisator, wie z.

   B. ein Kaseinhydrolysat, eine Amino  säure/Zuckermischung,    eine gepufferte Zuckerlösung o. dgl., in den Kulturbehälter eingeführt und der Inhalt desselben wird einer   Gefrier- und    Auftauchbehandlung unterworfen, um die Gewebezellen zu sprengen und das Virus aus denselben in Freiheit zu setzen. Die Stabilisierungsflüssigkeit wird dann dekantiert, mit der früheren Ernte des Unterhaltsmediums zusammengebracht und zentrifugiert, um   Zeilbruchstücke    zu entfernen und ein Vakzinprodukt zu erhalten. Das letztere kann dann hinsichtlich seiner Aktivität titriert und in üblicher Weise auf Reinheit geprüft werden. Gewünschtenfalls kann eine solche Vakzine unmittelbar bei niederer Temperatur gelagert oder in einem verschlossenen Behälter nach dem Gefriertrocknen konserviert werden.



   Gemäss einer beispielsweisen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird Ei-adaptiertes Virus des Flury-Stammes, welches dadurch charakterisiert ist, das es aus dem ursprünglich isolierten Stras  senwVirus    durch 138 aufeinanderfolgende Passagen durch   Intracerebralbeimpfúng    in Hühnern und anschliessend durch 64 Passagen in Embryonaleiern  modifiziert worden ist, in Gewebekulturen von Hühnerembryozellen überimpft. Die Gewebekulturen waren Einschichtkulturen, die in einem Glaskulturbehälter gezüchtet worden waren. Das Kulturmaterial wurde wie folgt hergestellt:
7 bis 10 Tage alte Hühnerembryos wurden nach Entfernung der Augen fein zerkleinert, wobei aseptische Bedingungen eingehalten wurden; das entstehende zerhackte Gewebe wurde mit phosphatgepufferter Salzslösung gewaschen.

   Das gewaschene Gewebe wurde in üblicher Weise unter Rühren durch einen Magnetrührer trypsinisiert. Das trypsinisierte Gewebe wurde bei 100 Umdr/min 3 Minuten lang zentrifugiert und die entstehenden angereicherten Zellen wurden in einem Nährboden suspendiert, wobei etwa 500 000 bis 600 000 Zellen/ml eingestellt wurden. Der Nährboden wurde mit Earle's Grundsalzlösung angesetzt, die aus 6,8 g Natriumchlorid, 0,4 g Kaliumchlorid, 0,2 g Kalziumchlorid, 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,125 g Mononatriumhydrogenphosphatmonohydrat, 1,0 g Glucose, 2,2 g Natriumbicarbonat und 0,02 g Phenolrot, in destilliertem Wasser gelöst und auf ein Endvolumen von   1000ml    aufgefüllt, besteht.

   Der Nährboden hat die folgende Zusammensetzung:
Bestandteile   O/o   
Earle's Grundsalzlösung (EBSS) 85    50/obige    Lösung von Lactalbumin hydrolysat in EBSS ohne Natrium bicarbonat 10 inaktiviertes   Kalbserum    5
Das Nährmedium enthielt ferner 200 Einheiten Penicillin und 200 Mikrogramm Streptomycin je ml.



     1 ml-Anteile    der obigen Hühnerembryozellsuspension wurden in sterile Röhrchen gebracht und bei einer Temperatur von etwa 350 C 24 bis 48 Stunden bebrütet, bis ein gutes Wachstum des Gewebes zu beobachten war. Eine ähnliche Verfahrensweise wurde auch zur Bildung grösserer Ansätze angewendet, indem 60 bis 70 ml der Zellsuspension in Kulturkolben bebrütet wurden. Nach der Anfangsbebrütungsperiode für das Hühnerembryozellgewebe wurde das Nährmedium von den Zellschichten abgezogen und letztere wurden mit einem synthetischen Medium, nämlich Medium 199 von Morgan und Mitarb. (Proc. Soc. Experimental Biology and Medicine, 1950, 73, Seiten 1 bis 8), ergänzt mit 200 Einheiten Penicillin und 200 Mikrogramm Streptomycin je ml, gewaschen.

   Die Waschflüssigkeit wurde von der Zellschicht des Kulturgewebes abgezogen und 0,2 ml einer wässrigen Suspension eines   10/obigen    Embryomaterials von Embryonaleiern, in welchem der Flury-Stamm des Tollwutvirus vermehrt worden war, wurden zugesetzt und so verteilt, dass eine Berührung mit der Zellschicht gewährleistet war.



  Dieses Eivirusmaterial hatte einen Titer von 10-6,3 Maus-Letaldosen per   0,2mol,    bestimmt durch Intracerebralbeimpfung in Mäusen. Die Kulturröhrchen und der so behandelte Inhalt derselben wurden 1 Stunde bei 350 C bebrütet, wobei die Röhrchen in einer solchen stationären Lage gehalten wurden, dass das Impfmaterial die Zellschicht bedeckte. Nach Beendigung dieser   Adsorptionsperiode    wurden   2 mol    des Mediums 199 zu der KuItur gegeben und Röhrchen sowie Inhalt wurden in eine   Walzentrommel    gebracht und 7 Tage lang bei einer Temperatur von   35     C durch Umwälzen langsam bewegt.



   Am 7. Tag nach der oben beschriebenen Beimpfung der Gewebekultur mit dem Eivirus wurde das Kulturmedium gefroren und aufgetaut, um das Intracellularvirus freizusetzen und die entstehende Mischung wurde zentrifugiert, um Zellbruchstücke abzutrennen. 0,2 ml der überstehenden Flüssigkeit der zentrifugierten Mischung wurden als Impfmaterial in den frischen Röhrchen mit Kulturgewebe wie vorstehend angegeben verwendet. Nach in der oben beschriebenen Weise durchgeführter Adsorption des Virus wurde wie vorstehend eine Bebrütung während 7    Tagen bei 350 C ausgeführt. Nach 6 solchen Passagen    wurden nachfolgend Passagen durchgeführt, indem eine frische, gewaschene Gewebekultur, die 2 ml des Unterhaltsmediums enthielt, mit 0,2 ml der überstehenden, Virus enthaltenden Flüssigkeit von der unmittelbar vorhergehenden Passage beimpft wurden.

   Nach 4 solchen zusätzlichen Passagen wurde die überstehende Flüssigkeit der Kultur, nachdem sie gefroren und aufgetaut worden war, titriert, indem eine Intracerebralimpfung von Mäusen durchgeführt wurde, wobei gefunden wurde, dass die Flüssigkeit einen Titer von   10.4,2    je 0,03 ml aufwies. Dieser Passagewert stellt einen Verdünnungsfaktor von   10.10,7    des ursprünglichen Ausgangsvirus dar.



   Beginnend mit dem 14. Passagewert wurde eine Reihe von   Grenzverdünnungs-Reinigungs-Blindpassa-    gen in der folgenden Weise ausgeführt: Das Virus mit dem 14. Passagewert wurde in 10-fach-Schritten verdünnt und in Mengen von   0,2 ml    in Hühnerembryokulturen überimpft. Nach 7 Tagen wurden die Kulturen, die mit   10-1- und    10-2-Verdünnungen beimpft worden waren, durch Gefrieren und Auftauen der Zellschicht geerntet; das Gefrieren und Auftauen der Zellen wurde durchgeführt, um die Zellen aufzubrechen.



  10 Tage nach der Beimpfung wurden jene Kulturen, die mit   10-3- und    10-4-Verdünnungen beimpft worden waren, in ähnlicher Weise geerntet. Das gesamte geerntete Material wurde an Mäusen auf Tollwutvirus geprüft. Die Kulturen, die ein Wachstum des mäuseinfizierenden Virus von dem am meisten verdünnten Impfmaterial zeigten, wurden als Saatsmaterial verwendet, das einer Reihenverdünnung unterworfen und in Hühnerembryogewebekulturen, wie vorstehend angegeben, überführt wurde. Nach 8 solchen Grenzverdünnungsreinigungspassagen, die einen Verdünnungsfaktor aus dem ursprünglichen Embryonaleivirusimpfmaterial von   10-46,5    darstellen, wurde das Virus von der 8.

   Grenzverdünnungspassage geerntet; es zeigte einen Titer von   10.4,6    je 0,03 ml oder eine   1045'5-fache    Zunahme des Virus gegenüber dem Ausgangsmaterial.



  Es wurden 10 solche Grenzverdünnungspassagen durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Endprodukt von verunreinigenden Viren und anderen Mikroorganismen frei ist.



   Flaschen, die mit trypsinisiertem Hühnerembryogeweben beschickt worden waren, wurden zur Herstellung grösserer Mengen   desl    Virus verwendet. Die Flaschen wurden durch Adsorption einer Mischung von 1,0 ml der Virussuspension aus einer vorhergehenden Passage und 9 ml des Mediums 199 zu der Zellschicht    während 1 Stunde bei 350 C beimpft. Dann wurden    90 ml des Mediums 199 zugegeben und die Flaschen stationär bebrütet. 10 Tage nach der Beimpfung wurde die infektiöse überstehende Flüssigkeit entfernt und  eine entsprechende Menge eines geeigneten Stabilisators wurde zu der Zellschicht gegeben, die dann durch
Gefrieren und Auftauen gesprengt wurde. Die Zellbruchstücke und der Stabilisator wurden mit der überstehenden Flüssigkeit vereinigt und zentrifugiert, um die Zellbruchstücke zu entfernen und eine Endvakzine herzustellen.



   Andere synthetische Unterhaltsmedien, wie Parker und Healy's synthetisches Medium Nr. 858 oder Eagle's Nährboden, können in dem vorstehend angegebenen Verfahren anstelle des Mediums 199 verwendet werden, falls dies gewünscht sein sollte.



   Die Viren, die aus der 4., 5., 6. und 7. der oben beschriebenen   Gewebekulturpassagen    geerntet wurden, wurden vereinigt und als Vakzine für intramuskuläre Injektion von Hunden verwendet. Diese vereinigte Vakzine zeigte einen Titer von   104ç3-Maus-Letaldosen    50   O/o    (MLD50) je ml. Eine Dose von 1 ml dieser Vakzine wurde jedem von 5 Hunden injiziert und 6 ähnliche Hunde wurden als unbeimpfte Kontrolltiere belassen. Etwa 8 Wochen nach der Impfung wurden alle Hunde mit einer Suspension einen virulenten Tollwutvirus beimpft. Alle geimpften Hunde überlebten in gutem Zustand, während alle ungeimpften Kontrollhunde starben.



   Zur Veranschaulichung der verbesserten Stärke der mit erfindungsgemäss vermehrtem Tollwutvirus herstellbaren   Valrzinen,    insbesondere nach Reinigung mit Hilfe der oben beschriebenen   Methode,    wurden Meerschweinchen intramuskulär mit Vakzinen wie folgt ge  beimpft:   
1. Virussuspension aus Hühnerembryogewebekultur (TC) vor Grenzverdünnungsreinigung.



   2. Virussuspension aus Hühnerembryogewebekultur nach 10   Grenzverdünnungspassagen.   



   Ein Anteil von jeder Vakzine wurde einer Reihenverdünnung unterworfen, wobei Verdünnungen von   10.1,    10-2,   10-5    bzw. 10-4 eingestellt wurden, bezogen auf die unverdünnten Vakzinen. Gruppen von Meerschweinchen wurden mit jedem der oben beschriebenen Vakzinen geimpft. Jedes Meerschweinchen erhielt eine Injektion von   0,25 ml    von einer der Vakzinen oder Verdünnungen derselben intramuskulär verabreicht.

   Andere   Gruppen    ähnlicher Meerschweinchen wurden ungeimpft als Vergleichstiere belassen. 21 Tage nach der Impfung wurden alle Meerschweinchen mit einem virulenten gewöhnlichen (Strassen) Tollwutvirus infiziert, indem intramuskulär eine so standardisierte Menge des Virus verabreicht wurde, dass wenigstens   s0       /o    Sterblichkeit bei nicht mit Vakzinen behandelten Meerschweinchen auftrat. Die Meerschweinchen wurden dann während der weiteren Haltung auf Anzeichen von Paralyse untersucht. Von der Zahl der Meerschweinchen, die mit jeder Verdünnung der angewendeten Vakzinen geschützt waren, wurde der   50 /o-Schutzendpunkt    für jede Vakzine nach Standardmethoden berechnet.

   Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle   zusammengefasst:    Vakzine- Quelle Maus-Dosis (MLD50) zahl notwendig für einen Schutz von   50 /o    der Meerschweinchen 1 Hühnerembryo TC, 184 ungereinigt 2 Hühnerembryo TC, 35 gereinigt 87    /o    der nicht mit   Vakzin    behandelten Vergleichstieren zeigten Paralyse infolge des Tollwutvirus.



   Die vorstehenden Ergebnisse veranschaulichen die Verbesserung der antigenen Eigenschaften des Tollwutvirus, der auf Hühnerembryogeweben gezüchtet wurde.



  Diese verbesserte antigenen Eigenschaften wurden ohne Erhöhung der Virulenz des Virus für Hunde oder Meerschweinchen erzielt.   

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Vermehrung des Tollwutvirus, dadurch gekennzeichnet, dass Tollwutvirus, das adaptiert worden ist, so dass es in Hühnerembryozellkulturen zu wachsen vermag, in Gegenwart von Hühnerembryozellen vermehrt wird, wobei die Hühnerembryozellen wenigstens während des letzten Vermehrungsschrittes in einem synthetischen, proteinfreien Unterhaltsmedium gehalten werden.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das im letzten Vermehrungsschritt verwendete Tollwutvirus zwecks Reinigung einer oder mehreren Verdünnungspassagen in einer Hühnerembryokultur in einem synthetischen, proteinfreien Unterhaltsmedium unterwirft.

   2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Tollwutvirus anwendet, das wenigstens 3 und vorzugsweise wenigstens 10 Verdünnungspassagen unterworfen worden ist.

   3. Verfahren nach Unteranspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Verdünnungspassagen limitierende Verdünnungspassagen anwendet.

   4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Tollwutvirus anwendet, das durch eine Mehrzahl von aufeinanderfolgenden Passagen durch Intracerebralbeimpfung in Kücken adaptiert oder modifiziert worden ist.

   5. Verfahren nach Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Tollwutvirus anwendet, das durch eine Mehrzahl von aufeinanderfolgenden Passagen in Embryonaleiern weiter adaptiert oder modifiziert worden ist.

   6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Tollwutvirus den Flury Stamm des Tollwutvirus anwendet.

   7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vermehrung im letzten Vermehrungsschritt und/oder in den limitierenden Verdünnungspassagen bei einer Temperatur von 34 bis 37 C durchführt.

   8. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vermehrung im letzten Vermehrungsschritt und/oder in den limitierenden Verdünnungspassagen bei einer Temperatur von etwa 35 C durchführt.

   9. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vermehrung in dem letzten Vermehrungsschritt und/oder in den limitierenden Verdünnungspassagen während einer Zeit von 4 bis 14 Tagen, vorzugsweise 7 bis 9 Tagen, durchführt.

   10. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Hühnerembryozellen in Form von Einschichtgewebekulturen anwendet, die durch Züchtung von Hühnerembryozellen in vitro in einem Nährmedium erhalten worden sind.

   11. Verfahren nach Unteranspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Hühnerembryozellen von dem Zuchtmedium vor der Impfung mit dem Tollwutvirus trennt.