CH467858A

CH467858A - Verfahren zur Gewinnung eines Antibiotikums

Info

Publication number: CH467858A
Application number: CH1527663A
Authority: CH
Inventors: Kawaguchi Hiroshi; Okanishi Masanori; Miyaki Takeo
Original assignee: Bristol Banyu Res Inst Ltd
Priority date: 1962-12-17
Filing date: 1963-12-13
Publication date: 1969-01-31
Also published as: DK107542C; BR6355476D0; FI40452B; GB1064300A

Description

Verfahren zur Gewinnung eines Antibiotikums
Die Erfindung betrifft die Herstellung einer neuen, als Coumermycin bezeichneten Substanz. Coumermycin hemmt das Wachstum grampositiver Bakterien. Es ist ungiftig und zeigt eine therapeutische Wirkung gegen über mit grampositiven Bakterien infizierten Mäusen.

Coumermycin ist gleichfalls bei der Behandlung von Infektionen bei Menschen, die durch grampositive Bakterien hervorgerufen wurden wie beispielsweise Pneumo- nie, wertvoll. Coumermycin wurde auch als Antibioti- kum Bu 620 bezeichnet.

Gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein antibiotischer Wirkstoff erhalten, der das Wachstum grampositiver Bakterien hemmt und aus einer sauren Substanz, dem Coumermycin, besteht, das sich leicht in Aceton, Dioxan und alkalischem Wasser löst, das mässig in Athanol, Butanol, Athylacetat, Butylacetat und Methylisobutylketon, wenig löslich in Benzol, Methanol und Chloroform und unlöslich in Tetrachlorkohlenstoff, Petroläther und angesäuertem Wasser ist, das ferner positive Fehling-und Molisch-Reaktionen ergibt, Brom entfärbt, negative Ninhydrin-, Tollensund Anthronreaktionen ergibt, in gereinigter Form bei 222-224 C schmilzt und [a] D20 = -134 (C = 1, 0, Aceton) aufweist,

ein ultraviolettes Absorptionsspektrum in Athanol mit einem Maximum bei 275 m, u (E 1 cm 1% = 595) und bei 335 mat (E= 498) besitzt, in n/10 HCI Maxima bei 275 m (E1cm 1% = 287) und 345 mu.

(E IL/o = 277) und in n/10 NaOH ein Maximum bei 280 m, (E 766), hat, ein Neutralisationsäquiva- lent von 548 aufweist und folgende durchschnittliche Elementaranalyse ergibt : C 59, 1 % ; H 5, 35 % ; N 5, 90% und O (als Differenz) 29, 65 % ; beim Einschliessen in Kaliumbromid zeigt die Substanz eine charakteristische Absorption im Infrarotgebiet, wie in Fig. 1 gezeigt ist.

In bezug auf die Zeichnungen ist Fig. 1 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums der freien Coumermycinsäure in Kaliumbromid.

Fig. 2 ist eine Kurve des Ultraviolett-Absorptions- spektrums des Coumermycins in einer Athanol'Tösung, in 0, 1n HCI und in 0, ln NaOH.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Gewinnung einer antibiotischen Substanz, die als Coumermycin bezeichnet wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm des Streptomyces rishiriensis in einem wässrigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle und ein stick stoffhaltiges Nährmittel enthält, unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis eine wesentliche Wirksamkeit gegenüber grampositiven Bakterien in der Lösung vorhanden ist, worauf das Coumermycin aus der Lösung abgeschieden wird.

Der das Antibiotikum erzeugende Organismus wurde aus einer Bodenprobe in Rishiri Island, Hokkaido, Japan, isoliert und ist eine neue Art der Streptomyces, die als Streptomyces rishiriensis bezeichnet wird. Eine Kultur des lebenden Organismus mit der Laboratoriumsbezeichnung 404 Y 3 und A 9795 wurde in der American Type Culture Collection, Washington, D. C. hinterlegt und der dortigen Sammlung von Mikroorga- nismen A. T. C. C. 14812 zugefügt.

Der Stamm Nr. 404 Y 3 des S. rishiriensis hat folgende Merkmale :
Kennzeichen der Kultur
W = Wachstum
L = Luftmycel
P = lösliches Pigment
B = biologische Eigenschaften 1. Czapek's Agar :
W : mässig, gelbgrau bis hell braungrau oder elfenbeinfarbig gelb
L : gering, pulverig, wei#
P : keines
2. Glycerin-Czapek's Agar
W : mässig, gelbgrau oder hell braungrau bis blass gelb mit undeutlichem Braun
L : gering, pulverig, weiss
P : keines oder blassgelb mit undeutlichem Braun 3. Glycerm-AmmoniumsaIz-Agar------
W : mässig, leicht gelbgrau bis gelbweiss
L : kärglich, pulverig, deicht gelbgrau bis hellgrau
P : keines
4.

Glukose-Asparagin-Agar
W : gering, dünm, tanzend, hell gelbgraut@@@@@@@@@@
L. keines .-,-,,."!,/;':Li.u;
5. Stärke-Agar
W: gut, hell, gelbbraun bis elfenbeinfarben
L: mä#ig, pulverig, ausgendehr, undeutlich braun bis hellbraun mit Grau P :keines
B : Hydrolyse ist mässig stark
6. Nährmittel-Agar''T
W: mä#ig, rehbraun
L: gering, pulverig, wei#
P : dunkelbraun < .;-"'
7. Bennett's Agar
W: mä#ig, grauolivbraun bis graubraun L : mä#ig, wei# bis hellbraun oder graubraun
P : gelbbraun
8.

HafermehI-Spyton-Agar.,
W: gut, hellgelb mit undeutlichem Braun
L: mä#ig, wei# bis grau mit undeutlichem Braun
P: hellgelb mit undeutlichem Braun
9. Kartoffelpfropfen .W;-'gut,glänzend,faltige'.Oberfläche.'".

'"'.L:'keaies./'"""/"','.

'P:.PfropDenwirdbraunschwarz'..-....j
10.Gelätinestäb'./L-'-.

10. Gelatinestab W: braunschwarze Kolonie auf der Oberflache
L: keines
P : dünkelbrauir." 'B:negativeVerflüssigung'' 1 Tyrösin-Hefe-GeIatinestab:-',. <
W : braunschwarze Kolonie auf der Oberfläche
L :'keines/."
P : dunkelbraun
B :negative.Verflüssigung-' 1 2. Milch
W : braune Ringbildung
L : keines
P : undeutlich braun.

B : nicht aufgeschlossen 13. Nitrallösung'J
W: wei#e, kugelige Masse an der Oberfläche
B: positive Reduktion zu Nitrit 14. Melanin bildendes Medium
W: gering, dünn, grauschwarz L : kärglich, weiss
P: braungrau bis graubraun
B: Melanin positiv 15. Kartoffel-Dextrose-Agar
W: gut, glänzend, braunschwarz.

L : wei# bis hellrosa bis : hellbraun mit undeutli- chem Grau.

P : grau bis tiefgrau Ausnutzung e-O & tMMssüssn
Xylose ++ Inulin ++
Arabinose ++ Salicin
Glucose++Mannit''i;'"."T'v'
Galactosc++Sorbit"
Fructose++Cdlobiose+
Sorbose @@ Rhanmose ++
Sucrose ++ Natriumcitrat +
Maltose Natriumsuccinat +
Lactose ++ Inosit ++
Raffinose + + Kontrolle .¯t'sWach¯stum¯-¯.¯.-¯-¯¯-¯:¯: + mittleres Wachstum ¯ geringes Wachstum -keinWachstum- .-no'i'.,j;';"ioi:ü
Mycologsche Kenezeichen
Die morphologischen Eigenschaften des Stammes wurden an Stärkeagar und Bennett's Agar festgestellt.

Die mikroskopische Untersuchung des Luftmycels ergab ein verwickeltes und verzweigtes Hyphen, das gelegent lich büschelig war, und Sporenträger, die linksgerich tete Spiralen bildeten. Die elektronenmikroskopische
HatersuchuNgg & b;.eineepti & ekbiarss:valehEorBi;der
SporenL.und/.ins.att & .OberNäche.,:l.:-.n.''.

Der Sfrepformyces 404 Y 3 weist ein braungraues
Luftmycel auf und erzeugt in organischen Medien ein braunes oder dunkelbraunes Pigment. Die gelatine verflüssigung dstsowohl beime Gelatinestab als auch beim
Tyrosin-Hefe-Gelatinestab negathy , und Milch wird nicht aufgeschlossen Aus nitrat wird Nitrit erzeigt, und Stärke wird hydrolysiert Der Stamm 404 Y 3 ähneltdem.n-ftdjr.'.di-f,
S.diastatochromosenes, 'i.;L,t!;!':?ittL.t..'K''!-JnDh.Hti'-:/"!-...(.!....

S, griseoruber
S, olivochromogenes, 'S.''aureus'''.""-'"'' 'bn.''..t..'].'ssi..,m..,ht;.Ji:.J..',.. f u,, d,-J fq
S. griseochromogenes,
S. hawaiensis und dem
S. naganisht in mancher Beziehung, wie der Spiralenbildung, der
Farbe des Luftmycels und des melanoiden Pigments, unterscheidet sich aber in gewissen Kulfur- und physio logischen Eigenschaften wie nachstehend gezeigt wird :''JrssoMüMss;.'L,'-.-..

Nach Waksman und Gurtis sind die Sporenträger gerade, und nach Jensen werden linksgerichtete Spiralen gebildet. Die Farbe des Luftmycles wird als wei# bis aschgrau auf Czapek's Agar und grau auf Glucose Asparagin-Agar beschrieben, Die Verflüssigung am
Gelatinestab verläuft ziemlich schnell. tS'Oss!'.'.....

;'ji, jDieForm;.der.S'pore.n,wird,als.zylindrischbeschrie- bete.Fa.rbe..derKaltttr.istro.tlicnorange,a
Czapek s und hell rötlichorange bis purpurront auf
Stärkeagan Unterschiede wurden auch bei der Aus nutzung der Kohlenstoffquelle, wie Sucrose, Raffinose,
Citrat undSuccinat,.gefunden,
S. olivochromagenes:
Unterschiede wurde in der Farbe der Kultur, dem IpchenPigmetaf:Glucose-Asparagtn-Agarun.ddei'
Verdauung von Gelatine und Milch festgestellt.

S. aureus:
Die Farbe der Kultur ist dunkelbraun auf Czapek's und hellorangefarben auf glucose-Asparagin-Agar. Die Gelatineverflüssigung lä#t spater schnelle nach.

S. griseochromogenes:
Dis Farbe des Luftmycels ist wei# bis leicht grau.

Die Gelatineverflüssigung ist mä#ig Milch wird ohne Koagulation abgebaut. Unterschiede sind auch in der Ausnutzung der Kohlenstoffquellen, wie Rhamnose.

InuhnSicin'CitratundSuccinät,restzustetlen." .-nMM'/H:.

S. naganishi.

Die. Farbe der Kultur auf Stärkeagar ist creme farben mit purpurrot, und das lösliche Pigment auf Stärkeagar ist undeutlich rosa. Gelatine wird mä#ig verflüssig. Milch wird koaguliert und abgebaut. Unterschdss'werden;;.iB.,de.Ausnutzung:deF.Kohlenstoff- quellen, :'wie;:Sa6rQserHnd.Sorbit & stgestellt.

'Mm:;StämNie.Rbher'Produktivität.auszuwählea wurde'derursprünglicheStatnih:ultraviolettbestrahlt und"diiedürehMutationentstandenenStämmeausge- sondert. Einige dieser Stämme gro#er produktivität wurden mycologischt untersucht, wobei jedoch merkliche Unterschiede nicht festgestellt werden konnten; au#er da# einige Stämme mit wei#em Luftinycel erhalten wurden.

Im Hinblick auf die oben genannten Kennzeichen des Stammes wurde der Strepomyces 404 Y 3 als neue Art bestimmt und mit Strepomyces rishiriensis nov. sp. bezeichnet.,
Die hier beschriebene Spezies Streptomyces rishi riensis umfasst alle Coumermycin bildenden Stämme, die nicht.vomStammNr.404Y3Unterschiedenwer- den können, sowie dessen Subkulturen einschlie#lich der Mutationen und Varianten. Die Eigenschaften des
Coumermycins werden hier beschrieben, und nach
Kenntnis dieser Eigenschaften ist es leicht, die Coumer mycin bildenden Stämme von andern zu unterscheiden.

Unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, erzeugt der Strepomyces rishiriensis Coumermycin. Eine
CoumermycinenthaltendeFermentationsbrühewird durch'Impf enont-Sporen oder Mycelen'des Coumer- mycin bildenden Organismus in einem geeigneten Me- diunilindanschliessendemZüchtenuntersubmers- aerobehBedingungenhergestellt.DieHerstellungeiner
CöUmBrMycilikultür.iheihem-festenMediumistan sichzwar-mpglich,\dochitdie.Herstellung einer grosse ren'Kultur'nur'in'ememflüssigenMediumwirtschaft- lich.'Daher'wird hier hur die tztgenannte Herstel- lung'be'antsprn.cht.Die'TemperaturderKulturkann sehr schwanken,undzwarbetragtsie am besten20bis
35'C;'vorzagsweise-beträgtsiejedochzwischen26 und30 'Cbei'einemimwesentlichenneutralenpH-
Wert.B & i:"dersübmersenaeroben:

Fermentationdes
Organi ! smus zur Erzeugung von Coumermycin enthält das MediunialsJKahlenstorfquelleeinimHandeL-er-. hältliches Glyceridöl oder Glycerin oder ein Kohlen hydrat, wie glucose, Maltose, Sucrose, Lactose,
Dextrin, Stärke usw. in reinem oder rohem Zustand, und als Quelle für den.'.

Stickstoff eme organische Substanz,"wieSojabohnenmehl,Erdnussmehl,Baum- wollsamenmehl,Fleischextrakt,Peptoh,.Fischmehl;
Heieextrakt,'MaisqüellWasserTisw.'und,falls.erforder- lich, anorganische-Sticlcst6ffquellen, wie-Nitrate und Ammoniumsalze, und Mineralsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, und Magnesiumsulfat und Pufferstoffe, wie Calciumearbonat oder -phosphat, und Spuren von Schwermetallsalzen;

diese Bestandteile sind in dem kanadischen Patent Nr. 513 324 in den britischen Patentschriften Nrn. 730 341 und 736 325 und in den USA-Patentschriften Nrn. 2 691 618, 2 658 018, 2 653 899, 2 586 762, 2 516080, 2483892, 2609 329 und 2 709 672aufgeführt.Beiderbelüftetensubmersen Züchtung wird zweckmä#igerwise ein Antischaummit- tel, wie beispielsweise ein flüssiges Paraffin, Fettöl oder ein Silikon, verwendet. Zur Herstellung, von Coumermycin kann mehr als eine Art von Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle oder Antischaummitel verwendet werden. Im allgemeinen wird die Züchtung fortgesetzt, bis sich mindestens mehrere hundert mcgXml Coumermycin im Medium angesammelt haben. In einigen Fällen fällt der pH-Wert der Brühe am Anfang und steigt dann allmählich wieder.

Beispiel 7 TXefürdieHerstellungdesÄntibiotikumsCoomer- mycihgeeignetenFermentationsbedinungenwurden: untersucht, und es wurde folgende Zusammensetzung des Mediums als vorteilhaft festgestellt: 1,5%'lösticheStärke, 2% Baumwollsamenmehl (PharmamediÅa),
0,1% K2HPO4,
0,1% NaCl, .,0,05.MgS07H2Q,
0, 05 % CaCl & -0,00-1%ZiiS04.70und'
0, 2%Hefeextrakte.:
Coumermycin wird in 3 bis 5 Tagen Fermentation unter hinreichender Belüftung und Rühren erzeugt, und woeohl in der Filtratbrühe als auch im Mycel wurde eine Aktivität festgestellt.

Coumermyein wurde gegen über Staphyloeoccus aureus FDA 209 P durch die Pa pierseheiben-öderZylinderplattenmethodegeprüft.

Beispiel--2
Die iesubmerseaerobeFermentationyonS.rishipiensis (Stamm 404 Y 3) in einem Schüttelkolben und einem
6% Starke (Staelipse I), 3% entbitterte. Brauereihefe und 1% CaCO3 enthaltenden Medium ergab 300 bis
400 meg/ml Coumermycin.

Beispiel 3 -Die. submierse aerobe Fermentation von S. rishiriensis (Stamm 404 Y 3) in einem Schüttelkolben und einem
6% Stärke (Staelipse I), 3% Baumwollsamenmehl (Pharmamedia), 2,5% Destillers solubles und 1%
CaC, enthaltenden.Mediumei-gab150-200mcg/mt Cbümermycm.'
Beispiel 4
Die submerse aerobe Fermentation von S. rishiriensis (Stamm 404 Y 3) in einem Schüttelkolben und einem
1% Sojabohnemehl, 2% Baumwollsamenmehl (Pharma media), 2% lösliche Stärke; 0,5 % Glycerin, 0,2% Hefe extrakte, 0,2% K2HPO4, 0,1% MgSO4, 1% CaCO3 und
0,05% Silikon als Anti-Schaummittel enthaltenden Me dium ergab bei einem pH-Wert von 7 Coumermyein wie folgt :

Zeit pH-Wert Wirksamkeit in mcg/ml
5 Tage 7, 8 70
6 Tage 8, 1 80
7 Tage 8, 3 120
Beispiel 5
Zusammensetzung des Mediums
Sojabohnenmehl 2, 0%
Glycerin 1, 5% %
Hefeextrakt 0, 2 %
Kaliumphosphat, dibasisch 0, 1 %
Natriumchlorid 0, 1 %
Calciumchlorid 0, 05 %
Magnesiumsulfat 0, 05 %
Zinksulfat 0, 001 % pH-Wert 7, 0
Ein die obigen Bestandteile aufweisendes Kulturmedium (100 ml) wurde in einem Kolben mit 500 ml Inhalt sterilisiert, mit einer Kultur von Streptomyces rishiriensis, Stamm 404Y 3,

angeimpftund bei 27 1 C 6 Tage unter Schütteln bebrütet, wobei die Bildung von Coumermycin in der Fermentationsbrühe 150 mcg/ml erreichte.

Beispiel 7
Ein dieselben Substanzen wie in Beispiel 6 enthaltendes Kulturmedium (30 1) wurde in einem 50-1-Tank aus rostfreiem Stahl sterilisiert, mit einer Kultur von Streptomyces rishiriensis geimpft und bei 28 1 C 90 Stunden, bebrütet, wobei die Bildung von Coumermycin in der Fermentationsbrühe 120 mcg/ml erreichte.

Die Fermentationsflüssigkeit (5 1) wurde bei einem pH-Wert von 8, 0 filtriert, das Filtrat auf einen pH-Wert von 6, 0 eingestellt und mit 2 Litern Methylisobutylketon extrahiert. Der Mycelkuchen wurde unter hefti- gem Rühren mit 500 ml Aceton extrahiert und das Extrakt im Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. Das sich ergebende wässrige Konzentrat wurde bei einem pH-Wert von 6, 0 mit 200 ml Methyl- isobutylketon extrahiert.

Die beiden Ketonextrakte wurden vereinigt und mit 500 ml Wasser gewaschen, worauf die Aktivität in 1000 ml kaltes Wasser, das mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 10, 0 eingestellt war, übertragen wurde. Der wässrige Extrakt wurde auf einen pH-Wert von 6, 0 eingestellt und er neut mit 300 ml Athyl'acetat extrahiert, worauf das Konzentrat im Vakuum auf 30 ml eingeengt wurde.

Bei Zusatz von 150 ml Petroläther zu dem Konzentrat bildete sich ein hellbrauner Niederschlag, der aufgenommen, mit wenig Methanol zur Entfernung der Verunreinigungengewaschen und getrocknet wurde, wobei sich 750 mg Coumermycin als Pulver ergaben.

Das so erhaltene Coumermycinpulver (400 mg) wurde in 100 ml Athylacetat gelas und an einer mit 20 g Aluminiumoxyd beschickten, vorher mit Schwefelsäure behandelten Säule absorbiert. Die Säule wurde mit 200 ml Athylacetat gewaschen und mit Methanol eluiert. Das Eluat wurde in Anteilen von 10 ml aufgeteilt, die aktiven Fraktionen vereinigt und im Va kuum zur Trockne eingedampft. Das hellgelbe, feste Coumermycin wurde zweimal aus Methanol umkristalli- siert und ergab 70mgweisses,kristallinesCoumermycin, das bei 218-220 C unter Zersetzung schmolz.

Das Coumermycin wurde weiter nach der Methode e von Craig der Gegenstromverteilung unter Verwen- dung von einem Lösungsmittelsystem aus fünf Teilen (Volumteils) Tetrachlorkohlenstoff, einem Teil Chloro- form, fünf Toiles Methanol und einem Teil Wasser gereinigt. Nach 50 Dbertragungen wurde die Spitzenr konzentration durch die biologische Kurve, die UV Kurve und die Gewichtskurve in Rohr 26 gefunden ; diese Kurven stimmen mit der theoretischen Kurve überein. Die Gefriertrocknung von 10 Röhren um die Spitze ergab reines Coumermycin.

Coumermycin wurde auch durch Umkristallisieren aus wässrigem Aceton und anschliessend aus absolutem Methanol gereinigt, wobei eine bei 220 C unter Zersetzung schmelzende Substanz erhalten wurde.

Coumermycin wurde ferner durch Chromatographie an Aluminiumoxyd gereinigt, wobei 39, 7 mg (Wirksamkeit 500 mcg/mg) in Athylacetat gelöst und an 2 g A1203 (pH-Wert 4, 7, behandelt mit H2SO4) absor- biert wurden. Nach Waschen mit Athylacetat wurde die Säule anschliessend mit Methanol und angesäuertem Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, neutralisiert, im Vakuum eingeengt und dann der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 12, 4 mg als hellgelbes Pulver (Wirksamkeit 700 mcg/mg) erhalten wurden.

Das Coumermycin (480 mg) wurde mit einer geringen Menge Aktivkohle in Acetonlösung behandelt und anschliessend aus heissem Athanol umkristallisiert, wobei 230 mg kristallines Coumermycin erhalten wurden, die im Vakuum drei Stunden bei 50 C getrocknet wurden.

Schmelzpunkt 222-224 C (Zers.), pKa. 6, 32 in 75 Aceton ; Titrationsäquivalent 526, 5.

Analyse : Berechnet für C2GH26N2Oso :
C 59, 35 H 4, 98 N 5, 32
Gefunden. : C 59, 1 H 5, 35 N 5, 90
Die Molekulargewichtsbestimmung nach der kryoskopischen Methode in Dioxan ergab einen Wert von 500 + 20. Die spezifische Drehung [a] D betrug -134, 4 (C = 1%, Aceton) im Vergleich zu-69, 6 für Novobiocin unter denselben Bedingungen. Coumermycin ergab eine negative (braun) Anthronreaktion, während Novobiocin eine positive (grün) Reaktion ergab.

Eine Lösung von 100 mg Coumermycin in 120 ml absolutem Athanol wurde mit 0, 25 g Katalysator nach Adams unterAtmosphärendruck vonWasserstoff dreissig Minuten bei Raumtemperatur verrührt. Eine Wasser- stoffaufnahme wurde nicht beobachtet. Nach Entfernung des Katalysators wurden dem Filtrat 35 ml Wasser unter heftigem Rühren zugesetzt. Durch Zufügen von 0, 5 ml einer unnormalen Salzsäure zu der entstandenen Emulsion wurde eine feste, weisse Substanz ausgefällt, die aufgenommen und getrocknet wurde ; das Gewicht betrug 88, 7 mg, und die Papierchromatographie ergab, dass es sich um das ursprüngliche Aus gangsmaterial, das heisst Coumermycin, handelt. Unter denselben Bedingungenergabengemässder papierchromatographischen Analyse (F. I.

Wolf et al., Antibiotics Annual 1956-1957, S. 1035) 1000 mg Novo biocin 946 mg Dihydronovobiocin.

Coumermycin gibt positive Fehling-und Molischreaktionen und entfärbt Brom.

Die Papierstreifen-Chromatographie des Coumermycins lieferte folgende Ergebnisse :
Lösungsmittelsystem Rf-Werte
Wässriges Butanol 0, 15 3%iges wä#riges Ammoniumchlorid 0, 03
75% iges Phenol 0, 95
50%iges Aceton 0, 75 Butanol-Methanol-Wasser(4:1 : 2) + 2%
Methylorange 0, 45 Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) 0, 40 Benzol-Methanol (4 : 1) 0, 05
Destilliertes Wasser 0, 05 Butanol-Wasser (4 : 1) + 0, 25% p-Toluol isulfonsäure 0, 30 Butanol-Wasser-Essigsäure (2 : 1 : 1) 0, 50
Butanol-Wasser (4 :

1) + 2% Piperidin 0, 25
Coumermycin ist leicht in Aceton, Dioxan und alkalischem Wasser, mässig in Athanol, Butanol, Athyl acetat, Butylacetat und Methylisobutylketon, wenig in
Benzol, Methanol und Chloroform löslich und unlös- lich in Tetrachlorkohlenstoff, Petroläther und ange säuertem Wasser.

Wie in Fig. 2 zu sehen ist, zeigt das Ultraviolett Absorptionsspektrum folgende Maxima : Maxima in Athanol
275 m, (E=595), 335 m, (E}=498) Maxima in n/10 HCl
275 m.(E=287), 345 m, (E=277) Maximum in n/10 NaOH
280 m, u (E z = 766)
Wie aus Fig. 1 zu entnehmen ist, zeigt Coumer mycin in Kaliumbromid charakteristische Infrarot-Ab- sorptionsmaxiima bei folgenden Wellenlängen in Mikron :
2, 99 ; 3, 36 (Schulter) ; 3, 45 ; 5, 88 (Schulter) ; 5, 92 ;
6, 10 ; 6, 24 ; 6, 45 ; 6, 55 ; 6, 7 ; 7, 2 ; 7, 65 ; 7, 85 ; 8, 9 ;
9, 2 ; 9, 6 ;

10, 05 ; 10, 3 ; 10, 6 ; 11, 3 ; 12, 25 ; 12, 65 ; 13, 1 ;
13, 35.

Damit sind Coumermycin und Novobiocin deutlich voneinander verschieden, beispielsweise durch den Schmelzpunkt, die Elementaranalyse,die spezifische Drehung, die Ultraviolett-und Infrarot-Absorptions- spektren, die Anthronreaktion und das Verhalten bei der Papierstreifenchromatographie.

Coumermycin ist eine saure organische Verbindung, die sich leicht in alkalischen Lösungen wie wässrigen Lösungen der Alkali-und Erdalkalimetallhydroxyde löst. Die Lösung des von Coumermycm in wässriger Natronlauge oder Calciumhydroxyd bildet das Natriumbzw. Calciumsalz, das beispielsweise durch Gefrier- trocknung, falls erwünscht, isoliert werden kann. In gleicher Weise werden Salze mit organischen Basen gebildet ; ein Zusatz von Streptomycin und Dihydro- streptomycin zu Coumermycin bildet die Streptomycinbzw. Dihydrostreptomycinsalze des Coumermycins ; bei dieser Reaktion wird vorteilhaft ein organisches Lö- sungsmittel, wie Äthylacetat, verwendet.

Andere Aminsalze, die verwendet werden können, sind die in der Therapie als Salze des Benzylpenicillins benützten, z. B. Procain, N-Benzyl-/?-phenäthylamin,Hydrabamin, Ephenamin, N, N'-Dibenzyläthylendiamin, Dehydro- abietylamin und Dicyclohexylamin. Ansäuern einer wässrigen Lösung von Natrium-Coumermycin dient zur Ausfällung des gereinigten Coumermycins als freie Säure.

Eine bevorzugte Methode zur Isolierung von Coumermycin aus einer Fermentationsflüssigkeit besteht im Extrahieren der gesamten Flüssigkeit bei einem pH Wert von 6, 01 mit dem halben Volumen Methylisobutylketon, Rückextraktion bei einem pH-Wert von 10, 0 in Wasser (ein Viertel des Volumes der Methyliso- butylketonphase) und erneuter Extraktion bei einem pH-Wert von 6, 0 in Äthylacetat oder Methylisobutylketon (ein Drittel des Volumens der letzten wässrigen Phase). Die schliesslich konzentrierte Lösung von Coumermycin in dem organischen Lösungsmittel wird dann auf ein Zehntel oder ein Zwanzigstel des ur sprünglichen Volumes durch Destillation im Vakuum eingeengt.

Das Coumermycin wird dann, wenn es nicht gleich ausfällt, durch Zusatz einer Mischung niederer Alkane ausgefällt, z. B. durch Zusatz von 10 Volumen der im Handel unter der Bezeichnung Skellysolve B befindlichen Substanz.

Coumermycin kann auch vollständig aus den filtrierten Brühen durch Adsorption an Aktivkohle ( Darco KB ) und anschliessendem Eluieren gewonnen werden ; dieses Verfahren ist der Lösungsmittelextrak- tion der gesamten Brühe jedoch nicht überlegen, da in vielen Brühen das Coumermycin sich im Mycel be- findet.

Mikrobiologische Untersuchungen des Coumermycins Antibakteriele Aktivitat in vitro. Die minimale Hemmungskonzentration (MHK) von Coumermycin gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen wurde durch eineAgarverdünnungsreihe unter Verwendung von Pferdeblutagar für hämolytische Streptokokken und Pneumokokken,Glucose-Hefeextrakt-Pepton-Agarfür Milchsäurebazillen, Nährmittel-Agar für andere Bakterien, 2 % igen Glucose-Sabouraud-Agar für Pilze und Kirchners Flüssigkeit für Tuberkelbazillen bestimmt.

Die Ergebnisse sindinTabellenform nachstehend zu sammen mit den mit Novobiocin erhaltenen aufgeführt : Antibakterielles Spektrum des Coumermycins (Agar-Verdiinnungsmethode)
Hemmende Konzentration Testorganismen mcg/cm3
Coumermycin Novobiocin Gram-negativ
Escherichia coliNIHJ > 50 3, 13
Escherichia coli P01495 > 50 50
Klebsiella pneumoniae Type A 3, 13 12, 5
Salmonella typhi > 50 6, 25
Hemmende Konzentration Testorganismen mcg/cm3
Coumermycin Novobiocin
Shigella flexneri > 50 6, 25
Shigella dysenteriae A > 50 25 Neisseria sp.

(CP-R) > 50 12, 5
Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 > 50 > 50
Pseudomonas aeruginosa > 50 > 50 Vibrio metchinikovii 0, 025 0, 1 Gram-positiv
Staphylococcus aureus FDA 209P 0, 003 0, 049
S. aureus FDA 209P (SM, St-R) 0, 003 0, 049
S. aureus FDA 209P (NB-R) 1, 56 6, 25
S. aureus 52-34 (TC, EM, CM, PC-R) 0, 003 0, 1
S. aureus Smith strain 0, 006 0, 049
S. aureus 193 (PC, TC-R) 0, 003 0, 049
S. aureus 193 (PC, TC, EM, CM-R) 0, 003 0, 1
S. aureus 193 (PC, TC, EM-R) 0, 003 0, 049
S.

aureus Terajima 0, 003 0, 012
S. albus 0, 006 0, 049
Micrococcus flavus 0, 006 0, 049 SarcinaluteaPCI 1001 0, 025 0, 1
B. subtils PCI 219 50 0, 1
B. sphericus 122 0, 78 0, 1
B. mycoides Os- 0, 78 0, 39
B. cereusATCC10702 3, 13 0, 78
B. anthracis :

115 0, 78 0, 1 Lactobacillus casei ATCC 7469 > 50 0, 1
L. acidophilus B-406-1 > 50 0, 1
Streptococcus faecalis B-40203 3, 13 0, 39
S. pyogenes Type 3 3, 13 0, 78
Diplococcus pneumoniae Type II 1, 56 0, 78
Mycobacterium 607 50 50
Mycobacterium phlei 50 12, 5 Pilze
Aspergillus niger van Tieghem > 50 > 50
Penicillium chrysogenum > 50 > 50
Candida albicans > 50 > 50
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 > 50 > 50
Trichophyton mentagrophytes > 50 > 50 Abkürzungen :

-R = Resistent
SM = Streptomycin
ST = Streptothricin
NB = Novobiocin
TC = Tetracyclin PC = PeniciBin
EM = Erythromycin
CM = Carbomycin
Die minimalen Hemmungskonzentrationen des Coumermycins wurden auch in einem zweifachen Röhrenverdünnungsverfahren unter Verwendung von Nährstoff-Flüssigkeit ausser für hämolytische Streptokokken und Pneumokokken untersucht, die mit einem Hirn-Herz-Aufguss geprüft wurden.

Die Ergebnisse sind nachstehend zusammen mit dem Aktivitätsverhältnis von Coumermycin und Novobiocin aufgeführt :
Antibakterielles Spektrum des Coumermycins (Röhren-Vordünnungsmethode)
Coumermycin Novobiocin
Testorganismen Verhältnis mcg/ml mcg/ml
Klebsiella pneumoniae 3,13 6,25 2
Staphylococcus aureus FDA 209P 0, 0015 0, 049 32 Staphylococcus aureus Terajima 0, 00075 0, 012 16 StaphylococcusaureusSmith 0, 0015 0, 024 16
SarcinaluteaPCI 1001 0, 006 0, 049 8 Corynebacteriumxerosis53-K-l0, 00075 0, 024 32 Bacillus cereus ATCC 10702 0, 78 0, 78 1 Bacillus anthracis 115 0,

39 0, 195 l/2 Streptococcus pyogenes Type 3 0, 049 0, 39 8 Diplococcus pneumoniae Type II 0, 098 0, 098 1
Coumermycin hemmt das Wachstum verschiedener grampositiver Bakterien ausser dem Bacillus subtils und Milchsäurebakterien, die gegenüber Novobiocin empfindlich sind. Coumermycin ist besonders aktiv gegen Staphylokokken, wobei die Aktivität 10-bis 30mal grösser als die des Novobiocins ist. Es besitzt jedoch gegenüber den im Laboratorium gegen Novobiocin resistent gemachten Staphylokokken verringerte Aktivität.

Wirkung der Impfstoffgrösse auf die Hemmungs- konzentration
Unter Verwendung von Staph. aureus Smith und
Staph. aureus, Stamm 193 als Testorganismen in Nährlösung wurden Rohrenverdünnungen mit verschiedenen Impfstoffgrössen durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend in einer Tabelle aufgeführt, und es ist zu sehen, dass die WirkunggrosserImpfsto-ffmengenähn- lich der von Novobiocin ist.

Wirkung der 7mpf0OH//MMtHK < 7KK < rOK Impfstoffgrösse (Zelle/ml)
Testorganismen Antibiotikum lOT lO6 105 104 103 102 (MHK in mcg/ml)
S. aureus Smith Coumermycin 0, 012 0, 012 O ;

U03 0, 003 0, 003 0, 003
S. aureusSmith Novobiocin 0, 39 0, 39 0, 195 0, 098 0, 098 0,098
S. aureus Coumermycin 0, 024 0, 003 0, 0015 0, 0015 0, 0015 0, 0015 strain 193 S. aureus Novobiocin 0, 78 0, 195 0, 098 0, 098 0, 098 0, 098 strain 193
Wirkung des pH-Wertes des Mediums auf die
Hemmungskonzentration
Die MHK des Coumermycins wurde durch die Me diumsverdünnungsmethode bestimmt, wobei der pH Wert auf verschiedene Werte eingestellt wurde.

Als Testmedium wurde Nährlösung und Difco's Hirn-Herz Aufgussbriihe verwendet, und eine lOfache Verdünnung einer eine Nacht alten Kultur von Staph. aureus
Smith (l'Os Zellen/ml) wurde in jeder Röhre geimpft.

Wie nachfolgend zu sehen ist, steigt die Aktivität von
Coumermycin bei saurem pH-Wert und fällt bei alka- lischem pH-Wert. Die vergleichsweisen Daten mit Novobiocin ergebeny dass Coumermycin durch den pH Wert des Mediums stärkerals.Novobiocinbeeinflusst wird.

Einwirkung des pH-Wertes des Mediums auf die MHK
Coumermycin Novobiocin pH des Mediums (MHK in mcg/ml)
NB* HHA** NB HHA
6, 3 0, 00010,000050,0240,024
7, 0 0, 003 0, 006 0, 098 0, 098
7, 6 0, 049 0, 098 0, 195 0, 39
8, 2 0, 39 0, 78 0, 78 0, 78
8, 5 1, 56 3, 13 1, 56 1, 56 * NB = Nährbrühe *6 HHA= Hirn-Herz-Aufguss Einfluss des Mediums czuf die Hemmungskonzentration
Der Einfluss wurde unter Verwendung von vier Medien bestimmt, nämlich Nährbrühe, Him-Herz- Aufguss (Difco), Tryptikase-Soja-Brühe und 1% Hefe extraktbrühe. Die MHK wurde durch die zur Bestimmung verwendeten Medien nicht beeinflusst,

solange der pH-Wert eingestellt wurde.

Einflu# des Serums auf die Hemmungskonzentration
Es wurden steigende Konzentrationen an menschlichem Serum der Nährbrühe zugesetzt, die einen Phbs phatpuffer von 1/10 m Konzentration enthielt, um den pH-Wert des Mediums auf 7, 2 zu halten. Als, Testorganismus wurde Staph. aureus Smith verwendet.

Die Impfmenge betrug 105 Zellen/ml. Wie nachfolgend zu sehen ist, wurde die MHK durch das Serum merklich beeinflusst : Serumeinflu# auf die MHK
MHK in mcg/ml Serumkonzentration Coumermycin Novobiocin ohne Serum 0, 003 0, 098
2, 5 % 0, 024 0, 195 5 % 0, 098 0, 195
10 % 0, 098 0, 39
20% 0, 098 0, 18
50% 0, 195 3, 13
Aktivität von Coumermycin gegenüber klinisch isolierten Staphylokokken
Eine Anzahl von Staph.

aureus-Kulturen (126 Stämme), die aus klinischen Quellen isoliert wurden, wurden in Vitro gegenüber Coumermycin und sechs handelsiiblichen Antibiotica untersucht, nämlich Benzyl pemcjlun,Dmydrostreptomycm,Tetracycun,Jbrythro- mycin, Kanamycin und Novobiocin.

Die durch zehnfache Agar-Reihen-Verdünnung erhaltenen MHK-Werte waren folgende : Empfindlichkeit klinisch isolierter Staphylokkken gegenüber Coumermycin und handelsüblichen Antibiotica
Coumer-Antibiotica mycin PC DSM TC EM KM NB > 100 0 0 3 0 0 0 0 100 0 1 16 2 1 0 0 10 0 7 103 0 3 0 1* 1 0 89 2 8 117 123 0 0, 1 1 * 21 0 114 3 3 122
0, 01 52 7 2 2 0 0 1
0, 001 48 0 0 0 2 0 2 0, 0001 21 0 0 0 0 0 0 0,

00001 4 0 0 0 0 0 0 * = gleicher Stamm
PC = Benzylpenicillin
DSM = Dihydrostreptomycin
TC = Tetracyclin
EM = Erythromycin
KM = Kanamycin
NB = Novobiocin
Die Ergebnisse zeigen, dal3 Coumermycin gegen Staphylokokken : hochwirksam ist und mit andern Antibiotica keine überlagerte Resistenz aufweist. Nur einer der 126 Stämme, der gegenüber Novobiocin resistent war, war gegen Coumermycin weniger empfindlich ; der MHK-Wert des Coumermycins bei diesem Stamm betrug jedoch auch 0, 1 mcg/ml.

In vivo-Versuche an Coumermycin Toxizität. Coumermycin ist ein Antibiotikum geringer Toxizität. Die intramuskuläre LDÏo wurde bei ; 500 mg/kg an Mäusen festgestellt.

Chemotherapeutische Wirlcung. Die Aktivität von Coumermycin in vivo wurde an Mäusen bei experimenteller Infektion mit Staph. aureus Smith festgestellt.

Die Mäuse wurden intraperitoneal mit 100 X LDao des Krankheitserregers infiziert, und das Antibiotikum wurde intramuskulär oder oral sofort nach der bakteriellen Infektion. Ein einzelner intramuskulärer CDÏO- Wert (50% heilende Dosis) von 0, 3 mg/kg und ein einzelner oraler CDgo-Wert von 4, 5 mg/kg wurde erhalten.

In einem Verglbichsversuch wurden die intramuskulären und oralen CDSo-Werte des Novobiocins zu 6, 0 mg/kg und 10,0mg/kgermittelt. Die Daten werden nachstehend aufgeführt:
Chemotherapeutische Wirkung des Coumermycins (Intramuskulare Therapie)
Dosis in mg/kg Coumermycin Novobiocin
50 5/5* 6/6
25 5/5 6/6
12, 5 5/5 4/6
6, 25 11/11 4/6
3, 12 6/6 1/6
1, 56 6/6 0/6
0, 78 12/12 0/6
0, 39 4/6- 0, 19 1/6
0,

10 1/6-
0, 05 0/6-
Kontrolle 0/12 0/12 * = Zahl der überlebenden Mäuse/Zahl der infizierten Mäuse Chemotherapeutische Wirkung von Coumermycin (Orale Therapie)
Dosis in mg/kg Coumermycin Novobiocin 100 5/5
50 11/11 6/6
25 6/6 6/6
12, 5 6/6 5/6
6, 25 10/12 1/6
3, 12 1/6 1/6
1, 56 0/6 0/6
0, 78 0/6 0/6
Kontrolle 0/12 0/12
Coumermycin ist ein wertvolles Mittel zur Behand- lung der Mastitis des Viehs oder der Kälberruhr ;

für diesen Zweck werden beispielsweise Suspensionen in pflanzlichen Olen zum Einflössen in die Zitzen der zu behandelten Mastitis hergestellt, die 1 bis 1000 mg/ml und vorzugsweise etwa 50 mg des Antibiotikums ent- halten, oder genügend Kapseln bereitet, so dass eine Gesamtdosis von 0, 25 bis 2, 0 g bei oraler Anwendung für die Kalbsruhr vorliegt.

Falls es für besondere Zwecke erforderlich und pharmazeutisch verträglich ist, können mit dem erfin- dungsgemäss gewonnenen Antibiotikum noch andere Mediamente, wie Antihistamine, Sulfaverbindungen [z. B. Sulfadiazin, Sulfabenzamid,Sulfacetamid,
Sulfanilamid, Sulfapyridin, Sulfathiazol,
Sulfapyrazin, Sulfaguanidin, Sulfathalidin,
Sulfasuccidin, Sulfaisoxazol, Sulfamylon, Phthalylsulfacetamid,
N'-3, SDimethylbenzoylsulfanilamid,
Benzylsulfanilamid und N-2-[2-(chinoxalyl)-sulfanilamid], lipotrope Mittel (besonders Methionin, Cholin,

Inosit und/ ss-Sitosterol und deren Mischungen),
Stimulation des Zentralnervensystems (z. B, Coffein, Amphetamine) Lokalanästetika, Analygetika (z. B. Acetylsalicylsäure, Salicylamid,
Natriumgentisat, p-Acetylaminophenol, Phenacetin, Codein), Sedativa (z. B. Barbiturate, Bromide),
Salze des, Benzylpenicillins (z.

B. Kalium-Penicillin G, Procain-Penicillin G, 1-Ephenamin-PeniciHin G, Dibenzylamin-Penicillin G, weitere in der USA-Patentschrift Nr. 2 627 491 beschriebene Salze, wobei diese Kombinationen besonders zur Anderung des Blutbildes dienen), Phenoxymethpenicillin, Phenäthicillin, Methicillin, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, Cephalothin und andere synthetische Penicilline und deren Salze, andere Antibiotika (z. B.

Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Bacitracin, Polymyxin, Tyrothricin, Erythromycin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Tetracyclin, Oleandomycin,
Chloramphenicol, Magnamycin, Novobiocin, Cycloserin, Neomycin, Kanamycin ; in manchen Fällen greifen diese Kombinationen ein grösseres Gebiet von Organismen an, zeigen synergistische Wirksamkeit oder besitzen eine verringerte Toxizität bei gleicher Wirksamkeit),
Vitamine (z. B. A, Ai, Bl, B2, B6, B12, und Glieder dieser Gruppe, Folsäure und Glieder dieser
Reihe, Vitamine C, D2, Ds und E),
Hormone (z. B. Cortison, Hydrocortison, 9-a-Fluorcortison,9-a-FIuorhydrocortison,
Prednison und Prednisolon), anaboHsche Mittel (z.

B. 11, 17-Dihydroxy-9-a-fluor 17a-methyl-4-androsten-3-on ; 17-a-i2ithyl-l9-nortestosteron) und
Fungicide (z. B. Mycostatin).

Das erfindungsgemäss gewonnene Antibiotikum ist ein wertvolles Mittel zur Bestimmung von Verseuchungen durch grampositive Bakterien, Pilze, Hefepilze und dergleichen der Erzeugung der Enzyme Streptokinase und Streptodbmase durch Züchtung von Streptokollen und der Erzeugung von Amylase durch Fermentation von B. subtilis oder B. cereus. So ermöglicht der Zusatz von 1 bis 1000 mcg/ml und vorzugsweise von etwa 10 mcg/ml des Antibiotikums zu einer entspre- chenden Menge des geimpften und anschliessend bebrüteten Mediums das Wachstum unerwünschter Begleitstoffe und deren visuelle Bestimmung.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Gewinnung eines Antibiotikums der Bezeich, nung Coumermycin, dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm von Streptomyces rishiriensis bzw. dessen Mutanten, und Varianten in einem wässrigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle und ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthält, unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis die Lösung eine wesentliche Aktivität gegenüber grampositiven Bakte rien aufweist, und anschliessend das Comuermycin aus der Lösung abgeschieden wird.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus der Streptomyces rishieriensis A. T. C. C. 14812 ist.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dal3 das Antibiotikum Coumermycin aus der Fermentationsbrühe durch Extraktion bei einem rauren pH-Wert mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel abgetrennt wird, in dem das Antibiotikum löslich ist.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum Coumermycin aus der Fermentationsbrühe durch Extraktion bei einem sauren pH-Wert mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel abgetrennt wird, in dem das Antibiotikum löslich ist, worauf das Coumermycin enthaltende Lösungsmittel konzentriert wird.

4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei einer Temperatur von 20 ! bis 35 C, vorzugsweise von 26 bis 30 C, durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass dem wässrigen Fermentationsmedium ein Antischaummittel zugesetzt wird.