Verfahren zur Herstellung eines Lactons und dessen Verwendung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Lactons der Formel I
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Die neue Verbindung der Formel I und deren Derivate können Oestrogenaktivität aufweisen, bzw. die Wachstumsgeschwindigkeit von fleischerzeugenden Tie ren, z. B. Rindern, Schafen und Schweinen, steigern.
Ein bekanntes Oestrogen ist Diäthylstilböstrol, das in weitem Umfange zur Unterstützung der Wachstumssteigerung von fleischerzeugenden Tieren verwendet wird. Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte neue Verbindung und deren Derivate haben besondere Vor teile gegenüber Diäthylstilböstrol.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I zeichnet sich dadurch aus, dass man eine Verbindung der Formel II
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unter Reduktionsbedingungen, die nur zum Reduzieren der olefinischen Bindung und der Ketogruppe durch Addition von 4 Wasserstoffatomen ausreichen, hy driert Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung des nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Lactons der Formel I, zur Herstellung entsprechender O-acylierter Derivate. Vorzugsweise werden die Acetyl- oder Valerylderivate hergestellt.
Es gibt zwei Diastereoisomere der nach dem erfin dungsgemässen Verfahren hergestellten Verbindungen bzw. der aus ihren erzeugten Acylverbindungen und diese können verschiedene Aktivität bestitzen. Die Dia- stereoisomeren können durch ihre Schmelzpunkte unter schieden werden, und da das höher schmelzende im allgemeinen weniger löslich, beispielsweise in Mischun gen aus Isopropylalkohol und Wasser, ist, lassen sich die Diastereoisomeren trennen.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren herge stellte Verbindung der Formel I und deren Acylderivate können Tieren auf geeignete Weise z. B. oral oder parenteral, verabreicht werden.
Beispielsweise können die Verbindungen mit gewöhnlichem Futter verschnitten werden, das Nährwerte in ausreichender Menge zur Erzeugung der gewünschten Wachstumsgeschwindigkeit enthält und können so den Tieren unmittelbar verfüttert werden, oder die Verbindung kann in einem geeigneten Injektionsmittel, wie Erdnussöl, suspendiert und paren- teral injiziert werden.
Die einem Tier verfütterte Menge der Verbindung schwankt natürlich je nach der Tierart der gewünschten Wachstumsgeschwindigkeit und der gleichen.
Wenn die neuen Produkte im Futter verabreicht werden sollen, kann eine Futtermasse zubereitet werden, welche die üblichen ernährungshinschtlich abgeglichenen Mengen an Kohlehydraten, Proteinen, Vitaminen und Mineralstoffen, zusammen mit nach -der Erfindung her gestellten bzw. acylierten Verbindungen, enthält.
-Diese üblichen Diätbestandteile sind Getreide, wie gemahlenes Getreide und Getreidenebenprodukte, tierische Protein substanzen, wie solche, die sich in Fischmehl und Fleischabfällen finden, pflanzliche Proteine, wie Soja bohnenölmehl, Erdnussölmehl, Vitaminstoffe, wie Vita min A- und D-Gemische, Riboflavinergänzungsstoffe und andere Vertreter des Vitamin B- Komplexes, ferner Knochenmehl und Kalkmehl zur Lieferung der Mineral stoffe. Eine übliche Futtermittelart zur Verwendung bei Rindern ist Alfaalfaheu und gemahlene Maiskolben gewünschtenfalls zusammen mit Vitaminergänzungsstof fen.
Die beim erfindungsgemässen Verfahren als Aus gangsmaterial eingesetzte Verbindung der Formel II kann als Gärungsöstrogensubstanz bezeichnet werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Ver fahrens kann man die olefinische Bindung und die Ke tongruppe in Gegenwart von Wasserstoff unter Anwen dung üblicher Reduktionsmethoden, beispielsweise in Gegenhart eines Raney-Nickelkatalysators, reduzieren, wobei insgesamt vier Wasserstoffatome verbraucht wer den. Die hier verwendete Nomenclatur basiert auf der Verbindung der Gärungsöstrogensubstanz. Beispielswei se wird die nach Reduktion der Olefinbindung und der Ketogruppe erhaltene Verbindung als Tetrahydr-Gä rungsöstrogensubstanz bezeichnet.
Die nach dem erfin- dungsgemässen Verfahren hergestellten Verbindungen in denen die beiden phenolischen OH Gruppen acyliert sind, werden als Diacyl- und wenn nur eine acyliert ist, als Monoacyl-tetrahydro-Gärungsöstrogensubstanz be zeichnet.
Die Reduktion der Gärungsöstrogensubstanz erfolgt vorzugsweise nach deren :Suspendierung oder Auflösung in einem geeigneten Mittel, z. B. einem Alkohol, vor zugsweise einem niederen Alkohol, wie Methanol, Aet- hanol, usw. Im allgemeinen kann die Reduktion bei Umgebungstemperatur und gewöhnlichem Druck durch geführt werden. Bevorzugte Temperaturen liegen bei etwa 15 bis 40 C. Bevorzugte Drücke betragen etwa 1 bis 100 atm. Im allgemeinen werden etwa 0,1 bis 5 Gramm Katalysator je Gramm Gärungsöstrogensubstanz gebraucht.
Die Gärungsbstrogensubstanz wird so bezeichnet, weil eine übliche Methode zu ihrer Herstellung in der Züchtung des Organismus Gibberella zeae (Gordon) gemäss Niederlegung bei der Northern Utilization Re- search and Development Division des Landwirtschafts- ministeriums der Vereinigten Staaten von Amerika unter der Nummer NRRL-2830 besteht.
Die folgenden Beispiele sollen zur näheren Erläute- rung des erfindungsgemässen Verfahrens dienen. Das Präparat I soll die Herstellung eines geeigneten Impfme diums, das den Organismus Gibberella zeae (Gordon) NRRL-2830 enthält, erläutern. <I>Präparat 1</I> Eine Sporensandkultur von Gibberella zeae (Gor don) NRRL-2830 wurde aseptisch in ein steriles Rohr gebracht, das 15 ml Czapek's-Dox-Lösung und eine kleine Menge Agar enthielt. Dann wurde das Medium etwa 168 Stunden bei ungefähr 25 C bebrütet.
Nach Ablauf der Bebrütungszeit wurde das Medium mit 5 ml sterilem entionisiertem Wasser gewaschen und in ein steriles Rohr übertragen, das 45 ml Czapek's-Dox-Lö- sung enthielt. Der Rohrinhalt wurde dann etwa 96 Stunden bei ungefähr 25 C bebrütet, worauf das Mate rial für die Impfung eines Gärmediums verfügbar war.
Das folgende Präparat II veranschaulicht ein Gä rungsverfahren unter Verwendung des Organismus Gib- berella zeae (Gordon) NRRL-2830 unter Erzeugung von Gärungsöstrogensubstanz. <I>Präparat 11</I> In einen Zweiliterkolben wurden 300 g fein zerteilter Mais gegeben. Der Kolben mit Inhalt darauf sterilisiert und dann wurden 150 ml steriles entionisiertes Wasser zugegeben. Die Mischung im Kolben wurde dann mit 45 ml des gemäss Präparat I hergestellten Impfmediums versetzt und das Material wurde völlig durchgemischt. Dann wurde die Mischung etwa 20 Tage bei 25 C in einer Dunkelkammer in einer mit Wasser gesättigten Atmosphäre bebrütet.
Das folgende Präparat erläutert die Gewinnung der Gärungsöstrogensubstanz aus dem Gärmedium. <I>Präparat 111</I> Ein Anteil des gemäss Präparat 1I vergorenen Materials von 300 g wurde in 500 ml entionisiertes Wasser gegeben und aufgeschlämmt. Dann wurde der Schlamm etwa 15 Minuten auf 75 C erhitzt, mit 300 g Filterhilfe versetzt und filtriert. Das feste abfiltrierte Material mit der anabolischen Substanz wurde darauf an der Luft getrocknet,
und 333 g d es trockenen Kuchens wurden dann mit 500 ml Aethanol extrahiert. Diese Verfahrensweise wurde noch 3 mal wiederholt. Der Aethanolextrakt wurde zur Trocknung unter Vakuum eingedampft und lieferte 6,84g festen Stoff. Letzterer wurde darauf in 20m1 Chloroform aufgelöst und mit 30 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 5 Gew.% Natriumcarbornat und eingestellt auf pH etwa 11,2, extrahiert. Der Extraktionsprozess wurde noch 7 mal wiederholt. Der pH-Wert des Natriumcarbonatextraktes wurde dann mit Salzsäure auf 6,2 eingestellt und lieferte einen anabolische Substanz enthaltenden Niederschlag.
,Der Niederschlag und der wässrige Natriumcarbonatex- trakt wurde darauf jeder wiederum mit 75 ml Aethylät- her extrahiert. Dieser Vorgang wurde noch dreimal wiederholt und ergab eine hellgelbe ätherische Lösung, die bei Eindampfung zur Trockne 160 mg feste anaboli- sche Substanz lieferte.
Dieses Material wurde dann einer mehrfachen Übertragungsgegenstromverteilung unter Verwendung von 100 Röhren und eines Lösungsmittel systems unterzogen, das aus 'zwei Teilen Chloroform und zwei Teilen Tetrachlorkohlenstoff als unterer Phase und vier Teilen Methanol und ein Teil Wasser als oberer Phase, bestand. Alle Teile beziehen sch auf das Volu men. Das aus der mehrfachen Übertragungsgegenstrom- verteilung erhaltene feste Material bestand aus Gärungs östrogensubstanz.
Die folgenden Bespiele 1 bis 3 erläutern die Reduk tion dieser Substanz zur Tetrahydroverbindung. <I>Beispiel 1</I> Tetrahydro-Gärungsöstrogensubstanz wurde herge stellt, indem man 0,5 g Gärungsöstrogensubstanz in 200 ml Aethanol auflöste und die Lösung 3 Stunden bei 30 C unter 70 kg/cm2 (l00 Psi) an Kontakt mit 2 g Raney-Nickel als Katalysator reduzierte. Nach Filtrieren und Einengen des Reaktionsgemisches wurde das Pro dukt mit 2 bis 3 ml 2-Nitropropan gewaschen und zur Kristallisation gebracht. Es zeigte einen Schmelzpunkt von 143 bis 169 C.
<I>Beispiel 2</I> Die Reduktion von Gärungstrogensubstanz wurde in Methanol bei 30 C unter 70 kg/cm2 Wasserstoffdruck 5 Stunden am Kontakt mit reinem Nickelkatalysator durchgeführt, um ein Produkt zu ergeben, das nach mehreren Umkristallisationen aus 2'-Nitropropan und Nitromethan bei 141 bis 143 C schmolz. Die Analyse ist:
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Berechnet <SEP> für <SEP> C18H26O5 <SEP> gefunden
<tb> <B>0</B>/<B>0</B> <SEP> C <SEP> 67,1 <SEP> 62,2
<tb> % <SEP> H <SEP> 8,14 <SEP> 8,28 <I>Beispiel 3</I> Die Reduktion von 1 g Gärungsbstrogensubstanz wurde in 150 cm3 Aethanol bei Zimmertemperatur unter 3,5 kg/cm2 (50 Psi) Wasserstoff 4 Stunden in Gegenwart einer kleinen Menge Raney-Nickel (etwa 1 cm3 einer dicken Suspenson in Wasser) durchgeführt.
Das Produkt wurde eingeengt, mit 5 ml Isopropylalkohol behandelt, gekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde mit 5 ml Wasser vermischt, über Nacht stehen gelassen, gekühlt und filtriert, sodass es 0,65 g Produkt mit einem Schmelzpunkt von 147 bis 157 C ergab. Es wurde zweimal aus Mischungen aus Isopropylalkohol und Wasser umkristallisiert und ergab 0,18 g einer Substanz mit einem Schmelzpunkt von 178 bis 180 C.
Ausser- ,dem wurde ein Produkt mit einem Schmelzpunkt von 146 bis 148 C im Gewicht von 0,22 g aus dem Filtrat nach der ersten Umkristallisation des Produktes im Gewicht von 0,65 g gewonnen. Die Reduktion der Ketogruppe führt ein asymmetrisches Kohlenstoffatom ein und macht die Bildung von Diastereoisomeren möglich. Die optischen Aktivitäten der beiden Produkte waren: 1. Für das Produkt mit einem Schmelzpunkt von 178 bis 180 C [α] D25 = etwa + 46 z. B. + 46,50 und 2. für das Produkt mit einem 'Schmelzpunkt von l46 bis 148 C [ I D25 = etwa + 39 z.
B. 38,75 , wobei
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in Methanol und 1 = 2 dem.
Die folgenden Versuche sollen die Aktivität der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten neuen Verbindung der Formel I .gemäss dem Mäusegebärmut tertest zeigen. Hierbei wurde eine Lösung der Testsub stanz auf eine pulverisierte Standardmäuseration gelegt und das Lösungsmittel durch Verdampfung entfernt, um eine trockene Ration zu ergeben, die ein bekanntes Geweicht der Substanz je Gramm Ration enthält.
Diese Ration wird dann an -Mäuse mit entferntem Ovarium im Gewicht von 20 g in einem Verhältnis von 3 g je Maus und Tag im Verlauf von 5 Tagen verfüttert, worauf die Mäuse gewogen und .die Uteri entfernt und gewogen werden. Eine Gewichtszunahme des Uterus gegenüber dem Gewicht des Uterus bei einem Kontrolltier beweist das Vorhandensein von Oestrogenaktivität für die Prüf substanz. Die Grösse der Zunahme ist proportional dem Gewicht des verbrauchten Oestrogens. Die Methode kann als quantitative Prüfung durch Vergleich hinsicht lich des erhaltenen Ansprechens mit einer reinen Form des der Prüfung unterliegenden Oestrogens verwandt werden.
Bei einem 10 Mäuse umfassenden Versuch mit Kontrollmäusen von einem mittleren Uterusgewicht von 11,6 mg und bei Zugabe des bei 178 bis 180 C schmelzenden Produktes des Beispiels 3 in einer Menge von 3,125 g je Gramm Futter betrug das Uterusgewicht im Mittel 21,4 mg. Bei 6,25 g je Gramm Futter -betrug das mittlere Uterusgewicht 26,8 mg. Wenn man mit Gärungsöstrogensubstanz in einer Menge von 6,25 g je Gramm Futter vergleicht, bedeutet dies 307,69 % des- Ansprechens auf Gärungsöstrogensubstanz.
Durch Ex- trapolierung einer Kurve des Gärungsöstrogensubstanz- ansprechens auf eine Dosis von 3,125 g je Gramm Futter beträgt das Ansprechen auf die Verbindung 445,5 % des berechneten Ansprechens für Gärungsö strogensubstanz.
In einem getrennten 10 Mäuse umfassenden Versuch mit Kontrollmäusen von einem mittleren Uterusgewicht von 11,6 mg und Zugabe des bei 146 bis 148 C schmelzenden Produktes des Beispiels 3 in einer Menge von 3,125 g je Gramm Futter betrug das mittlere Utersugewicht 15,0 mg. Vergleicht man- mit Gärungsö strogensubstanz bei einem Spiegel von 6,25 lug je Gramm Futter, so bedeutet dies 123,9 % des Ansprechens auf Gärungsöstrogensubstamz.
Durch Extrapolierung der Kurve des Gärungsöstrogensubstanzsprechens auf eine Dosis von 3,125,ug je Gramm Futter beträgt das Ansprechen auf die Verbindung 154,5 % des für Gä- rungsöstrogensubstanz berechneten Ansprechens.
Sechs Stück Rinder wurden mit einer Tagesration gefüttert, die eine Mischung von Alfaalfaheu und gemah- Jenen Maiskolben mit 1 bis 20 Unzen Tetrahydro- Gärungsöstrogensubstanz auf 100 Pfund Ration enthielt, um die Wachstumsgeschwindigkeit des Viehs zu stei gern.