Verfahren zur Vermehrung von Milchsäurebakterien
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vermehrung von Milchsäurebakterien, die für die Herstellung von Milchsäurebakterienmedikamenten für die innerliche Anwendung, die durch den Magensaft nicht zerstört werden und gegen Antibiotika sehr beständig sind, geeignet sind. Insbesondere können Milchsäurebakterienmedikamente hergestellt wenden, die im Magen nicht inaktiviert werden und die Superinfektion (vgl. Pharmacology in Medicine , herausgegeben von V.A.Drill, 2,Auflage, Mac Graw-Hill, NewYork 1958, S.
1162) mit Darmbakterien im Falle von einfachem Durchfall, Durchfall infolge von anormaler Fermentierung unid Durchfall infolge Ider Einnahme von Antibiotilka hemmen. Zu Idiesem Zweck züchtet man aus gewählte Milchsäurebakterien mit grosser Beständigkeit gegen Antibiotika in industriellem Massstab, gewinnt sie in vorteilhafter Weise und überzieht Kapseln, die die lebendigen Bakterien enthalten, mit einem in Darmsaft löslichen Film, ruder aus hochmolekularen Verbindungen besteht, um die Zerstörung durch ,den Magensaft im Magen nach der Einnahme zu verhindern.
Es ist bereits bekannt, dass gewisse Arten von Milchsäurebakterien, die im Darm als normale Darmmikroorganismen wachsen und sich fortpflanzen, idas Wachstum von pathogenen Darmmikroorganismen und die anormale Fermentierung im Darm hemmen und ausserdem zur Vorbeugung gegen infektiöse Darmkrankheiten und für die Behandlung von Durchfall brauchbar sind.
Überdies sind verschiedene Arten von gezüchteten Milchsäurebakterien in grossem Umfang als Mefdika- menge oder schmackhafte Getränke verwendet worden.
Jedoch konnten mit den bisher verwendeten Milchsäurebakterienmedikamenten nicht so befriedigende Er gebisse erzielt werden wie mit ,den innerlich anwendbaren Milchsäurebakterienmedikamenten, Idie im folgenden beschrieben werden.
Das erste Problem besteht Idlarin, dass die Milchsäurebakterien gegen Antibiotika beständig sein sollen.
Insbesondere werden heutzutage verschiedene Arten von Antibiotika, wie beispielsweise Penicillin, Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin und dergleichen, häufig verwendet, und Idaher ist es notwendig, dass Idie ver wendeten Milchsäurebakterien gegen Idile gewöhnlich verwendeten Antibiotika resistent sind, damit sie die erstrebte Wirkung zeigen. Jedoch haben viele Arten von gewöhnlich verwendeten Milchsäurebakterien im Gegen- teil eine nur schwache oder gar keine Beständigkeit.
Um dies nachzuweisen, wurden auf Indem Markt erhältliche Milchsäurebakterien oder Milchsäurebakteriengetränke zwei Tage bei 37 C auf leinem Nährboden bebrütet, der ,durch Zugabe von gewissen Antibiotika in verschiedenen Konzentrationen zu einem aus 2% Glucose, 10% frischem Tomatensaft, 1,5% Pepton und 1,2% Agar bestehenden Nährboden mit dem pH 6,8 herge- stellt wurde, und das Wachstum der Bakterien wurde beobachtet. Die Mindestkonzentration ,der Antibiotika, die das Wachstum der Bakterien hemmte, ist in der folgenden Tabelle angegeben.
Mindesthemmkonzentration für das Wachstum von isolierten Bakterien Milchsäurebakte rienmedikamente oder -getränke Y-1 Y-2 B-1 B-2 Isolierte Bakterien Y.A Y.B B.A B.B BacillusoderCoccus Coccus Coccus Bacillus Bacillus
EMI2.1
<tb> <SEP> Gramfärbung <SEP> Positiv <SEP> Positiv <SEP> Positiv <SEP> Positiv
<tb> <SEP> Penicillium
<tb> <SEP> G-Kalium
<tb> <SEP> (Einheiten) <SEP> 6,25 <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 12,5
<tb> 0 <SEP> Streptomycin <SEP> (y) <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 25 <SEP> 50
<tb> g <SEP> Tetracyclin(7) <SEP> 50 <SEP> 50 <SEP> 70 <SEP> 70
<tb> <SEP> Chloramphenicol
<tb> <SEP> (y) <SEP> 2,5 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5
<tb> <SEP> Colistin <SEP> (y) <SEP> 40 <SEP> 40 <SEP> 120 <SEP> 120
<tb> <SEP> Kanamycin <SEP> (y) <SEP> 60 <SEP> 40 <SEP> 40 <SEP> 40
<tb> Bemerkungen:
:
Die Zahlen geben die Konzentration der Antibiotika in y pro cm3 Nährboden, bei Penicillin und Colistin in Einheiten pro cm3, an.
Y-1 und Y-2 bedeuten Biofermine (hergestellt von Biofermin Pharmaceutical Co.
Ltd.) Zusammensetzung: Jede Tablette von 1 g enthält:
Streptococcus faecalis 0,3 mg
Bacillus subtilis 0,2 mg B-1 und B-2 bedeuten Yakuruto Zusammensetzung: 108 Lactobacillus sind in 1 cms Ma germilch enthalten Y.A und Y.B bedeuten Streptococcus faecalis B.A und B.B bedeuten Lactobacillus acidophilus
Wie in der obigen Tabelle gezeigt, sind die auf dem Markt befindlichen Milchsäurebakterienmedikamente bzw. die in den Getränken enthaltenen Milchsäunebak- terien in bezug auf Idie für die medizinische Behandlung verwendeten Antibiotika sehr empfindlich, und ihr Wachstum wind durch eine kleine Menge der Antibiotika gehemmt.
Es ist bekannt, dass bei Verwendung von Antibiotika für die medizinische Behandlung die normale Darmbakterienflora erheblich abnimmt und Moni list, Candida oder andere Eumycetes, deren übermässige Vermehrung in Darm von gesunden Personen nicht zulässig ist, sich fortpflanzen, wodurch neue Krankheiten verursacht werden. Candidasis und dergleichen können durch die Einnahme von Milchsäurebakterien unter diesen Bedingungen nicht verhindert werden.
Das zweite Problem besteht darin, dass bekanntlich bei Anwendung von Zentrifugen zur Gewinnung der in dem flüssigen Nährboden suspendierten Bakterien weni- ger als 80 % der Bakterien gewonnen werden und ausserdem die Bakterienzellen infolge Ides Zentrifugierens sich zusammenballen, so dass ihre Existenzbedingungen schlechter werden.
Ausserdem ist ein Verfahren bekannt, bei Idem Milch oder Kaseinlösung zugesetzt wird, um Kasein oder die hauptsächlichen lebenswichtigen Proteine Idurch Säure zu koagulieren rund auszufällen, wobei die Bakterien in dem Niederschlag gebunden werden. Jedoch ist dieses Verfahren zur Gewinnung der lebenden Bakterien nicht geeignet, weil wider isoelektrische Punkt, bei dem der maximale Proteinniederschlag erhalten wird, pH 2 bis 3 hat, wodurch natürlich die Lebensdauer verkürzt wird.
Das ,dritte Problem ist, ob ,die Milchsäurebakterien bei oraler Einnahme in der starken Säure {Salzsäure) im Magen überleben, wenn sie im Magen verbleiben.
Arzneimittel, die die Schleimhaut des Magens schädigen, sich in Berührung mit (Magensaft im Magen verändern oder im Darm in hoher Konzentration reagieren sollen, werden Ibei oraler Einnahme gewöhnlich auf der Oberfläche des Mutterkernes von Tabletten, Pillen oder Körnern mit feinem im Darmsaft löslichen Film überzogen, so dass sie durch den Magensaft nicht verändert werden, laber im Darm zerfallen, aufgelöst und resorbiert werden.
Jedoch denaturiert die Wirksubstanz von gewissen Arzneimitteln, die als im Darm lösliche Medikamente verabreicht werden, und verliert ihre Wirkung infolge des Pressschocks bei der Tablettenherstel lung oder Ides Wärmeeinflusses bei der Trockenbehand- lung. Diese Arzneimittel können Idaher nicht zu Tabletten, Pillen oder Körner geformt werden. Daher werden sie in harte Kapseln gefüllt, die aus Gelatine geformt sind, und als im Darmsaft lösliche Kapseln verabreicht.
Für ,die Herstellung derartiger Arzneimittel entwickelten Hausmann und Weyland die sogenannte Glutoidkap sel , die im Darmsaft löslich ist und gegen Magensaft beständig ist, indem sie die Gelatinekapsel mit Formalin behandelten, um sie im Magensaft unlöslich zu machen.
Jedoch werden diese im Darmsaft löslichen Kapseln im Verlauf !der Zeit im Darmsaft unlöslich. Daher sollen die auf diese Weise hergestellten Arzneimittel innerhalb einer zi!emlioh kurzen Zeit eingenommen werden.
Dieses Verfahren ist daher nicht praktisch anwendbar. Danach wurde Idem Gelatineausgangsmaterial ein Alkalimetallsalz von Celluloseacetatphthalat im Verhältnis von 5 bis 10 0/o zugesetzt, oder das Gelatineausgangsmaterial wurde mit Chromsäure oder Tannin behandelt, um die Gelatine im Darmsaft löslich zu machen. Jedoch haben sich diese Verfahren ebenfalls als nicht zufriedenstellend erwiesen.
Auf dem Markt erhältliche Arzneimittel oder Getränke, ldie angeblich lebende Milchsäurebakterien enthalten, wurden in Iden in Ider japanischen Pharmakopoe beschriebenen künstlichen Magensaft, der zur Entfernung von Michsäurebakterien steril filtriert war, gemischt und die Mischungen auf 37 C gehalten. Im Verlauf der Zeit werden Proben entnommen, und dann wird die Züchtung ausgeführt. Wie Idie folgende Tabelle zeigt, werden die Milchsäurebakterien offenbar in kurzer Zeit getötet und können gewöhnlich nicht nachgewiesen werden.
Überlebenstest für Milchsäurebakterien in künstlichem Magensaft
Milchsäurebakterien- Einwirkungsdauer medikamente oder Vor dem Mischen -getränke 30 Min. 3 Std.
Y-1 2 X 108 12 0
Y-2 2,7 x 108 23 0
B-l 2,8 X 105 31 0
B-2 1,3 x 108 12 0 Bemerkung: Die Zahlen geben die Anzahl Bakterien in 1 cm3 künstlichem Magensaft an.
Bei Einnahme von Milchsäurebakterien kann das Verhalten derselben im menschlichen Magen etwas von demjenigen im künstlichen Magensaft in einer Glasflasche verschieden sein. Jedoch weisen die obigen Ergebnisse darauf hin, dass die Milchsäurebakterienmedi- kamente oder -getränke im Magen eine starke Abnahme der Wirksamkeit zeigen.
Die Erfindung ermöglicht nun die Herstellung von Milchsäurebakterienmedikamenten, die den Darm er reichen können, ohne im Magen vom Magensaft oder von Antibiotika beeinflusst zu werden.
Das Verfahren gemäss der Erfindung zur Vermehrung von Milchsäurebakterien oder Mischungen derselben, die gegen verschiedene Arten von Antibiotika, die gegebenenfalls im Darm vorhanden sein können, resistent sind, ist Idadurch Igekenazeichn,et, dass man entsprechende Milchsäurebakterien in einem flüssigen Nährboden unter optimalen Bedingungen züchtet.
Diese Bakterien können in seinem während langer Zeit lebens- fähigen Zustand gewonnen werden, indem man die Bakterien durch Zugabe von Stärke zu dem flüssigen Nährboden lauf den Stärkekörnern adsorbiert und auf harten Kapseln, welche die die Bakterien tragenden Stärkokör- ner enthalten, einen im Darmsaft löslichen Film bildet, der sich nur im Darmsaft löst und durch jeden Magensaft nicht geschädigt wird.
Die erfindungsgemäss verwendeten Milchsäurebaktierien sind unter den Bezeichnungen
Lactobacillus lactis ATCC 21051
Lactobacillus acidophilus ATCC 21052
Streptococcus slactis ATCC 21053 bei der American Type Culture Collection, Georgetown University, School of Medicine, Washington, D.C., USA hinterlegt.
1. Untersuchungen hinsichtlich der optimalen
Milchsäurebakterien
Es wurden Nährboden hergestellt, indem man die folgenden Antibiotika einzeln einem Peton, Tomatensaft, Glucose und Lactose enthaltenden Agarmedlum zusetzte, und durch labsichtliches Stehenlassen angesäuerte und koaguiierte natürliche Kuhmilch oder die Exkremente von gesunden Menschen wurden kultiviert, um Bakterien zu isolieren, die in dem Nährboden trotz des Vorhandenseins von Antibiotika wachsen. Danach wurde ein Teil der Kolonien bei 37 C 2 Tage in dem Milchkulturmedium gezüchtet.
Die Bakterien haften sich erheblich vermehrt und bildeten Säure, ,die Milch koagulierte. Die Anzahl der Bakterien wurde berechnet. Die Antibiotika wunden in den folgenden Mengen zugesetzt: Penicillium 100 Einheiten/cm3 des Nährbodens
EMI3.1
<tb> Streptomycin
<tb> Aureomycin
<tb> Oleandomycin
<tb> Chloramphenicol <SEP> je <SEP> 500 <SEP> γ
;/cm3 <SEP>
<tb> Tetracyclin
<tb> Kanamycin
<tb> Polymyxin
<tb> Colimycin
<tb>
Durch Idauernde Sichtung von Kulturen aus etwa 20 000 natürlichen Materialien, einschliesslich menschlichen Exkrementen, wurden fünf Stämme von Milchsäurebakterien erhalten, die in Kulturmedien, die die oben genannten Konzentrationen mindestens eines der oben genannten Antibiotika enthielten, wuchsen und dagegen beständig waren.
Die bakteriologischen Eigenschaften dieser Milchsäurebakterien wurden mit Hilfe von Berges Manual of Determinative Baoteriology > , 7. Auflage, bestimmt und sind in der Tabelle I dargestellt.
Tabelle I
Bakteriologische Eigenschaften von Milchsäurebakterien
Nr. des Stammes 1 2 3 4 5 Bacillus oder Coccus Bacillus Bacillus Coccus Bacillus Bacillus Gramfärbung Positiv Positiv Positiv Positiv Positiv Grösse des Zellkörpers 1,5-3,0 1,5-3,5 0,5-1,0 1,0-3,0 1,0-3,0 (Mikron) Wachstum auf neutraler Gutes Gutes Durchsichtig Gutes Gutes Bouillon Wachstum, Wachstum, auf der oberen Wachstum, Wachstum, gleich gleich Schicht der gleich gleich trübe trübe Lösung,
trübe trübe
Bakterien werden gefällt Milchnährboden + + + + +
Maltose + + + + +
Glucose + + + + +
Mannit - - + -
Galactose + + + + + Zucker- zersetzungs- Arabinose + + + # + vermögen Lactose + + + + +
Saccharose f + +
Dextrin + + + +
Solicin - # +
Rhamnose + + + + +
Mikrobiologische Iden- Lactobacillus Lactobacillus Streptococcus Lactobacillus Lactobacillus tifizierung der Bakterien lactis acidophilus
lactis acidophilus acidophilus
Um die Beständigkeit dieser Stämme gegen Antibiotika zu erhöhen, wurde die aufeinanderfolgende Züchtung in einem Nährboden ausgeführt, ,der durch Zugabe einer kleinen Menge der oben genannten Antibiotika hergestellt worden war. Die Beständigkeit wurde erheblich erhöht, obgleich die Wirkung bei den verschiedenen Stämmen nicht gleich war. Der nach wiedenholter Züchtung bei den 55. Generationen erhaltene Grad der Beständigkeit ist in der Tabelle II angegeben.
Es wurde ein Nährboden folgender Zusammensetzung verwendet:
Hefeextrakt 0,25%
Polypepton 1 %
Glucose 1 % Tween 80 0,01%
Natriumchlorid 0,25%
Agar 1,5%
Die bei Lactobacillus lactis und Lactobacillus acidophilus angewendeten Antibiotikakonzentrationen sind:
Streptomycin 45- 450 γ/cm3
Oleandomycin 90- 900 y/cm3
Polymyxin 90- 900 y/cm3
Erythromycin 180-1800 γ/cm3
Kanamycin 3- 30 γ/cm3
Fradiomycin 45- 450 y/cm3
Colistin 45- 450 Einheiten pro cm3
Die bei Streptococcus lactis angewandten Antibiotikakonzentrationen sind:
:
Tetracyclin 0,3 - 3 γ/cm3
Aureomycin 0,3 - 3 γ/cm3
Chloramphenicol 0,006- 0,06 y/cm3
Pencillin 0,00S 0,06 Einheiten pro cm3
Kanamycin 0,3 - 3 y/cma
Colistin 4,5 -45 Einheiten/cm3
Es wurde bei 37 C während 48 Stunden kultiviert, und zwar im Schrägkulturverfahren.
Tabelle II
Grad der Beständigkeit von Milchsäotrebakterien
Nr. des Stammes 1 2 3 4 5 Penicillium 20 Einheiten 125 500 125 250 G-Kalium Streptomycin 15 000 15 000 15 000 15 000 15 000 Tetracyclin 300 300 300 150 150 Chlortetracyclin 30 50 300 300 30 Hydroxytetracyclin 30 30 100 1000 1000 Oleandomycin 3 000 3 000 1000 3 000 3 000 Polymyxin B. 3 000 3 000 1000 3 000 3 000 Chloramphenicol 300 100 20 200 200 Kanamycin 300 100 300 100 50 Fradiomycin 5 000 1 500 500 1 500 1 500 Colistin 1 500 Einheiten 1 500 1 500 1 500 1 500 Erythromycin 6 000 6000 2000 6 000 6 000 Mikrobiologische Klassi- Lactobacillus Lactobacillus Streptococcus Lactobacillus Lactobacillus fixierung der Bakterien lactis acidophilus lactis acidophilus acidophilus Bemerkung:
: Die Zahlen geben die Mindestwachstumskonzentration pro cm3 Nährboden an, und zwar bei Penicillin und Colistin in Einheiten pro cm3, bei den anderen Antibiotika in y pro cm3.
Es w.ird daher angenommen, dass diese Milchsäurebakterien im Darm wachsen, wenn man sie mischt und die gewöhnlich für die medizinische Behandlung angewandten Antibiotika einnimmt oder injiziert.
2. Industrielle Züchtung von Milchsäurebakterien
Bei Untersuchungen hinsichtlich der Kulturbedin- gungen von Milchsäurebakterien in grossen Mengen bei geringen Unkosten wurden die in der folgenden Tabelle dargestellten Ergebnisse erhalten.
Jedes der in der Tabelle angegebenen Ergebnisse war das beste von zellen ausgeführten Versuchen.
Nr. des pH des Nährbodens Zugabe von Zuzusetzende Menge Zuzusetzende Menge Höchste Dauer der
Stammes zu Anfang Phosphorsäurepuffer Lactose frischer Tomatensaft Züchtung bei 37 C (Tage)
1 6,3 Erforderlich 0,3 % 0 2
2 6,3 Erforderlich 0,3 % 5 O/o 2
3 6,8 Erforderlich 0,3 e/o 2,5 % 2
4 6,3 Erforderlich 0,3 % 0 2
5 6,3 Erforderlich 0,3 /o 0 2 Bemerkung: Bei jedem Stamm wurden dem Nährboden 2,5 % Pepton zugesetzt.
Es wurde ein Nährboden folgender Zusammensetzung verwendet:
Zusammensetzung des Nährbodens (%)
Nr. des Dinatriumhydrogen- Kaliumhydrogen Stammes Pepton Lactose phosphat phosphat phosphat (KH2PO4) Frischer Tomatensaft (Na2HPO4.12H2O)
1 2,5 0,3 0,12 0,182 0
2 2,5 0,3 0,12 0,182 5
3 2,5 0,3 0,143 0,36 2,5
4 2,5 0,3 0,12 0,182 0
5 2,5 0,3 0,12 0,182 0
Wenn die Züchtung in den oben genannten Nährböden bei 37 C ausgeführt wurde, erreichte die Anzahl der von jedem Stamm gebildeten Milchsäurebakterien nach 48 Stunden ein Maximum, und die Anzahl der lebenden Bakterien pro cm3 des flüssigen Nährmediums betrug etwa 109.
3. Gewinnung von Milchsäurebakterien
Es wurde die statische lelektrische Ladung der oben genannten Milchsäurebakterien während des Schwebens in dem Kulturmedium untersucht, und es wurde gefunden, dass es sich um eine negative Ladung handelte. Diese konnte direkt mikroskopisch beobachtet werden, wenn man eine schwache Gleichstromspannung an den flüssigen Nährboden anlegte. Überdies zeigte es sich, dass die Stärke eine positive Ladung hatte, als man die Ladung von in Wasser schwebenden Körnern von Diatomeenerde, Töpferton, Stärke usw. untersuchte.
Kartoffelstärke oder Maistärke wurde zubereitet, indem man sie auf Platten ausbreitete, in einen Sterilisiertank brachte, unter Absaugen von Luft Äthylendioxidgas darauf leitete und dann die Sterilisierung mit Gas während 4 Stunden bei 55 C ausführte, um die Bakterien zu töten. Ein Volumenteil der so hergestellten Stärke wurde in 10 Volumenteile des flüssigen Nährbodens, in welchen die Milchsäruebakterien 48 Stunden bebrütet worden waren, geschüttet, gerührt und stehen gelassen.
Die Stärke mit einem grossen spezifischen Gewicht setzte sich innerhalb kurzer Zeit am Boden der Mischflasche ab, wobei mehr als 80% der Medien in dem Nährboden adsorbiert wurden. Der Niederschlag wurde auf die Glasplatte aufgebracht und getrocknet. Die Blefestigung von einem bis mehreren Zellkörpern von Milchsäure- bakterien auf der Oberfläche der Stärkekörner wurde mikroskopisch durch Färbung mit Methylenblau nachgewiesen. Wie oben erwähnt, können die Bakterien im lebenden Zustand gewonnen werden, indem man bei niedriger Temperatur mit Gas sterilisierten Stärkestaub zu den Nährböden gibt. Dieses Verfahren lässt sich leicht für die praktische Herstellung anwenden.
Beispielsweise werden etwa 80% der gezüchteten Bakterien auf der Stärke adsorbiert, wenn man 2 Voulumenteile mit Gas sterilisierte Kartoffelstärke zu 10 Volumenteilen flüssigem Nährboden gibt, rührt und dann die Stärke durch Stehenlassen ausfallen lässt. Etwa 100% der Bakterien werden in lebendem Zustand gewonnen, wenn man die durch Abtrennen des Niederschlages erhaltene Lösung auf einen Volumenteil Stärke, die auf Filterpapier ausgebreitet ist, giesst, um die Lösung zu filtrieren und gleichzeitig die Bakterien in der Stärke auf dem Filterpapier zu adsorbieren.
Die so erhaltene Stärke ist schlammig, weil sie eine grosse Menge Wasser enthält. Man setzt einen Volumenteil Stärke zu derselben zu und mischt unter Rühren. Dadurch wird eine scheinbar trockene Stärkestaubmasse erzeugt. Jedoch enthält der trocken erscheinende Stärkestaub soviel Wasser, dass er beim Trocknen über Phosphorpentoxid eine Gewichtsabnahme von 40% zeigt.
Je 1 g der so erhaltenen Stärke, die auf den Oberflächen der Körner Milchsäurebakterien adsorbiert enthält, wird steril in kleine Reagenzgläser verteilt, auf einer Temparatur von 25 C gehalten und dann gezüchtet.
Die Anzahl der lebenden Milchsäurebakterien wird anhand der Berechnung der gezüchteten Kolonien be stimmt. Nach einer Woche hat sich die Anzahl etwa auf das Doppelte vermehrt, ändent sich nach den folgenden 25 Wochen nicht erheblich und nimmt dann nach 50 Wochen auf die Hälfte der Bakterienanzahl am Beginn ab. Es wurde bisher als unvermeidlich angesehen, dass die Anzahl der lebenden Bakterien wegen der durch dieselben erzeugten Stoffwechselprodukte in einer Woche auf die Hälfte abnimmt, wenn man die Kulturflüssigkeit auf einer Temperatur von 25 C belässt.
Es wurde daher ein besseres Ergebnis als erwartet erhalten, indem die Bakterien lange Zeit am Leben blie ben. Es wird angenommen, Idass dies idadurch verursacht wird, dass ,die für,das Leben ,der Bakterien schädlichen Substanzen aus Ider Umgebung der Bakterienzelle durch die Adsorption der durch die Milchsäurebakterien erzeugten organischen Säuren und anderen Abfallprodukte entfernt und die Polysaccharide, aus denen die Stärke besteht, durch die Milchsäurebakterien als Nährstoffquelle ausgenützt werden.
Die Milchsäurebakterien wurden in einer Lösung gezüchtet, die durch Zugabe von 1 Gew.-Teil Stärke zu 100 Gew.-Teilen Wasser und Erhitzen während 30 Minuten auf 121 C erhalten wurde, und die Anzahl der lebenden Bakterien wurde berechnet. Die Anzahl nahm während der ersten 24 Stunden auf etwa das Doppelte zu. Diese Tatsache bestätigt die oben erwähnte Annahme. Weiter wurde erkannt, dass die Menge der Milchsäure erheblich abnahm, wenn man einen Gew.-Teil Stärkestaub zu 3 Gew.-Teilen verdünner Milchsäurelösung (n/100) gab, rührte, die Stärke ausfällte und die Menge der Milchsäure in der überstehenden Flüssigkeit bestimmte.
4. Herstellung eines Medikamentes aus Milchsäure bakterien
Die Milchsäurebakterien überleben in Idem durch Mischen von Milchsäurebakterien und Stärke erhaltenen Staub während einer langen Zeit. Jedoch überleben die Milchsäurebakterien nicht, falls man diesen Staub mit dem in der japanischen Pharmakopoe beschriebenen künstlichen Magensaft mischt, bei 37 C 6 Stunden un unterbrochen rührt und züchtet. Es muss Idaher ein Arzneimittel entwickelt werden, das durch den Magensaft nicht beeinflusst wird, wenn es oral eingenommen wird.
Es wurden bereits zahlreiche Verfahren zur Her- stellung leines in Magensaft unlöslichen und in Darmsaft leicht löslichen Filmes vorgeschlagen. Die oben erwähnte Stärke, auf der Milchsäurebakterien adsorbiert sind, lässt sich wegen ihres grossen Wassergehaltes nur schwer zu Tabletten formen. Ferner werden mehr als 70 % der Milchsäurebakterien durch die im Inneren der Tabletten durch den mechanischen Schock beim Formen der Tablette momentan lerzeug,te hohe Temperatur getötet. Daher ist dieses Verfahren für den vorliegenden Zweck nicht geeignet.
Es wurde nun gefunden, dass die feuchte Stärke, an der Milchsäurebakterien absorbiert sind, vorsichtig in Gel,atinekapselln gefüllt und die Kapsel dann ohne Denaturierung Ider Gelatine selbst mit dem im Darmsaft löslichen Film überzogen werden kann, wodurch die Tötung bzw. die Abnahme Ider lebenden Bakterien bei der Tablettenherstellung vermieden wird.
Als Grundüberzugsmittel wird dabei eine hochpolymere Verbindung verwendet. Der im Darmsaft lösliche Film wind nämlich durch Behandlung wider Oberfläche der harten Kapsel mit einer Überzugslösung, die durch Auflösen der hochpolymeren Verbindung in organischen Lösungsmitteln hergestellt ist, gemäss dem Befilmungs- verfahren gebildet. Als hochpolymere Substanzen können Celluloseacetatphthalat (CAP), tPolyvinylalkohol- monophthalsäureester (PVP), Polyäthylenglycol und dgl.
als Überzugsmittel verwendet werden. Die Überzugs- lösung wird hergestellt, indem man mindestens eine dieser Verbindungen in organischen Lösungsmitteln mit niedrigem Siedepunkt, beispielsweise Methanol, tha- nol, Isopropanol, Aoeton, Methyläthylketon und dgl., löst. Harte Kapseln, die vorher mit dem Arzneimittel gefüllt worden sind, werden in den Dragierkessel ge geben und dieser in Drehung versetzt, und dann wird die Oberfläche Ider harten Kapseln mit der zugesetzten Überzugslösung überzogen. Diese Behandlung wird mehrere Male wiederholt. Danach werden die Kapseln an der Luft getrocknet.
Alle Kapseln in dem Dragierkessel weisen einen gleichmässigen, steifen, im Darmsaft löslichen Film auf. Bei Verwendung von Celluloseacetatphthalat als Hauptbestandteil Ider Überzugslösung ist es erwünscht, Idass harte Kapseln zuerst mit einer 100/eigen Lösung von Polyvinylpyrrolidon in Athanol überzogen werden, ehe die Oberfläche,der harten Kapseln indirekt mit ,der Überzugslösung überzogen wird.
Dadurch wird die Loch- oder Rissbiilidung in Ndem Film verhindert, und der gebildete Film wird steifer ohne Löcher oder Risse.
Die in Iden Kapseln enthaltenen, auf den Stärkekörnern adsorbierten Milchsäurebakterien werden durch Iden Magensaft im Magen nicht beeinflusst und im Darm aus ,den Kapseln freigesetzt und können sich überdies in leiner geeigneten Umgebung vermehren.
5. Untersuchung der Wirkung
Es wird durch Blestilmmung wider Milchsäurebakterien in den Exkrementen 24 Stunden nach Einnahme der Arzneimittel bestimmt, ob die wie oben beschrieben hergestellten Milchsäurebakterien die erwartete Wirkung haben oder nicht. Zu diesem Zweck wird ein Agar plattenmedium hergestellt, indem man Streptomycin und Colistin in einer Konzentratiion, gegen die die Milchsäurebakterien Resistenz zeigen, Lactose und einen pH Farbindikator, wie beispielsweise Bromkresolpurpur, zur Anzeige der Milchsäureerzeugung und Pepton und Hefeextrakt als Nährstoffquellen zusetzt und den pH Wert auf ca. 6,5 einstellt.
Man verwendet ein Agarplattenmedium, das 0,3 0/0 Lactose, 1 /o Pepton, 0,25% Hefeextrakt, 0,006% Bromkresolpurpur und 1,5% Agar enthält; es werden Antibiotikakonzentrationen von 150 γ/cm3 Streptomycin und 1500 Einhei ten/cm5 Colistin angewendet.
In einem so hergestellten Medium wachsen Bakterien, wie beispielsweise natürliche Escherichia coli, die gegen Antibiotika empfindlich sind, und die andere Dlarmflora nicht, während lediglich die Milchsäurebakterilen aus den eingenommenen Medikamenten wachsen und überdies die Farbe um die Kolonien herum durch Zersetzung von Lactose verändert wird. Daher ist eine Unterscheidung leicht.
Stärke mit adsorbierten Milchsäurebakterien, die nicht in überzogene Kapseln eingeschlossen ist, wird der Testperson auf nüchternen Magen oral verabreicht, und nach 24 Stunden werden !die Exkremente in dem oben erwähnten Nährboden gezüchtet. Sporadisch werden einige wenige Milchsäur,ebakterien gefunden, aber in den meisten Fällen wird kein Abgang von Milchsäurebakterien festgestellt.
Wenn jedoch mit einem im Darmsaft löslichen Film überzogene Kapseln, die Stärke mit adsorbierten Milchsäurebakterien enthalten, nüchtern eingenommen werden, wird gewöhnlich eine grosse Anzahl Milchsäurebakterien in ,den Exkrementen gefunden, und obgleich die Anzahl der Bakterien manchmal gross oder verhältnismässig klein ist, gibt es keinen Fall, in welchem sie überhaupt nicht festgestellt werden. Diese Tatsache beweist, dass die in der oben beschriebenen Form eingenommenen Milchsäurebakterien in lebende Zustand in den Darm freigesetzt werden.
Als wirksamer Beweis wurde ein Versuch mit Hunden ausgeführt. Jedem Hund wurden 10 Tage lang täglich 0,3 g Streptomycin, in eine Scheibe Rindfleisch gemischt, verabreicht. Nach einer Woche hatten die hefeähnlichen Mikroorganismen in den Exkrementen von drei Hunden merklich zugenommen, und in den Exkrementen eines Hundes hatten die Schimmelpilze zugenommen. Diese Tatsache zeigt offensichtlich eine Veränderung der Darmbakterienflora.
Diese Hunde zeigten den gleichen Befund, nachdem die Einnahme von Streptomycin unterbrochen worden war, und die Exkremente von 6 anderen Hunden hatten einen sehr schlechten Geruch. 10 anderen Hunden wurde in einer Scheibe Rindfleisch die gleiche Menge Streptomycin wie oben sowie mit einem im Darmsaft löslichen Film überzogene Kapseln, die auf Stärke adsorbierte Milchsäure bakterien enthielten, verabreicht.
Durch Kultivierung wider Exkremente aller für diesen Versuch verwendeten Hunde konnte in jedem Falle das Vorhandensein einer grossen Menge von Milchsäurebakterien bewiesen wer den. Die Mikroorganismen des Hefie- oder Schimmel pilztyps hatten nicht zugenommen, und Ider Geruch der Exkremente wurde weniger schlecht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Milchsäurebakterien mit einer grossen Resistenz gegen mindestens ein Antibiotikum für die medizinische Behandlung, wie beispielsweise Penicillin, Streptomycin,
Aureomycin, Oleandomycin, chloramphenicol, Tetracyclin, Kanamycin, Polymyxin, Colimycin und dgl., wurden aus den Exkrementen von Menschen sowie aus saurer Milch abgetrennt und aufeinanderfolgenden Übertragungskulturen unterworfen.
Gemäss der biologischen Untersuchung wurden fünf Stämme als Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus und Streptococcus lactis identifiziert. Jeder Stamm wurde bei 37 C während 48 Stunden in einem flüssigen Nährboden kultiviert, der durch Zugabe von 2,5 0/0 Pepton und 0,3% Lactose und Einstellen des pH-Wertes auf 6,3 bis 6,8 hergestellt worden war. Die Nährböden wurden mit bei niedriger Temperatur mit Äthylendioxid sterilisierter Kartoffelstärke versetzt und gerührt, um die Stärke auszufällen. Dann wurde die überstehende Flüssigkeit durch Giessen auf ein sterilisiertes Filterpapier, auf dem Stärke ausgebreitet war, filtriert.
Die ausgebreitete Stärke und die Stärke in dem Niederschlag wurden gesammelt und mit weiterer neuer Stärke versetzt, um eine äusserlich trocken erscheinende Stärkestaubmasse zu erzeugen. Die Anzahl der lebenden Bakterien in der Kulturflüssigkeit wurde in diesem Falle gleichzeitig bestimmt und die zugesetzte Stärkemenge so eingestellt, dass die Anzahl der lebenden Bakterien pro g Stärkestaub etwa 107 betrug. Die so erhaltene Stärkestaubmasse wurde in ein rotierendes Sterilisierungsgefäss gefüllt und vollständig gemischt. Dann wurde sie unterteilt und in Gelatinekapseln gefüllt. Die Kapseln wurden in einen Dragierkessel gegeben und dieser in Drehung versetzt.
Zuerst wurden die Kapseln mit einer 10%igen Lösung von Polyvinylpyrrolidon in Äthanol lüberzogen, und dann wurde auf oder Oberfläche der Kapsel mit einer 100/oigen Lösung von Celluloseacetatphthalat in Methylätylketon ein Film gebildet, so dass im Darmsaft lösliche Kapseln erzeugt wurden. Die Wirkung der resultierenden Milchsäurebakterienmedi- kamente wurde bestimmt, indem man diese in dem in der japanischen Pharmakopoe beschriebenen künstlichen Darmsaft löste und züchtete, wonach die Anzahl der Milchsäurebakterien bestimmt wurde.
Die Milchsäurebakterienmedikamente sind wirksam gegen einfachen Durchfall oder Durchfall infolge abnormalen Darmfermentierung und hemmen die Supermtektion mit der normalen Darmbakterienflora bei Einnahme von Antibiotika, auch durch Injektion.
Das so erhaltene Milchsäuremedikament wurde am Menschen erprobt. Je zwei Kapseln dieses Milchsäurebakterienmedikamentes wurden 10 gesunden Versuchspersonen (im Alter von 19 bis 47 Jahren) einmal am frühen Morgen auf nüchternen Magen verabreicht, und die Versuchspersonen wurden in zwei Gruppen von je fünf Personen verteilt. Danach wurde der ersten Gruppe während einer Woche täglich das Äquivalent von 1 g Streptomycin verabreicht, während Ider zweiten Gruppe keinerlei Antibiotikum gegeben wurde.
Die Milchsäurebakterien in den Exkrementen wurden nachgewiesen, indem man ca, 1 g der Exkremente bei jedem Stuhlgang nach der Verabreichung der Kapseln auf die Anzahl der Milchsäurebakterien untersuchte, wobei man einen Nährboden zum Nachweis von Milchsäurebakterien anwendete, worin bei 37 C 48 bis 60 Stunden gezüchtet wurde. Um das Wachstum von Colitiskeimen und anderen normalen Darmmikroorganismen in dem zum Nachweis der Milchsäurebakterien verwendeten Nährboden zu hemmen, wurde ein Plattenmedium verwendet, das durch Zugabe von mehreren Arten von Antibiotika zu einem Grundmedium hergestellt war, das aus 1% Pepton, 1% Hefeextrakt, 1% Glucose, 0,15% Tween 80 , 1,5% gefälltem Calciumcarbonat und 1,5 bis 1,8% Agar bestand.
Bei Lactobacillus acidophilus und Lactobacillus lactis wurden als Antibiotika 20 γ Polymyxin B pro cm3, 10 γ Kanamycinsulfat pro cm3 bzw.
10 bis 15 γ Dihydrostreptomycin pro cm3 verwendet, und bei Streptococcus lactis wurden 20 γ Polymyxin pro cm3 und 20 γ Kanamycinsulfat pro cm3 verwendet.
Die Ergebnisse des Versuches sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Aus diesier Tabelle ist ersichtlich, dass sowohl bei der Gruppe, der Streptomycin verabreicht wunde, als auch bei der Gruppe, der kein Antibiotikum verabreicht wurde, in den Exkrementen nach der Verabreichung der Milchsäurebakterienmedikamente eine Anzahl Milchsäurebakterien beobachtet wurden, wobei sich die Milchsäurebakterien innerhalb des Darmes festsetzten und wuchsen, ohne äusserlich durch den Magensaft und das Streptomycin beeinflusst zu werden.
1. Testgruppe, der Streptomycin verabreicht wurde
Anzahl
Bakterien im Vor der Anzahl Tage nach der Verabreichung Testperson Milchsäure- Ver bakterien- abreichung medikament 2 4 6 8 10 12 14
1 0 6x105 7,3x107 1,9x108 108 108 3x108 108
2 0 4,7 X 105 2,7 X 106 9 X 107 2,3 X 108 3 x108 1,3 X 108 2,3 X 108
3 2 x 107 0 4,3 X 105 8,3 X 107 3 X 108 3,3 X 108 2,7 x 108 2 X 108 2 x108 4 0 2,7 x 104 6 x 107 7 x 107 3,7 x @ 108 3,3 x 108 2,3 x 10s 1,7 X 108
5 0 3 X 105 6,3 X 106 5,7 X 107 2,7 X 108 2,3 X 108 2,7 X 108 108
2.
Testgruppe, der kein Antibiotikum verabreicht wurde
Anzahl Bakterien im Vor der
Anzahl Tage nach der Verabreichung Testperson Milchsäure- Ver- bakterien- abreichung medikament 2 4 6 8 10 12 14
6 0 6,3x105 4,3x107 1,7x108 1,7x108 1,7x108 2,3x108 1,7x108
7 0 2,7x104 2,3x108 2,7x108 2,3x108 3,5x108 4,3x108 8,7x107
8 2 X 107 0 5,7 X 104 2,7 X 107 2,7 X 107 2,3x108 4,7x108 2,7 X 108 2x108
9 0 104 4,3x107 3,5x108 4,7x108 4x108 6,7x107 1,7x108
10 0 3,3x105 7,3x106 2,7x107 3,7x108 2,7x108 9,3x107 1,7x108
Beispiel 2
Im vorliegenden Beispiel wird ein Verfahen zur Bildung des im Darmsaft unlöslichen Filmes auf den Kapseln erläutert. 1000 harte Kapseln Nr.
0 gemäss der japanischen Pharmakopoe, die mit 0,4 g Maisstärke gefüllt waren, wurden in einen Dragierkessel mit 25 cm Durchmesser gefüllt, Ider mit 45 Umdrehungen pro Minute rotieren gelassen wurde. In diesem Kessel wurden zweimal 10 cm3 einer Lösung von Polyvinylpyrrolidon in Äthanol gegeben, um den ersten Überzug herzustellen. Dann wurden 17mal je 10 cm3 10%ige Lösung von Celluloseacetatphthalat in Aceton zugesetzt, um auf der Oberfläche der harten Kapsel den im Darmsaft löslichen Film zu bilden. In diesem Falle war die Raumtemperatur 25 C, und die relative Feuchtigkeit wurde unter 35% gehalten.
Nach der Fertigstellung des Überzugs wurde ca.
38 Stunden bei 37 bis 49 C unter Belüften getrocknet, und das in dem Film verbleibende Lösungsmittel wurde durch Verdampfen beseitigt. Auf diese Weise wurde das Produkt erhalten.
6 dieser im Darmsaft löslichen Kapseln wurden gemäss der in der japanischen Pharmakopoe beschriebenen Methode untersucht. Sie veränderten sich beim Tauchen und Schütteln während 6 Stunden in künstlichem Magensaft nicht und lösten sich durch Tauchen und Schütteln während 10 bis 15 Minuten im künst zeichen Daunsaft. Ferner wurde keinerlei Veränderung intoige schlechter Behandlung festgestellt, wenn man die Kapseln offen bei einer Raumtemperatur von 37 C und einer relativen Feuchtigkeit von 75% fünf Monate lagerte.