CH494209A - Verfahren zur Herstellung von y(a-Niederalkylglutamyl)-cysteinyl-glycin und y-(a-Niederalkylaspartyl)-cysteinylglycin - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur Herstellung von   y(a-Niederalkylglutamyl)-cysteinyl-glycin    und   y- (a-Nieder-    alkylaspartyl)-cysteinylglycin
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Cysteinyl-glycin und dem Aspartyl-Analogan davon. Glutathion ist ein bekanntes Produkt, das in der Natur verbreitet vorkommt. Es kann aus verschiedenen natürlichen Quellen, z. B. Hefe oder Leber- und Muskelgewebe, isoliert werden. Man weiss, dass es an zahlreichen enzymatisch gesteuerten Redoxreaktionen beim Stoffwechsel von Pflanzen, Tieren, Menschen, Mikroorganismen, einschliesslich Bakterien und Viren, und Insekten teilnimmt. Bei diesen wird es von seiner oxydierten Form,   y-(a-Glutamyl)-cysteinyl-    glycin, in seine reduzierte Form, y-(a-Glutamyl)-cystinylglycin, umgewandelt und umgekehrt.

  Die Leichtigkeit, mit der diese Umwandlung erfolgt, erklärt die Wichtigkeit dieser Verbindung bei Stoffwechselzyklen, bei denen Redoxreaktionen vorkommen.



   Eines der interessantesten Probleme in der neuzeitlichen physiologischen Chemie ist die Herstellung von Homologa und Analoga bekannter physiologisch aktiver Substanzen. Die Herstellung solcher Produkte und der Ersatz der bekannten physiologisch aktiven Verbindungen damit am selben Wirkungsort führt oft zu einer wertvollen Auskunft, was die Wirkungsweise der bekannten aktiven Verbindungen betrifft. Sehr oft erhält man dadurch einen Hinweis, der die synthetische Herstellung therapeutisch aktiver Verbindungen erlaubt, die anstelle der natürlichen Verbindungen verwendet werden können, die sich in gewissen Fällen äusserst schwer in reiner aktiver Form aus natürlichen Quellen isolieren lassen. Gelegentlich sind die synthetischen Verbindungen aktiverer als die natürlichen Verbindungen.

  Die hohe Wirksamkeit der synthetischen Verbindung Prednisolon im Vergleich zum natürlichen Produkt 17-Hydroxycorticosteron ist ein solcher Fall.



   Ein weiteres wichtiges Ergebnis, das durch die Herstellung und das Studium von Homologa und Anologa bekannter physiologisch aktiver Verbindungen erzielt werden kann, besteht darin, dass solche Verbindungen als therapeutische Gifte für pathogene Organismen, Ungeziefer und unerwünschte Pflanzen wirken können, indem sie lebenswichtige Stoffwechselzyklen stören. Gewöhnlich wirken solche Verbindungen dadurch, dass sie in eine Stufe der Stoffwechselwege des Organismus, des Insekts oder der Pflanze eintreten, um eine Verbindung zu bilden, die in der nächsten Stufe des Wegs nicht verwendet werden kann. Der Stoffwechselweg wird dadurch unterbrochen. Die störende Verbindung wird Antagonist genannt. Die Verbindung a-Methylglutation ist in gewissen Enzymsystemen, die Glutation verwenden, ein Antagonist für Glutation.

  Die störende Wirkung von Kohlenmonoxyd auf den Atmungskreislauf durch dessen Verbindung mit Hämoglobin ist ein weiteres bekanntes Beispiel für diesen Typus von Vergiftung. Solche Verbindungen sind unter anderem als Antibiotika, Antidiabetika, Wurmmittel, Mittel gegen Viren und Unkrautvertilgungsmittel nützlich.



   Die Verbindungen a-Methylglutation und dessen Aspartyl-Analogon   1/-(a-Methyl-aspartyl)-cysteinylglycin,    die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden können, sind ein Homologon bzw. Analogon der natürlichen Verbindung Glutathion und somit wie oben beschrieben nützlich. Die Herstellung struktureller Varianten von Glutathion wird dadurch erschwert, dass bei Glutathion die Peptidbindung zwischen der Glutaminsäure und dem Cystein durch die y-Carboxylgruppe der Säure erfolgt. Jedes Verfahren zur Herstellung nahverwandter struktureller Varianten solcher Komponenten muss die Bildung einer Peptidbindung mit der a-Carbonylgruppe der Glutamin- oder Asparaginsäure im wesentlichen ausschliessen.



   Ferner ist die Sulfhydrylgruppe des Cysteins besonders reaktionsfähig und muss geschützt werden, um bei der Peptidbildung eintretende Nebenreaktionen auf ein Minimum zu reduzieren. Die Schutzgruppe muss leicht  zu entfernen sein, ohne auf andere funktionelle Gruppen im Molekül eine nachteilige Wirkung auszuüben. Im idealen Fall lässt sich die Sulfhydryl-Schutzgruppe unter den Bedingungen entfernen, die für die Gruppe verwendet werden, die zum Schutz des Aminosubstituenten in der Glutamin- oder Asparaginsäuregruppe verwendet wird.



   Das erfindungsgemässe Verfahren bezieht sich auf strukturelle Modifikationen von Glutathion, wobei ein Wasserstoffatom des a-Kohlenstoffatoms des Dicarbonsäureteils des Moleküls durch eine   verzweigtkettige    oder gradkettige Niederalkylgruppe ersetzt wird. Die nach diesem Verfahren erzeugten Produkte sind vom a-Isomer im wesentlichen frei. Beim bevorzugten Verfahren werden die Schutzgruppen für die Sulfhydrylund Aminofunktionen so ausgewählt, dass sie gleichzeitig entfernt werden können.



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von   1'-(a-Niederalkylglutamyl)-cysteinyl-glycin    und dessen Aspartyl-Analoga ist nun dadurch gekennzeichnet,   dass    S-Benzyl-cysteinyl-glycin N-Carbobenzoxy-niederalkylglutaminsäureanhydrid oder einem N-Carbobenzoxy-nie   deralkylasparaginsäureanhydrid,    N - Carbobenzoxy methyl-glutaminsäureanhydrid,   um gesetzt    wird.



   Die neuartigen Zwischenprodukte können mit Natrium in flüssigem Ammoniak behandelt werden, um beide Schutzgruppen gleichzeitig zu entfernen.



   Aus Gründen der Zweckmässigkeit wird die Erfindung nun anhand des a-Methylglutaminsäure-Homogons von Glutathion in Einzelheiten beschrieben. Die Beschreibung ist in gleicher Weise auf die   Herstellung    anderer   ci.-Niederalkylglutaminsäure-Derivate    und auf   am      Niederalkylasparaginsäure-Derivate    anwendbar.



   Die Verbindung   y-(N-Carbobenzoxy-a-methylglut-    amyl)-S-benzyl-cysteinylglycin kann durch Umsetzung des   N - Carbobenzoxy- cc -    methylglutaminsäureanhydrids mit S-Benzylcysteinylglycin unter alkalischen Bedingungen in einem wässrigen Lösungsmittel hergestellt werden. Die Umsetzung wird vorzugsweise bei Raumtemperatur, d. h.



  bei   20-30     C, durchgeführt, obwohl auch etwas über oder unter diesen Bereich liegende Temperaturen ohne negative Wirkung auf die Umsetzung verwendet werden können. Die Reaktionsdauer kann von etwa 10 Minuten bis etwa 2 Stunden variieren, wobei sie hauptsächlich von der gewählten Reaktionstemperatur abhängt. Eine gute Ausbeute kann unter Verwendung äquimolarer Mengen der Reaktionsteilnehmer erzielt werden, doch kann auch ein bis zu etwa 25 %iger molarer Überschuss am einen oder andern Reaktionsteilnehmer mit guter Wirkung verwendet werden. Die Umsetzung wird in einem alkalischen Milieu, das vorzugsweise einen pH Wert von etwa 7,5 bis etwa 9,5 aufweist, durchgefürt.



  Um den pH innerhalb des gewünschten Bereichs zu halten, können verschiedene Puffer verwendet werden, dazu gehören z. B. Borat-, Phosphat- und Carbonat Puffer. Zusätzliche Base, z. B. ein Alkalimetallhydroxyd, kann im Verlauf der Umsetzung beigefügt werden, um grosse Schwankungen in der Wasserstoffionenkonzentration zu verhindern. Die Löslichkeit der Reaktionsteilnehmer kann erhöht werden, indem ein der Reaktion gegenüber inertes, mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie z. B. Dioxan, Tetrahydrofuran oder Aceton und dergleichen, verwendet wird. Am Schluss der Umsetzungsperiode wird der pH der Lösung auf die saure Seite gebracht, z. B. auf etwa 1,5 bis etwa 3,5, um das neuartige Salz in die Säure umzuwandeln, die nach irgend einem passenden Verfahren isoliert werden kann.



   Es können äquimolare Mengen der   lLeaktionsteil-    nehmer verwendet werden, doch wird die Ausbeute gewöhnlich durch die Verwendung eines geringen   Üb er-    schusses von sagen wir bis zu 10 Mol   S    des einen oder andern Reaktionsteilnehmers erhöht.



   Das bei der oben beschriebenen Umsetzung verwendete S-Benzylcysteinylglycin kann nach irgend einem bekannten Verfahren hergestellt wer den. Bei einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird es durch die Umsetzung von   N-Carboxy-S-benzyl-cystein-    anhydrid mit Glycin erzeugt und durch Umsetzung mit z. B.   N-Carbobenzoxy-cc-methylglutaminsäureanhydrid    in situ in das gewünschte Endprodukt umgewandelt. Bei diesem Aspekt der Erfindung wird durch die Phosgenierung von S-Benzylcystein erzeugtes N-Carboxy-S-benzylcysteinanhydrid etwa 30 Sekunden bis etwa 2 Minuten bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 100 C in einem alkalischen Milieu bei einem pH von etwa 8,5 bis 10,5 mit Glycin umgesetzt.

  Es können äquimolare Mengen der   Reaktionsteilnehmer    verwendet werden, doch wird es vorgezogen, einen geringen Überschuss von sagen wir etwa 10   Mol %    Anhydrid zu verwenden, um eine   möglichst    vollständige Umsetzung zu gewährleisten.



   Die sich bildende   S-Benzylcysteinylglycincarbamat-    Zwischenverbindung wird decarboxyliert, indem das Gemisch zweckmässig durch die Beigabe einer Mineralsäure, wie z. B. Schwefel- oder Salzsäure, bis zu einem pH von etwa 1,5 bis etwa 4 angesäuert wird. Das Carbamat zersetzt sich, wobei sich Kohlendioxyd entwickelt.



  Die vollständige Entfernung des Kohlendioxyds kann dadurch erleichtert werden, dass in das angesäuerte Reaktionsgemisch Stickstoff eingeleitet wird.



   Nach der Decarboxylierung wird der pH des S-Ben   zylcysteinylglycins    enthaltenden Reaktionsgemisches auf die alkalische Seite gebracht. Das gewählte   N-geschützte-    a-Methylglutamin- oder -asparaginsäureanhydrid wird dann beigefügt und die Umsetzung wie oben beschrieben fortgesetzt.



   Wie bereits erwähnt, ist die bevorzugte Schutzgruppe für den   a-Mer:hylglutaminsäure-    oder   a-Methylasparagin-    säure-Teil die Carbobenzoxygruppe, da sowohl diese Gruppe als auch die Benzylgruppe am   Cystein-Teil    durch die Verwendung eines Alkalimetalls, vorzugsweise Natrium, in flüssigem Ammoniak gleichzeitig entfernt werden können. Die Umsetzung wird zweckmässig durch die Beigabe von metallischem Natrium zu einer Lösung des geschützten Peptids in flüssigem Ammoniak bewirkt.



  Es wird genügend Natrium beigefügt, bis die nicht umgesetztes Natrium anzeigende hellblaue Farbe mehrere Minuten andauert. Das überschüssige Natrium wird dann zersetzt und das Ammoniak verdampft. Die Verdampfung kann unter Stickstoff durchgeführt werden, um die Nebenreaktionen auf ein Minimum zu beschränken, doch ist dies nicht wesentlich.

 

   Das gewünschte Produkt kann durch irgend eine geeignete Methode aus dem nach Entfernen des Ammoniaks verbleibenden Rückstand isoliert werden. Bei einer passenden Methode wird der Rückstand in verdünnte Mineralsäure aufgenommen und mit einem mit Wasser   unvermischb aren    organischen Lösungsmittel extrahiert und das gewünschte Produkt als Kupfersalz aus der wässrigen Schicht gefällt. Bei Verwendung von Schwefelsäure wird der Niederschlag dialysiert, um die mit dem gefällten Kupfersalz verbundene Schwefelsäure zu entfernen. Das Salz wird dann in einem wässrigen Milieu mit Schwefelwasserstoff behandelt, um Kupfersulfid zu fällen, das durch Filtrieren entfernt  wird. Das Filtrat kann gefriergetrocknet werden, um das gewünschte Produkte zu erzielen.



     
N-Carbobenzoxy-a-niederalkylglutaminsäureanhydride    und die entsprechenden Asparaginsäureanhydride werden durch die Dehydratisierung der N-substituierten entsprechenden Säuren unter Verwendung eines milden Dehydratisierungsmittels, wie z. B. Essigsäureanhydrid oder Dicyclohexylcarbodiimid, hergestellt. Die N-substituierten Säuren werden durch die Umsetzung von Carbobenzoxychlorid mit den   a-Niederalkylsäuren    erzeugt, die nach bekannten Verfahren hergestellt werden; z. B.



  kann   a-Methylasparaginsäure    durch die Umsetzung von Cyanwasserstoff mit   Äthyl-L-aminocrotonat    mit nachfolgender Säurehydrolyse des Esters erzeugt werden.



   Folgende Beispiele dienen zur Veranschaulichung des erfindungsgemässen Verfahrens; sie sind nicht als Einschränkung aufzufassen.



   Beispiele N -   Carbobenzoxy-a-methyl-DL    -   glutamins äureanhydrid    (a) Verfahren mit Essigsäureanhydrid
5 g (0,17 Mol) N-Carbobenzoxy-a-methyl-DL-glutaminsäure werden in 20 ml Essigsäureanhydrid suspendiert und etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, um eine homogene Lösung zu erzielen. Das Essigsäureanhydrid wird bei vermindertem Druck und   50-60     C entfernt und der ölige Rückstand mehrmals mit Chloroform gespült. Das erzielte Öl wird mit   Äther    zerrieben, wobei man das gewünschte Produkt erhält.



  (b) Verfahren mit Dicyclohexylcarbodiimid
8,31 g (0,03 Mol)   N-Carbobenzoxy-cc-methyl-DL-    glutaminsäure werden in 250 ml Dioxan gelöst, und 6,18 g (0,03 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid werden unter Rühren beigefügt. Die Lösung wird 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Der sich bildende Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtrieren entfernt und der Niederschlag mit 20 ml Dioxan gewaschen. Das zum Waschen verwendete Dioxan und das Filtrat werden vereinigt, und das gewünschte Produkt wird durch Entfernen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck isoliert. Die Dioxanlösung des Anhydrids kann unmittelbar verwendet werden, ohne dass das Produkt isoliert wird.



   Die Verfahren (a) und (b) werden zur Erzeugung folgender Verbindungen verwendet:   N-Carbobenzoxy-a-methyl-DL-aspartylanhydrid N-Carbobenzoxy-a-äthyl-DL-glutaminsäureanhydrid N-Carbobenzoxy-awäthyl-DL-asparaginsäureanhydrid    N-Carbobenzoxy-a-isobutyl-DL-glutaminsäureanhydrid   N-Carbobenzoxy-a-hexyl-DL-asparaginsäureanhydrid      y-(N-Carbobenzoxy-cc-methylglutamyl)    -S-benzyl-L cysteinylglycin (a) S-Benzyl-L-cysteinylglycin
7,5 g (0,1 Mol) Glycin werden in 1 Liter eines molaren Kaliumborat-Puffers bei pH 11,0 gelöst, und die Lösung wird auf   0     C abgekühlt und mit 400 g Eis in eine Mischapparatur gegeben. 24,9 g (0,105 Mol) N - Carboxy - S -   benzyl-L-cysteinanhydrid    werden unter sehr raschem Rühren beigefügt.

  Es wird 90 Sekunden weiter gerührt, worauf das Gemisch filtriert wird. Der pH des Filtrats wird auf 4,5 eingestellt, worauf wiederum filtriert wird. Die Lösung von S-Benzyl-L-cysteinylglycin kann unmittelbar verwendet oder das gewünschte Produkt isoliert werden.



   Die Isolierung erfolgt mittels einer Kolonne von 500 ml Kohle, die mit 3 Liter Wasser gewaschen wird, um die Salze und das verbleibende Glycin zu entfernen.



  Das gewünschte Produkt wird mit 5   zeiger    Essigsäure in   50 %dem    wässrigem Aceton aus der Kolonne isoliert.



  Das Produkt wird aus dem Eluat isoliert, indem das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft wird.



  (b) y-(N-Carbobenzoxy-   a    - methylglutamyl)-S-benzyl-Lcysteinylglycin
8,04 g (0,03 Mol) des in (a) erzeugten Produkts und 5,04 g (0,06 Mol) Natriumbicarbonat werden in 500 ml Wasser gelöst, und der pH wird auf 8,0 bei 250 C eingestellt. Eine Lösung von 0,03 Mol N-Carbo   benzoxy-aXmethyl-DL-glutaminsäureanhydrid    in 270 ml Dioxan, die wie in Beispiel   l(b)    beschrieben hergestellt wird, wird in einem Zeitraum von 20 Minuten beigefügt, und der pH durch die Beigabe von Natriumhydroxydlösung bei 8,0 gehalten. Das Reaktionsgemisch wird eine weitere Stunde gerührt und der pH mit Schwefelsäure auf 1,5 eingestellt. Insgesamt 500 ml Wasser werden zugesetzt, und das Gemisch wird zweimal mit je 500 ml Äthylacetat extrahiert.

  Die   Äthylacetatextrakte    werden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird bei vermindertem Druck entfernt, wobei das gewünschte Produkt erzielt wird.



   Das Verfahren wird zur Herstellung folgender Verbindungen aus den in Beispiel 1 erzeugten Produkten verwendet:   y-(N-Carbobenzoxy-a-methyl-DL-aspartyl)-S-benzyl-   
L-cysteinylglycin   y-(N-Carbobenzoxy-a-äthyl-DL-glutamyl)-S-benzyl-   
L-cysteinylglycin   v-(N-carbobenzoxy-a-äthyl-DL-aspartyl)-s-ben   
L-cysteinylglycin   7a-(N-Carbobenzoxy-a-isobutyl-DL-glutamyl)-S-benzyl-   
L-cysteinylglycin   (N-Carbobenzoxy-a-hexyl-DL-aspartyl)-benzyl-   
L-cysteinylglycin.



   Dieselben Verfahren werden zur Herstellung von und L-Glutamyl- und Aspartyl-Isomeren der obigen Verbindungen unter Verwendung der nach dem Verfahren von Beispiel 1 erzeugten optischen Isomere verwendet.



     ;-(cc-Methyl-DL-glutamyl)-L-cysteinylglycin   
4,0 g (0,0073 Mol) der in Beispiel 2 hergestellten Verbindung werden in 250 ml flüssigem Ammoniak gelöst. Natriummetall wird beigefügt, bis die hellblaue Färbung 5 Minuten bestehen bleibt. Das überschüssige Natrium wird durch die Beigabe von Ammoniumchlorid entfernt und das Ammoniak unter einem Stickstoffstrom verdampft. Der feste Rückstand wird in 125 ml 0,5 N Schwefelsäure gelöst und die Lösung mit Äthylacetat extrahiert, um Dibenzyl zu entfernen. Das gewünschte Produkt wird durch die Beigabe von Kupferoxyd in kleinen Mengen, bis die rötliche Farbe bestehen bleibt, als Kupfersalz gefällt. Das Kupfersalz wird durch Ausschleudern isoliert und dann dialysiert, um die an das Kupfersalz gebundene Schwefelsäure zu entfernen. Das Kupfer wird als Sulfid entfernt, indem Schwefelwasserstoff in das Gemisch eingeleitet wird. 

  Der Niederschlag wird entfernt und das gewünschte Produkt durch Gefriertrocknung der Lösung isoliert.



   Ähnlich werden die nachstehenden Produkte aus den geeigneten gemäss den Verfahren der obigen Beispiele erzeugten Ausgangsverbindungen hergestellt:   y-(a-Methyl-DL-aspartyl)-L-cysteinylglycin y-(a-Sithyl-DL-glutamyl) -L-cysteinylglycin        , -(a-Äthyl-DL-aspartyl)-L-cysteinylglycin ;-(cc-Isobutyl-DL-glutamyl)-L-cysteinyiglycin X(a-Hexyl-DL-aspartyl)-L°cysteinylglycin .   



   Dieselben Verfahren werden zur Herstellung der Dund L-Formen aus den gleichen Glutamyl- und Aspartylverbindungen aus den entsprechenden Produkten der obigen Beispiele verwendet.



   Aus der Amino-Stickstoffanalyse dieser Produkte nach van Slyke gehen etwa 2 Äquivalent Stickstoff hervor. Dies zeigt, dass die Produkte von   cc-Isomeren    im wesentlichen frei sind. Es ist bekannt, dass bei der Analyse von van Slyke y-Peptide 2 Äquivalent Stickstoff und   a-Peptide    1 Äquivalent Stickstoff ergeben.



   Ein typisches Beispiel für den Nutzen der nach dem erfindungsgemässen Verfahren erzeugten Verbindungen ist die hemmende Wirkung von   a-Methylglutathion    auf das Wachstum von durch Tumorbildung herrührenden Zellenreihen. Standardversuche, bei denen die Zelltoxizität der Verbindung anhand von einfachen Schichten normaler Zellkulturen vom Maus- und Kückenembryo, Kaninchenniere und menschlichen Amnion in Standardnährmilieus untersucht wurde, ergaben, dass der Toxizitätstiter über 100   y/rnl    lag. Versuche mit denselben Verbindungen anhand von einfachen Schichten von als   Hela-l    und H-Ep-2Y-1 bezeichneten Zellenreihen, die von Tumorbildung herrührten, ergaben, dass der Toxizitätstiter 31,25   r/ml    bzw. 125   y/mI    betrug. 

  Bei Versuchen in einer Zellensuspension anhand derselben Zellenreihen betrug der Toxizitätstiter nur 0,1   y/ml    bzw.



  0,8 y/ml. Die Versuchsmethoden sind in Tamm and Names Virology; Bd. 4, Nr. 3, Dezember 1957, Seiten 483-498; Names an Hilleman, Proceedings of the Society For Experimental Biology and Medicine; Band
119, 1965, Seiten 515-250; und Rightsel et al, University of Michigan Medical Bulletin; Bd. XXIV, Juni 1958, Seiten 222-234, in Einzelheiten beschrieben. 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Herstellung von y-(cc-Niederalkylglut- amyl)-cysteinyl-glycin und dessen Aspartyl-Analoga, dadurch gekennzeichnet, dass S-Benzyl-cysteinyl-glycin mit einem N - Carbobenzoxy-niederalkylglutaminsäureanhy- drid oder einem N-Carbobenzoxy-niederalkylasparagin- säureanhydrid umgesetzt wird und die Schutzgruppen hierauf abgespalten werden.