CH500491A - Procédé d'obtention d'une préparation stable, sensibilisée, d'érythrocytes - Google Patents

Description

  Procédé     d'obtention    d'une     préparation        stable,        sensibilisée,        d'érythrocytes       La     présente    invention concerne un procédé d'ob  tention d'une préparation stable, sensibilisée,     d'éry-          bhrocytes,    propre à l'emploi pour les essais     d'hémag-          glutination    indirecte ou passive, et la préparation  d'érythrocytes stable sensibilisée, obtenue par ce  procédé.  



  Les     érythrocytes    natifs et ceux traités par les  procédés de     l'art    antérieur     utilisables    pour les essais       d'hémagglutination    directe tels que la détermination de  groupes sanguins présentent l'inconvénient qu'ils se  détériorent rapidement au stockage, de sorte que pour  de nombreuses applications, ils deviennent inutilisables  après environ 21 jours. En outre, les cellules natives  ne sont pas aptes nu stockage par congélation     sortant     des milieux spéciaux et ne sont pas non plus satisfai  sants après lyophilisation et reconstitution.

   Les éry  throcytes natifs sont aussi     sensibles    à la     composition     ionique, au pH et à la pression osmotique des milieux  de     suspension,    de sorte qu'il existe des limitations  indésirables au domaine d'essais auxquels on peut les  utiliser.  



  Les érythrocytes qui sont enduits avec des anti  gènes connus     constituent    une préparation connue pour  l'utilisation de moyens d'essais pour des     anticorps     spécifiques à ces antigènes. Lorsque l'on met en  contact avec les érythrocytes enduits un     antisérum    ou  un sérum contenant     l'anticorps    soupçonné, il se pro  duit une agglutination qui indique que l'anticorps sup  posé est bien présent dans le sérum. L'homme de l'art  sait que cette     agglutination    fournit des renseignements       semi-quantitatifs    sur la présence d'anticorps spécifiques  et également des renseignements utiles sur les condi  tions qui donnent lieu à la présence de ces anticorps.  



  On a rencontré de nombreux problèmes dans la  préparation, le stockage et l'utilisation de ces érythro  cytes enduits. Par exemple, pour résoudre les pro  blèmes d'enduction pendant la préparation, on a     utilisé     des agents de couplage pour appliquer les     antigènes     aux érythrocytes.

   Les problèmes peuvent aussi    concerner d'une manière     générale    la stabilité des     éry-          throeytes    dans les     conditions    de stockage ou leur sensi  bilité dans des essais     choisis        d'hémagglutination    pas  sive et la reproductibilité de ces essais     d'hémagglutina-          tion.    En     outre,    les cellules individuelles d'érythrocyte  peuvent s'agglutiner ou présenter une     hémagglutination     non spécifique,

       cette        activité        interférant    avec les essais       d'hémagglutination    pour un facteur spécifique. On  conserve     ordinairement    les érythrocytes enduits à l'état  congelé, mais     lorsque    l'on dégèle les préparations  congelées,     il    peut se produire     une    agglutination ou bien  les cellules peuvent être détruites par hémolyse.  



  Il est souhaitable de pouvoir traiter les     érybhrocytes     de telle manière que l'on puisse y appliquer divers       antigènes    et que ces érythrocytes enduits puissent être  utilisés     comme    réactifs sensibles pour     l'hémagglutina-          tion    passive, dont l'essai soit fidèle et reproductible. Il  est également     souhaitable    d'obtenir l'adsorption d'anti  gène sans que soit nécessaire la présence d'agents de  couplage ou d'autres     étapes.     



  L'invention a donc pour objet un procédé d'obten  tion d'une     préparation    stable, sensibilisé, d'érythro  cytes, caractérisé en ce que l'on adsorbe sur lesdits  érythrocytes, mis en jeu sous     forme    d'une préparation  stabilisée, un ou plusieurs     antigènes    et/ou anticorps.  



  Selon le procédé, on obtient une préparation d'éry  throcytes enduits avec divers     antigènes    ou anticorps,  qui peut être efficacement emballée et stockée pendant  des périodes prolongées, jusqu'à ce qu'on la soumette  aux essais particuliers     d'hémagglutination    passive.  



  L'invention     concerne    aussi les préparations stables       d'érythrocytes    sensibilisées, c'est-à-dire améliorées, par  une méthode de     potentialisation.    Le terme potentialisa  tion indique le conditionnement des cellules de manière  à augmenter le titre     d'hémagglutination    de la prépara  tion.  



       L'invention    est illustrée par la     description    qui suit.  On exposera d'abord le mode selon lequel on peut       obtenir    la préparation d'érythrocytes     stabilisée;    à cet      égard, il .importe de noter que la préparation d'érythro  cytes stabilisée peut, en outre, faire l'objet de différents  traitements d'activation, avant d'être mise en jeu dans  le procédé selon l'invention.  



  On recueille des érythrocytes natifs dans les sang  complet de divers animaux tels que lapins, rats.,  pigeons, moutons, poulets et aussi de     l'homme.    On       traite    l'échantillon de sang par des solutions     isotoni-          ques    classiques d'anticoagulants, on passe ensuite les  érythrocytes, par exemple par     centrifugation,    et on les  lave avec des solutions-tampons compatibles ayant un  pH sensiblement neutre pour éviter l'hémolyse des éry  throcytes et pour éliminer du sérum des. substances  indésirables qui peuvent être présentes sur les érythro  cytes.  



  On prépare une suspension des érythrocytes lavés  dans la solution-tampon neutre à une concentration  faible de préférence inférieure à environ 10 % en  volume. On traite les érythrocytes avec une faible       quantité    d'aldéhyde     pyruvique,    par rapport au volume  des érythrocytes, pendant un temps suffisant pour  donner aux érythrocytes la stabilité souhaitable, par  exemple     pendant    une nuit, en agitant.

   Après ce stade  de     traitement    à l'aldéhyde     pyruvique,    on lave plusieurs  fois les     érybhrocytes    pour éliminer l'excès d'aldéhyde       pyruvique    et les autres substances qui peuvent s'être  formées à partir du     sérum.    On soumet ensuite les éry  throcytes traités à l'aldéhyde     pyruvique    à l'action  d'une faible quantité de     formaldéhyde    par rapport au  volume d'érythrocyte et on     élimine    l'excès de     formal-          déhyde    par plusieurs lavages au moyen d'une solution  tamponnée.  



  Les traitements précédents par l'aldéhyde pyru  vique et par le     formaldéhyde    peuvent être désignés  ensemble par l'expression  double traitement aux aldé  hydes  pour obtenir une  préparation stabilisée     d'éry-          throcytes .     



  De préférence, le traitement à l'aldéhyde     pyruvique     doit précéder le traitement au     formaldéhyde    car on a  trouvé qu'avec beaucoup d'érythrocytes, un traitement  initial au     formaldéhyde    tend à endommager ces cel  lules;

   l'ordre préféré est donc recommandé comme pra  tique     habituelle.    Toutefois, il est bien entendu qu'avec       certains    érythrocytes, un traitement initial au     formaldé-          hyde    peut ne pas être particulièrement     contre-indiqué     et par conséquent, dans certains cas, un traitement ini  tial au     formaldéhyde    peut encore conduire à des résul  tats avantageux, aussi cet ordre des traitements est  préféré.  



  Les préparations stabilisées d'érythrocytes peuvent  être conservées pendant des périodes de temps nota  bles sans qu'il se produise de phénomènes indésirables  d'hémolyse,     d'agglutination    ou qu'il se présente d'au  tres caractéristiques indésirables.  



  La préparation d'érythrocytes stabilisée ci-dessus  peut être transformée en une préparation stable d'éry  throcytes enduits, par mise en contact d'un échantillon  d'érythrocyte traité aux aldéhydes avec un antigène,  puis une ou plusieurs étapes de lavage pour éliminer  l'excès d'antigène. En général, les érythrocytes stabi  lisés sont enduits avec des antigènes dans une solution  stabilisée à un pH inférieur à 7 et de préférence tam  ponnée à un pH d'environ 3,6 à environ 6. Pour les  antigènes du type polysaccharide tels que     l'endotoxine     de E.     coli,    l'enduction peut être effectuée à pH 7.

   On  obtient une     sensibilité    supérieure lorsque les érythro  cytes traités sont conditionnés par agitation dans la    solution tamponnée pendant d'enduction est habituelle  ment terminée en environ 1 heure mais peut parfois  nécessiter jusqu'à 24 heures. On préfère une tempéra  ture     d'enduction    de 24  C; des     températures    de 50  C  et supérieures produisent des préparations d'érythro  cytes ayant une sensibilité réduite.  



  Les conditions précédentes peuvent varier un peu  pour les     différents        antigènes    mais l'homme de l'art  peut     facilement    déterminer les conditions préférées  d'enduction en se référant à l'agglutination avec des  dilutions en série d'un     antisérum    choisi. Par exemple,  on peut injecter à un     lapin    diverses quantités d'anti  gène identique à l'antigène adsorbé sur la     préparation     d'érythrocytes.

   On recueille un échantillon de     sérum     dans lequel les anticorps seraient présents et on peut  placer une série de dilutions de ce     sérum    dans, des pla  teaux en matière plastique à fond en V auquel on  ajoute un égal volume de la préparation stable d'éry  throcytes traitée aux aldéhydes. On utilise un mélange  de réaction contenant des cellules et le diluant     comme          témoin    dans lequel les cellules     forment    un  bouton   dans le fond si la réaction est négative. L'aspect d'une   surface mate  indique une réaction positive d'aggluti  nation qui     indique    une enduction satisfaisante. On doit  soigneusement distinguer l'agglutination non spécifique.  



  Dans la présente description, l'expression      enduc-          tion    par un antigène  doit être comprise comme dési  gnant une substance qui peut être un anticorps ou un  antigène, sauf référence     particulière    à des antigènes ou  des anticorps particuliers.  



  Les antigènes que l'on peut utiliser avec succès  pour enduire les préparations d'érythrocytes stabilisées  comprennent les antigènes du type protéine tels que  l'albumine de     sérum    de boeuf ou     BSA,    le     BSA    insolu  bilisé, l'albumine de     sérum        humain,    la y-globuline de  lapin, la y-globuline     humaine,    protéine M de strepto  coque, antigène E de mauvaises herbes, antigènes du  type polysaccharide tels que l'endotoxine de E.

       coli     (TE), ET     acétylé,    ET     succinilé,    ET     désestérifié,    ET       désestérifié    et     bormacétylé,        polyglucose    synthétique,  antigènes divers tels que RNA-bactériophage     (acide     ribonucléique),     Qp,    antigène     d'entamoeba        histolytica    et  d'autres     encores.    Un avantage particulier de l'inven  tion est que la préparation stabilisée d'érythrocytes  convient pour l'enduction par ces diverses substances  de compositions chimique variées.  



  Selon un mode d'activation éventuel, on peut aug  menter le titre     d'hémagglutination    de la préparation  d'érythrocytes stabilisée et enduite en réduisant sa tem  pérature jusqu'à environ -190  C et en la maintenant  ensuite à une température de plusieurs degrés en des  sous du point de congélation, de préférence à une tem  pérature maintenue de manière uniforme et à environ  -20  C, pendant une période d'environ 16 semaines.  



  On peut aussi obtenir des résultats également effi  caces en environ 6 semaines en élevant périodiquement  la température des érythrocytes stabilisés et enduits à  24  C pendant plusieurs heures et sans agitation, de  préférence à des intervalles d'environ 6 ou 7 jours.  Des cycles de plusieurs heures à quelques jours sont  inefficaces.  



  Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'étape  éventuelle d'activation, on traite les     érythrocytes    par  une solution diluée d'un agent oxydant, le     periodate    de  sodium étant un réactif approprié.  



  On peut conserver la préparation     d'érythrocytes     enduits, éventuellement activée, à l'état     lyophilisé    ou à      une température d'environ -190  C jusqu'au moment  nécessaire pour les essais     d'hémagglutination.    Le mode  opératoire pour ces essais est bien connu de l'homme  de l'art.  



  En général, on combine un échantillon de sérum  animal que l'on suppose contenir l'anticorps avec les  érythrocytes enduits dans un véhicule liquide pour  déterminer sic l'agglutination se produit.  



  De manière analogue, on peut enduire les prépara  tions     d'érytrhocytes    stabilisées avec un anticorps spéci  fique, de sorte que dans l'essai ultérieur     d'hémaggluti-          nation,    les érythrocytes s'agglutinent en présence d'un  antigène spécifique libre. L'homme de l'art peut avan  tageusement mettre en oeuvre d'autres variantes de  l'essai     d'hémagglutimation    avec les préparations d'éry  throcytes stables enduits, obtenues selon     l'invention.     



  On peut     utiliser    l'essai     d'hémagglutination    passive  pour déceler la présence de     y-globuline    sur les cellules,  par exemple en présence d'antigène d'endotoxine, pour  déceler l'infection virale, pour déterminer un type  d'histocompatibilité, pour déceler des maladies par       autoimmunisabion    et pour d'autres phénomènes de ce  type. On peut aussi utiliser les préparations d'érythro  cytes enduits et stabilisés comme réactifs d'essais dans  les analyses chimique quantitatives ou     semi-quantita-          tives,    pour déceler la présence d'antigène.

      <I>Obtention du matériel -de départ</I>  a)     Préparation    stable d'érythrocytes traités aux  aldéhydes  On prélève par ponction cardiaque un échantillon  de 20 ml de sang complet chez un lapin de 2-3 kg et  on recueille cet échantillon dans une seringue conte  nant un égal volume de solution stérile     d'Alsever.     Cette solution est en général isotonique et contient un  anticoagulant à base de citrate de sodium, du chlorure  de sodium, du dextrose et de l'eau distillée. On laisse  reposer     l'échantillon    prélevé pendant une nuit à  environ à 4  C et ensuite on le centrifuge à 1500 tr/mn  pendant 10 minutes pour obtenir 10 ml d'érythrocytes  de lapin tassés.

   On combine ensuite les érythrocytes  tassés avec 10 volumes d'une solution de tampon au  phosphate 0,11 M à pH 7,2. On prépare cette solution  tamponnée à partir de phosphate     monopotassique    et de  phosphate     dissodique    par agitation tourbillonnaire. On  centrifuge le mélange d'érythrocytes et de     solutions-          tampons    et     ensuite    on le soumet à 5 lavages séparés  par 10 volumes de la solution tamponnée ci-dessus  pour éliminer les protéines et autres substances prove  nant du sérum. On remet ensuite en suspension les éry  throcytes lavés dans la solution tamponnée précédente  pour obtenir une suspension d'érythrocytes de lapin à  8 % en volume.  



  Dans une fiole     Erlenmeyer    de 507 ml, on ajoute  125 ml de la solution tamponnée au phosphate conte  nant 3 % en volume d'aldéhyde pyruvique et 125 ml  de la     suspension    précédente à 8 % d'érythrocytes et on  agite le mélange pendant environ 18 heures à la tem  pérature ambiante. On filtre ensuite le mélange à tra  vers un tampon de gaze pour séparer les plus gros  débris cellulaires et ensuite on lave les érythrocytes 5  fois séparément avec 10 fois leur volume de la solution  tamponnée de phosphate. On remet ensuite en suspen  sion la préparation d'érythrocytes traités à l'aldéhyde  pyruvique dans la solution tamponnée précédente avec  une concentration à 10 % en volume.

      On dilue à 8     %    125 ml de la suspension précédente  traitée à l'aldéhyde pyruvique et on mélange avec  125 ml de la solution tamponnée de phosphate conte  nant 3 % en volume de     formaldéhyde.    On agite le  mélange pendant une nuit avec un agitateur magné  tique à la     température    ambiante et ensuite on     filtre    le  mélange à travers un tampon de gaze pour éliminer les  débris cellulaires éventuels. On lave ensuite les éry  throcytes traités à l'aldéhyde pyruvique et au     formaldé-          hyde    5 fois séparément par 10 fois leur volume de la  solution tamponné précédente.

   On remet ensuite en  suspension la préparation     d'érythrocytes    traités aux  aldéhydes à une concentration de 10 % dans la solu  tion tamponnée précédente et on verse la suspension  obtenue dans des récipients en verre que l'on bouche  pour leur conservation. La préparation d'érythrocytes  précédente traitée aux aldéhydes est stable pendant au  moins 2 mois aux basses températures de l'ordre de  4  C ou indéfiniment, congelée dans l'azote liquide.  



  On peut activer la préparation d'érythrocytes       bilisée    mais, de préférence, on effectue l'étape d'acti  vation seulement lorsque les érythrocytes ont été  enduits.  



  La préparation d'érythrocytes ainsi stabilisée pos  sède la plupart sinon tous les centres actifs de combi  naison présents sur les érythrocytes natifs, ces centres  actifs     désignant    en     particulier    des centres qui peuvent  réagir avec un anticorps ou un virus.  



  b) Préparation d'érythrocytes stabilisés activés  Le présent alinéa illustre l'augmentation du titre       d'hémagglutination    réalisé par fixation de fibrinogène  aux cellules de la préparation d'érythrocytes stabilisée.  On chauffe à 60  C pendant 1 heure du fibrinogène de  boeuf à une concentration de 1 ;,/ml dans une solution       tamponnée    d'acétate 0,1 M à pH 4,0 et on refroidit à  la température ambiante. On ajoute à la     solution    de  fibrinogène une suspension à 10 % des érythrocytes  traités aux aldéhydes obtenue par le procédé de  l'exemple 1 et on agite pendant 1 heure à la tempéra  ture ambiante.

   On lave les érythrocytes stabilisés  activés avec une solution tampon de phosphate à pH  7,2 et on ajuste la concentration d'érythrocytes à 10 %  en volume. On utilise ultérieurement ces cellules avec  des résultats supérieurs pour les     déterminations    de  groupes sanguins.  



  c) Préparation d'érythrocytes stabilisés     activés     On traite des érythrocytes humains par les aldé  hydes déjà mentionnés pour obtenir des érythrocytes  humains stabilisés en suspension dans une solution  tamponnée de phosphate à pH 7,2. On traite ensuite  les érythrocytes stabilisés à 24  C pendant 15 minutes  par une solution de     periodate    de sodium 0,00035 M et  ensuite on lave jusqu'à     élimination    de ce réactif avec  la solution tamponnée de phosphate pH 7,2.

   Lorsqu'on  les soumet à la réaction     d'hémagglutination    directe par       l'antisérum    de rat, les cellules stabilisées donnent une  réaction à une dilution de 1:100 tandis que les cellules  stabilisées, activées par la réaction d'oxydation, pré  sentent     l'hémagglutination    à une dilution de 1:2000.  



  <I>Exemple 1</I>  Préparation d'érythrocytes stabilisés  activés enduits  On lave 1 ml de la suspension à 10 % d'érythro  cytes stabilisée activée, obtenue par la méthode décrite  sous b), avec une solution tampon d'acétate 0,1 M à  pH 4,0 et on remet en suspension dans 9 ml de la      solution tampon d'acétate contenant 1 mg de     BSA.    On  agite le mélange à la température ambiante pendant 2  heures et ensuite on lave 5 fois avec un excès de solu  tion tamponnée au phosphate à pH 7,2. On utilise  ensuite ces cellules pour des réactions     d'hémagglutina-          tion    passive.  



  <I>Exemple 2</I>  Préparation     d'érythrocytes    stabilisés  enduits d'antigène  Dans un tube à     centrifugation    conique de 12 ml à  24  C, on ajoute 1 ml de la     suspension    à 10     %    de la  préparation d'érythrocytes traitée aux aldéhydes selon  a).  



  On lave ensuite cet échantillon avec une solution  tampon d'acétate 0,1 M à pH 4,0. Les érythrocytes       stabilisés    ne sont pas     hémolysés    ni     agglutinés    à cette  faible valeur de pH. On remet en suspension les cel  lules de la préparation d'érythrocytes dans 9 ml de la  solution     tamponnée    d'acétate à 24  C, à pH 4,0, .et on  agite à ce pH et à cette température pendant 1 heure;

    ensuite, on ajoute 1     ml    de la solution tampon d'acétate  contenant 1 mg de     BSA.    On centrifuge pendant 2  heures à la température ambiante le mélange d'anti  gènes et d'érythrocytes traités aux aldéhydes et stabi  lisés et ensuite on     effectue    5 lavages séparés avec un  excès d'une solution tamponnée de     phosphat    à pH 7,2.  On remet en suspension les érythrocytes stables enduits  de     BSA    dans la solution volume et on place des por  tions aliquotes de 10 ml de cette suspension     dans    des       bouteilles    en verre de 20 ml que l'on bouche.

   On  congèle ensuite rapidement la quantité     prédéterminée     emballée de préparation d'érythrocytes traités aux  aldéhydes stabilisés enduits, dans un réfrigérateur à  azote     liquide    et on conserve à 20  C.    <I>Exemple 3</I>       Activation    d'une préparation stable  d'érythrocytes enduits  On dégèle à une température ambiante de 24  C  sans     agitation    des érythrocytes traités aux aldéhydes et  enduits comme     dans    l'exemple 2, mais à un pH de 3,6,  qui ont     éé    congelés à -196  C et conservés à 20  C  pendant 6 jours, on les maintient à 24  C pendant 2  heures et après les avoir à nouveau congelés à  -196  C,

   on les     porte    à -20  C. On répète ce procédé  une fois par semaine pendant 6 semaines.  



  On .congèle ensuite les     érythrocytes    enduits activés  à -196  C et on les     conserve    à cette température jus  qu'à ce qu'on en ait besoin pour l'essai     d'hémaggluti-          nation.    On peut aussi lyophiliser la suspension de cel  lules     enduites    activée et la reconstituer par addition  d'eau avant     l'utilisation.     



  Ce procédé augmente 30 fois le titre     tandis    qu'il ne  fait que doubler le titre     d'hémagglutination    non spéci  fique, augmentation qui est pratiquement insignifiante  Si l'on répète à nouveau les cycles de congélation et  dégel, on aboutit à une nouvelle augmentation du titre       d'hémagglutination    mais également une augmentation  concurrente notable du     titre        d'hémagglutination    non  spécifique, de     sorte        qu'.l    n'y a que peu d'avantage à  prolonger ce traitement.  



  Le nombre optimum de cycles de congélation et  dégel est lié à une préparation de cellules enduites par  ticulière mais     l'homme    de     l'art    notera facilement que       l'optimum    est obtenu avec le cycle au-delà duquel  l'augmentation du titre     d'hémagglutination    est accom-         pagné    par une augmentation notable du titre     d'hémag-          glutination    non     spécifique.    Une préparation de cellules  enduites optimale pour le sérum standard se révèle aussi  optimale pour d'autres     antisérums.    Ainsi,

   on peut éta  lonner des sérums standards successifs par rapport à       l'antisérum    initial choisi.  



  <I>Exemple 4</I>  Sensibilité de la préparation d'érythrocytes  enduits par     l'albumine    de     sérum    de boeuf  En     suivant    les procédés des exemples 1 et 2, on  obtient une préparation     d'érythrocytes    dans laquelle  des érythrocytes de lapin sont enduits d'albumine de  sérum de boeuf     (BSA).    On suit un     procéé    semblable  pour enduire une autre préparation d'érythrocytes par  du     BSA,    mais les érythrocytes de cet échantillon sont  stabilisés seulement par l'aldéhyde pyruvique et sans la  séquence de traitement aux aldéhydes.

   Les titres       d'hémagglutination    des deux préparations sont com  parés dans le tableau 1     ci    après pour illustrer la sensi  bilité plus grande de la préparation d'érythrocytes  enduits de     BSA    qui ont été stabilisés par le double  traitement aux aldéhydes. Ce tableau illustre aussi les  résultats de l'étape d'activation.  



  <I>Exemple 5</I>  Préparation d'érythrocytes stabilisés  activés enduits  On     traite    comme décrit sous c), par le     periodate    de  sodium 0,00035 M pendant 15 minutes à 24  C, une  préparation d'érythrocytes stabilisée enduits d'antigène  obtenue par le procédé de l'exemple 2. On lave les  érythrocytes     stabilisés    activés avec une solution tam  ponnée de phosphate pH 7,2 et on trouve qu'ils ont un  titre     d'hémagglutination    de 1:2 400 000.

    
EMI0004.0063     
  
    <I>Tableau <SEP> 1</I>
<tb>  <I>Comparaison <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction <SEP> d'hémagglutination <SEP> de</I>
<tb>  <I>préparations <SEP> d'érythrocytes</I>
<tb>  Cellules <SEP> enduites <SEP> pH <SEP> à <SEP> Durée <SEP> Titre <SEP> d'hémag  l'enduc- <SEP> (heures) <SEP> glutination
<tb>  tion
<tb>  érythrocytes <SEP> traités*
<tb>  à <SEP> l'aldéhyde <SEP> pyruvique <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/2.0'48
<tb>  enduits <SEP> de <SEP> BSA
<tb>  érythrocytes <SEP> stabilisés
<tb>  traités <SEP> à <SEP> l'aldéhyde
<tb>  pyruvique <SEP> et <SEP> au <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/40.000
<tb>  formaldhyde, <SEP> enduits
<tb>  de <SEP> BSA
<tb>  érythrocytes <SEP> traités <SEP> à
<tb>  l'aldéhyde <SEP> pyruvique <SEP> et
<tb>  au <SEP> formaldéhyde,
<tb>  enduits <SEP> de <SEP> BSA, <SEP> 3,

  6 <SEP> 1 <SEP> 1/1.280.000
<tb>  activés <SEP> par <SEP> 6 <SEP> cycles
<tb>  d'activation <SEP> par <SEP> con  gélation-dégel <SEP> (Ex. <SEP> 3)
<tb>  érythrocytes <SEP> stabilisés
<tb>  enduits <SEP> de <SEP> BSA <SEP> activés <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/2.400.000
<tb>  par <SEP> oxydation
<tb>  (exemple <SEP> 5)       
EMI0005.0001     
  
    <I>Tableau <SEP> 1 <SEP> (suite)</I>
<tb>  Cellules <SEP> enduites <SEP> pH <SEP> à <SEP> Durée <SEP> Titre <SEP> d7hémag  l'enduc- <SEP> (heures) <SEP> glutination
<tb>  tion
<tb>  érythrocytes <SEP> stabilisés
<tb>  activés <SEP> par <SEP> le <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/2.400.000
<tb>  fibrinogène <SEP> de <SEP> BS<B>A</B>
<tb>  (exemple <SEP> 1)

  
<tb>  comparatif       <I>Exemple 6</I>       Variations        représentatives    des     conditions        d'enducation     de     préparations        -d'érythrocytes        traitées    aux     aldéhydes     par divers     antigènes          On        choisit    un     certain    nombre d'antigènes pour en  duire une     préparation        d'érythrocytes        préparée        comme          décrit   

   sous a). On     suit    d'une     manière    générale le procédé  d'enduction de l'exemple 2.  



  Le tableau     II    ci-après     illustre    les     observations        en-          registrées    que l'homme de l'art peut     facilement    déter  miner en notant     l'agglutination    positive par des     dilutions          en    série de     sérum    de lapin     comme        décrit        précédemment.     
EMI0005.0034     
  
    <I>Tableau <SEP> II</I>
<tb>  Antigènes <SEP> Quantité <SEP> pH <SEP> Durée,
<tb>  (mg/10 <SEP> ml) <SEP> heures
<tb>  (à <SEP> 240 <SEP> C)

  
<tb>  Albumine <SEP> de <SEP> sérum
<tb>  de <SEP> boeuf <SEP> (BSA) <SEP> 1,0 <SEP> 4 <SEP> 2
<tb>  BSA <SEP> insolubilisé <SEP> 0,1 <SEP> 4 <SEP> 2
<tb>  Globuline <SEP> de <SEP> lapin <SEP> 0,01 <SEP> 5 <SEP> 1/6
<tb>  Endotoxine <SEP> et <SEP> dérivés <SEP> 0,01 <SEP> 7 <SEP> 1/2
<tb>  Polyglucose <SEP> 1,0 <SEP> 4 <SEP> 1/2
<tb>  Bactériophage, <SEP> Q/3 <SEP> 0,3 <SEP> 5 <SEP> 4
<tb>  Hormone <SEP> de <SEP> lutéine
<tb>  <B>d</B>e <SEP> brebis <SEP> 0,004 <SEP> 4
<tb>  Albumine <SEP> de <SEP> sérum
<tb>  de <SEP> boeuf <SEP> (BSA) <SEP> 1,0 <SEP> 4 <SEP> 1
<tb>  Albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> 1,0 <SEP> 3,6 <SEP> 1 <SEP> **
<tb>  de <SEP> boeuf <SEP> (BSA)

  
<tb>  * <SEP> -f- <SEP> 1 <SEP> heure <SEP> d'agitation <SEP> à <SEP> pH <SEP> 4 <SEP> avant <SEP> l'addition <SEP> d'antigène.
<tb>  ** <SEP> -f- <SEP> 1 <SEP> heure <SEP> d'agitation <SEP> à <SEP> pH <SEP> 3,6 <SEP> avant <SEP> l'addition <SEP> d'antigène.

Claims (1)

1. REVENDICATION I Procédé d'obtention d'une préparation stable, sen sibilisée, d'érythrocytes, caractérisé en ce que l'on adsorbe sur lesdits érythrocytes, mis en jeu sous forme d'une préparation stabilisée, un ou plusieurs antigènes et/ou anticorps. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on suspend la préparation stable d'érythrocytes dans une solution tamponnée, on met en contact ladite suspension d'érythrocytes avec un mélange d'antigènes, ledit mélange comprenant un antigène dans une solu tion tamponnée compatible avec les érythrocytes, et on maintient le contact pendant un temps suffisant pour adsorber efficacement l'antigène sur les érythrocytes. 2.

   Procédé selon la sous-revendication 1, caracté risé en ce que les érythrocytes sont mis en suspension dans une solution tamponnée à un pH d'environ 3,6 à environ 6. 3. Procédé selon la sous-revendication 2, caracté risé en ce que le pH de la solution tamponnée est d'en viron 3,6 à environ 4,0. 4. Procédé selon la sous-revendication 1, caracté risé en ce qu'on agite les érythrocytes en suspension dans la solution tamponnée avant la mise en contact avec l'antigène. 5.

   Procédé selon la sous-revendication 1, caracté risé en ce que, en outre, on élimine l'excès d'antigène par lavage des érythrocytes avec une solution tam ponnée et ensuite on remet en suspension les érythro cytes enduits d'antigène dans une solution tamponnée. 6. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on combine un antigène avec les érythrocytes dans des conditions de concentration d'antigène, temps de contact et pH choisies pour enduire efficacement lesdits érythrocytes pour l'essai d'agglutination par l'antisérum standard. 7.

   Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on active la préparation d'érythrocytes sensibi lisée obtenue, en la mettant en contact avec un agent oxydant. 8. Procédé selon la sous-revendication 7, caracté risé en ce que l'agent oxydant utilisé est le periodate de sodium. 9. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on active la préparation d'érythrocytes sensibi lisée obtenue, en la congelant à environ -190 C et en soumettant les érythrocytes congelés à une température d'environ -20 C pendant une période de temps suffi sante pour augmenter le titre d'hémagglutination sans augmentation notable du titre d'hémagglutination non spécifique. 10.

   Procédé selon la sous-revendication 9, caracté risé en ce qu'on soumet les érythrocytes congelés à des températures que l'on maintient de manière sensible ment uniforme à -20 C. 11. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on active la préparation d'érythrocytes sensibi lisée obtenue, en la maintenant à environ -20 C pen dant environ 6 jours, ensuite on élève la température à environ 24 C sans agitation, on maintient la tempéra ture à 24 C pendant 2 heures, on congèle à nouveau à environ -190 C et on ramène à environ -20 C. 12. Procédé selon la sous-revendication 11, carac térisé en ce qu'on répète ce cycle 6-9 fois.

   REVENDICATION:11 Préparation stable, sensibilisée, d'érythrocytes, cïb= tenue par le procédé suivant la revendication I. SOUS-REVENDICATIONS 13. Préparation selon la revendication II, obtenue par le procédé suivant la sous=revendication 7. 14. Préparation selon la revendication II, obtenue par le procédé suivant la sous-revendication 9. 15. Préparation selon la revendication II, obtenue par le procédé suivant la sous-revendication 11.