CH500999A - Verfahren zur Herstellung von Pterinderivaten - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur Herstellung von Pterinderivaten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 6-(Polyhydroxyalkyl)-pterinen (6-Poly   hydroxyallcyl-2-amino-4-pteridinole    bzw.



     -4(3H)-pteridinone,    Bezifferung stets nach Ring-Index). Solche Verbindungen und ihre hydrierten Derivate sind als in der Natur vorkommende Stoffe von hoher biologischer Aktivität bekannt geworden; beispielsweise wurde von   5. auf    man, Proc. nat. Acad. Sci. USA 50, 1085 (1963) als   Cd enzym    der Phenylalanin-hydroxylase ein hydriertes Biopterin aus Rattenlebern isoliert.



   Durch P. Karrer et al., Helv. Chim. Acta 30,   1031-1036    (1947) und 31, 782-783 (1948), wurde bekannt, dass sich   2,5,6-Triamino-4-pyrimidinol    mit Monosaccariden zu Polyhydroxyalkyl-pterinen kondensieren lässt. Als Hauptprodukte wurden bei der Kondensation mit Aldosen 7-(Polyhydroxyalkyl)-pterine und mit Ketosen , wie z. B. Fructose, 6-(Polyhydroxyal   kyl)-pberine    angenommen. H. S. Forrest und J. Walker, J. Chem. Soc. 1949, 79-85 [vgl. Nature 161, 308-309 (1948)], kondensierten   2,5,6-Triamino-4-pyrimidinol    mit D-Clucose und D-Fructose in Gegenwart von Hydrazin und erhielten in beiden Fällen 6-(D-arabo Tetrahydroxybutyl)-pterin als Hauptprodukt. Die gleiche Verbindung erhielten F. Weygand et al. [Chem.



  Ber. 82, 25-31 (1949), vgl. auch die Zusammenfassung dieser und weiterer Publikationen durch F. Weygand et al., Chem. Ber. 97, 1002-1023 (1964)] durch Kondensation der   Natriumhydrogensulfib-verbindung    von 2,5,6-Triamino-4-pyrimidinol mit dem aus   l-(p-Toluidino)-l -desoxy-D¯fructose    (p-Tolyl-D-isoglucosamin) und Hydrazin in situ gebildeten Osazon sowie durch Kondensation von   2,5, 6-Triamino-4-pyrimidinol-sulfat    mit 1 (p-Toluidino)-1 -desoxy-D-fructose in Gegenwart von Hydrazin. In Abwesenheit von Hydrazin entstand dagegen aus den zuletzt genannten Reaktionskomponenten als Hauptprodukt   7-(D-erythro-2,3 ,4-Trihydroxybutyl)-pterin.   



  Als Reaktionsmedium benützten F. Weygand et al. bei allen drei Kondensationen verdünnte, wässrige Essigsäure. Die Entstehung des 7-(2,3,4-Trihydroxybutyl)-pterins konnte durch die primäre Bildung des 7-(D-arabo Tetrahydroxybutyl)-7,8-dihydro-pterins, gefolgt von Wasserabspaltung unter Auftreten einer exocyclischen Doppelbindung und Verlagerung derselben in den Ring, erklärt werden.



   Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man 6-(Polyhydroxyalkyl)-pterine der Formel I,
EMI1.1     
 in welcher X Wasserstoff oder die Hydroxylgruppe und n eine ganze Zahl von 1-3 bedeutet, in höherer Ausbeute und/oder in grösserer Reinheit als nach bekannten Verfahren herstellen kann, indem man   2,5,6-Triamino-4-pyrimidinol    der tautomeren Formeln IIa und   lib,   
EMI1.2     
  mit einem Aldose-arylhydrazon oder einer Arylhydrazinoketose entsprechend den Formeln III und IV,
EMI2.1     
 bzw.
EMI2.2     




  in welchen Formeln Ar einen gegebenenfalls inerte Substituenten enthaltenden Arylrest, und R Wasserstoff oder eine nichtaromatisch gebundenen, gegebenenfalls inerte Substituenten enthaltenden Kohlenwasserstoffrest bedeutet und X und n die unter Formel I angegebene Bedeutung haben, in saurem Medium umsetzt, das erhaltene Reaktionsgemisch, das ein Tetrahydropterinderivat der Formel V enthält,
EMI2.3     
 in welcher X, n, Ar und R die unter Formel I bzw. Formeln III und IV angegebene Bedeutung haben, direkt oder nach Abtrennung eines oder mehrerer   Neberpro    dukte einer Oxydation unterwirft und die entstandene Verbindung der Formel I abtrennt.



   Die Kondensation wird vorzugsweise in Gegenwart einer organischen Säure, wie z.B. Oxalsäure oder Essigsäure, einer Mineralsäure, z. B. Salzsäure, Schwefelsäure oder Borsäure, oder einer Lewis-Säure vorgenommen, wobei die verwendete Säure gegebenenfalls in Form eines entsprechenden Additionssalzes mit dem 2,5,6-Triamino-4-pyrimidinol, z. B. des Dihydrochlorides oder Sulfates, eingesetzt wird. Als Reaktionsmedium wählt man vorzugsweise ein wässrig-organisches oder organisches Medium, z. B. Gemische von Wasser mit Methanol, Äthanol oder Essigsäure, ferner abs.



  Methanol, abs. Äthanol, Eisessig, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid. Als Reaktionstemperaturen werden vorzugsweise solche zwischen   0     und   100C    bzw.



  Siedetemperatur des verwendeten Lösungsmittels gewählt, in Dimethylsulfoxid wird die Kondensation z. B.



  bei Raumtemperatur, in Dimethylformamid bei Raumtemperatur bis ca.   50"    und in niederen abs. Alkanolen bei deren Siedetemperatur durchgeführt. Kondensation, Oxydation und alle Reinigungsoperationen werden vorzugsweise unter Ausschluss des kurzwelligen Anteils des Tageslichtes durchgeführt. Der Ausschluss von Sauerstoff sowie die Zugabe eines Antioxydans, z. B. Mercaptoverbindungen wie   2-Mercapto äthanol    oder Cystein, sind bei der Kondensation besonders wichtig, wenn anschliessend an diese eine Abtrennung der Verunreinigungen auf Grund ihrer optischen Eigenschaften, d. h. der verschiedenen   Fluereszenzen      (R    = 300-370   m,u)    durchgeführt wird.



   Die genannte Reinigung kann z. B. durch Chromatographie an einer mit einem basischen Ionenausbauscher in Salzform, insbesondere als Formiat, wie z. B.



     Dowex(µ'    1X4-formiat, beschickten Säule erfolgen, wobei z. B. mit einer neutralen, stark verdünnten Ammoniumformiatlösung fraktioniert eluiert wird. Die zuerst erhaltenen, gefärbten und fluoreszierenden Fraktionen enthalten Nebenprodukte, in einem Teil der folgenden, farblosen und praktisch nicht fluoreszierenden Fraktionen befindet sich das als Zwischenprodukt gewünschte 6-(Polyhydroxyalkyl)-7-(subst. amino)5,6,7,8-tetrahydro-pterin der Formel IV. Die anschliessende Oxydation dieser Fraktionen erfolgt vorzugsweise durch molekularen Sauerstoff, z. B. Luftsauerstoff, aber auch mit Wasserstoffperoxid, Mangandioxid und dergleichen, in schwach saurem bis neutralem, wässrigem Medium.

  Es ist von Vorteil, die verschiedenen Fraktionen getrennt partiell zu oxydieren, dann dünnschicht-chromatographisch auf die Anwesenheit von 1'-Desoxyverbindung zu prüfen und nur die von diesem Nebenprodukt freien Fraktionen zu vereinigen und weiter zu oxydieren. Das rohe Oxydationsprodukt wird vorzugsweise nochmals an einer mit einem basischen Ionenaustauscher in Salzform, wie z. B.   Dowex2'      lX4-formiat,    beschickten Säule chromatographiert. Beim Eluieren mit verdünnter, wässriger Ammoniumformiatlösung von zuerst schwach basischer (pH um 8,5), dann neutraler Reaktion (pH 7,0-7,3) werden zunächst Nebenprodukte und dann das gewünschte 6-(Polyhydroxyalkyl)-pterin erhalten. Es ist frei von dem isomeren 7-(Polyhydroxyalkyl)-pterin wie auch von 1'-Desoxy-analogen.

  Man kann aber ebensogut direkt das Rohprodukt oxydieren und anschliessend das rohe Oxydationsprodukt chromatographieren.



   Von den als Ausgangsstoffen benötigten Arylhydrazonen der Formel III sind einige Vertreter bekannt und weitere analog den bekannten durch Umsetzung von Aldosen, Pentosen, Hexosen, Heptosen, 5-Desoxy-pentosen, 6-Desoxy-hexosen und 7-Desoxyhheptosen - die von C3 aufwärts der im 6-ständigen Polyhydroxyalkylrest des Endstoffes gewünschten Konstitution und Konfiguration entsprechen, mit Arylhydrazinen der Formel VI,
EMI2.4     
 in welcher Ar und R die unter Formel III angegebene Bedeutung haben, herstellbar. Die Arylhydrazinoketosen der Formel IV bzw. deren Salze entstehen aus den Arylhydrazonen der Formel III durch eine Amadori Umlagerung, z. B. Behandlung mit Oxalsäure, Salzsäure oder andern Säuren in wasserhaltigen oder wasserfreien organischen Lösungsmitteln wie z. B. den für die Hauptreaktion genannten. 

  Weil die für die Amadori Umlagerung verwendeten Reagenzien, Reaktionsmedien und -bedingungen mit jenen der Hauptreaktion weitgehend übereinstimmen, können anstelle der stets als unmittelbare Ausgangsstoffe der Hauptreaktion an  zunehmenden Umlagerungsprodukte der Formel IV meist ebensogut die entsprechenden Arylhydrazone der Formel III eingesetzt werden. Als Beispiele von Aldosen, die mit Arylhydrazinen der Formel IV zu Arylhydrazonen der Formel III umgesetzt werden können, seien die folgenden genannt:
D-Arabinose, L-Xylose, 5-Desoxy-L-arabinose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Galaktose, L-Rhamnose, L-Fucose, D-a-Glucoheptose.



  Ausgehend von den drei erstgenannten Aldosen erhält man die bekannten, aus Lebewesen isolierten und eingehend untersuchten Pterine D-Neopterin, L-Monapterin bzw.   L-Biopterin.    Die obengenannten und weitere   Aldo    sen können z.B. mit Phenyl-hydrazin, N-Methyl-,   N-Äthyl-    oder N-Benzyl-phenyl-hydrazin umgesetzt werden.



   In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.



   Beispiel 1
214 mg (1 mMol)   2,5, 6-Triamino-4-pyrimidinol-    dihydrochlorid und 264 mg (1,1 mMol)   D(+)-Arabinose-phenylhydra-    zon werden in 50 ml mit Stickstoff gesättigtem, wässrig   gem Methanol      (Methanol:Wasser=1:1)    unter Rückfluss und Durchleiten von sauerstoffreiem Stickstoff gekocht.



  Nach etwa 30 Minuten liegt eine klare, rotbraune Lösung vor. Hierauf verfolgt man den Reaktionsverlauf dünnschichtchromatographisch (Cellulose;   Bubanol:Ei-      sessig:Wasser    20:3:7). Wenn kein 2,5,6-Triamino-4pyrimidinol mehr festzustellen ist (nach ca. 2 Stunden), kocht man das Reaktionsgemisch noch ca. eine Stunde weiter und dampft es dann am Rotationsverdampfer unter ca. 12 Torr zur Trockene ein. Der Rückstand wird mit 50 ml Wasser versetzt und mit 50/oiger Natriumbicarbonatlösung auf pH 7 gebracht. Durch die neutrale Lösung, welche das 6-(D-erythro-1,2,3-Trihydroxypropyl)-7   (N'-phenylhydrazino)-5,6,7,8-tetrahydropterin    enthält, leitet man während 12 Stunden Sauerstoff, wobei der Grossteil des entstandenen D-Neopterins ausfällt.

  Hierauf wird das Reaktionsgemisch mit 50/oiger Essigsäure auf pH 4-5 gebracht und das Reaktionsgemisch auf 5 ml eingeengt und mit Aceton versetzt. Das ausgefallene, rohe D-Neopterin wird abzentrifugiert und je dreimal mit 2 ml Wasser, 2 ml   Methanol,    5 ml Aceton und 5 ml Äther gewaschen und dann getrocknet. Man erhält in einer Rohausbeute von 218,5 mg = 86,3   O/o    ein salzfreies, hellgelbes Rohprodukt, das dünnschichtchromatographisch mehrere Flecken zeigt, jedoch mit Kaliumpermanganat als einziges Oxydationsprodukt 6-Pterincarbonsäure liefert.

  Zur Abtrennung der Nebenprodukte 6-(2,3-Dihydroxypropyl)-pterin und Pterin wird das obige Rohprodukt über eine mit   Dowex2 >     1X4 (HCOO-) (200/400 mesh) beschickte Ionenaustauschersäule der Dimension   4 X 10    cm chromatographiert, wobei man mit 0,03-molarem   Ammoniumformiatpuffer    vom pH 8, dann pH 7,2 eluiert. Insgesamt werden auf der Säule 3 fluoreszierende Banden bemerkt. Die zweite derselben entspricht D-Neopterin. Nach Filtrieren des Eluates, Eindampfen und Umkristallisieren aus Wasser werden 193,7 mg D-Neopterin (6-(D-erythro-1,2,3 Trihydroxypropyl)-pterin bzw.



     2-Amino-6-(D-erythro-1,2,3- trihydroxypropyl)-pterin-4(3H)-on)    entsprechend 76,5   O/o    der Theorie erhalten.



      Drehung: [oC]D2SO = +510 + 30     (c = 0,168 in 0,1-n. Salzsäure).



   Das in Kaliumbromid aufgenommene IR-Spektrum stimmt mit demjenigen des natürlichen Bufochrom (Antipod des D-Neopterins) [T.Goto, Jap. J. Zoolog. 14, 83, 91 (1963)] überein.



   Beispiel 2
214 mg (1 mMol) 2,5,6-Triamino-4-pyrimidinoldihydrochlorid werden mit 264 mg (1,1 mMol) L(+)-Xylose-phenylhydrazon unter den im Beispiel 1 angegebenen Bedingungen kondensiert, oxydiert und aufgearbeitet. Die Ausbeute an Rohprodukt beträgt 198 mg = 78,4   O/o,    die Ausbeute an reinem L-Monapterin (6-D-threo-1,2-3 Trihydroxypropyl)-pterin bzw.



     2-Amino-6-(D-threo-1,2,3-    trihydroxypropyl)-pteridin-4(3H)-on) 169,8 mg = 67   0/0.   



   Drehung:   [a]D230=    +1110 + 30  (c = 0,147 in 0,1-n. Salzsäure).



   Das IR-Spektrum der erhaltenen Substanz stimmt mit demjenigen des natürlichen L-Monapterins überein.



   Beispiel 3
Eine sauerstoffreie Lösung von 214 mg (1 mMol)   2,5,6-Triamino-4-pyrimidinol-    dihydrochlorid und 381,5 mg (1 mMol) Natriumborat   (Na3B4O7)    in 15 ml Wasser und 5 ml Methanol wird mit einer sauerstoffreien Lösung von 314 mg (1 mMol) N-Benzylphenylhydrazon der L-5-Desoxyarabinose (nach H. Zinner, K. Wessely und H. Kirsten, Ber. 92, 1618 (1959), hergestellt) und   90mg    (1 mMol) Oxalsäure in 5 ml Methanol versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden unter Rückfluss und Durchleiten von sauerstofffreiem Stickstoff gekocht. Nach dem Erkalten wird die Lösung zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 5 ml 5   0/obiger    Essigsäure gelöst.

  Durch die erhaltene Lösung, welche   6-(L-erythro-1 ,2-Dihydroxypropyl)-7- (N'-benzyl-N'-phenylhydrazino)-5,6,7,8-    tetrahydro-pterin enthält, wird bei Raumtemperatur während 15 Stunden ein Sauerstoffstrom geleitet. Das Reaktionsgemisch wird danach 48 Stunden stehengelassen. Nach Zugabe von 10 ml Aceton werden die ausgefallenen Pterine abzentrifugiert, in einer   10/oigen    Ammoniaklösung gelöst und vom Ungelösten abfiltriert. Das Filtrat wird  auf eine mit   Dowex < 3    1 X8 beschickte Säule (Dimension   1x7    cm) gebracht und hierauf werden die adsorbierten Pterine mit 0,03-m.   AmlrLoniumssormiatpuffer    vom pH 7,2 eluiert. Die blau fluoreszierenden Fraktionen werden chromatographisch geprüft und die Elution unterbrochen, sobald die Biopterin im Eluat nicht mehr erscheint.



   Die das Biopterin enthaltenden Fraktionen werden zur Trockene eingedampft; der Rückstand wird in 1    /Oiger    wässriger Ammoniaklösung gelöst und an einer mit   Dowex(µ'    1 X8 beschickten Säule der Dimension 3   X25    cm chromatographiert. Zur Elution wird 0,03-m.



  Ammoniumformiatlösung vom pH 8 verwendet. Nach einiger Zeit beobachtet man die Trennung der zum gewünschten Biopterin isomeren 7-Dihydroxypropyl-verbindung (erste laufende, blau fluoreszierende Bande, sehr wenig) vom Biopterin selbst (zweite blau fluoreszierende Bande) und Pterin (dritte blau fluoreszierende Bande, sehr viel, d. h. ca. 50-60   O/o).    Hierauf wird der pH der Ammoniumformiatlösung auf 7,5 gebracht, um die Elution zu beschleunigen.

  Fraktionen von 200 ml werden aufgefangen und durch Oxydation einer Probe mittels Kaliumpermanganat (Bestimmung des Gehaltes an Pterin-6-carbonsäure und Pterin-7-carbonsäure, die aus den entsprechenden Dihydroxypropylverbindungen entstanden sind) sowie Dünnschichtchromatographie (Whatman-Papier, 3   0/obige      Ammoniumchlorid-Lösung,    Bestimmung des Gehaltes an Pterin) auf ihren Inhalt geprüft. Die von Pterin und 7-Dihydroxypropyl-verbindung freien Fraktionen 6-12 werden vereinigt, auf 2 ml eingeengt und mit 10-15 ml abs. Äthanol versetzt. Das Biopterin fällt aus und wird zentrifugiert, mit Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet. 

  Zur Reinigung wird es aus Wasser umkristallisiert, wobei man 24 mg (10   0/0    der Theorie) Reinsubstanz erhält, deren IR Spektrum mit demjenigen des aus Drosophila melanogaster isolierten Biopterins (m. Viscontini, E. Loeser, P. Karrer, Helv. Chim. Acta 41, 440 (1958)) identisch ist.



      Drehung: [a]320 = 600 + 4      (c = 0,124 in   O,1-n.    Salzsäure).



   IR-Spektrum in Kaliumbromid:
Siehe Fig. 1. 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Herstellung von Pterinderivaten der Formel 1, EMI4.1 in welcher X Wasserstoff oder die Hydroxylgruppe und n eine ganze Zahl von 1-3 bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man 2,5,6-Triamino4-pyrimidinol der tautomeren Formeln IIa bzw. IIb, EMI4.2 mit einem Aldose-arylhydrazon bzw. einer Arylhydrazinoketose entsprechend den Formeln III und IV, EMI4.3 bzw. EMI4.4

   in welchen Formeln Ar einen gegebenenfalls inerte Substituenten enthaltenden Arylrest, und R Wasserstoff oder einen nichtaromatisch gebundenen gegebenenfalls inerte Substituenten enthaltenden Kohlenwasserstoffrest bedeutet, und X und n die unter Formel I angegebene Bedeutung haben, in saurem Medium umsetzt, das erhaltene Reaktionsgemisch, das ein Tetrahydropterinderivat der Formel V enthält, EMI4.5 in welcher X, n, Ar und R die unter Formel I bzw.

   Formeln III und IV angegebene Bedeutung haben, anschliessend einer Oxydation unterwirft und die entstandene Verbindung der allgemeinen Formel I abtrennt.

   UNTERANSPRUCH Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oxydation mittels molekularem Sauerstoff durchführt.