CH504533A

CH504533A - Verfahren zur Erzeugung von physiologisch aktiven Plazentarsubstanzen

Info

Publication number: CH504533A
Application number: CH1840868A
Authority: CH
Inventors: R Sanders George
Original assignee: Sanfar Lab Inc
Priority date: 1962-05-08
Filing date: 1963-05-06
Publication date: 1971-03-15

Description

Verfahren zur Erzeugung von physiologisch aktiven Plazentarsubstanzen
Bei der Plazenta handelt es sich um das innere sekretorische Organ, das im normalen Verlauf der Schwangerschaft nach der Ablage eines befruchteten Eis zur Entwicklung gelangt. Es ist von der Zellenmasse im Morulastadium der Gestation im Laufe der Wanderung des Eis durch den Eileiter in den Uterus differenziert. Die Einbettung der sich schnell entwikkelnden Blastula erfolgt im oberen Teil des Uterus und ist als Implantation bekannt. Diese cytologische Differenzierung ist einzigartig und signifikant, weil sie neurologisch in keiner Weise beeinflusst wird und dadurch als allmächtig, d. h. ohne Differenzierung auf anatomische Spezialisierung jeder Funktion fähig bezeichnet wird.

Das Nervensystem entsteht aus dem äusseren Keimblatt des Embryo und beeinflusst und koordiniert sein Wachstum und seine Entwicklung, da es die erste entwickelte spezialisierte Struktur ist. Deshalb ist das Chorion eigentlich vom Embryo unabhängig. Histolo wisch kennzeichnet sich das Chorion durch zwei Tellschichten, nämlich dem Cytotrophoblast und dem Syncytialtrophoblast. Die Cytotrophoblastzellen (Langhanssehe Schicht) sind gross und vielkernig, und Cytoplasma und Zellmembran sind gut definiert. Der Syncytialtrophoblast ist ein vielkerniges Plasmodium ohne sichtbare Zellmembran.

Sobald die Implantation erfolgt ist, erodiert der Trophoblast die Decidua und dringt in verästelten Vorsprüngen in sie ein, die als Villi bezeichnet werden und grosse Kammern bilden, die mit Mutterblut gefüllt sind, und schliesslich dringt Mesoderm in die Villi ein, das die ±totalen Blutgefässe trägt.

Damit gelangen die Blutgefässe von Fötus und Mutter über durchlässige Membrane in unmittelbare Nachbarschaft, so dass der Fötus ernährt und die Stoffwechselprodukte abgeführt werden können.

Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass die Plazenta eine grosse Zahl von physiologischen Wirkstoffen, einschliesslich Hormonen wie Östrogen, Progesteron, adrenokortikotropes Hormon, Thyrotropin, Gonadotropin, Samatotropin und adrenoartige Hormone absondert. Es werden auch andere Stoffe erzeugt, wie Enzyme, wachstumsfördernde Faktoren, Stoffwechselzwischenprodukte und dergleichen, denen als Heilstoffe oder für die Forschung wesentlicher Wert zukommt, wenn sich für deren Erzeugung und Isolierung zuverlässige Methoden finden lassen. Aller Wahrscheinlichkeit nach erzeugt die Plazenta lebensspendende und -erhaltende Stoffe, die ebenfalls zugänglich würden. So ist kürzlich die Feststellung einer Plazentarsubstanz gemeldet worden, welche die Fähigkeit aufweist, Organismen im Jugendstadium zu halten, und deshalb zum Aufhalten einer Alterung oder anderer Zerfallprozesse dienen könnte.

Biologisch gesprochen, kann angenommen werden, dass das Plazentargewebe aus undifferen vierten Zellen besteht.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Erzeugung von physiologisch aktiven Plazentarsubstanzen ist dadurch gekennzeichnet, dass lebendes Plazentargewebe bei einer zur Erhaltung des Gewebes am Leben geeigneten Temperatur in einem Kulturmedium während einer Zeitdauer kultiviert wird, die zur Erzeugung von Plazentarsubstanzen im Kulturmedium genügt, dass das diese Substanzen enthaltende Kulturmedium vom lebenden Gewebe getrennt und auf etwa 50 C gekühlt und zwecks Ausfällung einer Gonadatropin enthaltenden Glykoproteinfraktion angesäuert wird, die Glykoproteinfraktion mit dem Gonadatropin aus der Lösung getrennt, das restliche Kulturmedium mit einem Lösungsmittel in Berührung gebracht wird, der eine Fettfraktion mit Steroidhormonen enthaltende Extrakt vom Kulturmedium getrennt wird und das restliche Kulturmedium dehydriert wird.

Anhand der beiliegenden Zeichnung werden Ausführungsformen des Verfahrens beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1 einen Vertikalquerschnitt durch eine erste Gewebekulturflasche,
Fig. 2 einen Vertikalquerschnitt durch eine andere Gewebekulturflasche und
Fig. 3 einen Vertikalquerschnitt durch eine dritte Gewebekulturflasche zur dialytischen Entfernung von Stoffwechselprodukten.

Das in der Gewebekultur erforderliche Plazentargewebe kann nach der Entbindung vom Fötus durch den anwesenden Arzt gesammelt werden, was vorteilhaft in Fällen von Schwangerschaften und Geburten ohne Komplikationen geschieht, die Anomalitäten verursachen oder auf andere Weise die Sicherung gesunden, lebensfähigen Gewebes in Frage stellen könnten.

Der Arzt sollte nur geringen Zug auf die Nabelschnur ausüben, um den Austritt zu unterstützen, und die dafür erforderliche Hauptleistung der normalen Uteruskontraktur überlassen. Auf diese Weise wird verursacht, dass sich die Plazenta unter geringster Gewalteinwirkung, welche die Plazentallappen und andere Zellen schädigen oder sonstige unerwünschte Wirkungen verursachen könnte, von der Uterusschleimhaut löst. Die ausgetretene Plazenta ist sofort in ein geeignetes steriles Medium zu legen, damit das Gewebe während des Transportes in optimalem Zustand gehalten wird. Eine geeignete Menge, beispielsweise 1 Liter, isotonische Lösung, beispielsweise die Hanksche Lösung mit 2 g/l Glukose, 10 ml Natriumzitrat als Antikoagulans und einem Desinfektionsmittel, beispielsweise einem Antibiotikum mit breitem Wirkungsspektrum in geeigneter Menge, kann zu diesem Zweck verwendet werden.

Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin und dergleichen eignen sich zu diesem Zweck. Eine typische Mischung kann 0,5 mg Penicillin und 1,0 mg Streptomycin pro Liter enthalten. Die eingelegte Plazenta wird dann sobald als möglich transportiert und in einen Brutapparat mit einer Temperatur von 37,50 1 0,50 C gebracht.

Nach einem Kulturverfahren für das Gewebe wird das Trophoblastgewebe vorteilhaft innert weniger als 6 Stunden nach der Geburt unter streng aseptischen Bedingungen von der Grundmembran des Chorion in Immersion in einer abgeglichenen Salzlösung der erwähnten Art gelöst, um ein Verderben des Gewebes auf ein Mindestmass zu beschränken. Das gelöste Tro phoblastgewebe wird zum Einlegen in den Kulturapparat in Streifen von geeigneter Grösse, beispielsweise von 5 cm Breite und 15 cm Länge, geschnitten und während der Immersions- und Schneidedauer muss die Temperatur der Plazentarzellen auf etwa 37,50 C gehalten werden, um eine Schockwirkung auf das Gewebe zu vermeiden.

Ein Kulturflaschenapparat 10 für die Kultur dieser Streifen aus Trophoblastgewebe ist in Fig. 1 der Zeichnung ersichtlich, bei dem eine geschlossene Kammer 11 durch einen zylinderförmigen Flaschenkörper 12 gebildet ist. der beispielsweise aus Glas hergestellt ist. Geschlossen wird diese Kammer durch einen Dekkel 13 mit einem geschliffenen Flansch 14 oder einer entsprechenden Anordnung. Der Unterteil des Körpers 12 ist mit einem Auslass 16 versehen, in dem ein Ventil (nicht dargestellt) vorgesehen ist und durch den Flüssigkeit aus der Kammer 11 entnommen werden kann. Im Deckel 13 sind drei Öffnungen 17, 18 und 19 zu dem später zu erläuternden Zweck vorgesehen.

Zum Aufhängen von Gewebestreifen 22, die auf beschriebene Weise hergestellt werden, sind Mittel, beispielsweise ein Rahmen 21, angeordnet, an denen diese Streifen frei in der Kammer 11 hängen. Insbesondere kann der Rahmen 21 ein durch den Deckel 13 getragenes Querelement 23 umfassen, von dem Seitenteile 24 im Körper 12 abwärts verlaufen, während das untere Querstück 26 in der Nähe des Unterteils der Kammer 11 angeordnet ist. An beiden Enden der Streifen 22 befestigte Fäden 27 tragen letztere in paralleler Anordnung voneinander distanziert in der Längsrichtung der Kammer. Ein magnetischer Rührstab 28 ist am Boden 29 des Körpers 12 vorgesehen und bildet das Mittel der Umwälzung eines flüssigen Mediums in der Kammer 11. Der Stab wird durch einen konventionellen Magnetmotor (nicht dargestellt) betätigt, der ausserhalb des Bodens 29 angeordnet ist.

Ein Flascheninhalt von 1200 bis 1500 ml genügt für die Kultur des Gewebes einer Plazenta der normalen vollen Grösse; doch lassen sich, wenn erwünscht, in grösseren Flaschen weitere Gewebeteile mehrerer Plazenten oder unterteiltes Gewebe von wucherndem Material unterbringen. Selbstverständlich sind bei der Einbringung des Gewebes in die Flasche wie auch in allen anderen hier erläuterten Verfahrensschritten die üblichen aseptischen Verhältnisse einzuhalten.

Das Plazentargewebe lässt sich auch so präparieren, dass der Trophoblast intakt auf der Grundmembran des Chorion belassen wird, wobei alles überschüssige Amniongewebe entfernt wird. In die Nabelarterien werden Kanülen eingeführt, und der Trophoblast wird sorgfältig mit abgeglichener Salzlösung, d. h. Hankscher Lösung mit 10 gm/l Natriumzitrat, durchspült, um ein Gerinnen des Blutes zu verhindern. Bei der Durchspülung der Plazenta ist an der Spülspritze ein Manometer anzuordnen, so dass ein Druck von etwa 50 mm Hg nicht überschritten wird. Dadurch wird Einschnürung und späteres Reissen der kleinen Kapillargefässe verhindert. Diese Operation hat möglichst rasch nach der Geburt zu erfolgen, damit die Blutgerinnung verhindert und anderseits gewährleistet wird, dass dem Trophoblastgewebe möglichst viel Blut entnommen und die anatomische Geometrie möglichst wenig gestört wird.

Die Nabelschnur wird so abgeschnitten, dass ein Stück von 7,5-10 cm vorsteht.

Eine andere Art der Gewebekulturflasche 40 nach Fig. 2 der Zeichnung eignet sich für die Kultur einer derartig präparierten intakten Plazenta. Die Flasche 40 bildet eine geschlossene Kammer 41 mit einem relativ grossen Durchmesser im Verhältnis zu ihrer Höhe, welche die ausgebreitete Plazenta aufnimmt. Gebildet wird sie durch eine zylinderförmige Flasche 42, an der mittels eines geschliffenen Flansches 44 ein kuppelförmiger Deckel 43 befestigt ist. Eine ganze intakte Plazenta 46 wird horizontal auf eine Tragplatte aus Glas 47 in die Kammer 41 gelegt, wobei die Nabelschnur 48 durch eine in der Mitte dieser Platte vorgesehene Öffnung 49 nach unten geführt wird. Die Platte 47 ruht ihrerseits auf Füssen 50 oder ähnlichen Organen.

Die Teile 51, 52 und 53 sind im Deckel 43 zu einem im folgenden noch näher zu erläuternden Zweck angeordnet, und am Unterteil des Körpers 42 befindet sich eine Auslassöffnung 54 mit einem Ventil (nicht dargestellt). Ein Magnetrührstab 56 liegt auf dem Flaschen boden 57 und wird wie im vorstehenden Beispiel betätigt, um das flüssige Mittel in der Kammer und durch die Plazenta 46 zu treiben. Ein Flascheninhalt in der Grössenordnung von 1200 ml genügt für eine einzelne Plazenta; es lassen sich in einer höheren Flasche auch mehrere Trägerplatten übereinander anordnen, besonders wenn das Umwälzmittel für die Flüssigkeit in der Weise abgeändert wird, dass entsprechende Umwälzung der Flüssigkeit von oben nach unten in der Flasche und genügender Kontakt mit jeder ganzen Plazenta gewährleistet ist.

Bei der gezeigten Anordnung dringt das flüssige Medium in der Kammer durch die aufgelegten Plazenta und diffundiert langsam durch die Blutgefässe, so dass die Lelbensfähigkeit erhalten und die Stoffwechselprodukte einschliesslich der zu gewinnenden Stoffe abgeführt werden. Auf diese Weise wird die normale Blutzirkulation reproduziert.

Eine dritte Art der Kulturflasche 100 nach Fig. 3 eignet sich für die Kultur von Gewebestreifen der oben beschriebenen Art, könnte jedoch mit einem geeigneten Träger ausgerüstet und auf ähnliche Weise für eine intakte Plazenta benützt werden. Diese dritte Art kann auch als Apparat bezeichnet werden, der, ähnlich demjenigen nach Fig. 1, durch zusätzliche Anordnung eines Dialysemittels gekennzeichnet ist, wobei in Fig. 1 und 3 gleiche Bezugsziffern gleiche Bestandteile bezeichnen. Im zylinderförmigen Körper 12 der Flasche 10 vorgesehene geflanschte Öffnungen 101 dienen zum Anflanschen von Kugeln 102.

Die Kammern 103 in den genannten Kugeln sind von der Kammer 11 durch semipermeable Membrane getrennt, die über die Flanschöffnungen 105 gespannt sind und den Austausch von Stoffwechselprodukten und/oder Nährmitteln und/oder Stoffen zur Regulierung des pH-Wertes durch Dialyseprozesse an Lösungen oder deren Di alysemedien ermöglichen, die darin enthalten sind. Geeignete Membrane können aus einem Zelluloseprodukt wie Cellophan bestehen und können selektiv oder nichtselektiv arbeiten. Der Einlasshahn 104 bzw. der Auslasshahn 106 dient zur Zuleitung von für die besondere gewünschte Dialyseoperation geeigneten Lösungen.

Die Kammer 11 ist natürlich mit einem geeigneten Kulturmedium gefüllt, das später zu erläutern sein wird.

Das Plazentargewebe wird bei allen vorstehenden Operationen jederzeit in der genannten abgeglichenen Salzlösung gehalten. Doch wird das Gewebe sofort nach Einlegen der Gewebestreifen oder der intakten Plazenta in das gewählte Kulturmedium gelegt, das sich in den Kammern befindet und in allen Fällen zur Inkubation auf einer Temperatur von 37,5 1 0,50 C gehalten wird. Es wird eine zum Bedecken des Gewebes genügende Menge des Mediums, beispielsweise 1000 bis 1300 ml, verwendet, und die IRühreinrichtung oder ein anderes Bewegungsmittel für Flüssigkeiten wird zur Aufrechterhaltung einer konstanten Umwälzung betätigt.

Ein geeignetes Kulturmedium enthält die Eagelschen Medien mit 5 ml/l menschlichem Mlarkserum.

5 mi/l menschlichem Fruchtwassler, 5 % Plasma und 500 mg/l Vitamin E (alpha-Tocopherolazetat). Ein anderes geeignetes Kulturmedium ist das Eaglesche Medium mit Laktalbuminhydrolysat, Hefeextrakt und 6 % menschlichem Blutplasma. In geeigneten Mengen werden Antibiotika mit breitem Wirkungsspektrum der genannten Art zugesetzt, um Infektionen zu verhindern anderes geeignetes Kulturmedium ist das Eagelsche Me dium bezeichnet in der vorliegenden Beschreibung ein im Handel befindliches Gewebekulturmedium, das die Diffo Laboratories in Detroit, Michigan, herstellen, und enthält in der Regel die wesentlichen Aminosäuren, Vitamine, Stoffwechselzwischenprodukte und Mineralien für die Ernährung der Gewebekultur.

Bei allen drei vorstehenden Anordnungen wird infolge eines Präparationstraumas ein 3- bis 5-tägiger Stillstand in der Stoffwechseltätigkeit und Wucherung beobachtet.

Wenn die Zellen zu wachsen beginnen und der normale Stoffwechsel wieder in Funktion tritt, steigt die Erzeugung von Milchsäure mit entsprechender Senkung des pH-Wertes des Kulturmediums, was unerwünschte Wirkungen ausüben oder die Kultur sogar abtöten könnte, wenn sie ihren Gang unbeeinflusst nehmen könnte. Der pH-Wert des Mediums muss im Bereich von 7,2 und 7,8 gehalten werden. Zur leichteren Bestimmung des pH-Wertes des Mediums lassen sich geeignete pH-Messelektroden in eine der genannten Öffnungen im Deckel jeder Flasche einführen und im Verein damit aussen Anzeigegeräte verwenden. Die Einführung geeigneter Reagenzien erfolgt durch automati- sche Einrichtungen oder auch von Hand. Auf die genannte Weise lässt sich zur Regulierung des pH-Wertes im genannten Bereich eine Natriumbikarbonatlösung oder kristallines Natriumkarbonat zusetzen.

Auch kann zur Steuerung des pH-Wertes in vorbestimmten Abständen Glutamin zugesetzt werden. Ohne Nachteile lässt sich zu diesem Zweck auch ein Phosphatpuffer benützen. Ausserdem liesse sich zur Steuerung des pH Wertes und/oder Entfernung überschüssiger Milchsäure oder anderer Stoffwechselprodukte ein selektiver Eliminationsprozess, beispielsweise Dialyse oder Adsorption, anwenden. Die dritte Kulturflasche lässt sich zu diesem Zweck mit Vorteil derart einsetzen, dass beispielsweise eine isotonische Salzlösung oder das Eagelsche Medium einer oder beiden Kugeln zugesetzt wird, so dass die Säurekomponenten und andere giftige Stoffwechselprodukte mit niedrigem Molekulargewicht über die Membran gegen das Kulturmedium ausgetauscht werden können.

Die Zusammensetzung des Eagelschen Mediums ist folgende:
Tafel
Bestandteile des chemisch definierten Eagelschen
Gewebekulturmediums
Konzentration
Bestandteil mg/1 Millimol
L-Arginin 17,4 0,1 L-Zystin 6,0 0,05
L-Histidin 3,2 0,02
L-Isoleusin 26,2 0,2
L-Leusin 13,1 0,1
L-Lysin 18,2 0,1
L-Methionin 7,5 0,05
L-Phenylalanin 8,3 0,05
L-Threonin 111,9 0,1
L-Tryptophan 2,0 0,01 Tyrosin 18,0 0,1
L-Valin 11,7 0,1
L-Glutamin 146,0 1,0
Cholin 1,0
Nikotinsäure 1,0
Pantothensäure 1,0
Pryidoxol 1,0
Riboflavin 0,1
Thiamin 1,0
Zinositol 1,0
Biotin 1,0
Folsäure 1,0
Konzentration
Bestandteil mg/l Millimol
Glukose 2000
NaCl 8000 KG 400
CaCl2 140 MgS04 7HO 100 MgClr 6H20

100 Na2HP04.2H2O 60 KHPO4 60 NaHCO5 350 Phenolrot 20,0
Penicillin 0,50
Die vorstehend beschriebenen verschiedenen Apparatmodelle lassen sich kontinuierlich betreiben, sobald das gewünschte Produktniveau eine geeignete Grenze erreicht oder sich ein Wechsel des Mediums infolge eines anderen Umstandes durch Zusatz frischen Mediums aufdrängt, wobei das die gewünschten Stoffe enthaltende Kulturmedium abgezogen bzw. gewonnen wird. Doch wird der Apparat in der Regel halbkontinuierlich betrieben, indem das angereicherte Kulturmedium periodisch durch die Ablassöffnung abgezogen und durch eine der genannten Öffnungen durch neues Medium ersetzt wird.

So lässt sich Choriongonadatropin aus einem behandelten oder angereicherten Kulturmedium erzeugen, wenn der Pegel dieses Hormons auf eine genügende Höhe steigt, wie dies mittels einer geeigneten Probe, beispielsweise der normalen biologischen Messung unter Verwendung der Uterinstauung, bestimmt wird.

Einzelheiten dieser Probe gehen aus einem Artikel mit dem Titel The Rapid Rat Test for Pregnancy von Riley, Smith and Brown, Journal of Clinical Endocrinology, Vol. 8. S. 233, 1948 hervor. Der Einfachheit halber kann die Gewinnung in einem sterilen Operationsraum oder dergleichen erfolgen, der auf einer Temperatur von 370 C gehalten wird. Das Kulturmedium wird mittels eines sterilen Saugers sachte abgezogen, wobei eine unnötige Störung des Gewebes zu vermeiden ist, und sofort durch frisches Kulturmedium, das auf 370 C erwärmt worden ist, mit derselben Sorgfalt ersetzt. Zu diesem Zweck lässt sich das Medium durch ein Rohr einführen, das in der Nähe der Seite der Kulturflasche eingeführt wird. In den Flaschen wird sterile Luft zirkuliert, beispielsweise durch einen durch eine der genannten Öffnungen eingeführten Klemmschlauch.

Sind die genannten optimalen Bedingungen vorhanden, so wächst das Plazentargewebe mit logarithmischer Geschwindigkeit in dreidimensionaler Geometrie. Unter den ausgeschiedenen nützlichen Substanzen finden sich:
Choriongonadatropin, Geschlechtssteroide wie Estradiol, Estron, Estriol, Corticotropine, Corticosteroide, Wachstumshormone, Enzyme wie Phosphatase, Ribonuclease und Cholinesterase sowie andere bekannte bzw. unentdeckte Stoffwechselprodukte von physiologischer Bedeutung. Andere Komponenten dieser Art sind bisher nicht mit Sicherheit entdeckt oder definiert worden. Zu bemerken ist, dass es sich um ein empfindliches und labiles Glykoprotein handelt, das in gewissen Medien leicht hydrolysiert, so dass zur Vermeidung unnötiger Verluste infolge Denaturierung bei etwa 50 C gearbeitet werden muss.

Das ChoriongonadEatropin wird aus einzelnen oder zusammengenommenen Mengen des abgezogenen Kulturmediums isoliert und nach dem nachstehenden allgemeinen und spezifischen Beispiel gereinigt:
Das Verfahren erfolgt vorzugsweise unter Einhaltung einer Mediumtemperatur von etwa 50 C in einem Kühlkasten zur Vermeidung einer Schädigung des Glycoproteins (H. C. G.) bei der Behandlung.

1. (Eis-)Essigsäure oder gleichwertige Carboxylsäure wird dem gewonnenen Medium mit dem Zweck muge- setzt, die Azidität auf einem pH-Wert von etwa 3,5 zu bringen, und das Sangesäuerte Medium wird während einer angemessenen Zeitdauer, z. B. 48 Stunden, bei 5 C stehengelassen, damit das Glykoprotein (G. C. G.) daraus ausgefällt wird.

2. Das ausgefällte H. C. G. wird dann vom Medium unter Verwendung von aktivierter Tonerde und einem Filtriefmittel wie Diatomeenerde (Celit) abfiltriert. Für eine Flasche der genannten Grösse kann ein Büchnertrichter von 15 cm und eine 2-Liter-Filterflasche verwendet werden. Eine geeignete Filterschicht bereitet man mittels eines 1 1-cm-Glasfiltersiebes und Filterpapier, das schliessend mit Wasser sorgfältig angelegt wird. Dann wird eine Aufschlämmung des Filtriermittels, beispielsweise 125 ml Celit, gleichmässig über das mit 1 cm Wasser bedeckte Filterpapier gegossen und dann sorgfältig ein Vakuum angesetzt, damit auf dem Filterpapier eine gleichmässige Schicht entsteht.

Ein Stück Filterpapier kann dann auf die Mitte gelegt werden, damit beim Ubergiessen die Filterschicht nicht beschädigt wird. Alles zum Einschwemmen verwendete Wasser wird dann abgegossen und aus der Filterflasche ausgespült.

Zur Gewinnung der Gonadatropinfraktion aus dem gewonnenen Kulturmedium werden etwa 20 g/i aktivierte Tonerde zur Absorption dieser Fraktion eingerührt. Das aufgeschlämmte Gemisch wird dann unter Vakuum mit der genannten Anordnung mit etwa 1 1 Stundenliter filtriert und die eingeschlossene Flüssigkeit unter Verwendung von 500 ml destillierten Wassers gewaschen, das mit 1 ml/l Eisessigsäure angesäuert wird, und zwar beginnend mit der Filtrierung der letzten Teile des Mediums, damit die Berührung mit der Luft auf einem Minimum gehalten wird. Das abfliessende gemischte Kulturmedium und Waschwasser werden unter Spülen aus der Filterflasche entnommen und bilden eine Lösungsfraktion, aus der sich andere Produkte gewinnen lassen, während die abfiltrierte Gonadatropinfraktion auf dem Filter verbleibt.

Als sehr wichtiges Reinigungsverfahren wird das Waschen des Filterbettes mit etwa einem weiteren Liter angesäuertem Waschwasser fortgesetzt, und 50 mi der austretenden Flüssigkeit werden dann auf ihren Proteingehalt geprüft, indem ihnen 100 ml Azeton zugesetzt werden. Bildet sich eine Ausfällung, so wird der Waschvorgang fortgesetzt, bis das Prüfresultat negativ ist, was in der Regel etwa einen weiteren Liter Waschlösung erfordert.

Nach dieser Operation verbleibt auf der Filterschicht eine gereinigte Gonadatropinfraktion zurück.

3. Die Gewinnung des gereinigten Choriongonadatropins aus dem Filterkuchen erfolgt durch Auswaschen. Der Filterkuchen wird zusammen mit der Fil tersäure und dem Filterpapier aus dem Trichter entnommen und in eine Mischkammer gebracht. Nach Zusatz von 150 ml 2NNH4OH wird der Filterkuchen in dieser Kammer dispergiert oder homogenisiert, damit ein inniger Kontakt entsteht und das gewünschte Produkt vollständig ausgewaschen wird. Das Homogenat wird mittels einer Filterschicht der genannten Art mit mindestens einem zweiten Durchgang filtriert und die Mischkammer ausgespült. Die Restlösung lässt sich mittels destilliertem Wasser (100 ml) aus dem Filter ausspülen und dem Ammoniaklösungsfiltrat zusetzen.

4. Die Gonadatropinfraktion wird aus dem Ammoniakfiltrat durch Ansäuerung mittels (Eis-)Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,5 und unter Zusatz von 2 Volumen Azeton pro Volumen Filtrat zur Erzielung einer Ausfällung gewonnen. Die Lösung wird während 48 Stunden bei einer Temperatur von 50 C stehengelassen, damit die Ausfällung vollkommen wird, worauf das Gemisch zentrifugiert wird. Die obenaufschwimmende Flüssigkeit wird abgezogen und die Ausfällung mit einer minimalen Menge Wasser (15 bis 25 ml) aus der Zentrifugenflasche gewaschen.

5. Die Ausfällung wird wiederum unter Rühren und allmählichem Zusatz des Ammoniaks in 150 ml 2NNH40H gelöst, unter Zusatz vom Eisessigsäure und Azeton wiederum ausgefällt, erneut zentrifugiert und wie vorher aus dem Zentrifugenrohr ausgebracht.

6. Das Endprodukt fällt aus der Restaufschlämmung im Verfahrensschritt 4 oder 5 an, wobei sekundär die Reinigung unter Stanclardisierun,g und Endbereitung wie folgt vor sich geht.

Die Restsalze, z. B. Natrium, werden durch Dialyse entfernt, das Dialyseprodukt gerührt und ein Bruchteil (5 ml) mittels Lyophilisierung ausgezogen und getrocknet; dann wird der Rest zur Feststellung des Feststoffgehaltes pro ml gewogen. Die Feststoffe werden zur Bestimmung ihrer biologischen Wirksamkeit (Dosierung) pro Gewichtseinheit untersucht, worauf das ursprüngliche Dialysat mit Wasser verdünnt werden kann, um eine Normaldosis oder Einheit biologischer Wirksamkeit zu erzeugen. Es wird darauf Milchzucker auf 100 mg/5 ml verdünntes Dialysat zusammen mit 18 mg Na2HOP4 als Puffersubstanz zugesetzt. In den Handel gelangt das Produkt in Portionen von 5 ml in 10-ml-Gläschen, wobei die Feuchtigkeit durch Lyophilisierung entfernt und das Glas aseptisch verschlossen wird. Die Verabreichung erfolgt parenteral.

Die ausfliessende Filtratlösung aus der Abtrennung der Gonadatropinfraktion wird im Hinblick auf die Gewinnung der Steroidhormone entsprechend dem nachstehenden allgemeinen Verfahrensbeispiel behandelt:
1. Äther (Diäthyl) in geeignetem Verhältnis, etwa 30 ml/1000 ml Filtrat, dient zur Extraktion einer die Steroide enthaltenden Fettfraktion aus dem Filtrat.

2. Dann wird der Ätherextrakt mit 50 ml o.lN alkoholischem KOH während 1 Stunde bei 780 C in Kontakt gebracht, damit die verschiedenen darin befindlichen Säureester verseift werden. Die Seifen werden aus dem verseiften Extrakt durch wiederholte Extraktion mit destilliertem Wasser entfernt, wobei drei solche Extraktionen in der Regel genügen. Dann wird der gereinigte Extrakt unter Verwendung eines Stickstoffstroms verdampft, wobei die Erwärmung in einem Dampfbad erfolgt, damit eine übermässige Erhitzung ausgeschlossen ist.

3. Der Ätherextrakt lässt sich dann fraktionieren, indem er durch eine Chromatographie-Säule mit 97 prozentiger aktivierter Tonerde unter Verwendung eines Waschmittels mit 3 a-ther in Cyclohexan geführt wird. Die einzelnen Komponenten lassen sich, wenn die chromatographischen Fraktionen aus der Säule austreten, durch Ultraviolett-Spektrophotometrie erkennen, und die austretenden Fraktionen im Waschmittel, die getrennte Komponenten enthalten, werden gesammelt.

Die getrennten Komponenten fallen als Feststoffe an, wenn das Waschmittel verdampft wird, und die Analyse erfolgt auf üblichem biologischen Weg, wobei Dosierungen wie oben beschrieben bestimmt und formuliert werden können.

Ein zusammengesetzter Plazentarextrakt mit einer Vielfalt bekannter und manchen unbekannten physiologischen Wirkstoffen wird aus dem mit Äther extrahierten Filtrat gewonnen. Die vorhandenen Stoffe sind alkalische Phosphatase, Ribonuklease, Adenosintriphosphat, Cholinesterase und Desoxyribonuklease. Angesichts der unidentifizierten Komponenten und auch der bekannten Wirkstoffe dürfte der Extrakt zur Anregung weiterer Forschung und auch für allgemeine Heilzwecke höchst nützlich sein.

1. Das mit Äther extrahierte Filtrat wird unter Vakuum gesetzt, damit der Rest äther ausgebracht werden kann, beispielsweise durch Einbringen in eine Saug- flasche, an die während 4 Stunden ein Vakuum angesetzt wird.

2. Nach der Entfernung des Äthers wird die Lösung auf einen pH-Wert von 7,8 neutralisiert, was durch eine Base wie NaOH geschieht.

3. Alternativ lässt sich das Reinigungsverfahren durch Verseifen durch eine chromatographische Trennung ersetzen, wobei die Steroide in einer Säule mit 100% aktivierter Tonerde adsorbiert werden. Unreinigkeiten einschliesslich Fettsäureester werden durch Waschen mit 100% Cyclohexan entfernt. Schliesslich werden die gereinigten Steroidhormone wie oben mit 3% Äther in Cyclohexanlösung chromatographisch ausgewaschen.

4. Dann wird die neutralisierte Lösung durch Lyophilisierung getrocknet und pulverisiert, worauf die zur Weiterverarbeitung oder zum direkten Gebrauch in medizinischen Rezepturen oder zur Verwendung zu Forschungszwecken bereit ist.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur Erzeugung von physiologisch aktiven Plazentarsubstanzen, dadurch gekennzeichnet, dass lebendes Plazentargewebe bei einer zur Erhaltung des Gewebes am Leben geeigneten Temperatur in einem Kulturmedium während einer Zeitdauer kultiviert wird, die zur Erzeugung von Plazentarsubstanzen im Kulturmedium genügt, dass das diese Substanzen enthaltende Kulturmedium vom lebenden Gewebe getrennt und auf etwa 50 C gekühlt und zwecks Ausfällung einer Gonadatropin enthaltenden Glykoproteinfraktion angesäuert wird, die Glykoproteinfraktion mit dem Gonadatropin aus der Lösung getrennt, das restliche Kulturmedium mit einem Lösungsmittel in Berührung gebracht wird, der eine Fettfraktion mit Steroidhormonen enthaltende Extrakt vom Kulturmedium getrennt wird und das restliche Kulturmedium dehydriert wird.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Plazentargewebe in einer Flasche mit dem Medium in Berührung gebracht wird, die einen eine geschlossene Kammer bildenden Flaschenkörper umfasst, in dem ein Träger für das Gewebe und Mittel zur Einführung und Entleerung eines Kulturmediums vorgesehen sind, und dass das Plazentargewebe an dem Träger angeordnet ist.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Glykoproteinfraktion durch Adsorption an Tonerde und Filtrierung abgetrennt wird, so dass ein diese Glykoproteinfraktion enthaltender Filterkuchen entsteht, der durch Waschen mit angesäuertem Wasser gereinigt wird, dass der Filterkuchen mit einer Base zur Auswaschung von gereinigtem Gonadatropin aus dem Kuchen behandelt wird und das Gonadatropin aus der Waschflüssigkeit durch Ansäuerung und Stehenlassen bei niedriger Temperatur ausgefällt wird.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettfraktion mit alkoholischem KOH in Berührung gebracht wird, so dass darin die Fettsäureester verseift werden, die erhaltenen Fettsäuren durch Behandeln des Gemischs mit Wasser abgetrennt werden und der Rückstand zur Erzeugung einer festen Phase gereinigter Steroidhormone verdampft wird.

4. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase gereinigter Steroidhormone zur Erzeugung von Waschfraktionen mit getrennten Steroidhormonen in einer Chromatographiesäule mit aktivierter Tonerde behandelt wird und die Waschflüssigkeit zur Erzeugung aufgetrennter fester Steroidhormone aus den Fraktionen verdampft wird.

5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettfraktion zwecks Adsorption der Steroidhormone über eine Säule mit aktivierter Tonerde geführt wird, die Säule zur Entfernung von Unreinigkeiten mit Cyclohexan gewaschen wird und ein Waschmittel durch die Säule geführt wird, damit daraus Steroidhormonfraktionen ausgewaschen und abgetrennt werden.