Verfahren zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin in erhöhter Ausbeute.
Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin durch Fermenta- tion und Methoden zu seiner Aufarbeitung und Reinigung.
2'-Amino-2'desoxy-kanamycin hemmt wirksam das Wachstum grampositiver, gramnegativer und säurebeständiger Bakterien, wie Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella und Mycobakterium, sowie auch pathogener Bakterien, die beständig sind gegenüber bekannten Antibiotika und synthetischen chemotherapeutischen Mitteln. Dieses 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin weist eine viel geringere Toxizität, insbesondere eine geringe Oto-Toxizität auf und zeigt eine brauchbare therapeutische Wirkung bei Infektionen grampositiver, gramnegativer und säurebeständiger Bakterien an Mensch und Tier.
2¯Amino-2'-desoxy-kanamycin hat die Bruttoformel C18H37N5010 . H20 und kann durch die Strukturformel
EMI1.1
dargestellt werden.
Bei der Untersuchung der grosstechnischen Herstellung von Kanamycin A durch Fermentation wurde festgestellt, dass die gewöhnlichen natürlichen Stämme von Streptomyces kanamyceticus, die zur grosstechnischen Herstellung von Kanamycin A dienten, dieses gewöhnlich in grösserer Menge in der Kultur erzeugen können, aber nur eine sehr viel kleinere Menge von 2'-Amino-2'-desoxykanamycin erzeugen können.
Es wurde nun gefunden, dass sich die Menge des in der Kultur erzeugten und angereicherten 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycins merklich verbessern und in höherer Ausbeute daraus isolieren lässt, wenn entweder gewöhnliche Stämme von Streptomyces kanamyceticus kultiviert werden in bekannter Weise, aber in Gegenwart einer Aminoglucose oder eines Glucosids, welches eine Aminoglucose und Desoxystreptamin eingebaut enthält oder wenn einige neue Mutanten des Streptomyces kanamyceticus in bekannter Weise auf einem gewöhnlichen Kulturmedium kultiviert werden, wie es herkömmlicherweise für die Kultivierung bekannter Mikroorganismen von Actinomyceten verwendet wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin in erhöhter Ausbeute ist daher dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Streptomyces kanamyceticus oder eine Mutante von Streptomyces kanamyceticus unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das Kohlenhydrat und stickstoffhaltigen Nährstoff enthält, züchtet, wobei die Züchtung eines Stammes von Streptomyces kanamyceticus in Gegenwart einer Aminoglucose oder eines Glucosids, das eine Aminoglucose und Desoxystreptamin eingebaut enthält, erfolgt, bis sich eine merkliche Menge 2'-Amino-2'-de- soxy-kanamycin in der Kultur angereichert hat und dass man das 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin aus der Kultur isoliert.
Beispiele von Aminoglucosen, die sich im erwähnten Verfahren verwenden lassen, sind D-Glucosamin, 3-Ami no3-desoxy-D-glucose, 6-Amino-6-desoxy-D-glucose und 2,6-Didesoxy-2,6-amino-D-glucose. Als Glucosid kommen solche Verbindungen in Frage, worin die Aminoglucose mit Desoxystreptamin im Mol-Verhältnis 1:1 vorliegt; oder es können Komplexe dieser Verbindungen mit weite ren angelagerten Glucose- oder Aminoglucose-Molekülen sein.
Beispiele geeigneter Glucoside sind Paromamin (442-D-GlucosaminylSalpha-desoxystreptamin), Desoxystreptamin-O-kanosaminid, Neamin (4-(2,6-Di-desoxy-2,6-diamino- glucosyl > alpha-desoxystreptamin), Antibiotikum NK-1001 (eine Verbindung von 6-Amino-6-desoxy-D-glucose, Desoxystreptamin und Glucose) und Antibiotikum NK-1003 (eine Verbindung von 6-Amino-6-desoxy-D-glucose und Desoxystreptamin). (Die oben erwähnten Antibiotika NK-1001 und NK-1003 sind neue Substanzen, die z. B. in den französischen Patentschriften Nr. 1 583 985 und Nr. 1 583 986 beschrieben sind.)
In diesem Verfahren kann das oben erwähnte Additiv aus Aminoglucose oder dem Glucosid dem Kulturmedium vor Beginn der Streptomyces-Kultivierung zugegeben werden oder auch während der Kultivierung in der für gewöhnliche Nährmethoden bekannten Weise.
Der geeignete Anteil des im Kulturmedium vorliegenden Additives ist nicht kritisch, kann aber zwischen 0,05 bis 1,0 Gewichts prozent, insbesondere zwischen 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent des Kulturmediums betragen. Es wurde festgestellt, dass die in der Kultur erzeugte und sich anreichernde Menge am Antibiotikum 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin nach Ablauf von 3 bis 7 Tagen nach Beginn der Kultivierung ein Maximum erreicht.
Im Gegensatz zur oben erwähnten Tatsache, dass die gewöhnlichen Stämme von Streptomyces kanamyceticus, wie sie zur bestehenden grosstechnischen Herstellung von Kanamycin A dienen, eine höhere Kapazität zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin nur dann aufweisen, wenn sie im üblichen Kulturmedium und in Gegenwart von den genannten Aminoglucosen oder Glucosiden kultiviert werden, wurde ferner festgestellt, dass einige neue Mutanten von Streptomyces kanamyceticus, die von einem typischen natürlichen Stamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus abstammen, eine höhere Kapazität zur Erzeugung von 2¯Amino-2'desoxy-kanamycin selbst dann aufweisen können, wenn sie im üblichen Kulturmedium und in Abwesenheit der erwähnten Aminoglucosen oder Glucoside kultiviert werden.
Diese neuen Mutanten mit erhöhter Fähigkeit 2'-Ami no-2'-desoxy-kanamycin zu erzeugen, wurden z. B. durch Behandeln des bekannten natürlichen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus mit einem Mutationsmittel, wie Stickstoffsenfgas (nitrogen mustard) oder Bestrahlung mit Ultraviolett-Strahlen und spezielle Auslese der überlebenden Mycelen oder Sporen erhalten.
Diese neuen Mutanten schliessen vor allem vier Mutantenarten ein mit den Laborbezeichnungen A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2. Diese neuen Mutanten haben die geringe oder nicht vorhandene Fähigkeit der Verwertung von Xylose gemeinsam und unterscheiden sich dadurch vom ursprünglichen Stamm, der eine erhöhte Fähigkeit zur Verwertung von Xylose aufweist.
Wenn irgend ein bekannter Stamm von Streptomyces kanamyceticus mit einem bekannten Mutationsmittel, wie Stickstoffsenfgas, behandelt wird, kann man erwarten, dass neben den oben erwähnten Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2, auch andere Mutanten oder Varianten erhalten werden, denen eine erhöhte Fähigkeit zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin eigen ist.
Im Verfahren nach der Erfindung lässt sich die Kultivierung allgemein in üblicher Weise durchführen nach den gewöhnlichen Methoden zur Kultivierung der bekannten Actinomycetes. Kulturmedien, die bekannte Nährstoffquellen für Actinomycetes enthalten1 sind geeignet zur Erzeugung von 2¯Amino-2ldesoxy-kanamycin. So kann das Kulturmedium Kohlenstoffquellen, wie Stärke, Saccharose, Maltose, Glucose, Glycerin und dgl.,enthalten und als Stickstoffquellen z. B. Soyabohnenmehl, lösliche vegetabile Proteine, Maisquellwasser, Peptone, Fleischextrakt, Nitrate und Ammoniumsalze. Das Kulturmedium kann auch andere geeignete anorganische Salze, wie NaCI, MgSO4 und solche Mittel enthalten, die das Wachstum von Streptomyces kanamyceticus fördern.
Zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin ist die Kultivierung auf einem festen Medium möglich, aber für die grosstechnische Erzeugung bevorzugt man die Kultivierung in einem flüssigen Medium unter aeroben Bedingungen. Insbesondere bevorzugt man für die grosstechnische Herstellung des Antibiotikums die Methode einer stark belüfteten Tauchkultivierung. Es ist auch möglich, die Schüttelkultur und die belüftete gerührte Kultur in einem flüssigen Medium anzuwenden. Die Kultivierungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen 25 und 30 "C, insbesondere bei oder um 28 "C. Es wurde festgestellt, dass die sich anreichernde Menge von Y-Amino-2'-desoxy-kanamy- cin in der Kultur nach Ablauf von 3 bis 7 Tagen nach Beginn der Kultivierung ein Maximum erreicht.
2'-Amino-Y-desoxy-kanamycin, das sich in der Kultur angereichert hat, kann daraus nach irgend einer bekannten Methode isoliert werden, z. B. unter Anwendung von Ionenaustauscherharzen, durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und durch Verwendung eines Fällungsmittels, wie sie gewöhnlich zur Reinigung der bekannten wasserlöslichen Antibiotika angewendet werden.
Zur grosstechnischen Erzeugung von 21-Amino-2'desoxy- kanamycin bevorzugt man dessen Isolierung nach einer Methode der Adsorption und Eluierung mit Ionenaustauschern, vorzugsweise einem Kation austauschenden Harz des Carbonsäuretypus oder nach einer Extraktionsmethode mit einem organischen Lösungsmittel, das einen geeigneten Träger, wie p-Toluol-sulfonsäure oder Laurinsäure enthält.
Beispielsweise lässt sich 2'-Amino-2'-desoxykanamycin isolieren durch Filtrieren der Feststoffe, wie des Mycelkuchens von der 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin enthaltenden Nährlösung, Adsorbieren des Filtrates auf Amberlite IRC-50 (Warenzeichen für ein Ionenaustauscherharz der Rohm & Haäs Company, USA), Eluieren mit wässerigem Ammoniak, Vereinigen und Konzentrieren der aktiven Fraktionen und chromatographische Trennung der konzentrischen Fraktion mit Dowex 1 x 2 (Warenzeichen für ein Ionenaustauscherharz der Dow Chemical Company, USA), und Sammeln und Konzentrieren der aktiven Fraktionen. Die konzentrierte Fraktion wird wiederum einer chromatographischen Trennung unterworfen durch Adsorption auf Amberlite CG-50 und allmähliches Eluieren mit Wasser/wässerigem Ammoniak.
Es lässt sich eine Einzelfraktion, die eine wirksame Verbindung, d. h. 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin enthält, erhalten. Diese Fraktion wird z. B. gefriergetrocknet und das erhaltene Pulver aus Wasser/Dimethylformamid zu 2'-Ami no-T-desoxy-kanamycin umkristallisiert.
2'-Amino-Y-desoxy-kanamycin kann in Form von farblosen, nadelförmigen Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 183 bis 186 "C anfallen, die basisch sind und löslich in Wasser, wässerigem Methanol, wässerigem Methanol, wässerigem Aceton, aber unlöslich in absolutem Methanol, absolutem Äthanol, Äthylacetat, Butylacetat, Äthyläther, Chloroform und Benzol, und eine positive Reaktion mit Ninhydrin, Elson-Morgan- und Molisch-Reagens zeigen, aber eine negative Reaktion mit Sakaguchi-, Tollens-, Fehling-, Million- und Benedict-Reagens.
Eine wässerige 1 /Oige Lösung dieser Substanz zeigt eine spezifische optische Drehung (a)2D = +118 ". Ein durch Acetylierung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin mit Methanol/Acetanhydrid erhaltenes N-Acetylat mit der Bruttoformel C18H32Nso1o 5(CH3CO) H2O schmilzt bei 290 bis 300 "C unter Zersetzung und zeigt eine spezifische Drehung von (a) 2D = +118 ".
Die antibakterielle Aktivität des 2'-Amino-2'-desoxy-ka- namycins ist gegen Wärme beständig. Wenn eine Lösung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin in 6n-Salzsäure 40 Minuten auf 100 "C erwärmt wird, beträgt die antibakterielle Aktivität der erhaltenen Lösung gegen den Bacillus subtilis noch 60 bis 80 C/c der ursprünglichen. Die erhaltene Lösung wird in Form eines Tupfens auf ein 40 x 40 cm Toyo Filterpapier Nr. 50-Blatt aufgebracht und aufsteigend mit einem Lösungsmittel aus Butanol-Essigsäure-Wasser (4:2:1) entwickelt. Auf diesem Papierchromatogramm erscheinen zwei Tupfen, die eine positive Reaktion mit Ninhydrin zeigen, wobei einer der Tupfen auch positiv auf ammoniakalisches Silbernitrat reagiert.
2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin zeigt eine hohe antibakterielle Aktivität gegen grampositive, gramnegative und säurebeständige Bakterien sowie auch gegen solche Bakterien und Stämme, die gegen Kanamycin A und andere bekannte Antibiotika und Chemotherapeutika resistent sind. Die Toxizität von 2Amino-2'-desoxy-kanamycin ist sehr niedrig, indem sein LD50 nur 190 mg/kg bei Mäusen (intravenös) beträgt.
Das antibakterielle Spektrum von 2'-Amino-2'-desoxykanamycin ist in Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle I Untersuchte Mikroorganismen Mindestkonzentration für vollständige
Inhibierung in ,ug/ml Aerobacter aerogenes IAM 1102 0,15 Alcaligenes faecalis 0,031 Bacillus agri 0,078 Bacillus subtilis ATCC 6633 0,039 Bacillus subtilis PCI 219 0,078 Diplococcus pneumoniae Typ 3110 0,31 Escherichia coli IAM 1253 1,25 Klebsiella pneumoniae 607 0,31 Lactobacillus arabinosus ATCC 8014 1,56 Lactobacillus fermenti ATCC 9338 0,15 Staphylococcus albus PCI 1200A 0,039 Staphylococcus aureus 209 P 0,31 Staphylococcus aureus Terashima 0,015 Mycobacterium phlei Nr.
56 0,62 Mycobacterium phlei Sekiguchi 0,31 Mycobacterium 607 0,78 Untersuchte Mikroorganismen Mindestkonzentration für vollständige
Inhibierung in ,ug/ml Proteus vulgaris 7,8 Pseudomonas aeruginosa IAM 1007 0,1 Pseudomonas aeruginosa Takasaki 0,78 Pseudomonas aeruginosa Masakuro 0,39 Salmonella paratyphi A 0,62 Salmonella paratyphi B 0,62 Salmonella paratyphi C 1,25 Sarcina lutea PCI 1001 0,31 Saccharomyces cerevisiae IAM 4626 500 Shigella flexneri EW 10 2a 0,039 Streptococcus faecalis ATCC 8043 15,6 Staphylococcus aureus 209P 2,5 (resistent gegen Streptomycin) Staphylococcus aureus 209P 0,31 (resistent gegen Erythromycin) Escherichia coli K-12 CS-2 0,31 Escherichia coli K-12 CS-2 1,56 (resistent gegen Antibiotica)
In den Zeichnungen zeigen:
:
Fig. 1 eine Kurve des Ultraviolett-Absorptionsspektrums von 21-Amino-2'desoxy-kanamycin in Wasser gelöst, bei einer Konzentration von 1 mg/ml Wasser.
Fig. 2 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin in Nujol.
Fig. 3 eine Kurve des Ultraviolett-Absorptionsspektrums von Antibiotikum NK-1001, gelöst in Wasser, bei einer Konzentration von 1 mg/ml Wasser,
Fig. 4 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums von Antibiotikum NK-1001 in Nujol,
Fig. 5 eine Kurve des Ultraviolett-Absorptionsspektrums von Antibiotikum NK-1003, gelöst in Wasser, bei einer Konzentration von 1 mg/ml Wasser, und
Fig. 6 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums von Antibiotikum NK-1003 in Nujol.
Aus den Fig. 1 und 2 ist ersichtlich, dass 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin keine Ultraviolett-Absorption von 220 Millimikron bis 340 Millimikron, aber charakteristische Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenlängen in cm-1 zeigt: 3600, 3000, 1650, 1600, 1570, 1140, 1110, 1095, 1090, 1060, 1035, 960, 900, 895, 880, 845, 815, 790, 780, 765 und 725.
Eine Kultur des Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus, der sich zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung verwenden lässt, ist bei der ATCC in Washington D.C. hinterlegt worden und seiner ständigen Sammlung von Microorganismen unter der Nummer 21 252 eingereiht worden. Ferner sind Kulturen der Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus, die sich zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung verwenden lassen, bei der ATCC unter den Nummern 21 260, 21 159, 21 261 und 21 268 hinterlegt worden.
Wie schon erwähnt, zeichnen sich die Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceticus durch eine geringe oder gar keine Fähigkeit zur Verwertung von Xylose aus, verglichen mit der hohen Xylose verwertenden Fähigkeit ihres Elternstammes 0-4-1.
Die Mutante A-4-6 zeichnet sich weiter dadurch aus, dass sie auf einer Saccharose-Czapek-Agarplatte, die kein
Desoxystreptamin enthält, im Gegensatz zum Elternstamm 0-4-1, nicht wächst. Die Mutante 3AG unterscheidet sich ferner, indem sie bedeutend grössere Kolonien bildet auf einer 3-Aminoglucose enthaltenden Czapek-Agarplatte als aus dem Elternstamm 0-4-1. Die Mutanten 18-8 und 19-2 unterscheiden sich ferner, indem sie wenig oder kein Dulcit verwerten, im Gegensatz zum Elternstamm 0-4-1, der eine viel höhere Fähigkeit zur Verwertung von Dulcit aufweist.
Diese Mutanten wurden nach der folgenden Mutations- und Auslesemethode gewonnen. Die Verfahren zur Erzeugung jeder dieser Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 sind im folgenden eingehender beschrieben.
Die Mutante A-4-6 wurde durch Behandeln des typischen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus wie folgt gewonnen: Der erwähnte Stamm wurde auf die Oberfläche einer geneigten Saccharose-Czapek-Agarplatte geimpft, die dann bei 28 "C 7 Tage lang bebrütet wurde.
Mit einer Platinöse voll der entstehenden Kultur wurden 10 ml eines flüssigen Mediums beimpft, das 1 0/0 Maisquellwasser und 0,25 % getrocknete Hefe bei einem pH von 7,0 in einem 70 ml-Reagenzglaz enthielt. Eine Schüttelkultur wurde bei 28 "C 24 Stunden lang in einer Schüttelmaschine mit 350 Bewegungen pro Minute bei einer Amplitude von 2 cm durchgeführt. Das so erhaltene wachsende Mycel wurde durch Zentrifugieren der Nährlösung während 10 Minuten bei einer Beschleunigung von 2000 g und Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit isoliert.
Der Mycelkuchen wurde zweimal mit gleichen Mengen 0,90/oiger physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und das nasse Mycel in 5 ml der Salzlösung suspendiert, unter Zusatz von 4 ml einer t/4-molaren Na2HPO4-Lösung, der Mi schung 1 ml einer 500 ug/ml Stickstoffsenfgas enthaltenden Lösung zugesetzt und 10 Minuten lang stehen gelassen. Anschliessend wurde 1 ml der erhaltenen Mischung in 9 ml einer neutralisierenden Lösung von 0,2 % Glycin und 0,17 % NaHCO3 aufgenommen und die Mischung etwa eine Stunde lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Der Mycelkuchen wurde daraus durch Zentrifugieren isoliert, gespült und die gesamte Menge des Mycels in 10 ml Maisquellwasser in ein 70 ml-Reagenzglas verpflanzt.
Eine Schüttelkultur wurde dann bei 28 "C 24 Stunden lang wie oben beschrieben durchgeführt. Die Kultur wurde zweimal gespült, verdünnt und dann eine Saccharose-Czapek-Agarplatte, die zusätzlich 100 Fg/ml Desoxystreptamin enthielt, damit beimpft. Die Bebrütung erfolgte bei 28 "C während 10 Tagen zur Erzeugung von Kolonien.
Etwas Mycel wurde von jeder der Kolonien entfernt und damit 10 ml Maisquellwasser in einem 70 ml-Reagenzglas beimpft. Eine Schüttelkultur wurde wiederum bei 28 "C 24 Stunden lang wie oben erwähnt durchgeführt.
Die erhaltene Kultur wurde zweimal gespült, verdünnt und dann eine Saccharose-Czapek-Agarplatte und eine Saccharose-Czapek-Agarplatte, die zusätzlich 100 Fg/ml Desoxystreptamin enthielt, damit beimpft. Die Bebrütung erfolgte bei 28 "C während 7 Tagen zur Erzeugung von Kolonien. Ein solcher Stamm, der nicht auf der ersteren Platte, sondern nur auf der letzteren wuchs, wurde isoliert und als Mutante A-4-6 von Streptomyces kanamyceticus bezeichnet. Diese Mutante, die einen notwendigen Bedarf an Desoxystreptamin zeigte, lag im Verhältnis von etwa einer Kolonie zu 100 gebildeten Kolonien vor.
Die Mutante 3AG wurde durch Behandeln des Eltern Stammes 0-4-1 wie folgt erzeugt: Mit einer Kultur des typischen Stammes 0-4-1 wurde die Oberfläche einer geneigten Saccharose-Czapek-Agarplatte beimpft und bei 28 "C 7 Tage lang bebrütet. Eine Platinöse voll der erhaltenen Kultur wurde daraus entfernt und in 10 ml eines flüssigen Mediums, das 1 % Maisquellwasser und 0,25 % getrocknete Hefe bei pH 7 in einem 70 ml-Probierglas enthielt, verpflanzt. Eine Schüttelkultur wurde bei 28 "C während 24 Stunden in einer Schüttelmaschine mit 350 Bewegungen pro Minute bei einer Amplitude von 2 cm durchgeführt. Die Kultur wurde zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen und dann mit einer Lösung von 50 ug/ml Stickstoffsenfgas behandelt.
Mit Mycelien des so behandelten Stammes wurde dann ein 3-Aminoglucose haltiges Czapek-Medium beimpft, das 3 0/0 3-Aminoglucose anstelle von 3 % Saccharose enthielt, und eine Schüttelkultur bei 28 "C während 24 Stunden wie oben durchgeführt. Aus der durch Zentrifugieren abgetrennten Kultur wurde mit wachsenden Mycelien ein Maisquellwassermedium beimpft, um das Wachstum zu fördern. Eine Schüttelkultur wurde abermals bei 28 "C während 24 Stunden in der beschriebenen Weise durchgeführt. Danach wurde die Kultur gewaschen, die entstandene Suspension homogenisiert, verdünnt und damit eine 3-Aminoglucose Czapek-Agarplatte beimpft, die anschliessend bei 28 "C 14 Tage lang zur Erzeugung von Kolonien bebrütet wurde.
Als Ergebnis bildeten sich kleine, mittlere und grosse Kolonien. Mycelien wurden nur von den grossen Kolonien entnommen, und damit Maisquellwasser beimpft. Eine Schüttelkultur wurde wiederum bei 28 "C während 24 Stunden wie oben erwähnt durchgeführt. Nach dem Waschen wurde die Suspension homogenisiert und verdünnt und eine damit beimpfte 3-Aminoglucose-Czapek-Agarplatte bei 38 "C 14 Tage lang zur Bildung von Kolonien bebrütet. Als Resultat konnte man einen Stamm, der nur grosse Kolonien bildete, daraus isolieren, der als Mutante 3AG von Streptomyces kanamyceticus bezeichnet wurde.
Die Mutanten 18-8 und 19-2 wurden durch Behandlung des Elternstammes 0-4-1 folgendermassen erzeugt: Eine Kultur des Elternstammes 0-4-1 wurde auf die Oberfläche einer geneigten Stärke-Czapek-Agarplatte geimpft und bei 28 "C 7 Tage lang bebrütet. Eine Platinöse voll der entstandenen Kultur wurde in 1 ml sterilem Wasser suspendiert. Nach dem Aufschlämmen der Suspension wurde sie in eine Stärke-Czapek-Agar enthaltende Schale übergeführt und dann bei 28 "C während 10 Tagen bebrütet.
Nach dem Bebrüten wurde die Schale unter eine Ultraviolett-Lampe (19 Watt-Sterilisierlampe hergestellt von der Toshiba Company, Japan) gebracht und dann mit Ultraviolett-Strahlen 10 Minuten lang im Abstand von 30 cm bestrahlt. Nach dieser Mutationsbehandlung wurde das Mycel von der Agaroberfläche abgekratzt und in 10 ml sterilem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde homogenisiert und dann auf ein Stärke-Dulcit-Czapek-Agar (ein 0,1 % Stärke und 3 % Dulcit enthaltendes Czapek-Agar) gebracht und bei 28 "C während 7 Tagen bebrütet. Das Mycel wurde nur von den kleinen Kolonien, die leicht auf dem Agar gewachsen waren, entfernt. Mit dem Mycel wurden dann geneigte Stärke-Czapek-Agarplatten beimpft und bei 28 "C während 7 Tagen bebrütet. Auf diesen Stärke-Czapek-Agarplatten zeigten alle Kolonien ein gutes Wachstum.
Platinösen-Mengen des Mycels wurden von jeder der Platten entfernt und damit Dulcit-Mineral-Agarplatten (enthaltend 1 0/0 Dulcit, 0,264 % Ammoniumsulfat, 0,565 % Di-kaliumphosphat, 0,238 /o Monokaliumphosphat, 0,1 0/0 Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,00064 % Kupfersulfatpentahydrat, 0,00079 % Manganchlorid-tetrahydrat, 0,00011 % Eisensulfat-heptahydrat, 0,00015 0/0 Zinksulfat heptahydrat und 1,5 0/0 Agar, pH 7,0) beimpft. Die Bebrütung bei 28 "C während 14 Tagen ergab eine vorherrschende Anzahl von Stämmen mit normalem Wachstum und nur zwei Stämmen, die nicht merklich wachsen konnten.
Diese zwei Stämme, die wohl auf Stärke-Czapek Agar, aber nicht auf Dulcit-Mineral-Agar wachsen konnten, zeigten die Fähigkeit zur Erzeugung von 2'-Amino-2'- desoxy-kanamycin mit erhöhter Ausbeute. Diese Mutanten wurden als 18-8 und 19-2 von Streptomyces kanamyceti cus bezeichnet.
Die Mutanten 3AG, A-4-6, 18-8 und 19-2 von Strepto myces kanamyceticus zeigen die folgenden Eigenschaften:
Sie sind einander morphologisch darin ähnlich, dass die Luft-Mycelien verhältnismässig grobe Äste und gewöhnlich keine Spiralen und Wirbel bilden, dass sich die Sporen an den Enden der Luft-Mycelien bilden und gewöhnlich eine ovale oder zylindrische Form mit allgemein 1,0 bis 1,5 Mikron Durchmesser und eine glatte Sporenoberfläche aufweisen. Sie sind allerdings voneinander un terscheidbar bezüglich ihrer Wachstumsbedingungen auf Nährmedien, ihren physiologischen Wirkungen und ihrer Fähigkeit, Kohlenstoffquellen zu verwerten, welche Eigenschaften in den Tabellen II, III und IV aufgeführt sind.
Ferner sind die Unterschiede zwischen dem typischen Stamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus und seinen Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 in Tabelle IV bezüglich ihrer Wachstumsbedingungen, physiologischen Wirkungen und Verwertung von Kohlenstoffquellen zusammengefasst.
Tabelle II
Wachstumsbedingungen von Mutanten des Streptomyces kanamyceticus auf verschiedenen Nährmedien (beobachtet nach 14tägiger Bebrütung, Bruttemperatur 28 "C)
Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces kanamyceticus kanamyceticus kanamyceticus kanamyceticus Nährmedium Beobachtungen Mutante A-4-6 Mutante 3AG Mutante 18-8 Mutante 19-2 Saccharose- Wachstum Glattes Wachstum glattes Wachstum glattes Wachstum glattes Wachstum Czapek-Agar blassgelb gefärbt tiefgelb gefärbt tiefgelb gefärbt dunkelgelb gefärbt
Luft-Mycel keines keines keines keines lösliches blassgelb blassgelb gelb blassgelb
Pigment
Rückseite schwach gräulich- gräulich gelb gefärbt gelb gefärbt Glycerin-Agar Wachstum sehr schwaches glattes Wachstum glattes Wachstum glattes Wachstum farbloses Wachstum gelblich-grau gefärbt gelblich-grau gefärbt hellbraun gefärbt
Luft-Mycel keines keines
keines stark olivgrau gefärbt lösliches keines keines keines schwach gelblich
Pigment braun gefärbt
Rückseite schwach grau- schwach grau-gelb gelblich-braun gefärbt gefärbt gefärbt
Glucose- Wachstum gelblich-braun tiefgelblich- leuchtend gelb gefärbt
Asparagin-Agar bis tiefgelb braun bis braun tiefgelb gefärbt (Krainsky) gefärbt gefärbt
Luft-Mycel keines keines schwach gelb keines gefärbt lösliches keines keines keines keines
Pigment
Rückseite schwach grau schwach braun gefärbt gefärbt
Glucose- Wachstum tiefgelb bis tiefgelb bis tiefgelb gefärbt tiefgelb gefärbt
Asparagin-Agar gelb gefärbt gelb gefärbt (Uschinsky) Luft-Mycel keines keines keines keines lösliches keines keines keines keines
Pigment
Rückseite gelb bis gelb bis schwachgelb gefärbt schwachgelb gefärbt
Calciummalat- Wachstum schwachgelb bis weiss bis weiss bis sehr weiss bis sehr
Agar gelb gefärbt schwachgelb schwachgelb
schwachgelb gefärbt gefärbt gefärbt
Luft-Mycel keines keines keines keines lösliches schwachgelb keines keines keines
Pigment gefärbt
Rückseite weiss gefärbt weiss gefärbt
Glycerin- Wachstum gelblich-braun braun bis gutes Wachstum gutes Wachstum calciummalat- gefärbt gelblich-braun gelb gefärbt gelb gefärbt
Agar gefärbt
Luft-Mycel keines keines keines keines lösliches gelb gelb gelb blassgelb
Pigment
Rückseite glassgelb gefärbt braungefärbt
Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptorayces kanamyceticus kanamyceticus kanamyceticus kanamyceticus Nährmedium Beobachtungen Mutante A-4-6 Mutante 3AG Mutante 18-8 Mutante 19-2 Bouillon-Agar Wachstum farblos bis farblos bis farblos bis farblos bis
Luft-Mycel graugelb gefärbt graugelb gefärbt graugelb gefärbt graugelb gefärbt lösliches keines keines keines keines
Pigment keines keines
keines keines
Glucose- Wachstum feines runzeliges feines runzeliges feines runzeliges feines runzeliges
Nährstoff-Agar Wachstum Wachstum Wachstum Wachstum weisslich- weisslich- weisslich- weisslich schwachgelb schwachgelb schwachgelb schwachgelb gefärbt gefärbt gefärbt gefärbt
Luft-Mycel keines keines keines keines lösliches Pigment keines keines keines keines Stärke-AmmoniumWachstum gelb bis gelblich- gelb bis gelblich- schwachgelb bis schwachgelb bis Sulfat-Agar braun gefärbt braun gefärbt gelb gefärbt gelb gefärbt
Luft-Mycel keines keines keines keines lösliches keines keines keines keines
Pigment
Rückseite schwachgelb schwachgelb gefärbt gefärbt Kartoffelpfropf Wachstum erhabenes gutes runzeliges runzeliges runzeliges
Wachstum Wachstum Wachstum Wachstum ockerfarbig kernige Ober- kernige Ober- kernige Ober fläche schwach fläche schwach fläche schwach
gelblich-braun gelblich-braun gelblich-braun gefärbt gefärbt gefärbt
Luft-Mycel weiss gefärbt schwachweiss schwachweiss keines gefärbt gefärbt lösliches keines keines keines keines
Pigment Karottenpfropf -Wachstum runzeliges runzeliges runzeliges schwaches
Wachstum, Wachstum, Wachstum, Wachstum schwächer als schwächer als schwächer als auf dem Kar- auf dem Kar- auf dem Kar toffelpropf, toffelpropf, toffelpropf,
körnige Ober- körnige Ober- körnige Ober fläche fläche fläche
Luft-Mycel keines keines schwach weiss keines gefärbt lösliches keines keines keines keines
Pigment
Wachstum kein Wachstum kein Wachstum bei 37 "C Loeffler's- Wachstum brau bis creme grau bis creme grau bis creme grau bis creme Blutserum gefärbtes Wachstum gefärbtes Wachstum gefärbtes Wachstum gefärbtes Wachstum
Luft-Mycel keines keines keines keines lösliches keines keines keines keines
Pigment
Wachstum gleich wie gleich wie gleich wie bei 37 "C bei 28 "C bei 28 "C bei 28 "C Ei Wachstum runzeliges runzeliges runzeliges runzeliges
Wachstum,
Wachstum Wachstum Wachstum gelb gefärbt gelb gefärbt gelb gefärbt gelb gefärbt
Luft-Mycel keines keines keines keines lösliches keines keines keines keines
Pigment Magermilch Wachstum kein Wachstum kein Wachstum Ringwachstum Ringwachstum
Luft-Mycel keines keines lösliches keines keines
Pigment
Tabelle III
Physiologische Wirkung der Mutante von Streptomyces kanamyceticus (beobachtet nach 14tägiger Brutzeit bei 28 "C).
Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces kanamyceticus kanamyceticus kanamyceticus kanamyceticus Physiologische Wirkungen Mutante A4-6 Mutante 3AG Mutante 18-8 Mutante 19-2 Nitratreduktion positiv positiv positiv positiv Stärkehydrolyse positiv positiv positiv positiv Schwefelwasserstoffbildung negativ negativ negativ negativ Tyrosinasebildung negativ negativ negativ negativ Gelatineverflüssigung bei stark 15 "C während 14 Tagen verflüssigt verflüssigt verflüssigt verflüssigt Solubilisierung von Loeffler's Blutserum bei 28 "C keine keine keine keine und 37 "C während 14 Tagen beobachtet beobachtet beobachtet beobachtet Magermilchmedium keine Koagulie- keine Koagulie- keine Koagulie- keine Koagulie rung, rasche rung, rasche rung, rasche rung,
langsame
Petonisierung Petonisierung Petonisierung Petonisierung
Tabelle IV
Unterschiede zwischen dem typischen Stamm 04-1 und den Mutanten von Streptomyces kanamyceticus
Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces
Beobachtungen kanamyceticus kanamyceticus kanamyceticus kanamyceticus kanamyceticus
Stamm 04-1 Mutanten A4-6 Mutante 3AG Mutante 18-8 Mutante 19-2 Wachstum auf:
:
Saccarose-Czapek Agarplatte +++ l ++ + + Desoxystreptamin-Czapek Agarplatte + + + + 3-Aminoglucose
Czapek-Agar platte + - +++ i
Dulcit
Czapek
Agarplatte +++ +++ ++ i
Kartoffel- runzeliges erhabenes runzeliges runzeliges runzeliges propf Wachstum, gutes Wachs- Wachstum, Wachstum, Wachstum, körnige Ober- tum, ocker- körnige Ober- körnige Ober- körnige Ober fläche, leicht farbig fläche, schwach- fläche, schwach- fläche, schwach braun gefärbt gelb-braun-gefärbt gelb-braun gefärbt gelb-braun gefärbt
Physiologische
Wirkung: Gelatineverflüssigung + ++ + + + in Magermilch- langsame rasche Pepto- rasche Pepto- langsame Pep- langsame Pepmedium Peptonisie- niesierung niesierung tonisierung tonisierung rung Verwertung von Kohlenstoffquellen:
: Saccharose +++ + ++ + + Xylose ++ - 1 1 Natriumacetat ++ - i +++ + Natriumcitrat +++ + ++ + + Natriumsuccinat + + ++ + + Dulcit +++ ++ +++ + i
Die Antibiotika NK-1001 und NK-1003, die als Zusatz beim erfindungsgemässen Verfahren dienen können, sind neue antibiotische Substanzen und lassen sich durch Züchten eines Stammes von Streptomyces kanamyceticus in einem Nährmedium erzeugen, das einen besonderen Zusatz enthält.
Das Antibiotikum NK-1001 ist eine solche neue antibiotische Substanz, die das Wachstum grampositiver und gramnegativer Bakterien, wie des Bacillus subtilis, Lactobacillus fermenti und Shigella dysenteriae wirksam hemmt, basisch ist und löslich in Wasser, wässerigem Me thanol, wässerigem Äthanol, aber unlöslich in absolutem Methanol, absolutem Äthanol, Äthylacetat, Butylacetat und Benzol, die eine positive Reaktion mit Ninhydrin, Elson-Morgan- und Molisch-Reagens, aber eine negative Reaktion mit Sakaguchi;
Tollens-, Fehling-, Millon- und Benedict-Reagenzien zeigt, die die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, aber keinen Schwefel, Halogene und Asche enthält, die Bruttoformel C,8H3sN3012 H2O aufweist und farblose nadelförmige Kristalle bildet, die sich bei 238 bis 242 "C zersetzen, in 1 /Oiger wässeriger Lösung eine spezifische Drehung (a)2D +132 zeigt, keine Absorption von Ultraviolett-Licht von 220 bis 340 Millimikron zeigt (Fig. 3) und charakteristische Absorptionsbanden (Fig. 4) im Infrarot-Gebiet des Spektrums in Nujol aufweist. Wenn man das Antibiotikum NK-1001 in 6n-Salzsäure auf 100 "C während 40 Minuten erwärmt, verliert es seine antibakterielle Aktivität.
Die entstandene hydrolysierte Lösung wird in Form eines Tupfens auf ein Blatt (40 x 2 cm) Toyo-Filter-Papier No. 50 aufgegeben und dann fallend mit einem Lösungsgemisch von Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:1:3) entwickelt.
Aus dem erhaltenen Papierchromatogramm haben sich drei Tupfen gebildet, nämlich einer, der mit Ninhydrin und ammoniakalischem Silbernitrat, ein anderer der nur mit Ninhydrin und ein weiterer der mit ammoniakalischem Silbernitrat positiv reagiert. Verglichen mit bekannten Proben wurde festgestellt, dass-diese drei Tupfen Desoxystreptamin, bzw. 6-Amino-6-desoxy-D-glucose, bzw. D-Clucose, entsprechen. Angesichts dieser Tatsache und des für das Antibiotikum NK-1001 bestimmten Molekulargewichts hält man es für wahrscheinlich, dass das Antibiotikum NK-1001 eine neue Verbindung ist, die aus einem Molekül Desoxystreptamin, einem Molekül 6-Amino-6-desoxy-Dglucose und einem Molekül D-Glucose besteht. Antibiotikum NK-1001 ist praktisch ungiftig, da sein LD50 3050 mg/kg bei intravenöser Injektion an Mäusen beträgt.
Die Erzeugung von Antibiotikum NK-1001 kann durch Züchten des oben erwähnten typischen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium erfolgen, das Kohlenwasserstoff und einen stickstoffhaltigen Nährstoff, sowie Streptidin enthält, bis sich das Antibiotikum NK-1001 in der Kultur anreichert und daraus isoliert werden kann.
Die Methode zur Durchführung der fermentativen Erzeugung von Antibiotikum NK-1001 wie auch die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen dafür können die gleichen sein wie die zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin früher erwähnten. Demnach ist die Anwendung der Schüttelkultur und der Tieftauchkultur möglich. Die Kulturtemperatur kann zwischen 25 bis 35 "C, insbesondere um 28 "C liegen. Die dem Nährmedium zugegebene Streptidinmenge ist nicht kritisch, aber wirtschaftlich sind 0,05 bis 1,0 Gewichtsprozent, insbesondere 0,1 bis 0,5 Gewichts- prozent bezogen auf das Medium. Streptidin kann sowohl zu Beginn wie während der Kultur zugegeben werden.
Die Isolierung und Reinigung des Antibiotikums NK-1001 lässt sich in ähnlicher Weise wie für 2'-Amino-2'desoxy-kanamycin beschrieben durchführen.
Das Antibiotikum NK-1003, das wie das Antibiotikum NK-1001 als Zusatz dienen kann, ist ebenfalls eine neue antibiotische Substanz, die eine brauchbare antibakterielle Aktivität gegen grampositive, gramnegative und säurebeständige Bakterien, wie Bacillus subtilis, Lactobacillus fermenti und Shigella dysenteriae zeigt Das Antibiotikum NK-1003 ist eine solche antibiotische Substanz, die das Wachstum von grampositiven, gramnegativen und säurebeständigen Bakterien wirksam hemmt, basisch ist und löslich in Wasser, wässrigem Methanol, wässrigem Äthanol, aber unlöslich in absolutem Methanol, absolutem Äthanol, Äthylacetat, Butylacetat und Benzol, mit Ninhydrin, Elson Morgan- und Molisch-Reganzien positiv, aber mit Sakaguchi-, Tollens-, Fehling-, Millon- und Benedict-Reagenzien negativ reagiert, die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, aber keinen Schwefel,
kein Halogen und keine Asche enthält, die Bruttoformel C12H25N3O7 besitzt und farblose, nadelförmige Kristalle bildet, die sich bei 202 bis 205 "C zersetzen, in wässriger 10/oiger Lösung eine spezifische Drehung (a)2D - plus 95 zeigt, keine Absorption von Ultraviolett-Licht von 220 bis 340 Millimikron, wie in Fig. 5, aber charakteristische Absorptionsbanden im Infrarot-Gebiet des Spektrums in Nujol, wie in Fig. 6, aufweist. Wird Antibiotikum NK-1003 durch Erwärmen in 6n-Salzsäure auf 100 "C während 40 Minuten hydrolysiert, so verliert es seine antibakterielle Aktivität.
Die entstandene Hydrolyselösung wird in Form eines Tupfens auf ein Blatt (40 x 2 cm) Toyo-Filterpapier No. 50 aufgebracht und dann absteigend mit einem Lösungsmittelgemisch von Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:1:3) entwickelt. Das erhaltene Papierchromatogramm weist zwei Tupfen auf, die mit Ninhydrin positiv reagieren, wobei der eine auch auf ammoniakalisches Silbernitrat positiv reagiert. Durch Vergleich mit bekannten Proben hat man festgestellt, dass diese zwei Tupfen Desoxystreptamin, bzw. 6-D-Glucosamin, entsprechen. Angesichts dieser Tatsache und des ermittelten Molekulargewichtes, scheint das Antibiotikum NK-1003 eine Verbindung zu sein, die aus einem Molekül Desoxystreptamin und einem Molekül 6-D-Glucosamin besteht.
Das Antibiotikum NK-1003 ist praktisch ungiftig, da sein LD50 1550 mg/kg beträgt bei intravenöser Injektion an Mäusen.
Das Antibiotikum NK-1003 lässt sich durch Züchten eines Stammes von Streptomyces kanamyceticus in einem Nährmedium erzeugen, das Kohlenwasserstoff und einen stickstoffhaltigen Nährstoff, sowie eine Menge Antibiotikum NK-1001 enthält, unter aeroben Bedingungen bis sich Antibiotikum NK-1003 in der Kultur anreichert und daraus isoliert werden kann. Die Methode zur Durchführung der fermentativen Erzeugung von Antibiotikum NK-1003, wie auch die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen dafür, sind gleich denen zur Erzeugung von 2'-Amino-2desoxy-kana- mycin. Man bevorzugt die Anwendung der belüfteten Tieftankkultur.
Die Kulturtemperatur liegt gewöhnlich bei 25 bis 30 "C, insbesondere bei oder um 28 "C. Die dem Nährmedium zugesetzte Menge Antibiotikum NK-1001 ist unkritisch, kann aber bei 0,05 bis 1,0 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Medium, betragen. Das Antibiotikum NK-1001 kann entweder zu Beginn oder während der Kultur zugesetzt werden.
Die Isolierung und Reinigung von Antibiotikum
NK-1003 lässt sich in ähnlicher Weise wie für 2'-Amino-2'- desoxy-kanamycin beschrieben, durchführen.
Die antibakteriellen Spektren der Antibiotika NK-1001 und NK-1003, die als Zusatz beim erfindungsgemässen Verfahren dienen können, sind in Tabelle V zusammenge stellt.
Tabelle V
Mindestkonzentration für vollständige Hem mung in zug/ml Untersuchter Mikroorganismus Antibiotikum NK-1001 Antibiotikum NK-1003
Tabelle V Aerobacter aerogenes IAM 1102 31,2 15,6 Alcaligenes faecalis - 3,9 Bacillus agri 7,8 2,0 Bacillus subtilis ATCC 6633 6,25 3,125 Candida albicans über 500 über 500 Diplococcus pneumoniae Typ 311 D 500 250, Escherichia coli IAM 1253 125 125, Klebsiella pneumoniae 607 31,2 31,2 Lactobacillus fermenti ATCC 9338 3,9 3,9 Staphylococcus albus PCI 1200A 15,6 7,8 Staphylococcus aureus 209P 62,5 62,5 Staphylococcus aureus Terashima 6,25 3,125 Mycobacterium phlei MS 15,6 25 Mycobacterium 607 62,5 50 Salmonella paratyphi A 62,5 62,5 Sarcina lutea PCI 1001 500 250 Saccharomyces cerevisiae IAM 4626 über 500 über 500 Shigella flexneri EW 10 2a 6,25 3,125 Streptococcus haemolyticus D-90 500 500
Beispiel
1
15 Liter eines flüssigen Nährmediums, das 3,0 Gewichts prozent Stärke, 2,0 Gewichtsprozent Maltose, 2,5 Ge wichtsprozent Soyabohnenmehl, 1,2 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0,5 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurde mit dem typischen Stamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus beimpft und bei 28 "C unter Belüftung und Rühren bebrütet. Nach 22stündigem Brüten wurden dem Nährmedium 50 g 3-Aminoglucose zugefügt und die Brütung fortgesetzt. Die in der Kultur erzeugte Menge 2'Amino-2'desoxy-kanamycin erreichte ein Maximum nach 150 Stunden. Die Flüssigkultur wurde dann filtriert und das Filtrat mit 4 Liter Amberlite IRC-50 (Ammonium-Typ) behandelt Die am Harz adsorbierten Antibiotika wurden danach mit 0,5 N wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und zu einem Sirup konzentriert.
Der Sirup wurde in 500 ml Wasser gelöst und die Lösung durch Behandeln mit 6 g Aktivkohle entfärbt. Zur Entfernung der Aktivkohle filtrierte man die Lösung und chromatographierte das Filtrat mit 600 ml Dowex 1 x 2 (OH-Typ). Die das 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin enthaltenden Fraktionen wurden zuerst eluiert vor der Trennung von Kanamycin A. Die an 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin hochkonzentrierten Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und ergaben gefriergetrocknet 2,2 g rohes Pulver von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin. Diese Rohsubstanz (2,2 g) wurde in 50 ml Wasser gelöst und die Lösung mit Amberlite CG-50 (Ammoniak Typ) behandelt.
Das Harz wurde mit 0,1 n bis 0,5 n wässrigem Ammoniak fraktioniert, eluiert und das als Nebenprodukt in geringer Menge vorhandene Kanamycin A zuerst eluiert. 2'-Amino-2desoxy-kanamycin wurde danach getrennt als Einzelfraktion eluiert, konzentriert und zu einem rohen Pulver gefriergetrocknet. Durch Umkristallisieren des Pulvers aus Wasser-Dimethylformamid erhielt man 1,1 g 2¯Amino-2'-desoxy-kanamycin in Form von farblosen nadelartigen Kristallen. Eine Elementaranalyse des Produktes ergab 42,62 % C, 7,52 % H und 12,30 % N (gefunden). Das Molekulargewicht des Produktes wurde mit 435 bestimmt.
Beispiel 2
15 Liter eines flüssigen Nährmediums mit der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 wurden mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus aus Beispiel 1 beimpft und dann bei 28 "C unter Belüftung und Rühren bebrütet. Nach 22stündigem Brüten fügte man dem Nährmedium 50 g 6-Aminoglucose zu und setzte das Brüten fort. Die sich in der Kultur anreichernde Menge 2'Ami- no-2'-desoxy-kanamycin erreichte ein Maximum nach 145 Stunden Brüten.
Die Nährflüssigkeit wurde dann in gleicher Weise behandelt und das Rohprodukt gereinigt, wie in Beispiel 1, und ergab 1,0 g 2'-Amino-2desoxy-kanamycin in Kristallform.
Beispiel 3
15 Liter eines flüssigen Nährmediums, das 3,0 Gewichts- prozent Stärke, 2,5 Gewichtsprozent Soyabohnenmehl, 1,2 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0,35 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurde mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus, wie in Beispiel 1, beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28 "C bebrütet. Nach 20stündigem Brüten wurden 30 g Antibiotikum NK-1001 dem Nährmedium zugefügt und das Brüten fortgesetzt. Die Erzeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kana- mycin erreichte ein Maximum nach 140stündiger Brutzeit.
Die Nährflüssigkeit wurde dann wie in Beispiel 1 behandelt und das erhaltene Rohprodukt gereinigt, wonach man 2,5 g kristallines 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin erhielt.
Beispiel 4
15 Liter eines flüssigen Nährmediums derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 3 wurden mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus, wie in Beispiel 1, beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28 "C bebebrütet Nach 20stündiger Brutzeit fügte man dem Nährmedium 30 g Antibiotikum NK-1003 zu und setzte die Brütung fort. Die sich in der Kultur anreichernde Menge 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin erreichte ihr Maximum nach 140stündiger Brutzeit.
Die Nährflüssigkeit wurde dann behandelt und das erhaltene Rohprodukt gereinigt, wie in Beispiel 1, mit einer Ausbeute von 1,5 g kristallinem 2'-Amino-2'-desoxy-kana mydn.
Beispiel 5
15 Liter eines flüssigen Nährmediums derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 3 wurden mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus, wie in Beispiel 1, beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28 "C bebebrütet Nach 20stündigem Brüten wurden dem Nährmedium 45 g Neamin zugefügt und das Brüten fortgesetzt.
Die sich in der Kultur anreichernde 2'-Amino-2'-desoxy*a- namycin-Menge erreichte ein Maximum nach 140 Stunden Brutzeit.
Die Kulturbrühe wurde dann behandelt und das erhaltene Rohprodukt gereinigt wie in Beispiel 1, mit einer Ausbeute von 1,2 g kristallinem 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin.
Beispiel 6
15 Liter eines flüssigen Nährmediums, das 3,0 Gewichts prozent Stärke, 2,5 Gewichtsprozent Soyabohnenmehl, 1,2 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0,35 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurden sterilisiert, gekühlt und mit einer sterilisierten und gekühlten Lösung von 30 g Antibiotikum NK-1001 in Wasser vermischt. Die erhaltene Mischung wurde mit demselben Stamm von Streptomyces kanamyceticus, wie in Beispiel 1, beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28 "C bebrütet. Die sich in der Kultur anreichernde Menge 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin erreichte ihr Maximum nach 140 Stunden Brutzeit.
Die Kulturbrühe wurde dann behandelt und das erhaltene Rohprodukt gereinigt, wie in Beispiel 1, und zeigte eine Ausbeute von etwa 2,2 g kristallinem 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin.
Beispiel 7
Eine Kultur von Streptomyces kanamyceticus wurde in Gegenwart von Antibiotikum NK-1001, wie in Beispiel 3, durchgeführt. Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde filtriert und das Filtrat (14 Liter) mit Natriumhydroxyd auf pH 10 eingestellt. Das Filtrat wurde dann extrahiert mit einem Viertel seines Volumens n-Butanol, das 2 g Benzaldehyd pro Gramm im Filtrat vorhandener, wasserlöslicher, basischer Antibiotika enthielt. Der n-Butanol-Extrakt wurde abgeschieden und mit einem Zehntel-Volumen Wasser vermischt. Nach dem Einstellen des pH mit Schwefelsäure auf 2,0 und Rühren des erhaltenen Gemisches gingen die wasserlöslichen basischen Antibiotika in die wässrige Phase über. Die anfallende wässrige Lösung der Antibiotika wurde mit Aktivkohle entfärbt und mit Dowex 1 x 2 (OH-Typ) und Amberlite CG-50 (Ammonium-Typ), wie in Beispiel 1, chromatographiert.
Durch Umkristallisieren des Rohproduktes aus Wasser und Dimethylformamid erhielt man 1,1 g 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin als farblose nadelartige Kristalle.
Vergleichs-Beispiel 8
In diesem Beispiel wurden eine Anzahl Versuche durchgeführt, um die unerwartete und vorteilhafte Wirkung des Zusatzes von Aminoglucosen und Glucosiden zur Erzeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin nach dem erfindungsgemässen Verfahren zu zeigen.
In diesen Versuchen führte man die Kultur des typischen Stammes 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus bei 28 "C während 150 Stunden durch, wie in Beispiel 1, mit den gleichen Gärungsbehältern und Kulturmedien gleicher Zusammensetzung. Nach verschiedenen, seit Beginn der Kultur verflossenen, unten aufgeführten Zeitspannen wurden verschiedene nachstehend erwähnte Aminoglucosen und Glucoside dem Kulturmedium zugesetzt.
Nach 150stündiger Brutzeit wurden die Kulturbrühen wie in Beispiel 1 behandelt, so dass sich so viel als möglich 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin und Kanamycin A isolieren liessen. Die Produktausbeuten und Einzelheiten der Versuche sind in Tabelle VI zusammengestellt.
Tabelle V 1 Versuch Zusatzmittel Zusatz- Zeit- Gehalt an Ausbeute Gehalt an Ausbeute von Nr. menge spanne 2'-Amjno- von 2'- Kanamy- Kanamycin A (g) bis zum 2'-desoxy- Amino-2'- cin A (g)
Zusatz kanamycin desoxy- (ug/ml) (h) (ug/ml) kanamycin (g) 1 kein Zusatz 26 0,12 2790 26,8 2 3-Aminoglucose 50 22 260 1,10 1480 12,7 3 6-Aminoglucose 50 22 225 1,00 1730 15,2 4 Antibiotikum NK-1001 30 20 575 2,50 1240 11,2 5 Antibiotikum NK-1001 30 0 480 2,20 1450 13,6 6 Antibiotikum NK-1003 30 20 345 1,50 1700 16,0 7 Neamin 45 20 260 1,20 1390 12,8
Wie aus den Resultaten in Tabelle VI ersichtlich ist,
bringt der Zusatz von Aminglucosen oder Glucosiden zum Kulturmedium eine merkliche Steigerung der Ausbeute von 2'-Aminino-2'-desoxy-kanamycin, die wiederum zeigt, dass sich die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erzeugte und in der Kultur angereicherte Menge 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin beträchtlich erhöht.
Beispiel 9
15 Liter eines flüssigen Kulturmediums, das 3,0 Gewichtsprozent Maltose, 2,0 Gewichtsprozent Stärke, 3,0 Gewichtsprozent Soyabohnenmehl, 1,0 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0,5 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurden mit der Mutante A-4-6 von Streptomyces kanamyceticus beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28 "C bebrütet. Die sich in der Kultur anreichernde Menge 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin erreichte nach 6tägiger Brutzeit ihr Maximum.
Die filtrierte Kulturbrühe ergab 14 Liter Filtrat, das mit 4 Liter Amberlite IRC-50 (Ammonium-Typ) behandelt wurde. Das Harz wurde anschliessend mit 0,5 n wässerigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und zu einem Sirup konzentriert, den man in 500 ml Wasser löste. Die Lösung wurde durch Behan deln mit 6 g Aktivkohle entfärbt, diese abfiltriert und das Filtrat einer chromatographischen Eluierung mit 600 ml Dowex 1 x 2 (OH-Typ) unterworfen. 2'-Amino-2'-desoxykanamycin wurde vor dem Abtrennen von Kanamycin A eluiert. Die an 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin hochkonzentrierten Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und zu 3,2 g Produkt gefriergetrocknet. Das Rohprodukt wurde in 50 ml Wasser gelöst und die Lösung mit Amber lite CG-50 -Harz (Ammonium-Typ) behandelt zur Adsorption der Antibiotika.
Das Harz wurde wieder mit 0,1 bis 0,5 n wässerigem Ammoniak eluiert. Das als Nebenprodukt in geringer Menge vorhandene Kanamycin A wurde zuerst eluiert und dann das 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin separat als Einzelfraktion. Diese Einzelfraktion wurde kon zentriert und zu rohem 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin gefriergetrocknet. Durch Umkristallisieren aus Wasser-Dimethylformamid erhielt man 1,9 g 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin in Form von farblosen, nadelartigen Kristallen.
Beispiel 10
15 Liter flüssiges Kulturmedium gleicher Zusammen setzung wie in Beispiel 9, wurden mit der Mutante 3AG von Streptomyces kanamyceticus beimpft und dann unter
Belüftung und Rühren bei 28 "C bebrütet. Die sich in der
Kultur anreichernde Menge 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin erreichte ihr Maximum nach 6tägiger Brutzeit.
Die Kulturflüssigkeit wurde dann wie in Beispiel 9 be handelt, und ergab 2,2 g kristallines 2'-Amino-2'-desoxy-ka namycin.
Beispiel 11
15 Liter eines flüssigen Kulturmediums gleicher Zu sammensetzung wie in Beispiel 9 wurden mit der Mutante
Nr. 18-8 von Streptomyces kanamyceticus beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28 "C bebrütet. Die sich in der Kultur anreichernde Menge 2'-Amino-2'-desoxy-ka namycin erreichte ihr Maximum nach 7tägiger Brutzeit.
Die Kulturflüssigkeit wurde dann wie in Beispiel 9 be handelt und erbrachte etwa 2,2 g kristallines 2'-Amino-2' desoxy-kanamycin.
Beispiel 12
Das Verfahren nach Beispiel 9 wurde wiederholt unter
Verwendung der Mutante 19-2 von Streptomyces kana myceticus. Man erhielt ein ähnliches Resultat wie in Bei spiel 9. Ausbeute: 3,15 g kristallines 2'-Amino-2'-desoxy-ka namycin.
Vergleichs-Beispiel 13
In diesem Beispiel wurden eine Anzahl Versuche durchgeführt, um die unerwartete und vorteilhafte Wir kung bei Verwendung der Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 aufzuzeigen, die eine erhöhte Fähigkeit zur Er zeugung von 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin aufweisen, verglichen mit dem Elternstamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyceticus.
In diesen Versuchen wurden die Kultur des Eltern stammes 0-4-1 und der Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und
19-2 von Streptomyces kanamyceticus während 150 Stun den bei 28 "C, wie in Beispiel 9, durchgeführt, unter Ver wendung ähnlicher Fermentationsbehälter und der Kul turmedien derselben Zusammensetzung. Nach Abbruch der Kultur wurden die erhaltenen Kulturbrühen auf ihren
Gehalt an 2'-Amino-2'-desoxy-kanamycin und Kanamycin
A untersucht. Die Untersuchungsresultate sind in Tabelle
VII zusammengestellt.
Tabelle VII Ver- Stamm Gehalt an Gehalt an such 2'-Amino- Kanamycin A Nr. 2'-desoxy- (, < g/ml) kanamycin
Gcg/ml) 1 Elternstamm 26 2790
0-4-1 2 Mutante A-4-6 430 1970 3 Mutante 3AG 285 1785 4 Mutante 18-8 520 1900 5 Mutante 19-2 700 1690
Je 15 Liter der erhaltenen Kulturbrühen wurden wie in Beispiel 9 behandelt, so dass sich soviel 2'-Amino-2'-de- soxy-kanamycin und Kanamycin A als möglich daraus isolieren liess. Die Produktausbeuten sind in Tabelle VIII zusammengestellt.
Tabelle VIII Ver- Stamm Ausbeute von 2'- Ausbeute von such Amino-2'-desoxy- Kanamycin A Nr. kanamycin (g) (g)
1 Elternstamm 0,12 26,8
0-4-1 2 Mutante A-4-6 1,90 19,0 3 Mutante 3AG 1,20 15,8 4 Mutante 18-8 2,20 17,6 5 Mutante 19-2 3,15 16,1
Aus dem in Tabelle VIII zusammengestellten Resultat ist klar ersichtlich, dass den Mutanten A-4-6, 3AG, 18-8 und 19-2 die Fähigkeit eigen ist, 2'-Amino-2'-desoxy-kana mycin in merklich höherer Ausbeute zu erzeugen als der typische Elternstamm 0-4-1 von Streptomyces kanamyce ticus.
Die folgenden Präparationen 1 und 2 erläutern die Erzeugung der erwähnten Antibiotika NK-1001 und NK-1003, die als Zusatzmittel bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens dienen können.
Präparation 1
15 Liter eines Kulturmediums, das 2,0 Gewichtsprozent Stärke, 3,0 Gewichtsprozent Maltose, 3,0 Gewichts prozent Soyabohnenmehl, 1,0 Gewichtsprozent Natrium nitrat und 0,5 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurde mit dem typischen Stamm 0-4-1 von Streptomy ces kanamyceticus beimpft und unter Belüftung und Rüh ren bei 28 "C bebrütet. Nach 80stündiger Brutzeit fügte man dem Medium 30 g Streptidin zu und setzte das Brüten weitere 80 Stunden lang fort. Die sich im Medium an reichernde Menge von Antibiotikum NK-1001 erreichte ihr Maximum nach Beendigung dieser Brutperiode.
Die Filtration der Kulturflüssigkeit ergab 14 Liter Fil trat, die dann mit 4 Liter Amberlite IRC-50 (Ammonium Typ) behandelt wurden, um die Antibiotika auf diesem
Ionenaustauschharz zu adsorbieren. Das Harz wurde mit
0,5 n wässerigem Ammoniak eluiert und die aktiven Frak tionen des Eluates vereinigt und konzentriert. Das Kon zentrat wurde in 100 ml Wasser gelöst und mit 1 g Aktiv kohle 30 Minuten lang geschüttelt. Durch Filtrieren er hielt man eine farblose Lösung, die dann mit 2 Liter Am berlite CG-50 (Ammoniak-Typ) behandelt wurde. Das
Harz mit den daran adsorbierten Antibiotika wurde mit
0,3 n wässerigem Ammoniak eluiert.
Eine einzige Fraktion von Antibiotikum NK-1001 wurde vor der Trennung von
Kanamycin A isoliert Diese einzige Fraktion von Antibio tikum NK-1001 wurde konzentriert und ergab nach dem Gefriertrocknen 28,5 g eines rohen weissen Pulvers von Antibiotikum NK-1001.
Dieses rohe Pulver wurde in 12 ml Wasser gelöst und portionenweise 50 ml Methanol zugegeben, um Kristalle auszuscheiden. Nach dem Filtrieren und Trocknen erhielt man 17,4 g Antibiotikum NK-1001 in Form von weissen, nadelartigen Kristallen.
Nach der Elementaranalyse enthielt das Produkt 44,27 % C; 7,09 % H und 8,95 % N (gefunden) ohne Schwe fel, Halogene und Asche. Das Molekulargewicht des Produktes nach der Dampfdruckmethode wurde zu 492 bestimmt.
Präparation 2
15 Liter eines flüssigen Kulturmediums, das 2,0 Gewichtsprozent Stärke, 3,0 Gewichtsprozent Maltose, 3,0 Gewichtsprozent Soyabohnenmehl, 1,0 Gewichtsprozent Natriumnitrat und 0,5 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthielt, wurde mit dem typischen Stamm 0-4-1 von Stremptomyces kanamyceticus beimpft und unter Belüftung und Rühren bei 28 bebrütet. Nach 20stündiger Brutzeit fügte man 25 g Antibiotikum NK-1001 zu und setzte das Brüten unter Belüftung und Rühren fort. Nach 6tägiger Brutzeit erreichte die sich in der Kultur anreichernde Menge von Antibiotikum NK-1003 ihr Maximum.
Die Kulturflüssigkeit ergab nach dem Filtrieren 14 Liter Filtrat, das anschliessend mit 4 Liter Amberlite IRC-50 (Ammonium-Typ) behandelt wurde, um die Antibiotika auf dem Harz zu adsorbieren. Das Harz wurde anschliessend mit 0,5 n wässerigem Ammoniak eluiert und die aktiven Fraktionen des Eluates vereinigt und konzentriert. Das Konzentrat wurde in 100 ml Wasser gelöst und mit 1 g Aktivkohle zusammengeschüttelt. Die erhaltene entfärbte Lösung filtrierte man und behandelte sie mit 2 Liter Amberlite CG-50 (Ammonium-Typ). Das Harz mit den daran adsorbierten Antibiotika wurde mit Wasser gewaschen und dann mit 0,3 n wässerigem Ammoniak eluiert, um zuerst die Kanamycin A-Fraktion abzutrennen und dann eine Einzelfraktion vom Antibiotikum NK-1003 zu isolieren.
Diese Einzelfraktion von Antibiotikum NK-1003 wurde konzentriert und ergab nach dem Gefriertrocknen 11,3 g eines rohen Pulvers aus Antibiotikum NK-1003.
Durch Umkristallisieren dieses Pulvers aus Wasser Methanol und Trocknen erhielt man 7,5 g Antibiotikum NK-1003 in Form von weissen, nadelartigen Kristallen.
Nach der Elementaranalyse enthielt dieses Produkt 44,42 0/0 C, 7,81 % H und 13,11 % N (gefunden). Das nach der Dampfdruckmethode ermittelte Molekulargewicht des Produktes betrug 305 (im Produkt war ein Molekühl Methanol vom Umkristallisieren enthalten).