CH513401A

CH513401A - Mittel zum qualitativen Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung von Hydroperoxyden bzw. peroxydatisch wirksamen Substanzen und seine Verwendung

Info

Publication number: CH513401A
Application number: CH518870A
Authority: CH
Inventors: Nat Rey Hans-Georg Dr Rer; Hans Dr Phil Wielinger; Nat Rieckmann Peter Dr Rer
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1968-10-14
Filing date: 1970-04-08
Publication date: 1971-09-30

Description


  <B>Mittel zum qualitativen Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung von</B>  Hydroperoxyden bzw. peroxydatisch wirksamen Substanzen und seine  <B>Verwendung</B>    Gegenstand des Hauptpatentes Nr. 507 518 ist ein Mit  tel zum Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung von  a) Hydroperoxyden oder von Substanzen, die unter Frei  setzung von Hydroperoxyden reagieren oder b) Peroxy  dase oder anderen peroxydatisch wirksamen Substanzen    unter Ausnützung der Farbreaktion, welche a) und b) ge  gebenenfalls unter Einwirkung anderer Substanzen zu  sammen mit einem Chromogen eingehen.

   Als     Chromo-          gene    kommen im Hauptpatent die physiologisch unschäd  lichen Verbindungen der Formel I zur Anwendung  
EMI0001.0002     
    in der  R, eine niedere Alkylgruppe,  R2 Wasserstoff, eine Sulfogruppe oder eine     Alkalisulfo-          natgruppe,     R3 Wasserstoff, Chlor oder eine niedere Alkylgruppe,  X ein Schwefelatom, eine Vinylen- oder eine     Imino-          gruppe,    die gegebenenfalls durch einen niederen Alkylrest  oder Arylrest substituiert ist,  Y ein Stickstoffatom oder eine Methylidyngruppe, wel  che auch zusammen mit R3 einen durch R2 substituierten  Benzolring bilden kann,  bedeuten.

    In Ausgestaltung der dem Hauptpatent zugrundelie  genden Erfindung wurde nun gefunden, dass auch jene  Verbindungen der Formel 1, in denen X zusätzlich ein    Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen  substituiertes Kohlenstoffatom bedeutet, hervorragende  Eigenschaften als Chromogene besitzen.  



  Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein  Mittel zum Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung  von a) Hydroperoxyden oder von Substanzen, die unter  Freisetzung von Hydroperoxyden reagieren, oder von b)  Peroxydase oder peroxydatisch wirksamen Substanzen  unter Ausnützung der Farbreaktion, welche a) und b) ge  gebenenfalls unter Einwirkung anderer Substanzen zu  sammen mit einem Chromogen eingehen, wobei das Mit  tel a) oder b) und ein     Chromogen    enthält, dadurch ge  kennzeichnet, dass es als     Chromogen    mindestens eine  Verbindung der Formel I'    
EMI0002.0000     
    in welcher  R1 eine niedere Alkylgruppe,  R2 Wasserstoff, eine Sulfogruppe oder eine     Alkalisulfo-          natgruppe,     R3 Wasserstoff,

   Halogen oder eine niedere Alkyl  gruppe,  Y ein Stickstoffatom oder eine Methylidyngruppe, wel  che auch zusammen mit R3 einen durch R2 substituierten  Benzolring bilden kann,  einer der Reste X' ein Schwefelatom, eine Vinylengruppe,  eine gegebenenfalls durch Niederalkyl oder Aryl substitu  ierte Iminogruppe, ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei  niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffatom be  deutet, während der andere Rest X' ein Sauerstoffatom  oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes  Kohlenstoffatom darstellt, enthält.  



  Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwen  dung des Mittels zum Nachweis von peroxydatisch wirk  samen Substanzen.  



  Die Bestimmung von Hydroperoxyden mit dem     erfin-          dungsgemässen    Mittel ist vorzugsweise für gekoppelte  und ungekoppelte Enzymreaktionen geeignet, wie z B. zur  Bestimmung von Glucose, Galaktose, Aminosäuren, Harn  säure. Peroxyden, Hämoglobin, Peroxydase oder anderen  peroxydatisch wirksamen Substanzen sowie Enzymaktivi  täten. Die routinemässige Bestimmung von derartigen  Substraten ist wegen ihrer elementaren Wichtigkeit aus  der klinischen Chemie und aus der Lebensmittel-Chemie  nicht mehr wegzudenken. Bei der Bestimmung von Glu  cose beispielsweise wird diese von Glucoseoxydase zu  Gluconsäure oxydiert, wobei der Luftsauerstoff zu Was  serstoffperoxyd reduziert wird.

   Das Wasserstoffperoxyd  oxydiert dann mittels Peroxydase oder einer     peroxyda-          tisch    wirkenden Substanz den erfindungsgemäss verwen  deten Indikator zum entsprechenden Farbstoff.  



  Die Auswertung erfolgt beispielsweise durch optische  Ausmessung im Spektralphotometer oder bei Verwen  dung von Testpapierstreifen bzw. Testfilmen durch Ver  gleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zusam  mensetzung bzw. Farbtafeln. Besonders vorteilhafte und  gut abgestufte Farbänderungen erhält man überraschen  derweise, wenn man die Substanzen I' zusätzlich mit Re  duktionsmitteln der Formel II  
EMI0002.0007     
    in welcher  Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern,  V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe,  V' Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte  oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe,  W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder  Sulfogruppe und  W' Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-,  Aryl-, Carboxy- oder Sulfogruppe,  oder mit deren Alkalisalzen versetzt.  



  Diese Substanzen, die als  Modifier  wirken, geben für  sich alleine keine oder nur sehr unspezifische Verfärbun  gen und sind deshalb als Indikatoren im allgemeinen nicht  geeignet. Zusammen mit den Substanzen der Formel I' er  hält man aber besonders deutliche und gut abgestufte  Farbumschläge. Bevorzugte Ausführungsformen der vor  liegenden Erfindung enthalten daher eine Kombination  der Substanzen 1' und II als Indikator.  



  Selbstverständlich lässt sich umgekehrt das     erfindungs-          gemässe    Mittel auch zur Bestimmung der Chromogene I'  sowie der Modifier 1I mit Hilfe von Hydroperoxyden und  einer peroxydatisch wirksamen Substanz benutzen, was  beider Produktionsüberwachung dieser Diagnostika sehr  nützlich ist.  



  Die Herstellung von Verbindungen I' kann in an sich  bekannter Weise durch Umsetzung von 2-Halogen- oder  Mercapto-Quartärsalzen mit einem entsprechenden     N-alky-          lierten    Hydrazonsalz unter Zugabe eines Amins, vorzugs  weise von Triäthylamin in einem polaren Lösungsmittel  (z. B. Methanol) bei einer Temperatur von 15 bis 100  C  erfolgen. Die Reaktion ist je nach Reaktivität der einzel  nen Komponenten innerhalb von 10 Minuten bis 2 Stun  den beendet (S. Hünig et a1., Liebigs Ann. Chem. 676, S.  32-65, 1964).  



  Die Darstellung der als Ausgangsprodukte verwende  ten Hydrazone sowie der N-quaternisierten Salze kann  analog den von S. Hünig (Ann. Chem. 609, S. 160-180  119571) und H. Balli (Liebigs Ann. Chem. 647, S. 1-8 t19611)  angegebenen Vorschriften erfolgen. Die Verbindungen I'  können erfindungsgemäss sowohl für den optischen Test  in der Küvette als auch auf Reagenzpapieren und in Rea  genzfolien allein oder zusammen mit den  Modifiern  der  Formel 11 eingesetzt werden.  



  Das erfindungsgemässe Mittel sowie ihre Verwendung  werden anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:  BEISPIEL 1       Reagenzfilm    zum     Nchweis    von Glucose  45 g     Propiofan    (BASF), 35 g einer Lösung von 37 g     Al-          gipon    in 2 Liter eines 0,5     molaren    Phosphat- oder     Citratpuf     fers vom     pH    5,7, 1 g     Texapon    P (Fa. Henkel     Düsseldorf),         10 ml Wasser, 0,075 g Peroxidase und 0,15 g Glucoseoxi  dase werden zu einem homogenen Brei verrührt.

   Zu die  ser Mischung gibt man 6 ml einer maximal 5 %igen     met-          hanolischen    Lösung eines der nachstehend aufgeführten  Indikatoren, sowie gewünschtenfalls einen der Modifier  der Formel II, welcher in den nachfolgend angeführten  Lösungsmitteln gelöst und zu der Indikatormischung gege  ben wird. Mit den so hergestellten Mischungen, in denen  bis zu 0,3 % Indikator enthalten sind, werden Folien in  einer Schichtdicke von 300     p,    beschichtet und getrocknet.

    Auf einen derart hergestellten Teststreifen bringt man  einen Tropfen glucosehaltigen Blutes, lässt diesen einige  Zeit einwirken und erhält nach dem Abwischen des     Trop-          fens    die in der Tabelle I angegebenen Farbreaktionen,    welche je nach Glucose-Konzentrationen mehr oder weni  ger stark abgestuft sind.  



  Indikatoren der Formel I':  A 2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzoxazolon(2)]  B 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[1-äthylpyridon(2)]-azin  C 1[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin  D 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[1-äthylchinolinon(2)-azin  E     1-[l-Äthyl-3,3-dimethyl-indolinon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon-          .    (2)]-azin  
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    Tabelle <SEP> I
<tb>  Indi- <SEP> Modifiersubstanzen <SEP> Modifier- <SEP> gelöst <SEP> Farb  kator <SEP> II <SEP> Konzentra- <SEP> in <SEP> reaktionen
<tb>  I' <SEP> tion <SEP> <B>%</B>
<tb>  A <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> flieder  farben
<tb>  A <SEP> (1-Amino-naphthol-8)-2,4  disulfonsäure <SEP> 0,2 <SEP> Wasser <SEP> grün
<tb>  A <SEP> Naphthylamin(1)-sulfonsäure(6) <SEP> 0,

  05 <SEP> _nNaOH <SEP> rosa
<tb>  50
<tb>  A <SEP> p-Aminosalicyl-säure <SEP> 0,1 <SEP> Methanol <SEP> orange
<tb>  A <SEP> m-Aminophenol <SEP> 0,007 <SEP> Wasser <SEP> orange
<tb>  B <SEP> o-Aminophenol-p-sulfonsäure <SEP> 0,2 <SEP> Wasser <SEP> blau
<tb>  B <SEP> (1-Amino-naphthol-8)-2,4  disulfonsäure <SEP> 0,2 <SEP> Wasser <SEP> grün
<tb>  B <SEP> p-Aminosalicylsäure <SEP> 0,1 <SEP> Methanol <SEP> rosa
<tb>  B <SEP> m-Aminophenol <SEP> 0,007 <SEP> Wasser <SEP> rosa
<tb>  B <SEP> p-Phenetidin <SEP> 0,05 <SEP> Methanol <SEP> rotbraun
<tb>  C <SEP> Naphthylamin(1)-sulfonsäure(6) <SEP> 0,05 <SEP> _nNaOH <SEP> fleisch  50 <SEP> farben
<tb>  C <SEP> Napthylamin(1)-sulfonsäure(8) <SEP> 0,1 <SEP> Dimethyl- <SEP> rosa  formamid <SEP> violett
<tb>  C <SEP> p-Amino-salicylsäure <SEP> 0,1 <SEP> Methanol <SEP> orange
<tb>  D <SEP> o-Aminophenol-p-sulfonsäure <SEP> 0,

  2 <SEP> Wasser <SEP> violett
<tb>  D <SEP> (1-Amino-naphthol-8)-2,4  disulfonsäure <SEP> 0,2 <SEP> Wasser <SEP> grün
<tb>  D <SEP> p-Aminosalicylsäure <SEP> 0,1 <SEP> Methanol <SEP> rosa
<tb>  E <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> rot
<tb>  E <SEP> p-Aminosalicylsäure <SEP> 0,1 <SEP> Methanol <SEP> flieder  farben
<tb>  E <SEP> m-Aminophenol <SEP> 0,007 <SEP> Wasser <SEP> violett
<tb>  E <SEP> (1-Aminoaphthol-8)-2,4- <SEP> hellgrün  disulfonsäure <SEP> 0,2 <SEP> Wasser <SEP> graugrün       BEISPIEL 2  Hochempfindlicher Nachweis von Wasserstoffperoxid  in Flüssigkeiten.  



  1 ml einer 0,2%igen methanolischen Lösung von       1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon-(2)]-2-[3-äthylbenzthiazo-          lon(2)-1-azon,    1 ml einer 0,1%igen methanolischen Lö  sung von p-Aminosalicylsäure, 0,05 ml einer 1%igen Lö-    sung von Peroxidase in einem 0,1 molaren Phosphatpuffer  vom     pH    5,7 und 0,05 ml einer Lösung von Wasserstoffper  oxid werden zusammen     pipettiert,    umgerührt und bei  einer Wellenlänge von 530 nm gemessen. Die Wasser  stoffperoxid-Konzentration wird mit Hilfe einer vorher  aufgestellten     Eichkurve    bestimmt.      BEISPIEL 3  Nachweis von Glucose im Harn  Ein Filterpapier (2316 der Fa.

   Schleicher  &  Schüll)  wird mit einer Lösung von 75 mg Peroxidase, 143 mg Glu  coseoxidase und 0,25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düssel  dorf) in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH  5,6 imprägniert und getrocknet. Das in dieser Weise im  prägnierte Papier wird anschliessend in eine Lösung von  0,2 g     1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[1-äthylchinolinon(2)]-          azin    und 0,1 g p-Aminosalicylsäure in 100 ml Methanol ge  taucht und getrocknet. Beim Benetzen eines Streifens des  so hergestellten Reagenzpapieres mit Harn, welcher pa  thologische Glucosemengen enthält, verfärbt sich dieser  je nach Glucosekonzentration verschieden stark rotviolett.    BEISPIEL 4  Nachweis von Blut in Körperflüssigkeiten  Ein Filterpapier (23 S der Fa.

   Schleicher  &  Schüll)  wird mit einer Lösung von 0,25 ml Texapon P (Fa. Hen  kel, Düsseldorf) und 100 mg Natriumalginat in 100 ml  eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 5,6 impräg  niert und getrocknet. Das so hergestellte Papier wird mit  einer Lösung von 0,2 g     1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[1-ät-          hylchinolinon(2)]-azin    und 0,1 g p-Aminosalicylsäure in 100  ml Methanol imprägniert und getrocknet. Bringt man auf  ein so hergestelltes Reagenzpapier einen Tropfen einer  Körperflüssigkeit, welche Blut enthält, und tropft     an-          schliessend    3 %iges Wasserstoffperoxid auf das Papier, so  färbt es sich noch bei einer Blutkonzentration von  1:50 000 rotviolett.

      BEISPIEL 5  Nachweis von Hydroperoxiden in Flüssigkeiten  Ein Filterpapier (2316 der Fa. Schleicher  &  Schüll)  wird mit einer Lösung von 40 mg Peroxidase und 0,25 ml  Texap n P (Fa. Henkel, Düsseldorf) in 100 ml eines 0,1. mo  laren Phosphatpuffers vom pH 5,6 imprägniert und ge  trocknet. Anschliessend wird das so vorbereitete Papier  mit einer kalt gesättigten methanolischen Lösung von  1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin  imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so herge  stelltes Reagenzpapier Lösungen von Wasserstoffperoxid  in verschiedener Konzentration, so färben sich die Pa  piere je nach Wasserstoffperoxid-Konzentration verschie  den stark grünblau. Die untere Nachweisgrenze liegt bei  0,01y Wasserstoffperoxid/ml.  



  BEISPIEL 6  Nachweis von Glucose in Lösung  1 ml einer methanolischen Lösung, welche eine der  nachstehend aufgeführten Indikatorverbindungen I' je  nach Löslichkeit bis zu einer Konzentration von 1     %    ent  hält, wird mit 1 ml einer Lösung von 150 mg Glucoseoxi  dase und 75 mg Peroxidase in 100 ml eines 0,1 molaren  Phosphatpuffers von pH 5,6 und 1 ml einer Glucoselösung  vereinigt. Man erhält die in der Tabelle II angegebenen  Farbreaktionen. Als Modifier wird jeweils 0,1 ml einer '1  %igen methanolischen Lösung von p-Aminosalicylsäure  zugegeben.

    
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    Tabelle <SEP> 11
<tb>  Indikator <SEP> l' <SEP> Fp. <SEP>  C <SEP> Reaktionsfarbe
<tb>  ' <SEP> ohne <SEP> mit <SEP> Modifier
<tb>  2,2'-Azino-di-[3-äthylbenz  oxazolon(2)] <SEP> 216-217 <SEP> blau <SEP> rotbraun
<tb>  1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]  2-[1-äthylpyridon(2)]-azin <SEP> 145-146 <SEP> violett <SEP> rot
<tb>  1-13-Äthylbenzoxazolon(2)1  2-[1-äthylchinolinön(2)1-azin <SEP> 199 <SEP> violett <SEP> rot
<tb>  1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]  2-[3-äthylbenzthiazolon(2)1-azin <SEP> 193-194 <SEP> blau <SEP> rot
<tb>  1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]  2-[1,3-diäthylbenzimidazolon(2)]-azin <SEP> 215-216 <SEP> violett <SEP> braunorange
<tb>  1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-11  äthyl-6-chlor-pyridon(2)]-azin <SEP> 145 <SEP> violett <SEP> rot
<tb>  1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)]  2-[3-äthylbenz-thiazolon(2)

  ]-azin <SEP> 208-209 <SEP> rotbraun <SEP> rotviolett
<tb>  1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)]  2-[3-methylbenzthiazolon(2)]-azin <SEP> - <SEP> rotbraun <SEP> rotviolett
<tb>  1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)]  2-[-äthylchinolinon(2)]-azin <SEP> 199 <SEP> rotorange <SEP> braunorange
<tb>  2,2'-Azino-di[3-äthylbenzoxazolon  2-sulfonsäure-6] <SEP> 258-260 <SEP> blau <SEP> rotbraun
<tb>  2,2'-Azino-di[3-äthylbenzoxazolon- <SEP> [Zers.]
<tb>  2-ammoniumsulfonat-6] <SEP> 300 <SEP> [Zers.] <SEP> blau <SEP> rotbraun
<tb>  1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)]- <SEP> 165 <SEP> rot- <SEP> hell  2-[1-äthylpyridon(2)]-azin <SEP> violett <SEP> braun
<tb>  1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)]- <SEP> 146 <SEP> blau- <SEP> hell  241-äthyl6-chlorpyridon(2)1-azin <SEP> violett <SEP> braun
<tb>  1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)]- <SEP> 177 <SEP> braun- <SEP> braun  241,

  3-diäthylbenzimidazolon(2)1-azin <SEP> orange <SEP> orange
<tb>  1-[1,3,3-Trimethylindolinon(2)]  2-[1-phenyl-3-methyl-4-äthyl-1,2,4  triazolon(5)1-azin <SEP> 244 <SEP> grün <SEP> braun
<tb>  1-[1,3,3-Trimethylindolinon(2)]-2  [3-äthylbenzoxazolon(2)]-azin <SEP> 225 <SEP> grün <SEP> blaugrau
<tb>  143-Äthylbenzoxazolon(2)1-2-11-phenyl- <SEP>   3-methyl-4-äthyl-1,2;4-triazolon(5)1-azin <SEP> 227 <SEP> blau. <SEP> - <SEP> rot

Claims

PATENTANSPRUCH I Mittel zum Nachweis bzw. zur quantitativen Bestim mung von a) Hydroperoxyden oder von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxyden reagieren, oder von b) Peroxydase oder peroxydatisch wirksamen Sub stanzen unter Ausnützung der Farbreaktion, welche a) und b) gegebenenfalls unter Einwirkung anderer Substan zen zusammen mit einem Chromogen eingehen, wobei das Mittel a) oder b) und ein Chromogen enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es als Chromogen mindestens eine Verbindung der Formel I' EMI0005.0000 in welcher R, eine niedere Alkylgruppe, R2 Wasserstoff, eine Sulfogruppe oder eine Alkalisulfo- natgruppe, R3 Wasserstoff, Halogen oder eine niedere Alkyl gruppe, Y ein Stickstoffatom oder eine Methylidyngruppe,

wel che auch zusammen mit R3 einen durch R2 substituierten Benzolring bilden kann, einer der Reste X' ein Schwefelatom, eine Vinylen- gruppe, eine gegebenenfalls durch Niederalkyl oder Aryl substituierte Iminogruppe, ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoff atom bedeutet, während der andere Rest X' ein Sauerstoff atom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substitu iertes Kohlenstoffatom darstellt, enthält. UNTERANSPRUCH 1.

Mittel nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeich net, dass es zusätzlich mindestens eine Verbindung der Formel<B>11</B> EMI0005.0005 in welcher Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern, V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe, V Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe, W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfogruppe und W Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfogruppe, bedeuten, sowie gegebenenfalls deren Alkalisalze, ent hält. PATENTANSPRUCH II Verwendung des Mittels nach Patentanspruch I zum Nachweis von peroxydatisch wirksamen Substanzen.

UNTERANSPRUCH 2. VerwendÜng nach Patentanspruch I1, dadurch ge kennzeichnet, dass die peroxydatisch wirksame Substanz Hämoglobin ist.