CH513974A

CH513974A - Verfahren zur Herstellung einer Mischung der Antibiotika Quintomycin A,B,C und D

Info

Publication number: CH513974A
Application number: CH928568A
Authority: CH
Inventors: Munakata Katsura; Oda Takeshi; Mori Toshito; Ito Hisakatu
Original assignee: Kowa Co
Priority date: 1967-06-21
Filing date: 1968-06-21
Publication date: 1971-10-15
Also published as: DE1767835A1; MY7300394A; AT280474B; NL146532B; CS158620B2; DK118071B; FR8296M; NO124215B; BE716989A; NL6808802A; SE361326B; GB1225047A; ES355239A1

Description

Verfahren zur Herstellung einer Mischung der Antibiotika Quintomycin A,
B, C und D
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung der Antibiotika Quintomycin A, B, C und D; dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces lividus oder dessen Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthaltenden Medium züchtet und hernach die Antibiotika aus der Kulturbrühe gewinnt.

Der oben genannte neue Pilz wurde unter dem Namen Nr. 2230-N1-Stamm im Fermentation Laboratory of Technical Institute, 2, 5, 4-chome, Inage-Higashi, Chiba-shi, Japan mit der Hinterlegungsnummer von No. 50 FLTI hinterlegt. Derselbe Stamm wurde später unter dem Namen Streptomyces lividus in der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21178 hinterlegt.

Die oben genannte, erfindungsgemäss erzeugte antibiotische Substanz wurde zuerst als Nr. 2230-Substanz , und erst später Quintomycin benannt. Es enthält eine neue antibiotische Substanz, das Quintomycit-A, ausgedrückt durch die Molekularformel C29H55N5O19, das Pentahy drochlorid mit einer spezifischen Rotation von [a]n22 von +59 ; eine neue antibiotische Substanz Quintomycin-B ausgedrückt durch die Molekularformel C29H55N5O18, dessen Pentahydrochlorid eine spezifische Rotation von la]D22 von +50 besitzt;

und eine neue antibiotische Substanz Quintomycin-D ausgedrückt durch die Molekularformel C23H4sNsOI3 dessen Pentahydrochlorid eine spezifische Rotation von [ca," von +36 aufweist, und auch Quintomycin-C, das als ein Synonym für eine bekannte antibiotische Substanz das Paromomycin , erzeugt durch Streptomyces rimosus forma paromomycinus, betrachtet wird.

Die oben genannten drei antibiotischen Substanzen sind neue Substanzen.

Die Hauptbestandteile der erfindungsgemäss erzeugten antibiotischen Substanz Quintomycin sind somit neue antibiotische Substanzen, und zwar das Quintomycin-B und Quintomycin-A. Das erfindungsgemäss erzeugte Quintomycin, welches diese neuen Substanzen, insbesondere Quintomycin-B, enthält, weist eine hohe biologische Wirksamkeit gegenüber Pseudomonas aeruginosa auf und besitzt überdies eine überaus niedrige Toxizität gegenüber Warmblütlern. Bekannte antibiotische Substanzen haben zwar eine hohe biologische Wirksamkeit gegenüber dem oben genannten Bakterium, sind aber nicht befriedigend in bezug auf ihr toxisches Verhalten. Der erfindungsgemäss verwendete Streptomyces lividus besitzt die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:
1.

Morphologie
Streptomyces lividus n.s.p- kommt auf einem synthetischen Medium in Form eines hell-grauen Wachstums zum Vorschein, das allmählich dunkel-blau bis schwarz wird. Es wird kein lösliches Pigment gebildet, oder auf einer sehr seltenen Substanz, kommt es zu einem löslichen Pigment einer hell-rosa- oder einer Himbeerfarbe. Aeriale hyphen sind kurz und unregelmässig verzweigt in einer einzigen Form. Die sich gebildeten Sporophoren sind im allgemeinen geradlinig, und in seltenen Fällen gekrümmte Schlingen (Gewinde oder Spiralen werden nicht gebildet). Drei bis zehn Sporen erscheinen am Ende eines Sporophoren.

Die Struktur der Sporen-Oberfläche wurde durch ein Elektronen-Mikroskop beobachtet, und sie ist als oval oder el- lipsoidal (0,2 x 0,3 - 0,5u) festgestellt.

II. Bakterienkultur-Charakteristiken der verschiedenen
Medien: (Synthetische Medien) W = Wachstum, M = Luftmycel, L = lösliches Pigment Glyzerin-Czapek's-Agar W: mässig, hellgrau bis dunkelblau oder schwarz
M: mässig, samtweich, hellgrau bis dunkelblau oder schwarz
L: keine, selten hellrosa oder erdbeerfarbig Glucose-asparagin-agar W: mässig, creme-farbig bis dunkelblau oder kohlengrau
M: mässig, samtweich, hell-grau bis dunkelblau
L: keine Calciummalat-Agar W: mässig, weiss bis dunkelblau
M: sehr dürftig, weiss oder hellblau
L: keine (Organisches Medium) Nähragar W: gut, faltig, meistens gelb, braun oder schwarz
M: dürftig, hellgrau
L: keine Stärke-Agar W: gut, hellgrau bis dunkelblau oder schwarz M: samtweich, weiss oder hellgrau
L: keine Kartoffelglucose-Agar W:

mässig, dunkelblau oder dunkelgrau, leicht in das Medium eindringend
M: dürftig, hellgrau
L: keine, schwach hellrosa Peptonglucose-Agar W: gut, dunkelblau oder dunkelgrau
M: dürftig, weiss bis grau
L: ziegelrot Tyrosin-Agar W: mässig, hellbraun bis dunkelgrau
M: schwach weiss
L: keine oder hellbraun Gelatine durchlöchert W: gut, weiss oder hellgrau
M: keine
L: keine Lackmusmilch W: mässig, creme-farbig an der Oberfläche
M: keine
L: kein Wechsel
111. Biochemische Eigenschaften: Reaktion
Chromogen-bildung negativ
Tyrosinase negativ
Nitrat-Reduktion positiv
Cellulose-Zersetzung negativ
Milchgerinnung negativ
Milchpeptonisation positiv
Stärkehydrolyse positiv (stark)
Gelatin-Verflüssigung positiv (beträchtlich)
IV.

Verwendung von Kohlenstoffquellen:
Kohlenstoffquelle Verwendung
D-Xylose
L-Arabinose
D-Glucose ++
D-Galactose ++
D-Fructose +
D-Lactose
D-Maltose
Sucrose
D-Raffinose +
Trehalose ++
Inosit ++
Sorbit ' ++
D-Mannit ++
Dextrin +
Stärke +
Rhamnose
Inulin
Dulcit
Kohlenstoffquelle Verwendung
Glycerin ++
Natrium-citrat +
Natrium-acetat +
Calcium-malat + Durch Vergleich mit der im Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe, angeführten Klassifikation wurde festgestellt, dass der neue erfindungsgemäss verwendete Pilz dem S. gedanensis (S. ged.) in folgender Beziehung ähnlich ist: Psychrophiles bis mesophiles Wachstum; im organischen Medium wird kein lösliches Pigment erzeugt; starke proteolytische Wirkung; Wachstum auf synthetischen Medien dunkel bis schwarz bis meistens blauschwarz; und ein Serien-Mycel weiss bis grau. S.

ged. zeigt dagegen in einem Kartoffelmedium ein cremegefärbtes bis bräunliches Wachstum und erzeugt kein Luftmycel und lösliches Pigment, währenddem S. lividus (S. liv.) ein dunkelgraues oder gräulich-schwarzes Wachstum mit einem dürftigen Luftmycel zeigt, und gewöhnlich erzeugt ein lösliches Pigment, obschon in manchen seltenen Fällen eine hellrosa Farbe aufweist. Auf einem Stärkemedium führt S. ged. zu einem gelben bis creme-gefärbten Wachstum, und S. liv. weist ein hellgraues bis schwarzblaues oder schwarzes Wachstum auf. S. ged. verhält sich negativ bei der Milchpeptonisation und Nitratreduktion, währenddem S. liv. in beiden Fällen ein positives Verhalten zeigt.

Als Stamm mit einem psychrophilen bis mesophilen Wachstum und welches kein lösliches Pigment im organischen Medium erzeugt, kann genannt werden S. griseolus (S. gris.); dieses zeigt ein mausgraues Wachstum an synthetischem Medium, erzeugt ein weisses bis graues Luftmycel und bildet gerade Sporophoren. Zu diesem obigen Stamm gehört auch S. faciculus, welches besenförmige Sporophoren. Ein Vergleich dieser beiden Stämme mit dem erfindungsgemäss verwendeten S. liv. hat folgendes ergeben.

In einem Nähragar zeigt S. gris. ein bräunliches Wachstum mit einer weichen Oberfläche, erzeugt ein tiefes mattgraues Luftmycel und erzeugt kein lösliches Pigment, währenddem S. liv. ein faltenförmiges feuchtes gelbbraunes Wachstum zeigt, und erzeugt kein lösliches Pigment mit fast keinem Luftmycel In einem Kartoffelmedium zeigt S.

gris. ein gelblich weisses bis schwarzes Wachstum, bildet ein Luftmycel einer weissgrauen Farbe und erzeugt ein braunes bis schwarzes lösliches Pigment, währenddem S.

liv. ein dunkelgraues oder gräulichschwarzes Wachstum aufweist, nur ein dürftiges Luftmycel bildet und erzeugt kein lösliches Pigment, obschon zeitweise eine hellrosa Farbe aufweist. In Gelatin gibt S. gris. ein gelbliches flokkiges Häutchen und ein Sediment und bildet ein weisses Luftmycel und ein schwach braunes Medium, währenddem S. liv. ein weisses oder hellgraues Wachstum erzeugt, bildet dagegen kein Luftmycel und lösliches Pigment. In Milch zeigt S. gris. ein Wachstum eines kräftig roten Häutchens und führt zu einer langsamen Koagulation, währenddem S. Iiv. ein gelblich weisses Wachstum an der Oberfläche zeigt, und nicht koaguliert.

S. fasciculus (S. fasc.) zeigt ein gutes Lichenoid-Wachstum und bildet ein Luftmycel, das farblos ist und mit einem dunkelgrauen, pulverigen oder samtweichen Überzug bedeckt ist, währenddem S. liv. ein hellgraues bis dunkelblaues oder schwarzes Wachstum zeigt und ein weisses oder ein weissgraues Luftmycel bildet, das kurz und nicht so reichlich ist. In einem Milchmedium ist S.

fasc. positiv sowohl gegenüber der Koagulation als auch der Peptonisation und weist ein gutes Wachstum auf Cellu lose auf, währenddem S. liv. positiv ist nur gegenüber der Peptonisation im Milchmedium und zeigt kein Wachstum auf einem Cellulosemedium auf.

Beim Vergleich von charakteristischen Eigenschaften verschiedener Reihen von Streptomyces im Handbuch von S.A. Waksman The Actinomycetes , Band 2, wurde nichts vorgefunden, das auf S. liv. hinweist. S. intermedius, S. parvullus, S. craterifer, (S. crat.) und S. cellulose gehören zu den Reihen von Cinereus, können aber betrachtet werden als ähnlich zum S. liv. insofern, als Spiralbildung + oder - ist, Melanin ist - und ein Luftmycel ist weiss bis grau.

In einem Nähragar, S. crat. zeigt ein farbloses Wachstum und in einem Stärkeagar zeigt es ein Auswachsen der Kultur, ein dünnes und farbloses Wachstum bildet kein Luftmycel. In einem Kartoffelmedium S. crat. zeigt ein gelblich weisses Wachstum und bildet ein weisses bis mäusegraues Luftmycel. S. liv. zeigt andererseits in einem Nähragar ein gutes, faltiges feuchtes gelbbraunes Wachstum, oder ein gutes Wachstum von hellgrau bis dunkelblau oder schwarz und bildet ein samtartiges, weisses oder hellgraues Luftmycel in Stärkeagar, und ein dunkelgraues Wachstum in einem Kartoffelmedium.

S.Cellulose wächst gut auf Cellulose und koaguliert schnell Milch in Cellulose und zeigt ein gelbes oder zitronengelbes Wachstum in einem synthetischen Medium.

Diese Eigenschaften unterscheiden es vom S. liv.

S. parvullus unterscheidet sich vom S. liv. darin, dass es Sporophoren-Drehungen in langen, geschlossenen Spiralen bildet, es zeigt ein gelbes Wachstum in synthetischem Medium, erzeugt ein gelbes lösliches Pigment in Gelatin, erzeugt ein braunes lösliches Pigment und ein reichliches graues Luftmycel in Milch und führt zu einer sehr langsamen Peptonisation.

Das erfindungsgemäss verwendete S. liv. unterscheidet sich von S. intermedius darin, dass das letztere ein gutes Wachstum von olivgrün in Cellulose zeigt, ein gefaltetes Wachstum von braun bis grünbraun in einem Kartoffelmedium grünbraunes Wachstum von olivgrün in Cellulose zeigt, ein gefaltetes Wachstum von braun bis grünbraun in einem Kartoffelmedium und erzeugt ein grünbraunes lösliches Pigment und zeigt eine langsame Verflüssigung in Gelatin und erzeugt ein grünlich braunes lösliches Pigment.

Ausgenommen S. griseolus, S. cellulose und S. parvullus erzeugen die oben genannten bekannten Stämme keine antibiotische Substanz.

Es werden jetzt Angaben angeführt über Pilze des Genus Streptomyces, welche antibiotische Substanzen erzeugen, die zu der Aminocyclitol-Gruppe gehören. S. fradiae zeigt gemäss Waksman ein dünnes, weiches, farbloses, manchmal orange-gelbes Substratwachstum auf synthetischem Medium und bildet ein Luftmycel, welches schwach rot, meermuschel-rot oder lachsrot gefärbt ist.

Dieses unterscheidet das obige Streptomyces vom erfindungsgemäss verwendeten S. liv. Die Waksman'sche Klassifikation zeigt auch an, dass S. albogriseolus ein rotes bis purpurrötliches Wachstum auf einem Kartoffelmedium zeigt, und die Sporophoren erzeugen Spiralen. Infolgedessen unterscheidet es vom erfindungsgemäss verwendeten S. liv. S. rimosus, f. paromomyceticus, S. christomyceticus, S. kanamyceticus und S. pulveraceus zeigen sämtliche ein gelbes oder gelbliches weisses bis braunes Wachstum und weisen kein dunkelgraues bis dunkelblaues oder blauschwarzes Wachstum auf wie dies das erfindungsgemäss vei wendete S. Oliv. tut.

Aus dem oben angeführten folgt das der oben angeführte, das Antibiotikum Quintomycin erzeugender Stamm als ein neuer Stamm der zur Gattung Streptomyces gehört, identifiziert wurde.

Der Vollständigkeit halber werden in den weiter unten angeführten Absätzen I bis VI die Einzelheiten von microbiologischen Eigenschaften von zur Gattung Streptomyces gehörenden Stämmen angeführt, und welche Gattung antibiotische Substanzen erzeugen, die wiederum zur Aminocyclitolgruppe gehören. Die microbiologischen Eigenschaften von Stämmen die zu anderen Gattungen gehören und welche antibiotischen Substanzen, die zur Aminocyclitolgruppe gehören erzeugen, sind gleichfalls in den Absätzen VII und VIII angegeben.

1.

Stamm Streptomyces rimosus forma paromomycinus Antagonistische Eigen- Paromomycin schaften Morphologie Sporophoren, bildet dichte
Büschel von Spiralen; das Luft mycel ist kurz und gerade, aber selten Spiralförmig Glycerin-Asparagin- W: gelblich weiss gefärbt, Agar durch Altern wird es braun bis orange-braun gefärbt.

M: weiss
L: keins Calcium-Malat-Agar W: gelblich braun
M: weiss
L: keins Nähr-Agar W: hellgelblich weiss, gefärbt, bis gelblich braun
M: keins
L: keins Stärke-Agar W: gelblich weiss gefärbt, mit dunkler braunen Zentren
M: abwesend oder weiss
L: keins Kartoffel-Agar W: Lichenoid, gelblich weiss gefärbt bis rötlich braun
M: weiss bis grau bis dunkelbraun
L: gelblich braun Gelatin W: gelblich weiss gefärbt bis bräunlich
M: weiss
L: keins Milch W: schweres Oberflächenhäutchen, gelblich weiss gefärbt bis gelblich
M: grauweiss Nitratreduktion positiv Cellulose Zersetzung negativ Milchkoagulierung negativ Milchpeptonisation positiv Hydrolyse von Stärke positiv (begrenzt) Gelatineverflüssigung positiv (langsam) II.

Stamm Streptomyces kanamyceticus Antagonistische Eigen- Kanamycin schaften Morphologie Das Luftmycel entwickelt aus dem untergetauchten Mycel auf ein wenig Medium und seine
Verzweigung ist nicht reich- lich und es trägt die Sporo phoren an seinem Ende. Spira len und Windungen wurden im allgemeinen nicht beobachtet.

Glycerin-Czapek's-Agar W: farblos, später in zitro nengelb wechselnd
M: weiss bis gelb und gelegent lich grünlich oder schwach rötlich gefärbt
L: gelegentlich schwach braun Glucose-Asparagin-AgarW: farblos bis gelb mit schwachem Rötlichweiss
M: dürftig, weiss, schwach rötlich weiss, grünlichgelb oder gelb
L: gelegentlich schwachbraun Calcium-Malat-Agar W: gelb
W: orange
M: weissgelb Nähragar W: gelblich weiss
M: abwesend oder weiss
L: keines Kartoffelagar W: faltig, schwach gelblich braun bis gelb
M: dürftig, weiss
L: keines Nitratreduktion positiv Milchkoagulation zweifelhaft Milchpeptonisation zweifelhaft Stärke-Hydrolyse positiv Gelatin-Verflüssigung positiv
111.

Stamm Streptomyces fradiae Antagonistische Eigen- Neomycin schaften Morphologie Monopodial verzweigte Sporopho ren gerade oder flexibel, aber keine wahren Spiralen. Auf ge wissen Medien werden Spiralen gebildet.

Glucose-Asparagin-AgarW: beschränkt, glänzend, leder gelb gefärbt, lichenoiderk
Rand
M: late, meerschalen-rot Malate-Glycerin-Agar W: orange
M: meerschalen-rot Nähragar W: beschränkt, gelblich, orange werden bis ledergelb
M: keins
L: keins Stärkemedium W: verbreitet, farblos
M: meerschalen-rot Kartoffelagar W: beschränkt, orange-gefärbt weiss bis rosa oder rot
L: abwesend oder braun-gefärbt Gelatin W: dicht, gelblich weiss bis bräunlich
M: weiss
L: keines Lackmusmilch W: gelblich weisser Ring
L: wird alkalisch Nitratreduktion negativ Cellulose-Zersetzung negativ Milchkoagulation positiv Milchpeptonisation positiv (schnell) Stärke-Hydrolyse positiv
IV.

Stamm Streptomyces albogriseolus Antagonistische Eigen- Neomycin schaften Morphologie Monopodial verzweigtes Sporophc ren, erzeugen kurze, kompakte
Spiralen, im Durchschnitt 4-6
Drehungen. Sphärische oder ovale Sporen, bedeckt mit zahl reichen langen, feinen Haaren Nähragar M: weiss bis aschgrau Stärkeagar M: weiss bis dunkelgrau Milch W: orange-gefärbter Ring Nitratreduktion positiv Milchpeptonisation positiv Stärkehydrolyse positiv Gelatin-Verflüssigung positiv
V.

Stamm Streptomyces pulveraceus Antagonistische Eigen- Zygomycin (identisch mit schaften Paromomycin)
Luftmycel entwickelt sich im allgemeinen gut. Das Sporophor bildet Spiralen und die Sporen sind sphärisch bis ellipsoidal.

The spiral adhering state.

Glycerin-Czapek's-Agar W: farblos, später braun gefärbt
M: pulverig, hellgrau braun bis hellgrau oliv
L: keines Glucose-Asparagin-AgarW: orange bis xanthin orange
M: pulverig, hellgrau olive
L: kein oder wird ledergelb Calcium-Malat-Agar W: gelb, dringt in das
Medium ein
M: klein oder dürftig, rauchgrau
L: kein Nähragar W: farblos, gefalten
M: keines
L: keines Stärke-Agar W: farblos bis gelbocker, dringt tief in das Medium
M: dürftig, hellgrau oliv
L: keines Tyrosin-Agar W: farblos bis braun gefärbt
M: hellgrau oliv
L: kein Milch W: farblos, Oberflächenwachstum
L: braun Nitratreduktion positiv (stark) Cellulose-Zersetzung negativ Milchkoagulation negativ Milchpeptonisation positiv Stärke-Hydrolyse positiv Gelatin-Verflüssigung positiv VI.

Stamm Streptomyces chrestomyceticus Antagonistische Eigen- Aminosidin (identisch mit schaften Paromomycin) Morphologie Luftmycele sind im allge meinen stark, besitzen aber selten Haken oder Spiralen Glucose-Asparagin-AgarW: gelb
M: abwesend Kartoffeglucose-Agar W: farblos
M: dürftig weiss Peptone-glucose-Agar W: gut, weiss oder gelblich weiss
M: übermässig weiss Tyrosinase positiv Milchkoagulation positiv Milchpeptonisation negativ (neutral) Stärke-Hydrolyse positiv Gelatin-Verflüssigung positiv VII.

Stamm Micromonospora purpurea Antagonistische Eigen- Gentamicin schaften Morphologie Kein Luftmycel, erhöhte Kolo- nie, gewundenes reichliches
Wachstum, wachsartig, kein diffusibles Pigment. Oberfläche: terra cotta. Die Rückseite: rot braun. Mycel lang, verzweigt, regulär, durch keine Trennwand getrennt, 0,5 g im Durch messer. Sporophoren einfach, Spo; ren sphärisch bis ellipsoidal,
1,0 R im Durchmesser Glucose-Asparagin-AgarW: sauber, Pfirsich-Farbe Pepton-glucose-Agar W: gut, Burgunderrot Nitratreduktion positiv Gelatin-Verflüssigung positiv (schwach) VIII.

Stamm Micromonospora echinospora Antagonistische Eigen- Gentamicin schaften Morphologie Kein Luftmycel, erhöhte Kolo nie, kerbiges-gewundenes gutes
Wachstum, wachsartig, schwach bernsteinfarbenes, diffusibles
Pigment. Oberfläche: tief rot braun. Mycel lang, verzweigt, durch keine Trennwand getrennt. Keine
Sporen Glucose Asparagin-AgarW: schwach Pepton-glucose-Agar W: gut, burgunderrot Nitrat-Reduktion variabel Gelatin-Verflüssigung positiv
Die Verwendung von Kohlenstoffquellen der oben angeführten Pilze ausgenommen des Pilzes IV sind in der folgenden Tabelle zusammen mit ähnlichen Angaben für den erfindungsgemäss verwendeten S. lividus, angeführt.

Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces Micromono- Micromono lividus kanamyceticus fradiae pulveraceus rimosus f. chrestomyce- spora spora paromomycinus ticus purpurea chinospora L-Arabinose - + + + + + + Rhamnose - - - ++ - + + D-Xyrose - - + ++ - + + D-Glucose ++ + ++ + + + D-Galactose ++ + + ++ ++ + + + D-Fructose + + - + ++ + D-Lactose - - - ++ ++ + + + D-Maltose ++ + + ++ ++ + Sucrose - + - - + + Trehalose ++ < ++ + + + D-Raffinose + + - ++ + - Dextrin + + ++ ++ + Inulin - - - - - + Stärke + + ++ + + Dulcit - - Glycerin ++ + + ++ + - L-lnosit ++ - ++ D-Mannit ++ + - - ++ + - Sorbit ++ + - + ++ +

-
Gemäss dem vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren wird somit eine neue und nützliche antibiotische Substanz erzeugt; dieses erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces lividus oder dessen Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthaltenden Medium züchtet, und die Antibiotika aus der Brühe gewinnt. Das genannte Nährmedium kann gleichfalls eine anorganische Substanz d. h. ein Mineral, neben der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthalten.

Zur Züchtung gemäss dem oben erfindungsgemässen Verfahren können verschiedene, zu diesem Zwecke bekannte Substanzen als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet werden. Als Beispiele der Kohlenstoffquelle können erwähnt werden Stärke, Glucose, Glycerin, Maltose, Inosit, Fructose, Dextrin, Sucrose und der Lactose.

Als Stickstoffquelle kann genannt werden ein Hefeextrakt, Polypepton, trockene Hefe, Fleischextrakt, Getreidequellwasser, Sojabohnenmehl, anorganisches Nitrat und Ammoniumsalz.

Als Beispiele der oben genannten erwähnten anorganischen Substanzen bzw. Minerale sind zu nennen Natriumchlorid, Dikaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Calciumchlorid, Calciumcarbonat, Calciumhydroxid, Eisenchlorid, Zinksulfat und Cobaltchlorid.

Die Züchtung kann unter aeroben Bedingungen, entweder in einem festen Nährmedium oder einem flüssigen Medium durchgeführt werden. Es wird bevorzugt, die Züchtung in einem flüssigen Medium unter aeroben Bedingungen durchzuführen. Bei der Züchtung im flüssigen Medium unter aeroben Bedingungen können bekannte anti-Schaummittel wie z. B. flüssige Paraffine, fette Öle und Silicon-Öle verwendet werden.

Die Züchtungstemperatur beträgt etwa 20 - 39 "C, vorteilhafterweise etwa 25-37 "C. ist zweckmässig, die Züch- tung in einem Züchtungsmedium bei einem pH von 6,6-7,5, vorzugsweise bei 7,0 t 0,3 durchzuführen. Die Züchtungsdauer beträgt gewöhnlich mindestens 2 Tage.

Z. B. eine Zeitspanne von zwei Tagen bis zwei Wochen, oder zwei Tage bis einer Woche genügt vollkommen. Gewünschtenfalls ist eine längere Züchtungsdauer möglich, aber nicht notwendig. Falls die Erzeugung von Quintomycin in der Brühe eine genügende Menge erlangte, vorteilhafterweise falls die Menge ein Maximum erreichte, wird die Züchtung gestoppt und das in der Brühe enthaltende Quintomycin wird gewonnen. Die Gewinnung kann entweder so erfolgen, dass man die Brühe durch ein Adsorbens durchfliessen lässt und dann mit Hilfe einer geeigneten Eluierungsflüssigkeit eluiert oder indem man die Brühe mit einem geeigneten Lösungsmittel, zwecks Extraktion, behandelt; im allgemeinen aber wird das oben genannte erste Verfahren bevorzugt.

Falls das genannte Adsorbtions- und Eluierungsverfahren verwendet wird, wird ein geeignetes Adsorptionsmittel zur Züchtungsbrühe zugefügt, um das gewünschte Produkt, unter genügendem Rühren zu adsorbieren; nach Entfernung der Züchtungsbrühe mit dem Mycelium kann dann das Adsorbens der Eluierungsoperation unterworfen werden. Es ist auch möglich, ein Adsorbens zu der Züchtungsbrühe zuzugeben , aus welcher Brühe vorher das Mycelium, durch geeignete Mittel, wie Durchfiltrieren und Zentrifugieren, entfernt wurde; hernach kann das oben beschriebene Verfahren weitergeführt werden, oder auch die vom Mycelium gereinigte Brühe kann durch eine mit einem geeigneten Adsorbens gefüllte Säule durchgeleitet werden, und im weiteren dem oben genannten Verfahren unterworfen werden.

Als Adsorbens zu obengenanntem Zwecke kann jedes feste Adsorbens verwendet werden, das die gewünschten Produkte adsorbiert und aus welchem dann das gewünschte Produkt, durch eine geeignete Eluierungsflüssigkeit eluiert werden kann. Als Adsorbens werden im oben beschriebenen Gewinnungsverfahren Kationenaustauschharze bevorzugt. Insbesondere werden mit Vorteil schwach saure Kationenaustauschharze verwendet. Als spezifische Beispiele dieser Kationenaustauschharze können genannt werden, die unter dem Handelsnamen bekannten Amberlite IRC-50 , Amberlite IRC-84 , Am berlite CG-50 und Carboxy-methyl-cellulose. Neben diesen, können auch andere feste Adsorptionsmittel wie z. B.

Cellulosepulver, aktivierte Kohle, Tonerdegel, Silicalgel und Tonerde/silicagel verwendet werden.

Als Eluierungsflüssigkeit kommt eine wässerige Lösung von Säuren, wie anorganische und organische Säuren, und wässerige Lösungen von alkalischen Materialien, wie Ätzalkalien, Ammoniak- und Ammoniumsalze in Frage.

Diese genannten Säuren umfassen Mineralsäuren wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und niederaliphatische Säuren, wie Essigsäure und Ameisensäure. Es ist zweckmässig, diese Säuren in Form wässeriger Lösungen einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 N zu verwenden. Als Beispiele oben genannter alkalischer Materialien können erwähnt werden: Natriumhydroxid, Kalium-Hydroxyd, Ammoniak und Ammoniumformiat. Es ist gleichfalls zweckmässig, dass diese alkalischen Materialien Konzentrationen von etwa 0,1 bis 3,0 N zur Verwendung kommen. Von allen oben genannten Materialien wird die Verwendung von Mineralsäuren oder Ammoniakwasser empfohlen.

Der pH des erhaltenen Eluates wird gewünschtenfalls auf einen Wert in der Nähe des Neutralpunktes eingestellt und durch Entfernung der Flüssigkeit bei einer möglichst niedrigen Temperatur, kann das gewünschte Quintomycin in Form eines festen Pulvers erhalten werden. Das Entfernen der Flüssigkeit kann mit Hilfe jeder der verschiedenen, bekannten Arten erfolgen. Es wird aber in diesem Falle das Trocknen durch Ausfrieren oder durch Zerstäuben der Flüssigkeit bevorzugt. Falls diese Operation bei einer möglichst niedrigen Temperatur durchgeführt wird, kann ein Erwärmen unter vermindertem Druck erfolgen.

Es ist aber auch möglich, die Flüssigkeit durch Trocknen im Vakuum unter solchen Bedingungen einzuengen, dass sich ein stabiles Salz, wie z. B. das Hydrochlorid oder das Natriumsalz bildet. Auch kann das Quintomycin im Eluat in ein festes Pulver so überführt werden, dass man das Eluat mit einem geeigneten Extraktionslösungsmittel extrahiert und hernach das Lösungsmittel b-ei möglichst niedriger Temperatur entfernt.

Falls Aktivkohle als festes Adsorbens verwendet wird, wird mit einer wässrigen Säurelösung eluiert. Ih diesem Falle wird Aceton oder ein niederaliphatischer Alkohol, wie Methanol oder Äthanol, der auf ein pH von weniger als 5, vorteilhafterweise weniger als 4, eingestellt ist, neben den oben angeführten Säuren, verwendet.

Falls die Gewinnung von Quintomycin aus der Züchtungsbrühe durch eine Lösungsmittelextraktion durchgeführt wird, werden als Hilfsmittel höhere Fettsäuren, wie Laurinsäure und Stearinsäure verwendet. Als Lösungsmittel werden wasser-unmischbare aliphatische Alkohole verwendet. Mit Vorteil werden als solche Alkohole z. B. noder iso-butanol und Amilalkohol verwendet. Eine Alkoholschicht wird durch Dekantieren oder andere bekannte
Separierungsmittel in zwei Schichten separiert und der Alkohol wird bei möglichst niedriger Temperatur abge dampft. Zwecks Abdampfung kommt beispielsweise das
Zerstäubungs-Trocknen, neben Erhitzen unter verminder tem Druck, in Frage.

Es wird bevorzugt, wie oben angeführt, das erfindungs gemäss erzeugte Quintomycin durch ein Adsorbtions oder Eluierungs-Verfahren oder durch eine Lösungsmittel
Extraktion zu gewinnen. Solange aber das Quintomycin in der Züchtungsbrühe im wesentlichen nicht zerstört ist, können jegliche Separierungsmittel eines in einer flüssi gen Brühe gelösten Feststoffes zur Verwendung kommen.

Das erfindungsgemäss erzeugte neue Antibiotikum
Quintomycin ist eine weisse bis weiss-graue feste Substanz, und kann als eine antibiotische Substanz in einem weiten Bereiche, oder gewünschtenfalls, nach entsprechender Reinigung durch wiederholte Anwendung obengenannter Gewinnungsvorgänge, verwendet werden. Gewünschtenfalls kann das erfindungsgemäss erzeugte Quintomycin in vier antibiotische Substanzen getrennt werden.

Wie schon oben angeführt werden diese vier antibiotischen Substanzen mit Quintomycin-A, Quintomycin-B, Quintomycin-C und Quintomycin-D benannt. Quintomycin-A, Quintomycin-B und Quintomycin-D sind neue Substanzen. Das erfindungsgemäss erzeugte Quintomycin besteht haupsächlich aus Quintomycin-B.

Im folgenden werden die Mittel zur Trennung des erfindungsgemäss erhaltenen Quintomycins in diese oben genannten vier Substanzen beschrieben.

Falls das aus der Züchtungsbrühe gewonnene Quintomycin nochmals in Wasser gelöst wird, oder mit einer wässrigen Flüssigkeit, einer Säure oder einer alkalischen Substanz, wie oben angeführt, eluiert wird, kann es auf chromatographischem Wege bei Aufrechterhaltung des pH der Eluierungsflüssigkeit bei 6,2 bis 12 mit oder ohne Einstellung, in das Quintomycin-A, Quintomycin-B, Quintomycin-C, und Quintomycin-D zerlegt werden.

Sowohl Kationen- als auch Anionen-Austauschharze sind verwendbar. Bei Verwendung einer mit einem Kationen-Austauschharz gefüllten Säule, werden vorteilhafterweise schwach saure Kationen-Austauschharze, wie Harze der Handelsmarken Amberlite IRC-50 , Amberlite IRC-84 , Amberlite CG-50 , ferner Carboxymethyl-Cellulose und das Harz der Handelsmarke CM-Sephadex ; eine auf ein pH von 6,2 bis 12 eingestellte wässrige Lösung von Quintomycin wird durch die Säule adsorbieren gelassen, wonach die Säule entwickelt wird. Unter Verwendung von Ammoniakwasser oder einer wässrigen Ammoniumformiat-Lösung als Eluierungsflüssigkeit wird das Quintomycin durch ein Gradient- oder stufenweises Verfahren abgetrennt.

Gemäss dem Gradient-Verfahren wird unter den im Beispiel 4 weiter unten angeführten Arbeitsbedingungen das Quintomycin-A in den Sektionen 45-50 eluiert; das Quintomycin-B in den Sektionen 53-58, das Quintomycin-C in Sektionen 88-90 und hernach wird das Quintomycin-D eluiert. Gemäss der stufenweisen Methode wird das Quintomycin-A zunächst durch eine 0,1 N Ammoniakwasserlösung eluiert, und dann das Quintomycin-B durch eine Ammoniakwasserlösung derselben Normalität. Das Quintomycin-C wird durch eine 0,15 N Ammoniakwasserlösung und hernach das Quintomycin-D durch eine 0,3 N Ammoniakwasserlösung eluiert.

Es ist auch möglich das Quintomycin in seine einzelnen Bestandteile auf diese Weise zu zerlegen, dass man eine wässrige Lösung des Quintomycins unter Verwendung einer Säule eines Anionen-Austauschharzes, vorteilhafterweise eines stark basischen Anionen-Austauschharzes, wie z. B. vom Dowex 1 x 2 OH-Typus , Amberlite 400 entwickelt und dann mit Wasser eluiert, wobei zuerst Quintomycin-D, dann das Quintomycin-C, hernach das Quintomycin-B und schliesslich das Quintomycin-A nacheinander eluiert werden.

Jedes der so getrennten Komponenten kann im weitern durch chromatographische Behandlung gereinigt werden, und zwar unter Verwendung einer Aktivkohle, Tonerde oder Cellulose gefüllten Säure und von Aceton oder Niederalkohol angesäuert mit einer Mineralsäure wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Salpetersäure, oder einer niederaliphatischen Säure, wie Essigsäure, als Eluierflüssigkeit. Diese Komponenten können auch durch Überführung in ihre Picrat- oder Reinecke Salze und Umwandlung in ein eigentliches anorganisches Salz, mit Hilfe von Salz-Austauschmitteln, gereinigt werden.

Die neue erfindungsgemäss erzeugte antibiotische Substanz besitzt neue und nützliche antibiotische Wirksamkeiten, wie sie schon am Anfang der vorliegenden Beschreibung erwähnt wurden. Im weiteren werden diese Wirksamkeiten im einzelnen näher beschrieben.

1. Charakteristiken
Quintomycin-A, Quintomycin-B und Quintomycin-D sind basische Substanzen. Eine freie Base, das Hydrochlorid und das Sulfat jeder dieser Substanzen ist ein weisses amorphes Pulver.

2. Löslichkeit
Quintomycin-A, Quintomycin-B und Quintomycin-D in Form ihrer freien Base, Hydrochlorid- und Sulfat-Salze sind löslich im Wasser, einer wässrigen Natriumhydroxyd Lösung, in einer niederaliphatischen Säure und einer Mineralsäure. Sie sind löslich in Methylalkohol in ihrer freien basischen Form, aber sind sehr schwer löslich oder unlöslich in C4 oder höher aliphatischen Alkoholen, Ketonen und Ätern.

3. Farbreaktion
Quintomycin-A, Quintomycin-B und Quintomycin-D sind positiv auf die Molisch-Reaktion, Elson-Morgan'sche Reaktion, Abderhalden'sche Reaktion (Ninhydrin-Reaktion) und Bile'sche Reaktion, weisen eine tief purpurrote Farbe bei der Tollens'schen Reaktion (Phloroglucin-hydrochlorid) und sind negativ auf die Fehling'sche Reaktion, Benedict'sche Reaktion, Biuret'sche Reaktion, Ehrlich'sche Reaktion und Sakaguchi Reaktion.

Quintomycin-A und Quintomycin-B zeigen eine purpur Farbe bei der Skatol'schen Reaktion aber Quintomycin-D weist diese Farbe nicht auf.

4. Stabilität
Quintomycin-A, Quintomycin-B und Quintomycin-D in Form ihrer 1 N wässrigen Chlorwasserstoff Säure-Lösung sind unstabil beim Erhitzen auf 100 "C während 30 Minuten, sind aber stabil bei Zimmertemperatur. Sie sind stabil in ihrer 1 N wässrigen Natriumhydroxydlösung, sowohl beim Erhitzen auf 100 "C während 30 Minuten als beim Zimmertemperatur.

5. R-lndex-F-Wert
Der R-lndex-f-Wert bestimmt durch eine Tonerdedünnschicht Chromatographie (RrWerte in den Ansprüchen sind mit Hilfe dieses Verfahrens bestimmt) unter Verwendung als obere Schicht eines gemischten Lösungsmittels von Chloroform-methanol-17 /0-iges Ammoniakwasser im Volumenverhaältnis von 2:1 :1 als Entwicklungsflüssigkeit beträgt 0,23 für Quintomycin-A, 0,50 für Quintomycin-B und 0,75 für Quintomycin-D. Einige bekannte antibiotische Substanzen besitzen den folgenden, mit Hilfe des obigen Verfahrens bestimmten RrWert: Kanamycin, Produkt von Streptomyces kanamyceticus, 0,75; Paromomycin, Produkt von Streptomyces rimosus f. paromomycinus, 0,70; Neomycin, Produkt von Streptomyces fradiae oder Streptomyces albogriseolus, 0,74; und Gentamicin Produkt von Micromonospora echinospora, 0,81.

Der RrWert bestimmt durch eine papierchromatographische Methode unter Verwendung einer Methanol-3 /o- igen NaCI wässrigen Lösung im Volumenverhältnis von 2:1 als Entwicklungsflüssigkeit und von Toyo Filterpapier Nr. 51A (Produkt von Toyo Filter Paper Co., Ltd., Japan) beträgt 0,25 für Quintomycin-A und 0,27 für Quintomycin-B. Die RrWerte bestimmt durch die selbe Methode einiger bekannter antibiotischer Substanzen sind die folgenden: Kanamycin, 0,36; Paromomycin, 0,31; Neomycin, 0,20; und Gentamicin, 0,53.

Andere Eigenschaften der erfindungsgemäss erzeugten antibiotischen Substanzen gemeinsam mit den Eigenschaf ten anderer bekannter antibiotischer Substanzen sind in den folgenden Tabellen angeführt.

Tabelle I Name der antibiotischen Substanz Quintomycin-A Quintomycin-B Quintomycin-C Quintomycin-D Kanamycin-A Kanamycin-B Kanamycin-C Erzeugt durch S.lividus S.lividus S.lividus S.lividus S.Kanamyceticus S. Kanamyceticus S. Kanamyceticus Schmelzpunkt (F)- C(zers.) (frei) 197-203 (frei) 197-203 (frei) 178-184 (frei) 263-268 (frei) 170-190 (frei) ca. 270 (-HCl) 195 (-HCl) 190 (-HCl) 203 [&alpha;]D+ (-HCl)[&alpha;]D22=59 (-HCl)[&alpha;]D22=50 (gleich wie das (-HCl)[&alpha;]D22-36 (frei)[&alpha;]D24=146 (frei)[&alpha;]D24=126 (frei)[&alpha;]D20=126 Paromomuycin) (c=1, H2O) (c=1, H2O) (c=0,5, H2O) (c=1,0, 1N H2SO4) (c-0,7, H2O) (c=1, H2O) Molekularformel C29H55N5O19 C29H55N5O18 C23H45N5O14 C23H45N5O13 C18H36N4O11 C18H37N5O10 C18H36N4O11 Molekulargewicht (M.G.) 777,77 761,77 615,63 599,63 484,51 482,51 484,51 Analyse % Ber. Gef. Ber. Gef. Ber. Gef. Gef. Gef. Gef.

C:44,77-C:45,16 C:45,72-C:46,23 (gleich wie das C:46,07-C:46,40 C:44,62 C:44,80 C:44,62 H: 7,07-H: 7,05 H: 7,22-H: 7,70 Paromomycin) H: 7,56-H: 7,59 H: 7,49 H: 7,51 H: 7,49 N: 9,01-N: 8,73 N: 9,19-N: 9,14 N:11,68-N:11,33 C:11,56 N: 14,52 N: 11,56 Komponenten der Substanzen Mannose + + (gleich wie das - - - Ribose + + Paramomycin) + + - Deoxystreptamin + + + + + + Monoaminozucker + + + - + + Diaminozucker + + + - + +
Tabelle II Name der anti- Quintomy- Quintomy- Quintomy- Quintomy- Kanamy- Kanamy- Kanamybiotischen Substanz cin-A cin-B cin-C cin-D cin-A - cin-B cin-C Biolog.

Aktivität M. l. C. mcg/ml Staph. dasselbe wie aureus 209p 1,56 0,8 Paromomycin 0,4 0,8 S. citreus 3,12 0,8 1,56 3,12 S. albus 0,8 0,4 0,1 0,8 Strept. faecalis 100 100 50 12,5 Sarcina lutea 100 > 100 1,56 3,12 Bacillus subtilis 0,8 0,8 0,8 0,2 B. cereus 1,56 3,12 0,8 1,56 B. anthracis 1,56 1,56 0,4 Escherichia coli 6,25 6,25 3,12 1,56 Kleb. pneumoniae 6,25 3,12 6,25 3,12 Prot. vulgaris 12,5 12,5 12,5 12,5 Salmonella typhi 6,25 1,56 1,56 1,56 Shigella flexneri 6,25 12,5 12,5 6,25 Pseudo. aeruginosa 100 3,12 3,12 25 Mycobacterium 607 5,12 1,56 1,56 1,56 M.

phlei 3,12 1,56 1,56 1,56 Mycobacterium tuber 3,12 3,12 3,12
Tabelle III Name der anti- Quintomy- Quintomy- Quintomy- Quintomy- Kanamy- Kanamy- Kanamybiotischen Substanzen cin-A cin-B cin-C cin-D cin-A cin-B cin-C Toxizität bei Mäusen LDso mg/kg Intravenös 198 193 190 374,2 Intraperitoneal Subcutan 1878 1210 2282 Synonym Paromomycin Tabelle IV Name der antibiotischen Substanz Neomycin-A Neomycin-B Neomycin-C Paramomycin-I Paramomycin-II Gentamicin complex Erzengt durch S. fradiae S. fradiae S. fradiae S. rimosus f. S. rimosus f.

Micromonospora echinospora S. albogriseolus S. albogriseolus S. albogriseolus paromomycinus paromomycinus Micromonospora purpurea F C(zers.) (-H2SO4) 250-6 C1:94-100, C2:107-124 [&alpha;]D+ (-H2SO4)[&alpha;]D22=123 (-H2SO4)[&alpha;]D22=58 (-H2SO4)[&alpha;]D=82 (-HCl)[&alpha;]D25=64(-HCl)[&alpha;]D24=78 C:1[&alpha;]D25=158(H2) (c=0,7,H2O) (c=0,5, H2O) (c=0,5, H2O) (c=1, H2O) C:[&alpha;]D25=160(H2O) Molekularformel C12H26N4O6 C23H46N6O13 C23H46N6O13 C23H45N5O14 C23H45N5O14 C17-18H34-36N4O7 M.

G. 322,36 614,65 614,65 615,63 615,63 Analyse % berechnet berechnet berechnet berechnet berechnet C:44,71 C:44,94 C:44,94 C:44,87 C:44,87 H: 8,13 N: 7,52 H: 7,52 H: 7,37 H: 7,37 N:17,38 N:13,67 N:13,67 N:11,38 N:11,38 Komponenten der Substanzen Mannose - - - -x - Ribose - + + + + Deoxystreptamin + + + + + + Monoaminozucker - - - + + + Diaminozucker + + + + + -
Tabelle V Name der anti- Neomy- Neomy- Neomy- Paromomy- Paramomy- Gentamicin biotischen Substanz cin-A cin-B cin-C cin I cin-ll complex Biologische Aktivität M. l. C. mcg/ml Staph. aureus. 209p 0,8 0,8 0,8 S. citreus 0,4 1,56 3,12 S. albus 0,4 0,2 0,8 Strept. faecalis 12,5 25 25 6,25 Sarcina lutea 1,56 3,12 0,4 Bacillus subtilis 0,8 0,4 0,4 B. cereus 1,56 0,8 0,8 B.

anthracis 1,6 0,1 Escherichia coli 1,56 3,12 3,12 Kleb-pneumoniae 6,25 3,12 0,8 Prot. vulgaris 6,25 6,25 1,56 Salmonella typhi 6,25 3,12 0,8 Shigella flexneri 6.25 6,25 3,12 Pseudo. aeruginosa 12,5 > 100. 0,8 Mycobacterium 607 0,8 1,56 M. phlei 3,12 0,4 Toxizität bei Mäusen LD50 mg/kg Intravenös 90 72 Intraperitoneal 433 Subcutan 220 423 484 Synonym Framycetin Strepto- Aminosidin,
Streptothricin thricin Catenulin, BKK -B1 Hydroxymycin,
Zygomycin
Das oben beschriebene erfindungsgemässe Verfahren wird im nachfolgenden durch einige Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1
Streptomyces lividus -Stamm (Streptomyces Nr.

2230-Ní) wurde in einem sterilisierten und auf ein pH von 7,0 sterilisiertem Medium, das aus 0,5 % Stärke, 2,0 % Sojabohnenmehl, 0,1 % Dikaliumphosphat, 0,05 /O Magnesi umsulfat, 0,3 % Natriumchlorid bestand, fermentiert und wurde bei 27 "C während etwa 50 Stunden vorkultiviert.

Hernach wurden 100- 150 ml dieser Vorkulturbrühe zu 10 Litern desselben Kulturmediums gegeben und diese ganze Kulturbrühe wurde bei 27 "C unter Rühren bei einer Ge- schwindigkeit von 250 Upm, unter Durchleiten von sterilisierter Luft mit einer Geschwindigkeit von 10 Litern /Minute kultiviert. Nach vierzig Stunden betrug der pH der Kulturbrühe 7,2-7,4 und die Erzeugung von Quintomycin (der Substanz Nr. 2230) erreichte ein Maximum. Die Kulturbrühe wurde unter Verwendung von Kieselgur der Handelsmarke Celite als Filterhilfsmittel filtriert und ergab 1,2 Liter eines Kulturfiltrats. Die Filtratbrühe wurde dann 10 Minuten mit 300 ml eines Harzes der Handelsmarke Amberlite IRC - 50 vom Typus H, gerührt bis die wirksamen Komponenten vollständig durch das Harz adsorbiert wurden.

Das Harz wurde dann in eine Säure geführt und gründlich mit Wasser gewaschen. Das Quintomycin wurde durch Eluieren einer 0,5 N Chlorwasserstoffsäure-Lösung gewonnen. Die wirksamen Komponenten wurden gesammelt und mit einer 10 N Natriumhydroxydlösung auf ein pH von 7,6-7,8 eingestellt. Dann wurden sie durch eine mit 10 g Aktivkohle gefüllte Säule zum Zwecke der Reinigung adsorbieren gelassen, die Säure wurde mit 0,01 /O-igem Ammoniakwasser und dann mit Wasser gewaschen und mit einer 0,02 N Chlorwasserstoffsäure/Methanollösung IM Verhältnis von 1:1 eluiert. Das Methanol wurde unter vermindertem Druck destilliert und anschliessendes Trocknen durch Ausfrieren ergab Quintomycin-A Quintomycin-B, Quintomycin-C und Quintomycin-D in Form eines Hydrochloridkomplexes in einer Ausbeute von einem Gramm.

Beispiel 2
Eine gemäss dem Verfahren nach Beispiel 1 erhaltene Kulturbrühe wurde durch eine mit einem Harz der Handelsmarke Amberlite IRC - 50 vom Typus NH4 gefüllte Säule durchfliessen gelassen, wobei die wirksamen Komponenten vollständig durch das Harz adsorbiert wurden.

Hernach wurde das Harz gründlich mit Wasser gewaschen und mit 1,0 N Ammoniakwasser, zwecks Abtrennung der wirksamen Komponenten, eluiert. Diese wirksamen Komponenten wurden gesammelt und mit 2N Chlorwasserstoffsäure, zwecks Einstellung des Eluats auf ein pH von 6-7,8, behandelt. Die Reinigung erfolgte auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise.

Beispiel 3
Der Stamm-Streptomyces lividus wurde in einem sterilisierten und auf ein pH von 6,8 eingestelltem, und 0,5 % Stärke, 0,05 /o Glucose, 2,0 % Sojabohnenmehl, 0,2 /O Pepton, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,1 /o Dikaliumphosphat und 0,3 /n Natriumchlorid enthaltendem Medium fermentiert und hernach bei 35 "C während etwa 50 Stunden vorkulti- viert. Dann wurden 300 bis 400 ml dieser vorkultivierten Brühe zu 10 Litern des obigen Mediums zugegeben und das Kultivieren wurde bei 35 "C unter Rühren mit 200
Upm und Durchleiten von 14 Liter per Minute sterilisier ter Luft durchgefuhrt. Innerhalb von 96 Stunden erreichte der pH der Kulturbrühe einen Wert von 7,8 bis 8,2 und die Erzeugung an Quintomycin erreichte ein Maximum.

Diese Kulturbrühe wurde dann während 10 Minuten mit 100 Milliliter eines schwachen sauren lonenaustausch Harzes der Handelsmarke Amberlite IRC-84 vom NH4-Typus vermengt, wobei die wirksamen Komponenten vom Harz vollständig adsorbiert wurden. Nach Entfernung des Mycels und der Ablauge-Brühe durch Dekantation wurde das Harz, an welchem die wirksamen Komponenten adsorbiert sind, in eine Säule gefüllt; danach wurde diese Säule endlich mit Wasser gewaschen und hernach mit einer 2,0 N Ammoniakwasserlösung eluiert. Die wirksamen Komponenten wurden gesammelt und konzentriert. Diese Lösung wurde dann durch eine mit einem schwachen sauren Kationenaustauschharz zum Gebrauch in der Chromatographie gefüllte Säule von 30 x 2400 mm adsorbiert. Es wurde zunächst ein Pigment mit 0,08 N Ammoniakwasser und hernach mit einem 0,1 N Ammoniakwasserlösung eluiert.

Durch dieses Eluieren erhält man zunächst das Quintomycin-A und nach Beendigung dieser Eluierung mit oben erwähnten 0,1 N Ammoniakwasser das Quintomycin-B. Durch Eluieren mit 0,15 N Ammoniakwasser, nach Beendigung des Eluierens von Quintomycin-B erhielt man das Quintomycin-C. Nachdem mit einer 0,3 N Ammoniakwasserlösung das Eluieren von Quintomycin-C beendet war, begann das Eluieren von Quintomycin-D.

Durch Konzentrieren und durch Ausfriertrocknung gewann man reines Quintomycin-A, Quintomycin-B, Quintomycin-C und Quintomycin-D in Form der freien Basen mit einem Ertrag von 650 mg, 4200 mg, 40 mg bzw. 120 mg.

Beispiel 4
150 mg des gemäss Verfahren vom Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Quintomycin-Komplexes wurden in etwa 40 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde in einer, mit 30 ml eines Carboxymethyl-Harzes der Handelsmarke Sephadex C-25 vom Typus NH4, gefüllten Säule vom Durchmesser 1 cm adsorbiert und hernach mit Wasser gewaschen. Unter Verwendung von 200 ml einer 0,05 N Ammoniakwasserlösung und 200 ml einer 1,0 N Ammoniakwasserlösung wurde unter Verwendung einer Gradienten-Methode mit einer Geschwindigkeit von 25 ml/Std. eluiert. Das Eluat wurde nacheinander in Sektionen, jede in einer Menge von 4 ml, gewonnen. Das Quintomycin-A wurde eluiert in Sektionen 45-50; das Quintomycin-B in Sektionen 53-58; und das Quintomycin-C in Sektionen 88-90. Durch Fortsetzen des Eluierens mit Ammoniakwasser einer Konzentration von 1,0 oder mehr erhielt man das Quintomycin-D.

Unter Verwendung von Gefrier-Trocknungsverfahren ergab sich reines Quintomycin-A, Quintomycin-B, Quintomycin-C und Quintomycin-D in Form freier Basen in Erträgen von 31 mg, 49 mg, Spuren bzw. 18 mg.

Beispiel 5
150 g des gemäss Verfahren vom Beispiel 1 erhaltenen Quintomycin-Komplexes. wurden in 140 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde durch eine Säule von 1 cm Durchmesser adsorbiert; diese Säule war mit 30 ml eines, mit Ammoniumformiat gepuffertem Carboxymethyl-Harz der Handelsmarke Sephadex C-25 vom NH4-Typus gefüllt. Nach Durchführung der Adsorption wurde diese gefüllte Säule mit Wasser gewaschen. Unter Verwendung von 200 ml einer 0,5 Molar-Ammoniumformiat-Lösung und 200 ml einer 3,0 molaren Ammoniumformiat-Lösung wurde, unter Verwendung einer Gradienten Methode mit einer Geschwindigkeit von 25 ml/Std. eluiert.

Das Eluat wurde nachher nacheinander in Sektionen, jede in einer Menge von 3 ml, gewonnen. Das Quintomycin-A wurde eluiert in Sektionen 29-37; Quintomycin-B in Sektionen 40-45; und Quintomycin-C in Sektionen 78-80.

Durch Fortsetzen des Eluierens mit 3,0 molarer Ammoniumformiat-Lösung erhielt man im Eluat Quintomycin-D.

Durch Gefrier-Trocknung ergab sich reines Quintomycin-A, Quintomycin-B, Quintomycin-C und Quintomycin-D in Form freier Basen in Erträgen von 35 mg, 56 mg, Spuren bzw. 19 mg.

Beispiel 6
150 g des gemäss Verfahrens vom Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Quintomycin-Komplexes wurden in 40 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf ein pH von 7,0 mit einer von 0,1 N Ammoniakwasserlösung eingestellt und das Quintomycin wurde durch eine mit 20 ml von Amberlite CG-50 vom NH4-Typus gefüllten Säule mit einem 1 cm -Durchmesser vollständig adsorbiert. Unter Verwendung von 200 ml einer 0,02 N Ammoniakwasser Lösung und 200 ml einer 1,0 N Ammoniakwasser-Lösung wurde, unter Verwendung einer Gradienten-Methode mit einer Geschwindigkeit von 25 ml/Std. eluiert. Das Eluat wurde nacheinander in Sektionen jede in einer Menge von 3 ml, gewonnen. Das Quintomycin-A wurde eluiert in Sektionen von 29-35, das Quintomycin-B in Sektionen von 40-50 und das Quintomycin-C in Sektionen von 88-92.

Durch Fortsetzen des Eluierens mit 1,0 N Ammoniakwasserlösung gelangt man zum Quintomycin-D-Eluat. Durch Gefrier-Trocknung ergab sich reines Quintomycin-A, Quintomycin-B, Quintomycin-C, Quintomycin-D in Form von freien Basen in Erträgen von 33 mg, 52 mg, Spuren bzw.

16 mg.

Beispiel 7
Jede der gemäss Verfahren vom Beispiel 3 und den vorangehenden Beispielen erhaltenen freien Basen von Quintomycin-A, Quintomycin-B, Quintomycin-C und Quintomycin-D wurden in Methanol gelöst. Eine Zugabe einer 2N Schwefelsäure-Lösung zur so erhaltenen Methanol-Lösung führte zur Ausfällung eines Sulfats jedes der genannten Quintomycine. Der Niederschlag wurde mit Methanol Aceton gründlich gewaschen und man erhielt ein reines Sulfat jedes genannten Quintomycins.

Freie Basen des Quintomycin-A, Quintomycin-B, Quintomycin-C und Quintomycin-D wurden in Methanol gelöst und mit einer 2N Chlorwasserstofflösung angesäuert. Eine Zugabe von Aceton zu jeder so erhaltenen Methanol-Lösung führte zu einer Ausfällung eines Hydrochlorids jedes der Quintomycine. Der Niederschlag wurde gründlich mit Aceton-Äther gewaschen und man erhielt ein reines Pentahydrochlorid jedes der genannten Quintomycine.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur Herstellung einer Mischung der Antibiotika Quintomycin A, B, C und D, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces lividus oder dessen Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthaltenden Medium züchtet und hernach die Antibiotika aus der Kulturbrühe gewinnt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Medium auch eine Mineralsubstanz enthält.

2. Verfahren gemäss Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtungstemperatur 20-39 "C, vorteilhafterweise 25-37 "C beträgt.

3. Verfahren gemäss Patentanspruch und Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der pH des Kulturmediums 6,6-7,5, vorteilhafterweise 7,0 + 0,3, beträgt.

4. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung zwei Tage bis zwei Wochen durchgeführt wird.

5. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenstoffquelle Stärke, Glucose, Glyzerin, Maltose, Inosit, Fructose, Dextrin, Sucrose oder Galactose verwendet.

6. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stickstoffquelle Hefeextrakt, Polypepton, trockene Hefe, Fleischextrakt, Getreidequellwasser, Sojabohnen-Mehl, anorganisches Nitrat oder Ammoniumsalz verwendet.

7. Verfahren gemäss Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mineralsubstanz Natriumchlorid, Dikaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Kalciumchlorid, Kalciumcarbonat, Calciumhydroxyd, Eisenchlorid, Zinksulfat oder Kobaltchlorid verwendet.

8. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das Produkt durch Adsorption und Eluieren gewinnt.

9. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das Produkt mit Hilfe einer Lösungsmittelextraktion gewinnt.

10. Verfahren gemäss Unteranspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Adsorption mit Hilfe eines Kationenaustauschharzes und das Eluieren mit Hilfe einer wässerigen Lösung saurer oder alkalischer Substanzen durchgeführt wird.

11. Verfahren gemäss Unteranspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kationenaustauschharz schwach saure Kationenaustauschharze oder Carboxymethyl-Cellulose verwendet.

12. Verfahren gemäss Unteranspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Adsorption mit Hilfe von Aktivkohle und das Eluieren mit Hilfe von wässerigen Lösungen von Säuren, angesäuerten niederaliphatischen Alkoho len oder angesäuertem Aceton durchgeführt wird.

13. Verfahren gemäss Unteranspruch 9, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Lösungsmittelextraktion mit Hilfe eines wasser-nicht-mischbaren-aliphatischen Alkohols als Lösungsmittel durchgeführt wird.

14. Verfahren gemäss Unteranspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als aliphatischer Alkohol n-Butanol, iso Butanol oder Amylalkohol verwendet wird.

15. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Quintomycin durch ein Kationenaustauschharz adsorbiert und mit einer wässerigen Lösung einer alkalischen Substanz eluiert wird, wobei mindestens eines der Quintomycine, d. h. Quintomycin-A,.

Quintomycin-B, Quintomycin-C oder Quintomycin-D gewonnen wird.

16. Verfahren gemäss Unteranspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Eluieren mit Hilfe einer Gradienten-Methode oder stufenweisen Methode durchgeführt wird.

17. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Quintomycin durch ein Anionenaustauschharz adsorbiert, mit Wasser eluiert wird, wobei mindestens eines der Quintomycin-A, Quintomycin-B, Quintomycin-C und Quintomycin-D gewonnen wird.