CH515036A

CH515036A - Procédé d'obtention de globulines cytobiotiques et leur utilisation

Info

Publication number: CH515036A
Application number: CH1513768A
Authority: CH
Inventors: Ardry Robert; Robilliart Michel
Original assignee: Ardry Robert; Robilliart Michel
Priority date: 1967-10-10
Filing date: 1968-10-10
Publication date: 1971-11-15
Also published as: FR94653E; SE375448B; FR1547619A; LU57047A1; NL6814078A; CH530792A; NO136252C; NO136252B

Description


  
 



  Procédé d'obtention de globulines cytobiotiques et leur utilisation
 La présente invention a pour objet un procédé permettant d'isoler, à partir d'organes ou de tissus d'animaux sains tells qu'on peut les trouver à l'abattoir, c'està-dire prélevés sur des animaux n'ayant subi aucun traitement préalable, les globulines qui se trouvent fixées sur ces organes ou tissus et qui possèdent une activité cytobiotique analogue à celle des anticorps antitissulaires obtenus à partir du sang d'animaux préalablement soumis à une longue hyperimmunisation au moyen d'antigène tissulaire convenable.



   Les globulines cytobiotiques sont douées des propriétés suivantes: a) elles sont dépourvues d'activité agressive ou toxique
 sur l'organisme humain; b) elles présentent un tropisme spécifique pour les tissus
 humains; c) elles sont capables d'exercer sur ces tissus déficients,
 par exemple la peau, une action régénératrice se tra
 duisant par une restauration du cycle biologique
 normal.



   Le procédé est caractérisé en ce qu'on lave à plusieurs reprises les organes ou tissus, hachés sommairement, par une solution de chlorure de sodium à   0,9      O/o,    on élue les globulines cytobiotiques au moyen d'une solution citratée sodique de pH 3,1   +    0,01 (force ionique 0,15 M), on centrifuge et amène la partie surnageante à un pH voisin de 6 par addition de soude, on élimine le précipité formé par centrifugation et filtration, on amène le filtrat à pH voisin de la neutralité et traite par une solution concentrée de sulfate d'ammonium de façon à obtenir une concentration en sel ammonique de 1,85 M, on dissout le précipité formé dans la quantité juste suffisante d'eau et on soumet la solution à une dialyse contre de l'eau purifiée, puis à une centrifugation.



   10 - Préparation des organes
 L'organe choisi pour l'obtention des globulines cytobiotiques spécifiques et qui peut être, par exemple, le rein ou le coeur, est utilisé dès le prélèvement à l'abattoir ou, à défaut, après une congélation pratiquée immédiatement après le prélèvement sur l'animal.



   Après un hachage sommaire, il subit un premier lavage avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 0/o afin d'éliminer le maximum de sang résiduel. Puis il est broyé au mixer ou avec tout autre appareil similaire et mis en suspension dans dix fois son poids de la même solution saline. Après agitation et maintien en contact une heure environ, la partie insoluble est séparée et soumise à congélation à une température inférieure à   - 200 C    de manière à parfaire la rupture cellulaire.



   Après décongélation, cette partie insoluble est à nouveau mise en suspension dans dix fois son poids de solution saline, séparée et lavée à nouveau jusqu'à ce que le liquide de lavage n'entraîne plus aucun élément soluble.



   20 -   Ablution    des globulines cytobiotiques
 On emploie une solution d'élution de pH 3,1   +    0,01 et on fait suivre l'élution d'une première élimination de la portion non cytobiotique par passage au pH 6.



   La technique employée est la suivante: le résidu tissulaire insoluble obtenu lors de la préparation des organes est traité par deux à trois fois son poids, selon l'organe, d'une solution citratée sodique de pH 3,1 + 0,1 (force ionique 0,15 M). Le pH du mélange est vérifié et ajusté, en cas de besoin, à 3,1 + 0,1 par addition de la quantité nécessaire et suffisante d'acide chlorhydrique.



   Après avoir été abandonné pendant une heure environ à la température du laboratoire, le mélange est centrifugé puis la partie surnageante est amenée à pH 6 ou voisin de 6 par l'addition de la quantité nécessaire et suffisante de soude. Le précipité formé est éliminé par  centrifugation et filtration. Cette purification est essentielle pour l'obtention ultérieure exclusive des globulines cytobiotiques.



   Le filtrat est ensuite amené à pH neutre (bande des   pM    7) et additionné de la quantité suffisante de solution de sulfate d'ammonium,   (NH4)2SO4,    pour obtenir une concentration finale 1,85M (solution aqueuse à   45 0/o    de sel obtenue à 230 C).



   Après quelques heures de repos, le précipité formé est collecté, dissous dans la quantité juste nécessaire d'eau purifiée. La solution est dialysée contre de l'eau purifiée jusqu'à disparition de toute trace de sel d'ammonium.



   30   -      Concentration    des globldines   cytobiotiqes   
 La portion surnageante après centrifugation contient les globulines cytobiotiques     brutes  ,    c'est-à-dire un mélange de globulines cytobiotiques d'un haut degré de pureté et de globulines à activité cytobiotique nulle ou réduite.



   La séparation des premières, c'est-à-dire des globu   hunes    d'un haut degré de pureté, s'effectue comme suit:
 La solution dialysée et centrifugée est additionnée de monophosphate de sodium de manière à obtenir une concentration finale égale à 0,0175M (pH 6,3). Cette solution est ensuite passée sur une colonne de diéthylaminométhylcellulose et dispersée dans une solution tampon de phosphate monosodique 0,2 M (pH 6,3) puis lavée par le tampon monophosphate 0,0175 M (pH 6,3).



  Les portions finales sont déplacées par ce même tampon. La solution effluente contient les globulines cytobiotiques  purifiées  et constituées essentiellement de globulines I g.   -G.   



   Après nouvelle dialyse et filtration, la solution est lyophilisée et le résidu sec est constitué par les globulines cytobiotiques d'un haut degré de pureté. Ces globulines seront dissoutes au moment de l'emploi dans l'excipient convenable. Les globulines cytobiotiques ainsi obtenues possèdent un ensemble de propriétés qui les rendent aptes à l'emploi en cosmétologie. C'est ainsi que les substances isolées de la peau de certains animaux ou de l'ensemble des tissus d'un animal à l'état de vie foetale ont sur l'épiderme humain et même sur le derme une action stimulante qui se traduit par une vigueur nouvelle et un éclat particulier de la peau. On peut donc utiliser les globulines cytobiotiques obtenues pour la préparation de produits cosmétiques.



   REVENDICATION I
 Procédé d'obtention de globulines cytobiotiques à partir d'organes ou de tissus d'animaux, caractérisé en ce qu'on lave à plusieurs reprises les organes ou tissus, hachés sommairement, par une solution de   chlorure    de sodium à 0,9 pour cent, on élue les globulines cytobiotiques au moyen d'une solution citratée sodique de pH   3,1 + 0,01 (force ionique 0,15nu), on centrifuge et    amène la partie surnageante à un pH voisin de 6 par addition de soude, on élimine le précipité formé par centrifugation et filtration, on amène le filtrat à pH voisin de la neutralité et traite par une solution concentrée de sulfate d'ammonium de façon à obtenir une concentration en sel ammonique de 1,85 M, on dissout le précipité formé dans la quantité juste suffisante d'eau et on soumet la solution à une dialyse contre de l'eau purifiée,

   puis à une centrifugation.



   SOUS-REVENDICATIONS
 1. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que la solution résultant de la centrifugation finale est filtrée et le filtrat est lyophilisé, ce qui donne un résidu sec constitué par l'ensemble des globulines cytobiotiques.



   2. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on ajoute à la solution résultant de la centrifugation finale du monophosphate de sodium de concentration égale à 0,0175 M, on passe sur colonne de di   éthylaminométhylcellulose,    puis on disperse dans une solution tampon de phosphate monosodique 0,2M et on lave par le tampon de monophosphate de sodium, ce qui livre des globulines cytobiotiques d'un haut degré de pureté.

 

   3. Procédé selon la revendication I et la sousrevendication 2, caractérisé en ce que la solution effluente est dialysée puis filtrée et le filtrat est lyophilisé pour obtenir un résidu sec constitué par les globulines cytobiotiques pures.



   REVENDICATION II
 Utilisation des globulines cytobiotiques obtenues par le procédé de la revendication I pour la préparation de produits cosmétiques.

**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.

Claims

**ATTENTION** debut du champ CLMS peut contenir fin de DESC **. centrifugation et filtration. Cette purification est essentielle pour l'obtention ultérieure exclusive des globulines cytobiotiques.

Le filtrat est ensuite amené à pH neutre (bande des pM 7) et additionné de la quantité suffisante de solution de sulfate d'ammonium, (NH4)2SO4, pour obtenir une concentration finale 1,85M (solution aqueuse à 45 0/o de sel obtenue à 230 C).

Après quelques heures de repos, le précipité formé est collecté, dissous dans la quantité juste nécessaire d'eau purifiée. La solution est dialysée contre de l'eau purifiée jusqu'à disparition de toute trace de sel d'ammonium.

30 - Concentration des globldines cytobiotiqes La portion surnageante après centrifugation contient les globulines cytobiotiques brutes , c'est-à-dire un mélange de globulines cytobiotiques d'un haut degré de pureté et de globulines à activité cytobiotique nulle ou réduite.

La séparation des premières, c'est-à-dire des globu hunes d'un haut degré de pureté, s'effectue comme suit: La solution dialysée et centrifugée est additionnée de monophosphate de sodium de manière à obtenir une concentration finale égale à 0,0175M (pH 6,3). Cette solution est ensuite passée sur une colonne de diéthylaminométhylcellulose et dispersée dans une solution tampon de phosphate monosodique 0,2 M (pH 6,3) puis lavée par le tampon monophosphate 0,0175 M (pH 6,3).

Les portions finales sont déplacées par ce même tampon. La solution effluente contient les globulines cytobiotiques purifiées et constituées essentiellement de globulines I g. -G.

Après nouvelle dialyse et filtration, la solution est lyophilisée et le résidu sec est constitué par les globulines cytobiotiques d'un haut degré de pureté. Ces globulines seront dissoutes au moment de l'emploi dans l'excipient convenable. Les globulines cytobiotiques ainsi obtenues possèdent un ensemble de propriétés qui les rendent aptes à l'emploi en cosmétologie. C'est ainsi que les substances isolées de la peau de certains animaux ou de l'ensemble des tissus d'un animal à l'état de vie foetale ont sur l'épiderme humain et même sur le derme une action stimulante qui se traduit par une vigueur nouvelle et un éclat particulier de la peau. On peut donc utiliser les globulines cytobiotiques obtenues pour la préparation de produits cosmétiques.

REVENDICATION I Procédé d'obtention de globulines cytobiotiques à partir d'organes ou de tissus d'animaux, caractérisé en ce qu'on lave à plusieurs reprises les organes ou tissus, hachés sommairement, par une solution de chlorure de sodium à 0,9 pour cent, on élue les globulines cytobiotiques au moyen d'une solution citratée sodique de pH 3,1 + 0,01 (force ionique 0,15nu), on centrifuge et amène la partie surnageante à un pH voisin de 6 par addition de soude, on élimine le précipité formé par centrifugation et filtration, on amène le filtrat à pH voisin de la neutralité et traite par une solution concentrée de sulfate d'ammonium de façon à obtenir une concentration en sel ammonique de 1,85 M, on dissout le précipité formé dans la quantité juste suffisante d'eau et on soumet la solution à une dialyse contre de l'eau purifiée,

puis à une centrifugation.

SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que la solution résultant de la centrifugation finale est filtrée et le filtrat est lyophilisé, ce qui donne un résidu sec constitué par l'ensemble des globulines cytobiotiques.

2. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on ajoute à la solution résultant de la centrifugation finale du monophosphate de sodium de concentration égale à 0,0175 M, on passe sur colonne de di éthylaminométhylcellulose, puis on disperse dans une solution tampon de phosphate monosodique 0,2M et on lave par le tampon de monophosphate de sodium, ce qui livre des globulines cytobiotiques d'un haut degré de pureté.

3. Procédé selon la revendication I et la sousrevendication 2, caractérisé en ce que la solution effluente est dialysée puis filtrée et le filtrat est lyophilisé pour obtenir un résidu sec constitué par les globulines cytobiotiques pures.

REVENDICATION II Utilisation des globulines cytobiotiques obtenues par le procédé de la revendication I pour la préparation de produits cosmétiques.