Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-phosphaten
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Nucleosid-phosphaten, nämlich l-B-D-Arabinofuranosylcytosin-(und 5-substituierte-cytosin-) 2'- und 3'-phosphate.
Die neuen Verbindungen weisen die folgenden For meln auf:
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worin X Wasserstoff, Methyl, Trifluormethyl, Fluor Chlor, Brom oder Jod bedeutet.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch ge kennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel
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oder ein Salz dieser Verbindung gegebenenfalls nach vorherigem intermediärem Schutz der 5'-OH-Gruppe durch Verätherung mit Triphenylchlormethan, (p-Methoxyphenyl)-diphenylchlormethan, Bis-(p-methoxyphenyl) -phenylchlormethan oder den Bromanalogen unter Bildung einer Verbindung der Formel II
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in der T Triphenylmethyl, (p-Methoxyphenyl)-diphenylmethyl oder Bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl bedeutet, und gegebenenfalls nach intermediärem Schutz der 4-Aminogruppe durch Acylierung einer Verbindung der Formel II mit dem Säurechlorid,
Säurebromid oder Säureanhydrid von Kohlenwasserstoffcarbonsäuren mit 2-12 C-Atomen und Behandlung der erhaltenen Verbindung mit einem Alkalihydroxyd bei einer Temperatur von - 100 bis + 10 C weniger als 60 Minuten lang unter Bildung einer Verbindung der Formel IV
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in der Ac die Acylgruppe einer Kohlenwasserstoffcarbonsäure mit 2-12 C-Atomen bedeutet, mit einem Phosphorylierungsmittel in Gegenwart eines Kondensationsmittels und dann mit einem Alkalihydroxyd bei niedrigen Temperaturen unter Bildung einer Mischung des entsprechenden 2'-Phosphats und 3'-Phbsphats beziehungsweise falls man von Verbindungen der Formel I ausgegangen ist, unter Bildung einer Mischung des entsprechenden 2'-, 3'- und 5'- Phosphats umsetzt, und dass man diese Mischung, falls die Schutzgruppe T vorhanden ist,
mit wässriger Essigsäure und, falls die Schutzgruppe Ac vorhanden ist, anschliessend mit wasserfreiem ammoniakalischem Methanol oder Äthanol zur Abspaltung der Schutzgruppe behandelt und das erhaltene Gemisch dann chromatographiert.
Das erfindungsgemässe Verfahren, je nachdem ob Schutzgruppen eingeführt werden, wird nach einem der nachfolgend beschriebenen Syntheseschritte A, B oder C ausgeführt.
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In diesen Formeln haben Ac, T und X die weiter oben angegebene Bedeutung.
Als Alkalihydroxyd werden vorzugsweise Lithiumhydroxyd, Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd verwendet. Als Phosphorylierungsmittel dient insbesondere 2-Cyanoäthylphosphat in Gegenwart des vorzugsweise als Kondensationsmittel angewendeten N,N-Dicyclohexylcarbodiimids. Die wässrige Essigsäure zur Abspaltung der T-Schutzgruppe weist vor allem eine Konzentration von 80% auf.
In einer besonderen Ausführungsform des neuen Verfahrens werden die Verbindungen VII und VIII nach der Synthese B durch direkte Phosphorylierung der Verbindung II mit 2-Cyano-äthylphosphat in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und anschliessende Behandlung mit einer Base unter Bildung von 1-(5'-Triphenyl- methyl-p-D-arabinofuranosyl)-cytosin-2'-phosphat und 3' -phosphat (IX und X) erhalten, die durch Behandlung mit wässriger Essigsäure die gewünschten Verbindungen VII und VIII ergeben.
Die direkte Phosphorylierung (Synthese C) der Verbindung I mit 2-Cyanoäthylphosphat in Gegenwart von Carbodiimid ergibt das 1-,8-D-Arabinofuranosylcytosin- -2'-phosphat, -3'-phosphat und -5'-phosphat, Verbindungen, die chromatographisch voneinander getrennt werden.
Die neuen Verbindungen, 1-p-D-Arabinofuranosyl- -cytosin-2'-phosphat und -3'-phosphat (VII und VIII), die auch Substituenten in 5-Stellung enthalten, wie Methyl, Trifluormethyl, Halogene wie Fluor, Chlor, Brom und Jod, besitzen eine wesentliche cytotoxische Wirkung in vitro, besonders gegen KB-Tumorzellen und gegen Viren, insbesondere gegen die verschiedenen Typen von Herpes-, Coe- und Vaccinia-viren. Anders als bei Cytosin-arabinosid-5'-phosphat werden das 2'-Phosphat und das 3'-Phosphat der Formeln VII u.
VIII durch menschliche Leberdeaminase nur sehr langsam desaminiert, so dass sie bei systemischer Verabreichung eine verlängerte Wirkung haben, weil sie nicht in unwirksame Uridinverbindungen umgewandelt werden. Äusserlich können diese Verbindungen zum Reinigen von Glasgegenständen und Instrumenten verwendet werden, die bei der Herstellung von Gewebekulturen für die Virus- und Tumorforschung benutzt werden, sowie zum Waschen von ausgeschnittenen Tumorgeweben verwendet werden, die für die Verpflanzung in Tiere vorgesehen sind, um das Wachstum von Tumorzellen zu verhindern, die sonst umgebende Gewebe impfen oder zu anderen Teilen des Tierkörpers transportiert werden könnten. Die antivirale Wirksamkeit kann auch verwendet werden, um Kulturen von Mikroorganismen herzustellen, die frei von Virusphagen sind, z.B. phagenfreie, Antibiotika bildende Streptomyceskulturen.
Die Verbindungen sind weiterhin in der Regel geeignete Zwischenprodukte für die Herstellung von Oligonucleotid-Polymeren, die den substituierten oder nichtsubstituierten l-p-D-Arabinofuranosyl- cytosin-2'- oder 3'-phosphatrest enthalten. Zu diesem Zweck können die Verbindungen der Formeln VII und Vffi in Form der freien Säure mit anderen Nucleosiden in Gegenwart von Kondensationsmitteln kondensiert werden, wie z.B. Dialkyl- oder Dicycloalkylcarbodiimide wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid.
Die antivirale Wirksamkeit der Verbindungen VII und VIII kann zur Behandlung von Herpes keratitis im Auge von virusinfizierten Haustieren verwendet werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann l-,8-D-Arabinofuranosylcytosin (1), insbesondere in Form des Hydrochlorids, Hydrobromids oder eines anderen Salzes oder in Form der freien Base, mit einem Verätherungsmittel, vorzugsweise in einem basischen organischen Lösungsmittel, behandelt werden. Als Verätherungsmittel zur Einführung der Schutzgruppe werden Triphenylchlormethan, (p-Methoxyphenyl)-di phenylchlormethan Bis-(p-methoxyphenyl)-phenylchlormethan und die Bromoanalogen dieser drei Verbindungen verwendet. Als organische Base können Pyridin, Pi- koline, Lutidine, Trialkylamine und dgl. verwendet werden, wobei Pyridin bevorzugt wird.
Die Umsetzung kann bei einer Temperatur zwischen 0 und 1 160C durchgeführt werden und wird vorzugsweise bei Raumtemperatur zwischen 20 und 300C durchgeführt. Die Umsetzung bei Raumtemperatur erfordert gewöhnlich eine Zeitspanne zwischen 6 Stunden und 10 Tagen. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das 1 -ss-D-Arabinofuranosylcytosin in Pyridinlösung 6 Stunden bis 10 Tage mit Chlortriphenylmethan oder Bromtriphenylmethan gerührt werden. Danach wird das Produkt in der Regel durch übliche Mittel isoliert, z.B. durch Eingiessen der Mischung in Wasser und Abtrennen des Produktes, nachdem es kristallisiert ist. Das Produkt kann durch übliche Massnahmen wie Umkristallisieren, z.B. aus Aceton, gereinigt werden.
Die gegebenenfalls auszuführende Acylierung des auf diese Weise erhaltenen Produktes, 1-(5'-O-Triphenylme- thyl-8-D-arabinofuranosyl)-cytosin, zur Einführung einer Schutzgruppe, wird mit einem Acylierungsmittel aus der Gruppe der Acylchloride, Acylbromide oder Säureanhydride von Kohlenwasserstoffcarbonsäuren mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen durchgeführt. Beispiele für Acylchloride und Acylbromide umfassen Acetylchlorid, Acetylbromid, Benzoylchlorid, Anisoylchlorid, p-Äthylbenzoylchlorid, p-Methylbenzoylbromid, ,8-Cyclopentylpro- pionylchlorid, Lauroylchlorid, Decanoylchlorid, Octanoylbromid und dgl.
Beispiele für Säureanhydride sind Essigsäureanhydrid, Propionsäureanhydrid, Buttersäureanhydrid, Phenylessigsäureanhydrid, Phenylpropionsäureanhydrid, Hexanonsäureanhydrid und dgl. Bei der
Die auf diese Weise erhaltenen Ester, die der Formel IIIa und/oder IIIb entsprechen, werden durch ein Alkalihydroxyd, wie z.B. durch Behandlung mit Natriumhydroxyd, Lithiumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Natriummethoxyd, Natriumäthoxyd, Kaliumäthoxyd und dgl., bei 100 bis + 100C weniger als 60 Minuten lang selektiv hydrolysiert, um eine Spaltung des N4-Amido-teils zu vermeiden. Die Umsetzung kann durch Zugabe von Säure oder vorzugsweise eines Austauscherharzes wie Pyridinium Dowex 50 W X 8 beendet werden.
Das Produkt wird gewöhnlich durch übliche Verfahren wie Verdampfen des filtrierten Reaktionsgemischs und Chromatographieren des Rohprodukts erhalten. Umkristallisierung und Chromatographie können ebenfalls zur Reinigung der Produktes, eines N-Acyl-l -(5'-O-triphenylmethyl-B- -D-arabinofuranosyl)-cytosins (IV), angewendet werden.
Die Phosphorylierung des N4-Acyl-1-5'-O-triphenyl- methyl-B-D-arabinofuranosyl)-cytosins (1V) kann nach dem Verfahren von G.M. Tener, J. Am. Chem. Soc.
Band 83,Seite 159 (1959) durchgeführt werden. Die bei diesem Verfahren im allgemeinen verwendeten Lösungsmittel sind insbesondere wasserfreie, nicht hydroxylgruppenhaltige Lösungsmittel, in denen das Phosphorylierungsmittel, ein Phosphatester in der Regel, ebenfalls löslich ist. Diese Lösungsmittel umfassen z.B. Pyridin, Picoline, Lutidine und dgl. Neutrale Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxyd, Tetrahydrofuran, N,N-Dimethylacetamid oder Dioxan können verwendetwer den, vorausgesetzt, dass gewöhnlich für jedes Mol des Phosphorylierungsmittels ein Äquivalent Base zugesetzt wird. Typische Basen für diese Reaktion sind vor allem Pyridin, Picoline, Lutidine und Trialkylamine.
Phosphatester, die leicht durch eine Alkalibase abgespalten werden, können verwendet werden, und besonders geeignet für diese Umsetzung sind 2-substituierte Äthyl-dihydrogen-phosphate der Formel
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in der R"' Wasserstoff oder einen niederen Alkylrest, Z' ein stark elektronegativer Substituent aus der aus
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bevorzugten Ausführungsform wird die Acylierungsreaktion in trockenem Pyridin bei Raumtemperatur zwischen 20 und 300C unter kontinuierlichem Rühren für die Dauer von 1 bis 48 Stunden durchgeführt.
Nach dieser Zeitspanne kann das Material nach üblichen Verfahren, z.B. Eingiessen der Pyridinlösung in Wasser, Dekantieren des Wassers und Reinigung des verbleibenden Materials durch übliche Massnahmen wie Chromatographie, Extraktion, Umkristallisieren oder eine Kombination dieser Verfahren und dgl. unter Bildung des entsprechenden N4-Acyl-1-(2',3'-di-O-acyl-5'-O-triphenyl-methyl-,8-D- -arabinofuranosyl)-cytosins (IIIa) oder der entsprechenden Verbindung IIIb gewonnen werden.
und dgl. bestehenden Gruppe, R"" einen niederen Al kyl- oder Arylrest und R""' Wasserstoff, einen niederen
Alkylrest oder einen Arylrest bedeuten. Das bevorzugte 2-substituierte Äthyl-dihydrogen-phosphat ist 2-Cyan -äthyl-dih ydrogen-phosphat.
Anstelle eines 2-substituierten Äthyl-dihydrogen-phos- phats können auch andere Dihydrogen-phosphatester ver wendet werden, die sich leicht durch eine Base spalten lassen, z.B. o- und p- Carboxyphenyl-dihydrogen-phos phat, o- und p-Carboamoylphenyl-dihydrogen-phosphat und o und p-Cyanophenyl-dihydrogen-phosphat.
In der das 2-disubstituierte Äthyl-dihydrogen-phos phat oder o- oder psubstituierte Phenyl-dihydrogen -phosphat enthaltenden Lösung wird in der Regel. das vorgenannte N4-Acyl-l-(5'-O-triphenylmethyl-,B-D-arabi- nofuranosyl)-cytosin (IV) gelöst, erforderlichenfalls unter Erhitzen auf eine Temperatur zwischen 30 und 50 C.
Nachdem das gesamte Material in Lösung gegangen ist, kann das Kondensationsmittel, wie z.B. ein alkyl-, cycloalkyl- oder arylsubstituiertes Carbodiimid, zugesetzt werden. Andere mit Carbodiimiden nicht verwandte Verbindungen, die als Kondensationsmittel zugesetzt werden können, sind p-Toluolsulfonylchlorid, Methoxyacetylen, Keten-imine, Trichloracetonitril, substituierte Cyanamide, a-substituiertes Acetonitril, Alkyl- und Arylisocyanate, Carbonsäurechloride, Aralkylchlorcarbonate und dgl.
Die bevorzugten Temperaturen für diese Reaktion sind die Temperaturen um und etwas oberhalb von Raumtemperatur, d.h. Temperaturen zwischen 20 und 400C; die Reaktion kann jedoch bei niedrigeren Temperaturen, wie z.B. 50C und bis zu Temperaturen von etwa 750C ohne übermässige Nebenreaktionen durchgeführt werden.
Bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 400C und bei einer angemessenen Konzentration beträgt die für den Abschluss der Umsetzung erforderliche Zeit im allgemeinen etwa 6 bis 24 Stunden. Reaktionszeiten zwischen etwa 1 und 60 Stunden können jedoch angewendet werden; bei stärkerer Verdünnung sollte die Reaktionszeit merklich verlängert werden.
Die Konzentration der Reaktionsteilnehmer ist in der Regel nicht kritisch. Äquimolare Mengen von N4-Acyl -1 -(5'4riphenylmethyl--D-arabinofuranosyl)-cytosin, 2substituiertem Äthyl-dihydrogen-phosphat und Kondensationsmittel ergeben insbesondere eine etwa quantitative Umwandlung, falls eine ausreichende Zeit für eine voll ständige Umsetzung zur Verfügung steht. Um die Reak tionszeit abzukürzen, kann ein 3- bis 4facher molarer Überschuss des 2-substituierten Äthyldihydrogen-phos- phats über das N4-Acyl-l-(5'-triphenylmethyl-p-D-arabi- nofuranosyl)-cytosin hinzugegeben werden. Nach beendeter Umsetzung wird gewöhnlich eine kleine Menge
Wasser zugesetzt, um den Überschuss an Phosphorylie rungsmittel und an Kondensationsmittel zu inaktivieren.
Die Lösung kann dann filtriert werden, um unlösliches
Material wie die bei der Umsetzung von Carbodiimiden mit Wasser erhaltenen disubstituierten Harnstoffe zu ent fernen, und das Filtrat wird für die nächste Verfahrens stufe, die hydrolytische Reaktion, verwendet.
Die bei der vorherigen Verfahrensstufe erhaltene Lö sung wird mit einer Alkalihydroxydlösung bei niedrigen
Temperaturen umgesetzt, um die gewünschte Hydrolyse zu erreichen. Bei der bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung wird die das N4-Acyl-l-(5'-O4riphenylmethyl- -p-D-arabinofuranosyl)-cytosin - 2'-yl-2 cyanoäthyl-phos phat und N4-Acyl-1-(5'-O-triphenyl-methyl-,8-D-arabino- furanosyl)-cytosin-3'-yl-2-cyanoäthyl-phosphat enthalten de Lösung zuerst auf ein kleines Volumen eingeengt, wo bei die Konzentration vorzugsweise unter Vakuum er folgt.
Wenn das Volumen klein genug ist, so dass das gekühlte Material ein viskoser Rückstand wird, kann man eine 0,4- bis 2-normale Base, z.B. wässriges Lithium-,
Natrium- oder Kaliumhydroxyd zusetzen, bis der pH
Wert der Lösung auf zwischen 12 und 12 ansteigt. Kon zentriertes Ammoniumhydroxyd kann ebenfalls verwen det werden. Diese Umsetzung kann bei Temperaturen zwischen OOC und dem Siedepunkt der wässrigen Lö sung für die Dauer von 10 Minuten bis 24 Stunden durch geführt werden. Nach beendeter Umsetzung wird die Mi schung im allgemeinen gekühlt und filtriert. Aus dem
Filtrat kann das Produkt V und VI nach üblichen Verfahren wie Extraktion, Verdampfung, Ausfällung in Form von unlöslichen Phosphatsalzen, Absorption und Desorption auf Harzen, Umkristallisieren und dgl. gewonnen werden.
In Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen werden ein 1 -(5 -O-Triphenyl-methyl--D-arabinofuranosyl) cytosin-2'-phosphat und 1-(5'-O-Triphenylmethyl-,-D- -arabinofuranosyl)-cytosin-3'-phosphat erhalten, wobei die Acylgruppe am N4 zurückbleibt oder entfernt ist. Insbesondere bei niederen Temperaturen, z.B. 0 bis 20 C, und kurzen Reaktionszeiten, z.B. 10 bis 40 Minuten, kann die Acylgruppe am N4 erhalten bleiben. Falls die das organische Cyanophosphat enthaltende alkalische Lösung bei höheren Temperaturen, z.B. zwischen 75 und 1000C, gehalten wird, kann die Acylgruppe am N4 entfernt werden.
Das auf diese Weise erhaltene 1-(5'-O-Triphenylme thyl-p-D-arabinofuranosyl)-cytosin-2'-phosphat und -3' -phosphat, bei dem gewöhnlich in Abhängigkeit von den Temperaturen und der Zeit des Kontaktes mit der Base das N4-Stickstoffatom noch acyliert ist, es kann aber auch nicht acyliert sein, wird darauf einer Ätherspaltung unterworfen, die mit wässriger Essigsäure durchgeführt wird. Vorzugsweise wird 80%ige wässrige Essigsäure für die Dauer von 4 Stunden bis 4 Tagen bei Raumtemperatur verwendet.
Das Lösungsmittel, Wasser und Essigsäure, können im Vakuum entfernt werden, und die Rohprodukte werden mit wasserfreiem ammoniumalkalischem Methanol oder Äthanol behandelt, wobei die Mischung von l-p-D-Arabinofuranosyl-cytosin-2'-phosphat und 1 -p-Arabinofuranosylcytosin-3'-phosphat erhalten wird, die voneinander durch Chromatographie getrennt werden. Es können aber auch übliche Mittel, wie z.B. Ionenaustauscherchromatographie zu dieser Trennung angewendet werden. Bei einer Modifikation B dieses Verfahrens wird der Äther der Formel II phosphoryliert und ergibt das entsprechende l-(5'-O-Triphenylmethyl-tp-D-arabinofura- nosyl)-cytosin-2'-phosphat u. -3'-phosphat, u. diese Verbindungen werden auf die vorstehend erwähnte Weise unter Verwendung von wässriger Essigsäure einer Ätherab spaltung unterworfen.
Auf diese Weise werden die Verbindungen VII und VIII als Mischung erhalten, die chromatographisch getrennt wird. Als dritte Modifikation kann die Phosphorylierung dieses Ausgangsmaterials I 1 -p-D-Arabinofuranosylcytosin-5'-phosphat, -3'-phosphat und 2' -phosphat ergeben. Diese Verbindungen werden chromatographisch voneinander getrennt.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert.
In den Beispielen werden verschiedene Ionenaustauscherharze verwendet, die wie folgt beschrieben wer den können: Dowex 50 X 8 ist ein starkes Säureaustauscherharz, das aus nuklearen Sulfonsäureaustauschgruppen zu sammengesetzt ist, die an einem Styrolpolymerengitter hängen, das mit etwa 8% Divinylbenzol vernetzt ist.
Dowex AG 50 X 8 ist eine besonders geeignete und grössenmässig sortierte Form des Harzes Dowex
50 X 8 der Dow Company, die von den Bio Rad Labo ratories in Richmond California geliefert wird.
Dowex 50 W X 8 ist eine besonders geeignete
Form von Dowex 50 X 8 , bei der das Harz eine weisse (W) Farbe anstelle der gelb-braunen Farbe von < (Dowex
50 X 8 hat.
Dowex 1 X 8 ist einstark basisches Anionenaustauscherharz, das quaternäre Ammoniumaustauschgrup pen aufweist, die an einem Styrolpolymerengitter hängen, wie es bei Dowex 50 X 8 beschrieben ist.
Dowex AG 1 X 8 ist eine speziell gereinigte und grössenmässig sortierte Form von Dowex 1 X 8 der Dow Company, das von der Bio Lab. in Richmond, California geliefert wird.
Beispiel I l(S'-O-Triphenylmethyl-p-D-arabinof uranosyl)¯cytosin
Einer Lösung von 10 g l-D-Arabinofuranosylcyto- sin-hydrochlorid in 200 ccm Pyridin wurden 12 g Triphenyl-chlormethan zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde danach bei Raumtemperatur (23 bis 260) eine Woche gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann unter Rühren in 3 Liter Eiswasser gegossen, worauf sich l-(5'-O- -Triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin als Öl abtrennte. Das öl kristallisierte nach Abstellen mit Wasser übernacht, und die Kristalle wurden abfiltriert, dann zerkleinert, gründlich mit Wasser gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz an der Luft getrocknet.
Die auf diese Weise erhaltenen Feststoffe wurden mit 200 ccm siedendem Heptan zerrieben und nach dem Trocknen in 1 Liter siedendes Aceton gegeben, das 1 g Aktivkohle ( Darco G-60 ) enthielt. Die heisse Suspension wurde filtriert, um die Kohle zu entfernen, und das Filtrat wurde auf einem Dampfbad auf ein Volumen von etwa 75 ccm de stilliert, das auf Raumtemperatur abkühlen gelassen wurde, wobei ein kristallines Produkt erhalten wurde. Das kristalline Produkt wurde auf einem Sinterglastrichter gesammelt und mit 25 ccm eiskaltem Aceton gewaschen.
Das Produkt wurde dann getrocknet und ergab 13 g 1 -(5'-O-Triphenylmethyl)-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, das bei 227,5 bis 2280C unter Zersetzung schmilzt.
Auf die gleiche Weise können 1-.f5'-O-(p-Methoxy- phenyl) diphenylmethyl - p - D- arabinofuranosyl] - cytosin oder 1-[5'-bis-(p-Mèthoxyphenyl)-phenylmethyl-ss-D -arabinofuranosyl]-cytosin durch Umsetzung von 1-,8-D- -arabinofuranosylcytosin oder dessen Hydrochlorid in Pyridinlösung mit (p - Methoxyphenyl) - diphenylchlor methan bei einer Temperatur zwischen 0 und 600C un ter kontinuierlichem Rühren erhalten werden.
Ähnlich wie in Beispiel 1 kann anstelle von Triphe nylchlormethan Triphenylbrommethan bei Bildung des gleichen Endproduktes 1-(5'-O-Triphenylmethyl)-ss-D-ara binofuranosyl)-cytosin verwendet werden.
Beispiel 2
N4-Benzoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabino furanosyl)-cytosin
Eine Mischung von 5,0 (10,3 mMol) 1-(5'-O-Tri phenylmethyl)-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin 35 ccm trok kenem Pyridin und 5 ccm Benzoylchlorid wurde bei
Raumtemperatur (24-260C) etwa 20 Stunden gerührt.
Die auf diese Weise erhaltene Reaktionsmischung wurde dann in 400 ccm kaltes Wasser gegossen und bei Raum temperatur 18 Stunden gerührt. Der wässrige Teil wurde dann dekantiert und das zurückbleibende gummiartige
Material durch Dekantieren zweimal mit Wasser gewa schen. Der Gummi und die Feststoffe wurden in 300 ccm
Methylenchlorid gelöst und diese Lösung zweimal mit jeweils 50 ccm Wasser und zweimal mit jeweils 50 ccm gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen.
Die Methylenchloridlösung wurde dann getrocknet, in dem man sie durch 10 g wasserfreies Natriumsulfat leitete, und das Filtrat wurde dann unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde in 400 ccm absolutem Methanol und 200 ccm trockenem Tetrahydrofuran aufgenommen. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde mit Eis auf 0 C gekühlt. Die kalte Lösung wurde dann mit 10 ccm 25% Natriummethoxyd in Methanol behandelt. Nach 30 Minuten bei 0 C wurden 110 com Dowex 50 W X 8 (Pyridin)-Harz zugesetzt, worauf der pH-Wert der Lösung auf etwa 7 fiel.
Die auf diese Weise erhaltene Suspension wurde harzfrei filtriert, das Harz mit 250 ccm Mengen Methanol gewaschen und die vereinigten Waschflüssigkeiten und das Filtrat bei 300C unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in einer kleinen Menge Benzol gelöst, die Benzollösung wurde auf einer Kolonne von Silikagel (58mal 4,8 cm) absorbiert, die ein Kolonnenvolumen von 1 Liter hatte. Diese Kolonne wurde zwanzigmal mit jeweils 100 ccm von 2% Methanol in Benzollösung und anschliessend vierzigmal mit jeweils 100 ccm von 5% Methanol in Benzollösung ausgewaschen. Wie durch Dünnschichtchromatographie festgestellt wurde, enthielten die Fraktionen 31-41 das Produkt. Diese Fraktionen wurden vereinigt, Aceton zugesetzt und die Mischung in Form von Mikrokristallen durch Zugabe von Skellysolve B -Hexanen kristallisiert.
Das Material wurde aus Aceton- Skellysolve B -Hexanen umkristallisiert und ergab reines N4-Benzoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin mit einem Schmelzpunkt von 210,5 bis 211,5 C.
Analyse für Cs5H3lOssNs
Berechnet: C 71,9 H 5,32 N 7,19
Gefunden: C 71,41 H 5,59 N 7,46
Beispiel 3
N4-Acetyl-l-(5'-o-rriphenylrrEeittyl-p-D syl) -cytosin A. N4-Acetyl-1-(2',3'-di-O-acetyl-5'-O-triphenylmethyl -p-D-arabinofuranosyl)-cytosin.
Eine Suspension von 750 mg 1-(5'-O-Triphenylmethyl-ss-D-arbainofuranosyl)-cytosin (Beispiel 1) in 9 ccm Pyridin wurde mit 3 ccm Essigsäureanhydrid unter Rühren behandelt, bis eine gleichförmige Lösung erhalten wurde. Das Rühren wurde 2 Stunden fortgesetzt, wobei die Lösung eine kristalline Masse wurde. Dieses Material wurde in 90 ccm Wasser überführt und ergab ein weisses kristallines Material, das abfiltriert wurde: die Feststoffe wurden gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet u. ergaben 950 mg Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 249-259,50C. Dieses Material wurde aus Äthanol umkristallisiert und ergab 800 mg farblose Rosetten aus N4-Acetyl-1-(2',3'-di-O-acetyl-5'-O-triphenylmethyl-p-D-arabinofuranosyl)-cytosin mit einem Schmelzpunkt von 251-252 C.
Analyse für C32Hs307N8
Berechnet: C 66,76 H 5,44 N 6,87
Gefunden: C 67,04 H 5,47 N 7,00 B. N4-Acetyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofura nosyl)-cytosin.
Auf die in Beispiel 2 angegebene Weise wurde N4 - Acetyl -1- (2',3' - di -0- acetyl-5'-O-triphenylmethyl-D- -arabinofuranosyl)-cytosin bei 0 C mit Kaliumäthoxyd in Methylenalkohol von etwa 0 C behandelt und ergab N4-Acetyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin.
Auf die in Beispiel 2 angegebene Weise können andere N4-Acyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin durch Umsetzung von 1-(5'-O-Triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin mit einem Säurechlorid oder einem Säureanhydrid unter Bildung von Verbindungen der Strukturformel IIIa und IIIb hergestellt werden, die bei Umsetzung mit einer Base bei niedriger Temperatur das entsprechende N4-Acyl-l-(5'-O-tri- phenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin (IV) ergeben.
Typische auf diese Weise erhaltene Verbindungen umfassen N4-Anisoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Lauroyl-l -(5'-O-triphenylmethyl-9-D-arabinofurano syl)-cytosin, N4-Propionyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Butyryl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Valeryl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Hexanoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Octanoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Decyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Dodecyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-p-D-arabinofurano-
syl)-cytosin, N4-(ss-Cyclopentylpropionyl)-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss -D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Phenylacetyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Phenylpropionyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Acetyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-diphenylmethyl-ss -D-arabinofuranosyl]-cytosin, N4-Propionyl-1-[5'-O-bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-cytosin, N4-Phenylacetyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-fluorcytosin, N4-Butyryl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-chlor-cytosin, N4-Hexanoyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-diphenylmethyl -ss-D-arabinofuranosyl]-5-bromcytosin, N4-Octanoyl-1-[5'-O-bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-jod-cytosin, N4-Lauroyl-1-[5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-methylcytosin, N4-Decanoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-5-trifluormethylcyt
tosin, N4-Heptanoyl-l -[5'-O-(p-methoxyphenyl)-diphenylme- thyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-methylcytosin, N4-Nonyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-diphenylmethyl -ss-D-arabinofuranosyl]-5-methylcytosin, N4-Undecanoyl-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-5-fluorcytosin und dgl.
Beispiel 4
N4-Benzoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofurano syl)-cytosin-2'-phosphat und N4-Benzoyl-1-(5'-O-triphe nylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin-3'-phosphat
Eine Lösung von 590 mg N4-Benzoyl-1-)5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin in 10 ccm Pyridin, die 1,5 ccm M 2-Cyanoäthyl-phosphat (1,5 Millimol) enthielt, wurde in Vakuum bei 40 C eingedampft.
Dieses Verfahren wurde zweimal wiederhol, und danach wurde der Rückstand in 5 com gereinigtem Pyridin aufgenommen und 600 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und die Lösung bei Raumtemperatur in der Dun- kelheit 2 Tage geschüttelt. Dieser Reaktionsmischung wurden 5 com Wasser zugesetzt und die Lösung dann bei Raumtemperatur 2 bis 3 Stunden gerührt. Der unlösliche Feststoff wurde abfiltriert, mit 1,2 ccm Pyridin gewaschen und das vereinte Filtrat zweimal mit Skelly- solve B -Hexanen gewaschen. Die Skellysolve B))-Hexa- nen wurden unter verrtngertem Druck entfernt und die verbleibende Pyridinlösung auf die Temperatur von Eis abgekühlt.
Diese Lösung wurde dann mit 6,5 ccm 2-N wässrige Natriumhydroxyd 20 Minuten bei niedriger Temperatur (etwa 0 C) behandelt. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 15 ccm Pyridin Dowex 50 W X 8 -Harz beendet. Die harzfreie Lösung und drei Waschflüssigkeiten aus jeweils 5 ccm 50prozentigem wässri- gem Pyridin wurden vereinigt und dann bei 40 C unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Die auf diese Weise erhaltenen Rohmaterialien, eine sowohl das 2'- als auch das 3'-Phosphat von N4-Benzoyl-1-(5'-O-tri- triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-cytosin enthaltende Mischung wurde für die nächste Verfahrensstufe nicht getrennt.
Die Trennung von N4-Benzoyl-1-(5'-O-triphenylme- thyl-ss-D-arabinofuranosyl]-cytosin-2'-phosphat von dem entsprechenden 3'-Phosphat erfolgt chromatographisch auf die in Beispiel 5 für die Endprodukte, die 2'- und 3' Phosphate von 1-ss-D-arabinofuranosylcytosin, gezeigte Weise. Auf diese Weise wurden N4-Benzoyl-1-[5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-cytosin-2'-phosphat und -3'-phosphat erhalten. Auf die gleiche Weise werden andere 2'- und 3'-Phosphate von N-Acyl-1-(5'-O-T9-D- -arabinofuranosyl)-cytosin erhalten, wobei T die vorste hend angegebene Bedeutung hat.
Beispiel 5
1-ss-D-Arabinofuranosycytosin-2'-Phosphat und 1-ss-D-Arabinofuranosycytosin-3'-phosphat
Die Gesamtmenge des Produktes des Beispiels 4, das aus N4-Benzoyl-1-[5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-cytosin-2'-und 3'-phosphaten bestand, wurde mit 30 com 80% wässriger Essigsäure aufgenommen und diese Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 56 Stunden abgestellt. Die wässrige Essigsäure wurde dann bei 40 C in Vakuum entfernt und der trockene Rückstand in 100 com Wasser suspendiert und filtriert, bis er frei von Tritylalkohol war. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei ein hellgelbes gummiartiges Material erhalten wurde, das gemäss Dünnschichtgromatographie aus zwei Hauptprodukten, N4-Benzoyl -1-B'-D-arabinofuranosylcytosin-2'-phosphat und -phosphat, bestand.
Dieser Rückstand wurde in 3 com gesättigtems wasserfreiem ammoniakalischem Methanol aufgenommen und die erhaltene Lösung 18 Stunden bei Raumtemperatur (2-25 ) abgestellt. Das Lösungsmittel und Ammoniak wurden unter verringertem Druck entfernt und der erhaltene Rückstand in einem kleinen Volumen Wasser aufgenommen und auf einer Kolonne von 2,8 X 24 cm chromatographiert, die mit Dowex AG 1 X 8)y (Formiat) Ionenaustauscherharz gefüllt war, wobei zuerst mit 2 Litern 0,01 molarer Ameisensäure und anschliessend mit 5 Litern 0,02 molarer Ameisensäure aus gewaschen wurde und Fraktionen von jeweils 20 ccm aufgefangen wurden.
Die das 2'-Phosphat enthaltenden Fraktionen kamen zuerst, wie anhand des NMR-Spektrums und der erwarteten Zurückhaltung des Produkts festgestellt wurde. Diese Fraktionen wurden vereinigt, einer Gefriertrocknung unterworfen und aus Wasser umkristallisiert und ergaben l-,8-D-Arabinofuranosylcytosin- -2'-phosphat mit einem # pmaxs von 274 mF, dessen Struktur durch kernmagnetische Resonanz bestätigt wurde.
In den späteren Fraktionen wurde das 1-ss-D-Arabinofuranosyl]-cytosin-3'-phosphat erhalten, das ein #maxpH5 von 274 m hat.
Beispiel 6
N4-Acetyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabino furanosyl)-cytosin-2' -phosphat und -3'-phosphut
Auf die in Beispiel 4 angegebene Weise wurde N4 -Acetyl-1-(5'-O-triphenyl-methyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin mit 2-Cyanoäthylphosphat in Gegenwart von N,N' -Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt, und das Produkt mit Kaliumäthoxyd behandelt. Man erhielt eine Mischung von N4-Acetyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabifuranosy)-cytosin-2'-phosphat und N4-Acetyl-1-(5'-Otriphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosy)-cytosin-3'-phosphat.
Beispiel 7
1-ss-D-Arabinofuranosylcytosin-2'-phossphat und 1-ss-D-Arabinofuranosylcytosin-3'-phossphat
Auf die in Beispiel 5 angegebene Weise wurde die Mischung des 2'- und 3'-Phosphats von N4-Acetyl-l-(5' -O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosy)-cytosin zuerst der Ätherabspaltung mit 80% wässriger Essigsäure und darauf der Amminolyse mittels mit Ammoniak gesättigtem Methanol unterworfen und ergab l-p-D-Arabino- furanosylcytosin-2'-phosphat und l-p-D-Arabinofurano- sylcytosin-3'-phosphat, die voneinander durch Ionenaustauscherchromatographie getrennt werden konnten.
Auf die in Beispiel 4 angegebene Weise konnten andere N4-Acyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin durch Behandlung mit 2-Cyanoäthylphosphat in Gegenwart eines Carbodiimids und anschliessende Behandlung mit einer Base wie Lithiumhydroxyd, Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd für kurze Zeitspannen und bei niedriger Temperatur in ihre 2'- und 3'-phosphate umgewandelt werden. Typische Verbindungen, die auf diese Weise erhalten wurden, sind u.a. das 2'-Phosphat und das 3-Phosphat von N4-Lauroyl-1-(5'-O-triphenylmethylz,(3-D-arabinofurano- syl)-cytosin, N4-Anisoyl-1-(5'-O-triphenylmethyli3-D-arabinofurano- syl)-cytosin.
N4-Propionyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Butyryl 1 -(S'-O-triphenyl-p-D-arabinofuranosyl)-cyto- sin, N4-Valeryl-1-(5'-triphenylmethyl9-D-arabinofuranosyl)- -cytosin, N4-Hexanoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Octanoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Decyl-1-(5'-O-triphenylmethyl,8-D-arabinofuranosyl)- -cytosin, N4-Dodecyl-1-(5'-O triphenylmethylss-D-arabinofurano- syl)-cytosin, N4-(frCyclopentylpropionyl)- 1 -(5-'-O-triphenylmethyl-,8- -D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Phenylacetyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N4-Phenylpropionyl- 1 -(5'-O-triphenylmethyl-p-D-ara- binofuranosyl)-cytosin und dgl.
Nach den in den Beispielen 1 und 2 angegebenen Verfahren können N4-Acyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-diphenylmethyl-ss-D -arabinofuranosyl]-cytosine und N4-Acyl-1-[5'-O-bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-ss -D-arabinofuranosyl]-cytosine und deren 5-substituierte Analoge hergestellt werden wie z. B.
N4-Anisoyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-diphenylmethyl ss-D-arabinofuranosyl]-cytosin; N4-Acetyl-1-[5'-O-bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl -,8-D-arabinofuranosyl] -5-trifluormethylcytosin, N4-Acetyl 1 -(5'-O-triphenylmethyl-p-D-arabinofurano- syl) -5-fluorcytosin, N4-Benzoyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-diphenylmethyl -ss-D-arabinofuranosyl]-5-chlorcytosin, N4-Benzoyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-bromcytosin, N4-Phenyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-jodcytosin, N4-Lauroyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-fluor-cytosin, N4-(ss-Cyclopentylpropionyl)-1-[5'-O-bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-ss-D-arbainofuranosyl]-5-trifluormethylcytosin, N4-Acetyl-l-[5'-O- (p-methoxyphenyl)-diphenylmethyl- --D-arabinofuranosyU-cytosin, N4-Propionyl- 1
-[5'-O-bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-cytosin, N4-Phenylacetyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-fluorcytosin, N4-Butyryl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-chlorcytosin, N4-Hexanoyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-diphenylmethyl -ss-D-arabinofuranosyl]-5-bromcytosin, N4-Octanoyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-jodcytosin, N4-Lauroyl-1-[5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-methylcytosin, N4-Decanoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-5-trifluormethylcytosin, N4-Heptanoyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-diphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl]-5-methylcytosin, N4-Nonoyl-1-[5'-O-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-ss-Darabinofuranosyl]-5-chlorcytosin, N4-Undecanoyl-1-(5'-O-triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-5-fluorcytosin und dgl.
Diese Verbindungen können mit 2-Cyanoäthylphosphat in Gegenwart eines Carbodiimids phosphoryliert werden, worauf wie in Beispiel 4 angegeben die Behandlung mit einer Base unter Bildung des entsprechenden 2'- und 3'-Phosphate desd vorgenannten N4-Acyl-1-(5'-Otriphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosins erfolgt.
Diese Verbindungen ergeben bei Behandlung mit wässriger Essigsäure und anschliessend Methanol oder Äthanol, das mit Ammoniak gesättigt ist, in kaltem Zustand auf die in Beispiel 5 beschriebene Weise das 2' Phosphat und 3'-Phosphat von 1-ss-D-Arabinofuranosylcytosin.
Beispiel 8
1-(5'-O-Triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin -2'-phosphat und 1-(5'-O-Triphenylmethyl-ss-D-arabino furanosyl)-cytosin-3'-phosphat
Auf die in Besipiel 4 beschriebene Weise wurden 970 mg 1-(5'-O-Triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl) -cytosin mit 2-Cyano-äthyl-phosphat in Gegenwart von N,N-Dicyclohexylcarhodiimid behandelt und das Produkt mit wässrigem Natriumhydroxyd bei einer Temperatur von OOC behandelt. Man erhielt eine Mischung des 2'-Phosphats und des 3'-Phosphats von 1-(5'-Triphenyl methyl-B-D-arabinofuranosyl)-cytosin.
Beispiel 9
1-ss-D-Arabinofuranosylcytosin-2'-phosphat und 1-ss-D-Arabinofuranosylcytosin-3'-phosphat
Die Mischung der 2'- und 3'-Phosphat von 1-(5'-O -Triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-cytosin (aus Beispiel 8) wurde in 100 ccm 80% wässriger Essigsäure gelöst. Diese Mischung wurde 4 Tage bei Raumtemperatur abgestellt. Danach wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck bei 400C entfernt und man erhielt einen trockenen Rückstand, der in einer kleinen Menge Wasser aufgenommen, durch Filtrieren von Triphenylcarbinol befreit und auf einer 2,8 x 24 cm Kolonne von Dowex AG 1 X 8 (Formiat) -Ionenaustauscherharz absorbiert und mit 7 Litern 0,01 molarer Ameisensäure gefolgt von 5 Litern 0,02 molarer Ameisensäure ausgewaschen wurde, wobei Fraktionen von jeweils 20 ccm aufgefangen wurden.
Die Fraktionen 195 bis 210 wurden vereinigt und aus gefrorenem Zustand getrocknet und ergaben 10 mg 1-ss-D-Arabinofuranosylcytosin-2'-phosphat.
Die Fraktionen 426 bis 470 wurden vereinigt, aus gefrorenem Zustand getrocknet u. isoliert u. ergaben 112 mg 1-ss-D-Arabinofuranosylcytosin-3'-phosphat.
Beispiel 10
1-ss-D-Arabinofuranosylcytosin-2'-phosphat, 1-ss-D
Arabinofuranosylcytosin-3'-phosphat und 1-ss-D
Arabinofuranosylcytosin-5'-phosphat
Es wurde eine Lösung hergestellt, die 2,8 g 1-ss-D -Arabinofuranosylcytosin-hydrochlorid, 34 ccm 0,325 molares Pyridin-cyanoäthylphosphat (11 Milimol), dem weitere 16 ccm trockenes Pyridin zugesetzt worden waren, und 4,75 g Dicyclohexylcarbodiimid 822 Millimol) enthielt. Diese Lösung wurde im Dunkeln 48 Stunden gerührt. Der erhaltenen farblosen Suspension wurden 10 ccm Wasser zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur (etwa 240C) eine Stunde gerührt, danach wurde mit weiterem Wasser (20 ccm) verdünnt und der unlösliche Harnstoff abfiltriert. Das Filtrat wurde dann im Vakuum zur Trockene eingedampft, erneut in 50 ccm Wasser gelöst und zur Entfernung des zurückgebliebenen Pyridins wiederum zur Trockene eingedampft.
Der Rückstand wurde zwischen 75 ccm Wasser und 75 ccm Äther getrennt Der Ätherteil wurde verworfen und der wässrige Teil im Vakuum destilliert, bis er frei von Äther war und dann mit 2,16 g Lithiumhydroxyd (90 Millimol) bei 110 C 1 Stunde behandelt und danach die gekühlte Suspension durch Filtrieren von Lithiumphosphat befeeit. Die Lösung wurde dann durch Zugabe von Dowex 50 X 8 Harz (H+-Form) auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die Lösung wurde zur Erzielung einer harzfreien Lösung filtriert, deren Volumen unter verringertem Druck auf 25 ccm eingeengt wurde. Dieses Konzentrat wurde durch eine 75 ccm Kolonne aus Dowex 50 X 8) > -Harz gegeben, die dann mit Wasser ausgewaschen wurde, bis der pH-Wert des Eluats etwa 5 be trug. Das abfliessende Material (ca. 250 ccm) wurde mit Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt.
Das Volumen der Lösung wurde auf 25 ccm verringert und die Lösung auf einer Kolonne von Dowex AG 1 X 8 (Formiat) absorbiert, die ein Kolonnenvolumen von 150 ccm hatte. Die Kolonne wurde mit einem Kolonnenvolumen Wasser und dann 0,02 molarer wässriger Ameisensäurelösung ausgewaschen, bis aus der Kolonne eine Lösung erhalten wurde, die für Ultraviolettlicht undurchlässig war (Vanguard 1056 O.D. Kolonnenmonitor bei 260 m ). Das abfliessende Material wurde bei einer Fliessgeschwindigkeit von 2 ccm pro Minute in Fraktionen von 20 ccm aufgefangen. Die Fraktionen 90 bis 160, die das Hauptprodukt l9-D-Arabinofuranosyl- cytosin-5'-phosphat enthielten, wurden vereinigt, aus gefrorenem Zustand getrocknet und ergaben 40 mg dieses Materials.
Die Fraktionen 125 bis 152 wurden vereinigt und lyophilisiert und ergaben einen farblosen Gummi, der aus dem 2'- und 3'-Phosphat von 1-ss-D-Arabinofuranosylcytosin bestand. Die Abtrennung des 2?-Phos- phats von dem 3'-Phosphat des ly,B-D-Arabinofuranosyl- cytosins wurde auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise durchgeführt.
Beispiel 11
1-ss-D-Arabinofuranosyl-5-fluormethylcytosin-2' -phosphat und -3'-phosphat
Auf die in Beispiel 8 angegebene Weise wurde 1-(5' -O-Triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-5-trifluormethylcytosin mit 2-Cyanoäthylphosphat in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und danach mit Lithiumhydroxyd behandelt und ergab eine Mischung des 2' -Phosphats und des 3'-Phosphats von 1-(5'-O-Triphenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)-5-trifluormethylcytosin.
Die Behandlung dieser Mischung wie in Beispiel 9 mit wässriger Essigsäure ergab die 2'- und 3'-Phosphate von 1-ss-D-Arabinofuranosyl-5-trifluormethylcytosin, die fdurch Chromatographie in die Komponenten, 1-ss-D-Arabinofuranosyl-5-trifluormethylcytosin-2'-phosphat und 1 -ss-D-Arabinofuranosyl-5-trifluormethyl-cytosin-3'-phosphat, getrennt werden konnten.
Beispiel 12
1-ss-D-Arabinofuranosyl-5-fluormethylcytosin-2#-phosphat,
I -ss-D-Arabinsf uranosyl-S-fluarcytosin-3'-phosphat,
I -!p-D-Arabinof uranosyl-S-f Zorcytosin-S'-phosphat
Auf die in Beispiel 10 angegebene Weise wurde 1e- -D-Arabinofuranosyl-5-fluorcytosin mit 2-Gyanoäthyl- -phosphat in Gegenwart von N,N-Dicyclohexylcarbodiimid phosphoryliert und danach mit Lithiumhydroxyd unter Bildung einer Mischung der drei möglichen Phosphate behandelt, die durch Chromatographie in ihre Bestandteile, 1-ss-D-Arabinofuranosyl-5-fluormethylcytosin-2' -phosphat, 1-ss-D-Arabinofuranosyl-5-fluormethylcytosin-3' -phosphat, 1-ss-D-Arabinofuranosyl-5-fluormethylcytosin-5' -phosphat getrennt wurden.