Verfahren zur Herstellung einer therapeutisch aktiven Aspergillopeptidase zur Verhinderung der Bildung von Blutgerinnseln
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Aspergillopeptidase, die in der Lage ist, das Anhaften und Zusammenballen von Blutplättchen herabzusetzen, sowie ein Verfahren zur Verhinderung der Bildung von Blutgerinnseln und Embolie, hierfür verwendete pharmazeutische Präparate sowie ein Verfahren zur Herstellung der Peptidase und der Präparate.
Ein Thrombus kann als ein Pfropfen oder Klümpchen in einem Blutgefäss oder in einer der Herzkammern charakterisiert werden, welches an der Stelle seiner Bildung verbleibt. Im Falle, dass ein solches Blutgerinnsel von dem Blutstrom ergriffen und zu einem entfernt gelegenen Blutgefäss gebracht wird, wo es in ein engeres Gefäss hineingezwängt wird und stecken bleiben kann, so dass es die Blutzirkulation verstopft, spricht man von einem Embolus. Der Mechanismus von deren Bildung ist komplexer Natur und besteht in der Hauptsache aus der Zusammenballung und dem Verkleben der Blutplättchen (Thrombozyten) und sekundär aus einer Plasmagerinnung und anderen Faktoren.
Die meisten Wissenschaft ler stimmen darin überein, dass die erste Ursache für die Bildung von Thrombi und Emboli in einer Störung des funktionellen Betragens der Blutplättchen und in einer erhöhten Neigung zu deren Zusammenballung zu suchen ist Csiehe beispielsweise A. Hellem und P.A. Owren, Acta Haematologica, Band 31 (1964), Seite 230, Leitartikel Lancet 2 (1964), Seite 2953.
Nach dem Anhaften an Gewebezellen oder Collagenphasern oder nach Zusammenballung unterliegen die Plättchen strukturellen Änderungen, einer viskosen Me tamorphosexy und bilden einen weissen Kopf , der der Kern für den Thrombus ist.
In den letzten Jahren wurden daher beachtliche Bemühungen unternommen, den Mechanismus des Anhaftens und der Zusammenballung der Blutplättchen aufzuhellen. Man fand zahlreiche Mittel, die eine Zusammenballung einleiten, und Thrombin und Adenosindiphosphat (ADP) sind jene, die am umfangreichsten untersucht wurden. Man fand Substanzen, die in vitro und/oder in vivo das Anhaften und die Zusammenballung von Blutplättchen verhindern. So wurde behauptet, dass Nialamid unter bestimmten Umständen wirksam ist, aber dies konnte nicht bestätigt werden. Blutplättchen kann man auch auf Oberflächen und aneinander nicht haftend machen, indem man Kokain zu setzt, doch benötigt man dann eine derart hohe Konzentration, dass diese für das gesunde Tier tödlich wäre.
Adenosin oder Adenosin-monophosphat (AMP), hemmen das Anhaften und das Zusammenballen von Blutplättchen, doch werden diese Stoffe schnell entfernt, wenn sie in die Blutbahn eingespritzt werden. The- rapeutisch verträgliche Dosen von Phenolamin zeigten keine nachweisbare Wirkung auf die Blutplättchen oder auf die Blutungszeit. Makromoleküle, wie Dextran, und niedermolekulares Polybren stören ebenfalls das Anhaften und die Zusammenballung von Blutplättchen. Auch Monojodacetat macht Blutplättchen nach einer halben Stunde nicht anhaftend. Selbstverständlich ist keine dieser Methoden klinisch verwendbar.
[J.R. O'Brien, Leitartikel in Blood 23 (1964), Seite 309].
Durch die Therapie mit Antikoagulantien, wie Heparin oder Cumarinderivaten, wird der Sekundärprozess, die Plasmagerinnung, blockiert, doch wird das Anhaften und Zusammenballen der Blutplättchen dadurch nicht beeinflusst. Selbst Heparin, welches das kräftigste Antikoagulans ist, wirkt dem Anhaften auf Glas oder der durch ADP verursachten Zusammenballung nicht entgegen. Demnach muss bei der Verhinderung von thrombotischen Verstopfungen, namentlich auch bei Koronarthrombose, der Einfluss auf die Zusammenballung der Blutplättchen von grösserer Wichtigkeit als der auf die Blutgerinnung sein.
Man fand, dass ein erhöhtes Zusammenballen, verbunden mit einer verstärkten Bildung von Thrombi und Emboli, bei vielen verschiedenen Krankheitsarten, wie auch nach grösseren chirurgischen Eingriffen und Geburten zu beobachten ist, und demnach muss eine Verbindung, die ein anormal starkes Zusammenballen der Blut plättchen vermindert, als Substanz von grossem praktischen Wert angesehen werden. Bis jetzt ist jedoch noch kein klinisch wirksames Präparat hierfür verfügbar.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Substanz oder ein Präparat zu schaffen, das in der Lage ist, die Bildung von Thrombi und Emboli durch Herabsetzung des Anhaftens und Zusammenballens von Blutplättchen zu verhindern. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verhinderung der Bildung von Thrombi und Emboli bei Tieren und Menschen zu liefern.
Ein weiteres Ziel ist es, für die Behandlung von Tieren und Menschen zur Verhinderung der Bildung von Thrombi und Emboli verwendbare pharmazeutische Präparate zu schaffen. Noch eine andere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung solch einer Substanz oder solch eines Präparates zu liefern.
Nach der Erfindung erreicht man diese Ziele durch eine bisher unbekannte Aspergillopeptidase, die nachfolgend beschrieben wird.
Die Herstellung, Isolierung u. Charakterisierung einer Aspergillopeptidase, genannt Protease I, wurde von Bergkvist beschrieben, (R. Bergkvist, Acta Chem. Scand., Band 17 (1963), Seite 1521, 1541, 2230 und 22393. Von diesem Enzym wurde behauptet, dass es ein einheitliches Protein sei, das zur Auflösung von Blutklümpchen durch seine fibrinolytische Aktivität verwendet werden könne.
Es wurde berücksichtigt, dass dieses Enzym die Komponenten von Blut oder Plasma nicht wesentlich beeinflusst. Es ist jedoch nicht in der Lage, das Anhaften von Blutplättchen zu vermindern und die Zusammenballung von Blutplättchen zu verhindern. Nun wurde gefunden dass das von Bergkvist beschriebene Verfahren so modifiziert werden kann, dass man ein Enzympräparat erhält, das entgegen der Protease I in der Lage ist, das Anhaften von Blutplättchen zu vermindern und das Zusammenballen der Blutplättchen zu verhindern und damit die Bildung von Thrombi zu unterbinden.
Dieses neue Enzym kann man durch Behandlung eines Proteasegemisches erhalten, welches aus der Kulturflüssigkeit von Aspergillus oryzae, (Bergkvist, a.a.O., Seite 1537) mit Tannin ausgefällt wurde, worauf das wieder-gelöste Produkt bei pH 5,5 auf CM-Zellulose absorbiert, aber mit 0,005 m Ammoniumacetatpuffer mit pH 7,5 anstelle von Phosphatpuffer eluiert wird. Der Bequemlichkeit halber wird das trockene, pulverartige Präparat dieses Eluates in der nachfolgenden Beschreibung als Enzymgemisch A bezeichnet. Das Enzymgemisch A besitzt eine Wirksamkeit bei Konzentrationen unterhalb derer einer physiologisch auftretenden Enzymhemmung für Protease I. Bei der fraglichen Konzentration liegt keine freie fibrinolytische Wirkung vor, und man fand keine schädliche Wirkung auf das Koagulationssystem des Blutes.
Die klinische Verträglichkeit der Enzymmischung A ist unter diesen Bedingungen ausgezeichnet.
Im Hinblick auf diese neuen Antihafteigenschaften und Antizusammenballungseigenschaften des Enzympräparates wurden weitere chemische Experimente durchgeführt, und nach immunologischen Verfahren, Immunodiffusion und Immunoelektrophorese, fand man, dass dieses Enzympräparat ein Gemisch ist und dass es möglich ist, Komponenten voneinander zu trennen, von denen eine, genannt Aspergillopeptidase ARL 1, für die Wirkung auf die Blutplättchen verantwortlich ist, während die anderen Komponenten im wesentlichen frei von dieser Wirkung sind. Dieses neue Enzym kann auch aus anderen Aspergillopeptidasepräparaten isoliert werden.
Die erfindungsgemäss erhältliche Aspergillopeptidase ARL 1 ist, wie man fand, eine Substanz von solchen Eigenschaften, die eine definierte chemische Zusammensetzung anzeigen, doch können möglicherweise kleine Variationen vorliegen. Sie ist durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet:
a) Ein Protein gleichmässiger Zusammensetzung, b) leicht löslich in Wasser, Salzlösung und herkömm- lichen gepufferten Lösungen, c) stabil und ihre enzymatische Aktivität bei Raumtemperatur mehr als 1 Jahr in Form eines trockenen Pulvers behaltend, d) stabil in etwa neutraler, wässriger Lösung bei 40C praktisch ohne Verlust der enzymatischen Aktivität während mehr als 2 Monaten, e) stabil in etwa neutraler, wässriger Lösung bei 370C praktisch ohne Verlust der enzymatischen Aktivität während mehr als 24 Stunden, f) mit einem für aromatische Aminosäuren enthaltende Proteine charakteristischen Ultraviolettspektrum, g) proteolytisch aktiv gegen Kasein, Hämoglobin und Fibrin, h) mit einem proteolytischen Optimum mit Hämoglobin bei pH 5,0 bis 5,5,
i) nicht in der Lage, Natriumtosyl-l-arginin-äthylester und N-Acetyl-l-tyrosin-äthylester zu hydrolysieren, j) fähig, das Anhaften und Zusammenballen von Blutplättchen zu vermindern, k) Absorbierbarkeit auf Carboxymethylcellulose bei pH5,5,
1) Eluierbarkeit daraus durch auf pH 7,5 gepufferte Ammoniumacetatlösung mit einer Molarität höher als 0,005 und vorzugsweise gleich oder höher als 0,01 bis 0,10, m) sie wird während der Chromatographie durch Amberlites CG 50 II, welches äquilibriert und mit 0,01 molarem Phosphatpuffer auf pH 7,5 eluiert wird, aufgehalten, n) läuft durch eine Hydroxylapatitsäule, die äquilibriert und mit 0,001 molarem Phosphatpuffer auf etwa 6,80 eluiert wird, ohne irgendeine bemerkenswerte Adsorption,
o) wird während der Gel-Filtration durch Sephadex G: 50 F so verzögert, dass sie in dem Auslauf mit ihrem Maximum bei etwa einem Drittel des Volumenunterschiedes des Auslaufes für Glukose und des Auslaufes für Dextran von einem Molekulargewicht von 5:105 erscheint (siehe Beispiel 3), p) und besitzt ein Molekulargewicht, das durch Gel Filtration als geringer bestimmt wurde, als das der Aspergillopeptidase Protease I, die ein Molekulargewicht von 20 000 bis 30 000 bei Bestimmung mit der Ultrazentrifuge besitzt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung einer therapeutisch aktiven Aspergillopeptidase, Aspergillopeptidase ARL 1, die zur Behandlung von Tieren und Menschen zur Vermeidung von Thromben und Embolien geeignet ist, durch Chromatographieren einer Lösung von Aspergillopeptidasen, erhalten durch EQultivie- rung von Aspergillus oryzae und Vorreinigung durch Fällung mit Tannin oder Lignin, bei einem pH und einer lonenkonzentration, bei welchen die Bindung am Trennmittel für Aspergillopeptidase ARL 1 anders ist als für die Mehrzahl der anderen vorhandenen Aspergillopeptidasen und der anderen vorhandenen Proteine, wonach die Lösungsphase von der Trennmittelphase getrennt wird, so dass eine Anreicherung an Aspergillopeptidase ARL 1 erzielt wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung,
welche die Aspergillopeptidase enthält, mit einem Trennmittel für Proteine behandelt, das (a) Hydroxylapatit oder (b) Diäthylaminoäthylcellulose oder ein Carboxylgruppen enthaltendes Polymer auf Basis von Polysaccharid, Polystyrol oder Polyacrylamid ist, wobei im Fall (a) der Verwendung von Hydroxylapatit die Begleitstoffe vom Trennmittel zurückgehalten werden und ein in bezug auf Aspergillopeptidase ARL 1 angereichertes Eluat erhalten wird, während im Fall (b) die Aspergillopeptidase ARL 1 in der Trennmittelphase angereichert und dann eine an Aspergillopeptidase ARL 1 angereicherte Fraktion vom Trennmittel mit einer 0,005 bis 0,100 molaren und auf pH 6-8 gepufferten Ammoniumacetatlösung eluiert wird.
Die Trennung der Komponenten erfolgt dabei in beiden Fällen aufgrund der unterschiedlichen Reaktionsfähigkeit der Komponenten mit den Trennmitteln, d.h. nicht nur im Falle der unter (b) genannten Trennmittel sondern auch im Falle des Hydroxylapatits beruht die Trennwirkung auf lonenaustauscheffekten (vgl. z.B. Klas-Bertil Augustinsson Experimentell Biokemi > y 1966, Seite 75).
Als Medium ist im allgemeinen Wasser bevorzugt, u.
es kann durch Zugabe von beispielsweise Natriumchlorid, Glukose oder Lävulose isotonisch gemacht werden. In Fällen, in denen die Verwendung anderer Arzneimittel angezeigt erscheint, können diese zu den einspritzbaren Lösungen zugesetzt werden, vorausgesetzt, dass sie mit diesen verträglich sind. Bei der Durchführung der oben beschriebenen Stufen müssen die speziellen Verfahrensbedingungen selbstverständlich im Hinblick auf die Eigenschaften der Aspergillopeptidase ARL 1 so gewählt werden, dass deren Anreicherung oder Isolierung gefördert wird, wie dies für den Fachmann selbstverständlich ist.
In den Enzymmischungen A, auf die sich auch die Beispiele beziehen, fand man, dass die Menge des neuen Enzyms bei etwa einem Gew.-%, berechnet auf trocknes Pulver, liegt. Man kann aber auch beachtlich mit Aspergillopeptidase ARL angereicherte Präparate erhalten, wenn man ein rohes, aus dem Kulturmedium von Aspergillus oryzae (siehe R. Bergkvist, a.a.O.) mit Tannin oder Lignin ausgefälltes Proteasegemisch mit Carboxymethylzellulose bei pH 5,5 behandelt und die nachfolgende Eluierung mit Pufferlösungen durchführt, deren Konzentrationen von Molaritäten von beispielsweise etwa 0,005 oder weniger bis auf Molaritäten von 0,01 bis 0,1 allmählich ansteigen (welche letztere höher liegen als jene, die von Bergkvist verwendet wurden). Die günstigsten Ergebnisse erhält man mit einer Carboxymethylzellulose, die 0,7 bis 0,9 milliäquivalente Carboxylgruppen pro Gramm Carboxymethylzellulose enthält.
Die Anreicherung an ARL 1 kann variiert werden, indem man den pH-Wert variiert, bei dem die Enzyme auf der Carboxymethylzellulose absorbiert werden. Ausserdem ist es möglich, bestimmte synthetische Ionenaustauscher, wie jene auf der Basis von Polystyrol oder Polyacrylamid, anstelle von Carboxymethylzellulose zu verwenden, um den Anteil an Aspergillopeptidase ARL 1 zu steigern.
Das neue Enzym nach der Erfindung läuft durch eine Kalziumphosphatsäule bei einem pH-Wert von 6,80 und bei einer Verwendung einer Phosphatpufferkonzentration von 0,001 m ohne beachtliche Adsorption. Dieses Betragen ist typisch für kleine Moleküle, wie Peptide, und für neutrale und einige basische Moleküle [A. Tiselius et al., Arch. Biochem & Biophys., Band 65 (1956), Seite 1323.
Aspergillopeptidase ARL 1 wird von schwach sauren Ionenaustauschern, wie Amberlites CG: 50 II, in Gegenwart eines 0,01 m Phosphatpuffers bei pH 7,5 adsorbiert. Verglichen mit der Hauptkomponente (Protease I) des Enzymgemisches A wird Aspergillopeptidase ARL 1 stärker sowohl auf synthetischen wie auch von Zellulose hergeleiteten sauren Ionenaustauschern adsorbiert.
Aspergillopeptidase ARL 1 wird mehr als die anderen Komponenten des Enzymgemisches A zurückgehalten, wenn dieses aus einer Säule mit quervernetzten Gel Filtrationsmaterialien durch Chromatographie auf beispielsweise Sephadex-Säulen (G: 50, G: 75 oder G: 100) eluiert wird. Wie man fand, ist es möglich, die Protease 1 vollständig von der Aspergillopeptidase ARL 1 abzutrennen. Aus dieser Durchlaufverzögerung kann man schliessen, dass das Molekulargewicht von Aspergillopeptidase ARL 1 geringer als etwa 20 000 bis 30 000, geringer also als das durch Ultrazentrifugieren für Protease I bestimmte Molekulargewicht ist. Ausserdem fand man, dass Aspergillopeptidase ARL 1 auf einem Sephadex G: 50 zu etwa 30% des Unterschiedes zwischen dem Eluiervolumen von Glukose und dem von Dextran mit einem Molekulargewicht von 5 X 105 verzögert wird.
Dieses letztere Gel verzögert Dextranmoleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 8000 bis 10000.
Bei der Stärke-Gel-Elektrophorese wandert Aspergillopeptidase ARL 1 als eine einzige breite Spitze mit einer Beweglichkeit von 2,0 bis 2,5 cm pro Stunde bei 35 Volt pro Zentimeter in einem 0,01 m Boratpuffer von pH 8,9. Die Beweglichkeit der Hauptspitze in dem Enzymgemisch A unter den gleichen Bedingungen betrug 0,5 bis 0,8 cm. Die Wanderung verlief in beiden Fällen zu dem negativen Pol hin.
Die Aktivität von Aspergillopeptidase ARL 1 gegen Kasein wurde mit der bei Bergkvist beschriebenen Methode bestimmt. Das Kasein wurde mit Johnson-Lindsay Puffer (R. Bergkvist a.a.O.) gepuffert. Man fand, dass die Hydrolyse bei pH 7,4 direkt proportional der bis zu 0,3 mg vorhandenen Enzymmenge ist. Aspergillopeptidase ARL 1 in einer Menge von 0,1 mg ergibt nach Inkubation mit Kasein bei pH 6,85 während 20 Minuten bei 37CC ein Ansteigen der optischen Dichte um 0,170.
Die Aktivität von Aspergillopeptidase ARL 1 gegen Fibrin wurde nach dem Verfahren von Dyer und Kader [A.E. Dyer und D. Kader, Blood Band 23 (1964), Seite 7293 demonstriert. Dieses Vetrfahren wurde auch dazu verwendet, die Hemmung durch Diisopropylfluorphosphat zu untersuchen. Aspergillopeptidase ARL 1, sowie auch Protease I, wurde gehemmt. In dieser Hinsicht ähneln sie Enzymen, die Aminosäureserin an ihren aktiven Stellen enthalten, wie Trypsin und Chymotrypsin.
Das pH-Optimum für Aspergillopeptidase ARL 1 mit Hämoglobin als Substrat wurde bestimmt und mit dem von Protease I verglichen. 100 g Aspergillopeptidase ARL 1 wurden aus einer Lösung mit einem Gehalt von 1 mg/ml in eine Reihe von Teströhrchen mit einem Gehalt an 2 ml Hämoglobinlösung (hergestellt nach D.
Glick: Methods of Biochemical Analysis II, Seite 248) mit verschiedenem pH und nach deren Äquilibrierung in ein Temperaturbad bei 370C überführt. Nach einer 10minütigen Inkubationszeit bei 370C wurde eine Probe von einem ml aus einem Röhrchen abgenommen und zu 4 ml einer 5%igen Lösung von Trichloressigsäure so schnell wie möglich zugesetzt. Nach innigem Vermischen liess man das Gemisch bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen, bevor es zentrifugiert wurde. Das Zentrifugat wurde dann durch Baumwolle filtriert. Die Extinktion des Klarfiltrates wurde auf einem Zeiss-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 280 mp gemessen. Man fand, dass das pH-Optimum für Aspergillopeptidase ARL 1 bei 5,0 bis 5,5 liegt, während das von Protease I bei etwa 7,0 bis 7,5 liegt.
Zur Untersuchung der Aktivität von Aspergillopeptidase ARL 1 gegen synthetische Substrate, namentlich Natriumtosyl-l-argininäthylester und N-Acetyl-l-tyrosin -äthylester verwendete man einen pH-Regler (Radiometer Modell SBR 2/SBU 1/MITT 1). Das Experiment wurde bei 300C und einem pH-Wert von 7,4 durchgeführt.
Als Reagenz wurde eine 0,05 m Lösung von NaOH verwendet, was einer Empfindlichkeit von 0,25 Mikromol gebildete Säure pro Skaleneinheit des Messinstrumentes entspricht. Eine Versuchslösung enthielt 0,5 Millimol Na triumtosyl-l -arginin-äthylester und 0,2 mg Enzym in 10,0 ml Wasser, und eine andere Versuchslösung enthielt 0,1 Millimol N-Acetyl- 1 -tyrosin-äthylester und 0,2 mg Enzym in 10,0 Milliliter 10%igem Äthanol. In 10 Minuten konnte eine Hydrolyse der Verbindungen beobachtet werden. Es ist erwähnenswert, dass die beiden Verbindungen gute Substrate für Protease I sind.
Aspergillopeptidase ARL 1, die ein UV-Spektrum mit den charakteristischen Eigenschaften für Proteine mit einem Gehalt an aromatischen Aminosäuren besitzt, ist in Wasser, Salzlösung und Pufferlösungen leicht löslich.
In trockener Pulverform ist sie mehr als 1 Jahr ohne Verlust der enzymatischen Aktivität, d.h. ohne Verlust ihrer Eigenschaften, das Anhaften und Zusammenballen von Blutplättchen zu verhindern, stabil. Beispielsweise sind wässrige Lösungen bei 40C monatelang und bei 370C mehr als 24 Stunden ohne Verlust der enzymatischen Aktivität stabil.
Die intravenösen Toxizitäten von Protease I und Aspergillopeptidase ARL 1 wurden bestimmt. Man fand, dass der LD50-Wert männlicher Albinomäuse 17,5 mg/ kg bzw. 9,5 mg/kg Körpergewicht beträgt.
Nach der vorliegenden Erfindung spielt ADP (Adenosin-diphosphat) eine wesentliche Rolle in dem Mechanismus des Anhaftens und Zusammenballens von Blutplättchen und nimmt daher eine Schlüsselposition bei solchen Prozessen, wie Thrombose, ein. Diese Eigenschaft von ADP kann auch in vitro nach verschiedenen Methoden demonstriert werden, von denen einige auch für ein Studium von die ADP-Wirkung störenden Mitteln geeignet sind. So wurde der Einfluss des Enzymgemisches A auf die ADP-induzierte Zusammenballung von Kaninchen-Blutplättchen in zwei Systemen in vitro studiert.
In einem der Systeme verwendete man gewaschene Blutplättchen, die aus dem Blut durch unterscheidende Zentrifugierung und am Ende Suspendierung in einem künstlichen Medium isoliert wurden. In dem anderen System liess man die Blutplättchen in ihrem natürlichen Milieu, dem Plasma, nachdem die roten Blutzellen durch Zentrifugierung entfernt worden waren. In beiden Systemen wurde nach Zusatz von ADP ein Zusammenballen als eine Änderung der Trübheit oder optischen Dichte verzeichnet, und man beobachtete, wie vorausgehender Zusatz des Aspergilloproteasepräparates in vitro die ADP-Wirkung modifizierte.
Nach einem dritten Verfahren wurde Aspergilloprotease nicht in vitro zugesetzt, sondern dem Tier vor dem Sammeln der Biutproben und der Herstellung plättchenreichen Plasmas verabreicht. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Enzyminjektion wurde die Zusammenballung der Blutplättchen als Reaktion auf den ADP-Zusatz photometrisch wie oben studiert, und eine Ände rung gegenüber den Werten der Vorbehandlung wurde dem verabreichten Enzym zugeschrieben.
Bei Verwendung gewaschener Blutplättchen von Ka ninchen, suspendiert in gepufferter Salzlösung, verur sachte ADP mit dem Zusatz von Kalziumionen eine wirk same Zusammenballung der Blutplättchen. Der Zeitab lauf des Prozesses wurde durch Ablesen der optischen
Dichte in Intervallen von 1 Minute verfolgt. Man fand, dass nach etwa 10 Minuten eine maximale Zusammen ballung auftrat, und bei längeren Beobachtungen konnte kein weiteres Anwachsen mehr verzeichnet werden.
Wenn die Werte für maximale Zusammenballung bei 15 Minu ten (verursacht durch eine bestimmte Konzentration an
Kalzium und ADP) verglichen wurde, beobachtete man, dass der vorausgehende Zusatz von Enzymgemisch A in kleinen Konzentrationen (l - 10-5 pg pro ml) die ADP
Wirkung hemmte. Diese Wirkung trat erst nach einer kur zen Latenzzeit auf, doch wenn sie einmal vorhanden war, wurde die Hemmung durch längere Vorinkubation nicht mehr erhöht. Die Hemmung der durch ADP induzierten
Zusammenballung erfordert keine Kalziumionen, da sie auch in einem Medium zu erhalten ist, das das wirksame Kalziumchelierungsmittel EDTA enthält.
Als ein weiteres
Charakteristikum dieser Hemmwirkung des Enzyms beob achtete man, dass die mit Enzym behandelten Blutplätt chen, wenn die Enzymwirkung erst auftrat, wiederholt ohne wesentlichen Verlust ihrer Widerstandsfähigkeit ge gen ADP-Zusatz gewaschen werden konnten.
Wenn man in vitro Enzymgemisch A zu ungewasche nen in Plasma suspendierten Blutplättchen zu setzte, war es auch möglich, zu demonstrieren, dass dieses Enzym präparat eine Widerstandsfähigkeit gegen nachfolgenden
ADP-Zusatz verursachte, obwohl die erforderlichen Kon zentrationen wesentlich höher lagen als in dem oben er wähnten Versuchssystem. Die Existenz einer kurzen La tenzzeit bei der Wirkung des Enzyms wurde auch in die sem System festgestellt.
Wenn das Enzymgemisch A intravenös Tieren ver abreicht wurde, war seine Wirkung auf die durch ADP induzierte Zusammenballung von nachfolgend abgenom menem plättchenreichen Plasma nicht zu beobachten, bis
24 bis 28 Stunden nach der Verabreichung vergangen wa ren. Der Grund für diese Diskrepanz zwischen den Er gebnissen in vivo und in vitro hinsichtlich der Latenzzeit ist bis jetzt noch nicht bekannt. Einmal aufgetreten, be stand die durch ADP induzierte Zusammenballung jedoch
3 bis 4 Tage. Dies konnte durch wiederholte Injektionen des Präparates verlängert werden.
Die Wirkung des Enzympräparates im Menschen wur de ebenfalls bei 28 Patienten studiert, von denen einige nonnale, die meisten aber pathologisch erhöhte Zusam menballungswerte zeigten (normaler Wert 37%). Die Me thode der Bestimmung der Zusammenballung bestand darin, dass man Plasmaproben einer reproduzierbaren
Zusammenballungsstimulierung während einer bestimm ten Zeit unterzog, worauf die Plasmaprobe filtriert wurde.
Die Zahl der Thrombozyten wurde vor und nach dem
Verfahren elektronisch berechnet. [Das Verfahren ist im einzelnen von J. Jürgens in Life Sciences, Band 7 (1966),
Seiten 139-87 beschrieben]. Der Unterschied gibt ein
Mass der Zusammenballung an. Die Zahl der zusammen geballten Thrombozyten wird in Prozent der ursprüngli chen Zahl ausgedrückt und wird nachfolgend als Aggre vgationswert bezeichnet. Die Präparate mit dem Enzym Gemisch A wurden durch langsame intravenöse Injektion oder durch intravenöse Infusion verabreicht. Man fand, dass die Verabreichung von 120 bis 150 mg des Enzym präparates zu einer deutlichen Verminderung der Blutplättchen zusammenballung führte. In einigen Fällen war sogar eine Dosis von 60 mg ausreichend, um die erwünschte Wirkung zu erzielen.
Ein Ansteigen der Dosis auf 180 bis 200 mg verursachte eine anhaltendere Wirkung. Durch wiederholte Verabreichung von beispielsweise 150 mg alle 4 bis 6 Tage war es möglich, für eine sehr lange Zeit niedrige Aggregationswerte zu erhalten.
Bei diesen Versuchen wurde das Präparat sehr gut vertragen, ohne dass ernsthafte Nebenwirkungen auftraten.
Wenn Aspergillopeptidasen nach der Erfindung in der Therapie zur Verhinderung der Bildung von Thrombi und Emboli verwendet werden, sollte man sie durch langsame intravenöse Injektion oder intravenöse Infusion verabreichen. Bei Verwendung eines Enzymgemisches, in dem Aspergillopeptidase ARL 1 in einer Menge von etwa 1 bis 2 Gew.-OJo, berechnet auf trocknes Pulver, vorhanden ist, variiert die Dosis im allgemeinen zwischen 50 und 200 mg, und diese Dosis kann alle 4 bis 6 Tage verabreicht werden, um eine ausgedehnte Wirkung zu erzielen. Die Dosis und das Zeitintervall zwischen den Verabreichungen hängt von der Reaktion des Patienten ab.
Quantitative Vergleiche zwischen isolierter Aspergillopeptidase ARL 1 und Enzymmischungen mit einem Gehalt an ARL 1 wurden noch nicht zu Ende geführt, doch zeigt ARL 1 die erwünschte Wirkung in viel kleineren Konzentrationen als die Enzymgemische.
Die Erfindung wird nun nachfolgend im einzelnen anhand der Beispiele beschrieben, die die Herstellung und Eigenschaften von Präparaten sowie deren Wirkungen auf das Blut von Tieren und die Injektion bei Menschen zeigen. Letzteres wird durch Diagramme erläutert, die die Wirkung der intravenösen Infusion des Enzymgemisches A bei Menschen auf die spontane Blutplättchenzusam menballung A, ausgedrückt in Prozenten, als eine Funktion der Zeit T vom Zeitpunkt der Verabreichung aus zeigen, wobei die Augenblicke der Verabreichung durch Pfeile angezeigt sind.
In der Zeichnung erläutern:
Die Figuren 1 und 2 die Wirkung einer einzelnen intravenösen Dosis von ie 120 bzw. 150 mg des Präparates auf drei Patienten und
Fig. 3 die Wirkung wiederholter intravenöser Dosen von 150 mg des Präparates auf einen Patienten.
Beispiel I
85 g eines mit Tannin aus einem Kulturmedium von Aspergillus oryzae ausgefällten Proteasegemisches wurden in 725 ml Wasser zusammen mit 29 Natriumacetat gelöst, dann wurde der pH auf 6,5 mit NaOH eingestellt.
Nach 45minütigem Rühren der Suspension und Zugabe von 8,5 g Dibenzyl-äthylen-diaminacetat wurde das System zentrifugiert. Das Sediment wurde mit 150 ml Wasser gewaschen und noch einmal zentrifugiert. Die Lösungen der beiden Zentrifugierungen wurden vereinigt und nach Zugabe von 18 g Celites als Filterhilfe filtriert. Das Filtrat, 990 ml, wurde 17 Stunden gegen 85 1 H20 dialysiert und anschliessend auf 1700 ml verdünnt. Nach Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 5,5 mit Essigsäure setzte man 255 g mit Ammoniumacetat auf pH 5,5 äquilibrierte Carboxymethylzellulose zu. Die Carboxymethylzellulose wurde mit den adsorbierten Enzymen abgetrennt und 3mal mit 1700 ml Wasser von pH 5,5 gewaschen.
Die Carboxymethylzellulose wurde nacheinander und getrennt mit Mengen von je 640 ml wässriger Lösungen von 0,005 m NWAc, 0,01 m NH4Ac, 0,01 m NH4Ac und 0,1 m NH4Ac behandelt, die alle auf pH 7,5 eingestellt waren. Für jede Behandlung wurde das System mit 5 g Celites als Filterhilfe filtriert. Die Filtrate wurden getrennt der Gefriertrocknung unterzogen. Für jede Behandlung erhielt man ein trocknes, pulverartiges Präparat mit einem höheren Prozentgehalt an Aspergillopeptidase ARL 1 als in jedem der vorausgehenden Präparate.
Die Gesamtmenge an trockenem Pulver nahm jedoch mit der Zeit ab. In der ersten erhaltenen Enzymmischung A betrug die Konzentration von Aspergillopeptidase ARL 1 etwa 1%. In dem vierten Präparat konnte sie zwischen 40 und 60% variieren. Die Gesamtmenge an Material in den vier Präparaten betrug etwa 2,6 g, 1,3 g, 0,36 g und 0,59 g. Wenn an Stelle einer Ammoniumacetatlösung eine mit Phosphat gepufferte Lösung verwendet wurde, mussten die Filtrate sorgfältig dialysiert werden, bevor sie der Gefriertrocknung unterzogen wurden, wobei wesentliche Verluste an Aspergillopeptidase ARL 1 auftraten.
Beispiel 2
0,4 g eines Gemisches gleicher Mengen von Aspergillopeptidase ARL 1 und der drei Proteasen I, II und III, die von Bergkvist [Acta Chem. Scand. 17 (1963), Seite 15213 beschrieben sind, wurden in einer Pufferlösung gelöst und zu einer Diäthylaminoäthylzellulosesäule (3,9 X 40 cm) zugesetzt, die mit 0,005 m Phosphatpuffer auf pH 6,0 äquilibriert war. Die Eluierung wurde nacheinander mit 0,005 m, 0,10 m, 0,25 m und 0,5 m Phosphatpufferlösungen durchgeführt. Die Aspergillopeptidase ARL 1 erschien zuerst, jedoch von der Protease I nur unvollständig abgetrennt, wenn man 0,005 m Puffer verwendete. Die Protease II wurde mit 0,10 m Puffer und die Protease III mit 0,15 m Puffer eluiert.
Beispiel 3
4 Hydroxylapatitsäulen mit einer Länge von 17 bis 20 cm und einem Durchmesser von etwa 1 cm wurden verwendet [Der Hydroxylapatit wurde nach A. Tiselius et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 65 (1956), Seite 132, hergestellt3. Nachdem die Säulen mit 0,001 m Phosphatpuffer auf pH 6,80 äquilibriert worden waren, wurde das Ausgangsmaterial, 30 mg Enzymmischung A (wie das von Beispiel 1), welches ausserdem mit Diäthylamino-äthylzellulose bei pH 6,0 mit 0,025 m Ammoniumacetat, gelöst in 3 ml des Puffers, behandelt worden war, in jede der Säulen eingefüllt. Die Eluierung wurde mit dem Puffer durchgeführt, und der Auslauf wurde in Fraktionen von etwa 3 ml aufgefangen.
Die Extinktion der Fraktionen wurde bei der Wellenlänge von 280 mll bestimmt. Einen Peak erhielt man gleich nach dem Leervolumen der Säule. Alle zu diesem Peak gehörenden Fraktionen wurden zusammengegossen und in einem Rotationsverdampfer auf 1/5 des Anfangsvolumens konzentriert. Diese Lösung wurde anschliessend auf eine Sephadex G : 50-Säule gegeben, die etwa 27 g mit 0,04 m Phosphatpuffer auf pH 6,80 äquilibriertes Sephadex enthielt. (Das Leervolumen dieser Säule wurde mit Hilfe eines blaugefärbten Dextranderivates mit einem Molekulargewicht von 500 000 bestimmt und betrug etwa 40 ml, das Auslaufvolumen von Glukose betrug etwa 135 ml). Beim Eluieren der Säule mit dem 0,04 m Puffer erschien Aspergillopeptidase ARL 1 bei 60 bis 80 ml.
Alle Fraktionen wurden auf ihre antigenen Eigenschaften untersucht. In einer Reihe von Versuchen variierte die isolierte Menge an Aspergillopeptidase ARL 1 zwischen 0,5 und 2,0So
In einigen Fällen wurde die Gel-Filtrationsstufe weggelassen, und es war noch möglich, reine Aspergillopep tidase ARL 1 zu erhalten. In solchen Fällen wurde die Lösung dialysiert, bevor sie auf die Hydroxylapatitsäule mit einer Visking-Dialyseröhre (von Union Carbide International Company) aufgegeben wurde. Nach 16 Stunden Dialyse wurde die Lösung auf die Hydroxylapatitsäule gegeben und wie oben beschrieben behandelt. Längere und intensivere Dialyse kann die Konzentration auf Null reduzieren.
Ähnliche Ergebnisse erhielt man, wenn man ein handelsübliches Kalziumphosphat, beispielsweise Bio-Gel HT (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif., USA) anstelle des oben genannten Hydroxylapatitpräparates verwendete.
Beispiel 4
2 Sephadex G: 50 Fine-Säulen, beide mit einer Querschnittsfläche von 8 cm2 und mit einer Länge von 47 bzw.
93 cm, wurden mit einem Aufzeichnungsabsorpüometer (Uvicords, LKB-Produkter, Schweden) ausgestattet. Die Säulen wurden äquilibriert und anschliessend mit einem 0,001 m Phosphatpuffer für pH 6,80 und mit einem Gehalt von 9 g NaCI pro Liter eluiert. Nachdem die beiden Säulen so miteinander verbunden worden waren, dass der Auslauf aus der kleineren Säule in die grössere Säule eintrat, wurden 302 mg des Ausgangsmaterials von Beispiel 3, gelöst in 4,9 ml Puffer, auf die kleine Säule aufgegeben.
Wenn das erste Absorpflometer 3 Peaks für hohes Mo lekulargewicht aufgezeichnet hatten, wurden die beiden Säulen gelöst, und die Komponenten mit hohem Molekulargewicht wurden aus der brösseren Säule als 3 gut getrennte Peaks eluiert. Die Identität der Aspergillopeptidase ARL 1, die der dritte Peak war, wurde durch Immunodiffusion bestimmt.
Beispiel 5
Ein mit Tannin ausgefälltes Proteasegemisch aus dem Kulturmedium von Aspergillus oryzae wurde mit Carboxymethylzellulose bei pH 5,5 behandelt. Ein rohes Gemisch wurde von der Carboxymethylzellulose mit 0,005 m Ammonium-acetatpuffer von pH 7,5 eluiert. Das Produkt ist ein Enzymgemisch A (siehe Beispiel 1). 30 mg eines trocknen Pulverpräparates hiervon wurden in 3 ml Puffer gelöst, 16 Stunden unter Verwendung einer Visking-Dialyseröhre dialysiert und dann auf eine Hydroxylapatitsäule der gleichen Grösse wie in Beispiel 3 aufgegeben, nachdem die Hydroxylapatitsäule äquilibriert und anschliessend mit 0,001 m Phosphatpuffer von pH 6,80 eluiert worden war. Bei dem Leervolumen erschien eine kleine Komponente von mutmasslich niedrigem Mole kulargewicht, unmittelbar gefolgt von Aspergillopeptidase ARL 1.
Das Enzym wurde weiterhin gereinigt und durch Gel Filtration auf Bio-Gel P-6 mit einer Grösse von 50 bis 150 Maschen (Bio-Rad-Laboratories) gereinigt.
Die Säule mit den Abmessungen 2 X 109 cm wurde mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde eluiert. Der mittlere Teil des Hauptpeaks wurde aufgefangen und lyophilisiert. Man erhielt ein farbloses Pulver. Ausbeute 1,5%.
Die Carboxymethylzellulose wird anschliessend mit Ammoniumacetatpuffer von höherer Molarität, 0,01 bis 0,1 m, eluiert, wobei man trockene Pulverpräparate mit einem beachtlich höheren Gehalt an Aspergillopeptidase ARL 1 erhielt, wenn auch in kleineren Mengen.
Beispiel 6
Beispiel 4 wurde in der Weise wiederholt, dass Enzymgemisch A anstelle des in Beispiel 4 verwendeten Aus gangsmaterials benützt wurde. Die Ausbeute war wenigstens der von Beispiel 4 gleich.
Beispiel 7
Eine Säule von Amberlites CG : 50 II mit einer Grösse von 200 bis 400 Maschen wurde äquilibriert und anschliessend mit 0,01 m Phosphatpuffer von pH 7,50 eluiert. 58 mg trockenes Pulverpräparat eines Eluates (erhalten durch eine zweite Eluierung der Carboxymethylzellulose von Beispiel 5 mit 0,01 m Ammoniumacetatpuffer von pH 7,5) wurden in einem ml 0,01 m Phosphatpuffer von pH 7,50 gelöst, gegen 500 ml dieses Puffers während einem Tag dialysiert und auf die Säule gegeben.
Bei einem Eluiervolumen, 3- bis 4mal so gross wie das Leervolumen, wurde Aspergillopeptidase ARL 1 isoliert.
Es wurde durch Immunodiffusion identifiziert. Die Ausbeute betrug etwa 30 Gew.-% der gesamten zugesetzten Menge.
Beispiel 8
1 g mit Tannin gefälltes Proteasegemisch aus einem Kulturmedium von Aspergillus oryzae wurde zusammen mit 4 g Celite 535 in 10 ml eines 0,001 m Phosphatpuffers suspendiert. Der pH-Wert wurde dabei auf 5,5 eingestellt. Diese Suspension wurde auf eine Hydroxylapatitsäule gegeben, die mit einem 0,001 m Phosphatpuffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde darauf mit einem Phosphatpuffer von pH 6,80 und stufenweise stei wender Molarität eluiert. Man erhielt nur eine teilweise Abtrennung der bei 280 mp absorbierenden Komponenten. Durch Immunodiffusion wurden alle die Aspergillopeptidase ARL 1 enthaltenden Fraktionen identifiziert.
Diese Fraktionen wurden vereinigt und in einem Rotateionsvakuumverdampfer auf ein Volumen v. 13 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine kleine Hydroxylapatitsäule aufgegeben und erneut chromatographiert.
Unmittelbar nach einem kleinen Peak, der bei dem Leervolumen mit einem 0,001 m Phosphatpuffer eluiert wurde, folgte Aspergillopeptidase ARL 1 und wurde durch Immunodiffusion identifiziert. Die Ausbeute betrug 1,5%.
Beispiel 9
Das Betragen von Aspergillopeptidase ARL 1 (erhalten nach Beispiel 5) bei der Gel-Elektrophorese wurde untersucht. Die verwendete Apparatur ist anderswo beschrieben p:I. Mouray, J. Maretti und J.M. Fine, Bull.
Soc. Chim. Biol., Band 43 (1961), Seite 9431.
Der Puffer besass die folgende Zusammensetzung: 1,42 g Borsäure, 0,37 g NaOH pro Liter entionisiertes Wasser mit pH 8,9.
Die hydrolysierte Stärke war ein handelsübliches Produkt, das man von Connaught Medical Research Laboratories erhält und die speziell für die Gel-Elektrophorese hergestellt wird. Die Konzentration der Stärke in den Gel-Streifen betrug 15%. Die Menge an Aspergillopeptidase ARL 1, die auf das Elektropherogramm aufgegeben wurde, betrug 0,5 mg, gelöst in 2,5 p1 entionisierten Wassers oder Puffer. Die verwendete Spannung betrug 35 Volt pro cm und die Zeit der Durchführung der Elektrophorese betrug 1 Stunde.
Zur Entdeckung der Proteine nach der Elektrophorese wurden die Streifen in ein Bad getaucht, das folgende Substanzen enthielt: 0,1 g Amido-schwarz, 45 ml Glyzerin, 45 ml Wasser und 10 ml Essigsäure. Die Streifen wurden in dem Gemisch von Glyzerin, Wasser und Essigsäure mehrere Stunden gewaschen.
Die Verteilung der proteolytischen Aktivität in dem Elektropherogramm erhielt man durch Zerschneiden der Gel-Streifen in Abschnitte von 2 mm Breite. Die Streifen wurden in Versuchsröhrchen gegeben, worauf 3 ml eines 0,2 n Phosphatpuffers von pH 6,0 zugegeben und darauf die Streifen in einem Mischer zerrissen wurden. Die proteolytische Aktivität in jedem Röhrchen wurde nach der Kaseinasemethode bestimmt [R. Bergkvist, Acta Chem.
Scand., 17 (1963), Seite 15213.
Die proteolytische Aktivität fiel mit der gefärbten Zone in dem Elektropherogramm zusammen. Nur eine ge färbte Zone konnte entdeckt werden. Die Entfernung, über die die Aspergillopeptidase ARL 1 gewandert war, betrug zwischen 2,0 und 2,5 cm zu dem negativen Pol hin.
Die folgenden Experimente dienen der Erläuterung des Verfahrens, das zum Studium des Einflusses der Aspergillopeptidasen auf das Anhaften und Zusammenballen von Blutplättchen verwendet wurde.
Beispiel 10
Blut erhielt man aus einem mit Äther anästhesiertem Kaninchen mit Hilfe einer in eine Halsarterie eingeführten Kunststoffkanüle. Das abgenommene Blut wurde unmittelbar mit 0,075 Volumenteilen 0,077 m Natrium EDTA, eingestellt auf pH 7,4, in einem Kunststoffzentrifugenröhrchen vermischt. Bei allen nachfolgenden Operationen wurden silikonisierte Glasgeräte verwendet. Das Blut wurde in einer gekühlten Zentrifuge (+ 50C) bei 250 X g während 12 min zentrifugiert um die roten Blutzellen zu entfernen. Die oberen 3 der überstehenden Flüssigkeit, die die Blutplättchen enthielten, wurden wiederum zentrifugiert, wobei sich die Blutplättchen absetzten.
Das Sediment wurde durch erneute Suspendiemng in einem Gemisch gewaschen, das 0,154 m Natriumchlorid, 0,154 m Tris-hydrochloridpuffer von pH 7,4 und 0,077 m EDTA in den Verhältnissen 90: 8 : 2 enthielt.
Das Zentrifugieren wurde 12 Minuten bei 250 x g wiederholt. Die Blutplättchen wurden schliesslich in Tris-gepufferter Salzlösung (0,154 m Natriumchlorid u. 0,154 m Tris-puffer von pH 7,4 im Verhältnis von 9: 1) suspendiert, um etwa 5 000 Blutplättchen pro mm3 zu ergeben.
Solche Blutplättchensuspensionen wurden nicht mehr als 5 Stunden in Eis aufbewahrt.
Für den Versuch wurden 3,0 ml der Suspension in eine silikonisierte Kolorimeterröhre gegeben, die in ein Klett-Summersonkolorimeter eingesetzt wurde. Es wurde mit Hilfe eines silikonisierten Glasstabes gerührt, der in einen bei 1000 Umdrehungen/Minute arbeitenden Synchronmotor eingesetzt war. Jede Minute wurde bei 620 mlF abgelesen. Ein 4,5minütiger Kontrollversuch fand statt, bevor irgendwelche Zusätze zugegeben wurden. Zu der leeren Lösung wurden die nötigen Zusätze in Mengen von 10 ,ul zugegeben. Kalziumionen setzte man in der Form einer Lösung von CaC12 zu, um eine Endkonzentration in der Versuchsprobe von 1,1 mM zu erhalten.
Beispielsweise wurde ADP bis zu einer Konzentration von 8 ,ug pro ml zugegeben. Die Wirkung von 1,001 und 0,01 ,ng Enzymgemisch A pro ml Suspension, 10 Minuten vor der ADP-Zugabe, wurde mit einer Kontrollprobe verglichen, in der Salzlösung anstelle des Enzyms zugesetzt wurde.
Die Ergebnisse sind nachfolgend aufgeführt, wobei die Angaben die maximale Zusammenballung 15 Minuten nach der ADP-Zugabe wiedergeben:
Prozent Zusatz Zusammen ballung
Kontrollprobe (CA++, ADP) 61 Enzymgemisch A, 0,001 Mg, CA++, ADP 2 Enzymgemisch A, 0,01 ;yg, CA++, ADP 5
Beispiel 11
Eine Blutplättchensuspension wurde wie in Beispiel 10 hergestellt. EDTA wurde bis zu einer Konzentration von 1,5 mM zu der Suspension zugesetzt. Enzymgemisch A wurde in Dosen von 0,001, 0,01 und 0,1 mg/g Suspension mit den Blutplättchen 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wonach sie durchzentrifugiert, abgelagert, danach einmal gewaschen und wie in Beispiel 10 wieder suspendiert wurden.
Als Kontrolle wurde eine Suspensionsprobe in gleicher Weise behandelt, mit der Ausnahme, dass das Enzym weggelassen wurde. Kalziumionen und ADP wurden 5 Minuten nach dem Einlegen der Proben in das Kolorimeter zugesetzt.
Prozent Zusatz Zusammen ballung Kontrollprobe (CA ADP) 52 Enzymgemisch A, 0,001 1lg/ml, Ca++, ADP 2 Enzymgemisch A, 0,01 lFg/ml, Ca++, ADP 15 Enzymgemisch A, 0,1 llg/ml, Ca++, ADP 15
Beispiel 12
Blutplättchensuspensionen wurden, wie in Beispiel 10 beschrieben, hergestellt. Das Enzymgemisch A wurde bis zu einer Konzentration von 0,001 ,ug pro ml Suspension mit den Blutplättchen bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert. Nach dieser Zeit wurden verschiedene Proben zentrifugiert und (wie in Beispiel 10 beschrieben) 1mal, 2mal und 3mal vor der Endsuspendierung gewaschen. Die Wirkung der Kalziumionen und der ADP wurde gemessen.
Als Kontrolle wurde eine Probe der Blutplättchensuspension ohne Enzym 3mal vor dem Versuch gewaschen.
Prozent Behandlung Zusammen ballung Kontrolle, 3 mal gewaschen (Ca++, ADP) 51 Enzymgemisch A, 1 mal gewaschen, 20 (Ca++, ADP) Enzymgemisch A, 2 mal gewaschen, 19 (Ca++, ADP) Enzymgemisch A, 3 mal gewaschen, 17 (Ca++, ADP)
Beispiel 13
Für die Herstellung von blutplättchenreichem Plasma wurde Blut, wie in Beispiel 10 beschrieben, gesammelt, mit der Ausnahme, dass 3,8%ges; Trinatriumzifrat. als Antikoagulans verwendet und mit dem Blut im Mengenverhältnis von einem Teil Zitrat zu neun Teilen Blut vermischt wurde. Zentrifugierung wurde bei Raumtemperatur während 15 Minuten bei 300 x g durchgeführt.
Von der resultierenden blutplättchenreichen darüber stehenden Flüssigkeit wurden die obersten 35 für den Versuch verwendet. In diesem System brauchen keine Kal ziumionen hinzugesetzt zu werden, während ADP in einer Endkonzentration von 8 pg pro ml Plasma verwendet wurde. Die Zusammenballung wurde wie in Beispiel 10 geschätzt. Enzymgemisch A wurde bis zu einer Endkonzentration von 10, 25 und 50 pg pro ml Plasma 10 Minuten vor der Zugabe von ADP zugesetzt. Der Grad der Hemmung im Vergleich zu der Kontrollprobe ohne Enzym wurde berechnet.
Prozent hemmung Zusatz der
Zusammen ballung Enzymgemisch A, 10 !g/ml, ADP 24 Enzymgemisch A, 25 Fg/ml, ADP 47 Enzymgemisch A, 50 Fg/ml, ADP 62
Beispiel 14
5 ml Blut wurden von einem männlichen Albinokaninchen mit einem Gewicht von 2,2 kg abgenommen.
Das Blut wurde mit Zitrat und blutplättchenreichem Plasma, das wie in Beispiel 13 hergestellt worden war, vermischt. Die Wirkung der zugesetzten ADP auf die Blutplättchen in dem Plasma in vitro wurde wie in Beispiel 11 gemessen. Danach wurden 4,0 mg/kg Enzymgemisch A durch Infusion intravenös verabreicht und blutplättchenreiches Plasma zu verschiedenen Zeiten nach dieser Behandlung gesammelt. Die Zusammenballung in vitro nach ADP-Zugabe wurde wie oben geschätzt.
Prozent
Zusammen ballung Vor der Injektion 56 4 Stunden nach der Injektion 55
1 Tag nach der Injektion 34 2 Tage nach der Injektion 39 3 Tage nach der Injektion 38 4 Tage nach der Injektion 44 7 Tage nach der Injektion 59
Zum Studium der Wirkung über eine lange Zeit hinweg verabreichte man einem männlichen Albinokaninchen mit einem Gewicht von 4,15 kg intravenös 4,0 mg/ kg Enzymgemisch A. Am fünften Tag-wurde eine zweite Dosis von 4,0 mg/kg des Enzyms verabreicht.
Prozent
Zusammen ballung Vor -der- Injektion 61 b Tag nach der Injektion 51 3 Tage nach der Injektion 40 4 Tage nach der Injektion 39 5 Tage nach der Injektion 52 Zweite Injektion 6 Tage nach der ersten Injektion 40 7 Tage nach der ersten Injektion 20
Beispiel 15
Blutplättchensuspensionen wurden wie in Beispiel 10 hergestellt, und die Wirkung von ADP wurde wie dort geschätzt. Man setzte Aspergillopeptidase ARL 1 zu der Suspension 10 Minuten vor der ADP-Zugabe zu.
Prozent Zusatz Zusammen ballung Kontrollprobe (Ca++, ADP) 51 Aspergillopeptidase ARL 1, lO-SiFLg/ml, 0 Ca++, ADP Aspergillopeptidase ARL 1, 104pg/ml, 0 Ca++, ADP Aspergillopeptidase ARL 1, 10-SIIlg/ml, O Ca++, ADP Aspergillopeptidase ARL 1, 10-6lFg/ml, 0 Ca++, ADP
Beispiel 16
Blutplättchenreiches Plasma wurde wie in Beispiel 10 hergestellt, und die Wirkung von ADP wurde wie dort geschätzt. Zum Vergleich der Wirksamkeit bei der Reduzierung der Zusammenballung wurden Aspergillopeptidase ARL 1 und Enzymgemisch A 10 Minuten vor der ADP-Zugabe zugesetzt.
Prozent Zusatz Zusammen ballung Kontrollprobe (ADP) 55 Enzymgemisch A 50lFg/ml, ADP 45 Aspergillopeptidase ARL 1 2,5 yglml, 29 ADP Aspergillopeptidase ARL 1 5,0 q g/ml, 15 ADP
Zur Erläuterung der Wirkung von Aspergillopeptidase ARL 1 bei Menschen wurden die folgenden Beispiele ausgeführt:
Beispiel 17
120 mg Enzymgemisch A in der Form eines sterilen, trockenen Pulvers wurden in 500 ml einer 5%igen Levuloselösung aufgelöst und durch intravenöse Infusion mit einer konstanten Geschwindigkeit während einer Stunde einem Patienten verabreicht, dessen Blutplättchen-Aggregationswert vor der Behandlung bestimmt worden war.
Nach Beendigung der Infusion wurde die Wirkung auf die spontane Zusammenballung durch Studium der Plasmaproben in regelmässigen Abständen verfolgt.
In Fig. 1 sind die Ergebnisse für 3 Patienten aufgeführt. Vor der Behandlung zeigt 1 Patient einen normalen, und 2 Patienten zeigten einen pathologisch erhöhten Aggregationswert. In all den Fällen beobachtete man ein merkliches Abfallen der Zusammenballung mit einer maximalen Herabsetzung am 4. Tag nach der Verabreichung.
Beispiel 18
In gleicher Weise wie in Beispiel 17 wurden 150 mg Enzymgemisch A verabreicht, und die Wirkung wurde wie oben beschrieben beobachtet. Fig. 2 zeigt die Ergebnisse an drei Patienten, die mit dieser Dosis behandelt wurden. Man beobachtete eine bemerkenswerte Erniedri gung des Aggregationswertes.
Beispiel 19
Ein Patient mit einer stark erhöhten Zusammenballung der Blutplättchen, bei dem daher die Gefahr bestand, dass er einen Thrombus oder Embolus besass, wurde, wie in Beispiel 17 beschrieben, mit wiederholten Dosen von 150 mg behandelt, worauf die Wirkung auf die Zusammenballung bestimmt wurde.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Eine merkliche Verminderung der Zusammenballung wird schon nach der Verabreichung der ersten Dosis beobachtet, und es wird ebenfalls gezeigt, dass es durch Verabreichung weiterer Dosen möglich ist, die Zusammenballung ohne Schwankungen über eine lange Zeit hin auf einem niedrigen Stand zu halten.