CH528083A - Immunologischer Indikator, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung - Google Patents

Description

  
 



  Immunologischer Indikator, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen
Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen immunologischen Indikator, der aus Mikrobenzellen aufgebaut ist, an die über ein Kupplungsmittel chemisch eine Antigensubstanz gebunden ist. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieses immunologischen Indikators und ausserdem dessen Verwendung zur Feststellung von homologen Antigenen oder Antikörpern, insbesondere zur visuellen Feststellung dieser Substanzen.



   Die Möglichkeit, die Anwesenheit von Antigensubstanzen in verschiedenen Flüssigkeiten festzustellen, hat sehr grosse Bedeutung. Bei vielen industriellen Verfahren werden proteinartige Materialien, die Antigeneigenschaften besitzen, entweder als Reaktanten verwendet oder diese Materialien .werden sonst irgendwie behandelt. Die Möglichkeit die Änderungen in der Konzentration dieser Materialien festzustellen, um derartige Reaktionen zu verfolgen, ist insbesondere bei der Kontrolle und der Wiederholbarkeit derartiger industrieller Verfahren von Bedeutung. Ein anderes, sehr bedeutendes Anwendungsgebiet besteht in der Feststellung verschiedener Antigene und Antikörper in Körperflüssigkeiten.



  Der Spiegel vieler Hormone, Proteine, Lipoproteine, Mucoproteine, Glycoproteine usw. und der Spiegel der Hydrolyseprodukte dieser Materialien, die normalerweise im Körper vorkommen und auch dann, wenn verschiedene pathologische Erscheinungen auftreten, ist für die medizinische Praxis von grosser Bedeutung. Einige dieser Substanzen, die von grossen Interessen sind, können nach bisher bekannten Methoden unter Verwendung von üblichen chemischen Analysenmethoden schwer festgestellt werden. Jedoch unter Anwendung von immuno-chemischen Testverfahren können manche dieser Antigene und Antikörper in Mischungen, die andere grosse Moleküle enthalten, die ähnliche chemische Gruppen aufweisen, jedoch nicht genau die gleiche Konfiguration wie das zu bestimmende Makromolekül besitzen, nachgewiesen werden.

  Eine Anzahl von diesen immunologischen Verfahren sind jedoch schwer auszuführen und benötigen oft lange Zeit und spezielle Arbeitstechniken, sie wurden aber dennoch zur Feststellung der Anwesenheit derartiger Substanzen in verschiedenen Körperflüssigkeiten verwendet. Für einige Antigene und Antikörper waren jedoch bisher keine Testverfahren zugänglich.



   In neuerer Zeit wurde Hämagglutinationssysteme für die Feststellung von Antigenen oder die Feststellung deren Antikörper ausgearbeitet. Bei diesen Systemen werden rote Blutkörperchen als Indikatorteilchen angewandt, die zu deren Verwendung auf irgend eine Art mit einer Antigensubstanz verbunden werden, so dass ein Indikator erhalten wird, der zur Feststellung des homologen Antikörpers oder zur Feststellung der Antigensubstanz selbst verwendet werden kann. Zur Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Substanz, auf die unter Verwendung derartiger Indikatoren geprüft wird, ist es im allgemeinen notwendig, das Aussehen des Musters der roten Blutkörperchen zu interpretieren um feststellen zu können, ob eine Hämagglutination aufgetreten ist.

  Hämagglutination tritt dann auf, wenn der homologe Antikörper in dem Testmedium in einer solchen Form vorliegt, die in der Lage ist, mit der Antigensubstanz zu reagieren, die an die roten Blutkörperchen gebunden ist um mit derselben einen Immunkomplex zu bilden. Hämagglutination tritt nicht auf, wenn der homologe Antikörper keinen Komplex mit den roten Blutkörperchen bilden kann, an welche die Antigensubstanz gekuppelt ist. Aufgrund vieler Bedingungen, zu denen die Anwesenheit von Puffern und anderen reaktionsfähigen Materialien zählt, ist dieses Testverfahren nur beschränkt anwendbar und es ist nötig, ein ge übtes Personal zur Verfügung zu haben, das in der Lage ist, das Aussehen der erhaltenen Muster zu interpretieren, obwohl gut arbeitende   Testsysteme    für einige Substanzen bereits angewandt werden.

  Eine andere, Schwierigkeiten verursachende Erscheinung, die bei Hämagglutinationssystemen auftritt, ist die Erscheinung, die unter der Bezeichnung heterophiles Antikörperproblem zu verstehen ist, und die von einigen Serumproteinen hervorgerufen wird, die in der Antiserumlösung enthalten sind, die mit den Antigengruppen reagiert, die üblicherweise an der Oberfläche der roten Blutkörperchen auch dann vorkommen, wenn das Antiserum von einer Species genommen wird, die von der Tierspecies verschieden ist, von der die roten Blutkörperchen verwendet werden. Auf diese Weise wurde Ovalbumin bereits früh von Pressmann, D., Campbell, D. H., Pauling, L: Journal of Immunology 44, Seiten 101-105 (1942) im Serum entdeckt.



  Ein ähnliches Verfahren wurde angewandt, um Tuberkulin  festzustellen, eine Methode die von Cole, L.   R.,    Farell, V. R.



  im Journal of Experimental Medicine 102, Seite 157 (1955) beschrieben ist, und Insulin wurde im Serum von Arquilla, E. R und Stavitsky, A. B. festgestellt, wie dies im Journal of Clinical Investigation 35, Seiten 458-466 (1956) beschrieben ist In der US-Patentschrift Nr. 3 236 732 von Edward R. Arquilla ist ein ähnlicher Indikator zur Prüfung auf das Hormon Choriongonadotropin beschrieben. Eine pathologische Antigensubstanz, nämlich Diphtherietoxin wurde auch auf diese Weise getestet und dieses Verfahren ist von Butler W. T. im Journal of Immunology 90, Seiten 663-671 (1963) beschrieben.



   Es wird angenommen, dass die beschränkte Anwendbarkeit dieser Arten des Hämagglutinationstest zum Teil darauf zurückzuführen ist, dass ein enger Bereich der Grössen und der speziellen Konfigurationen der tierischen roten Blutkörperchen, die im allgemeinen angewandt werden, vorliegt, und dass eine grössere Anwendbarkeit der Agglutination in immunologischen Testsystemen dadurch erreicht werden könnte, wenn Indikatorpartikel gefunden werden könnten, die die roten Blutkörperchen ersetzen können und die eine stärkere Variation der Grösse erlauben würden. Im allgemeinen ist durch die Verwendung von tierischen roten Blutkörperchen als Indikatorteilchen für verschiedene Antigene sowohl die Anwendung eines chromatographischen als auch die Anwendung eines   Plattentyp-Agglutinationsmechanismus    ausgeschlossen.

  Die roten Blutkörperchen sind auch bei ihrer Verwendung teuer, denn es müssen im Laboratorium Tiere gehalten werden und die Abnahmebedingungen müssen sorgsam vorgeschrieben sein, damit eine Hämolyse der Zellen vermieden wird und damit eine Einheitlichkeit erreicht wird, ohne welche der Hämagglutinationstest nicht reproduzierbar ausgeführt werden kann.



   Es hat sich nun herausgestellt, dass Mikrobenzellen als immunologische Indikatorpartikel dienen können und dass hierdurch viele der vorher beschriebenen Schwierigkeiten überwunden werden können. Mikrobenzellen existieren in sehr breiten Grössenbereichen und auch ihre Farben sind stark unterschiedlich und die Grössen liegen in den Bereichen, die sowohl für Röhren-Agglutinationstest als auch für Platten-Agglutinationstest benötigt werden und auch für Tests des chromatographischen Typs zugänglich sind. Daher ist eine Vielzahl von Testmechanismen anwendbar, wenn Mikrobenzellen als Indikatorpartikeln verwendet werden.



  Die Zellen können leicht unter Laboratoriumsbedingungen gezüchtet werden und können billig hergestellt werden. Die Mikrobenzellen können entsprechend der benötigten Grösse, entsprechend der Oberflächeneigenschaften, die für den jeweiligen Testmechanismus besonders vorteilhaft sind und nach dem Gesichtspunkt, unter dem die Züchtung der Zellen besonders leicht möglich ist, ausgewählt werden. Deshalb ist eine grössere Variationsmöglichkeit bei der Herstellung des immunologischen Testsystems möglich, wenn Mikrobenzellen verwendet werden. Durch die Verwendung von Mikrobenzellen kann auch das heterophile Antikörperproblem beseitigt werden.



   Unter der Bezeichnung  Indikatorteilchen  sind hierin Mikrobenzellen zu verstehen, an die keine Verbindung chemisch gebunden ist, die nach der Bindung an die Mikrobenzellen noch eine freie reaktive Gruppe aufweist. Eine Verbindung, die, bevor sie an die Mikrobenzellen gebunden wird, 2 nichtgebundene reaktive Gruppen aufweist, von denen dann eine mit den Mikrobenzellen unter Ausbildung einer kovalenten chemischen Bindung reagiert, wird in der Folge auch  Kupplungsmittel  genannt. Unter der Bezeichnung  Material zur Herstellung immunologischer Indikatoren  sind Mikrobenzellen zu verstehen, an die das Kupplungsmittel gebunden ist, aber ohne dass eine Antigensubstanz an dieselben gebunden ist. Unter der Bezeichnung  immunologischer Indikator  ist die Kombination aus Zellen, Kupplungsmittel und Antigensubstanz zu verstehen.



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein immunologischer Indikator, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er Mikrobenzellen enthält, an die über eine covalente chemische Bindung eine Verbindung gebunden ist, die ausserdem über eine weitere covalente Bindung an ein Antigen gebunden ist.



   Im erfindungsgemässen Indikator können die Mikrobenzellen Bakterienzellen, Pilziellen, Parasitenzellen, Protozoenzellen oder Virenzellen sein und bevorzugte Mikrobenzellen weisen gleiche Form und Grösse auf und besitzen in einer Richteung eine maximale Ausdehnung im Bereich von 0,2 bis 10 Mikron.



   Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen immunologischen Indikators, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Mikrobenzellen, ein Antigen und eine Verbindung, die mindestens 2 reaktive Gruppen aufweist, miteinander umgesetzt werden, wobei eine dieser reaktiven Gruppen mit den Mikrobenzellen unter Bildung einer covalenten chemischen Bindung reagiert und die andere der erwähnten reaktiven Gruppen mit dem Antigen reagiert, wodurch erreicht wird, dass über diese Verbindung das Antigen an die Mikrobenzellen gebunden ist.



   Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemässen Indikators zur Feststellung von Antigenen oder Antikörpern.



   Beispielsweise kann man den erfindungsgemässen Indikator zusammen mit einem Antikörper des im Indikator gebundenen Antigens in einer diagnostischen Testvorrichtung verwenden die zur Prüfung auf das Antigen herangezogen wird. Man kann dabei ein saugfähiges Material verwenden, bei dem sich an einer Stelle, die vom Rand dieses saugfähigen Materiales entfernt ist, ein Trockenrückstand befindet, wobei der Trockenrückstand entweder als erste Abscheidung den Indikator enthält, wobei sich auf dieser ersten Abscheidung eine zweite Abscheidung befindet, die den Antikörper des im Indikator gebundenen Antigens enthält, oder der Trockenrückstand die Abscheidung eines Immunaggregates ist, wobei das Immunaggregat aus dem Indikator und dem Antikörper des im Indikator gebundenen Antigens aufgebaut ist.



   Beim erfindungsgemässen Indikator ist das Antigen an die Mikrobenzellen über den Rest einer Verbindung ( Kupplungsmittel ) gebunden, die im noch nicht umgesetzten Zustand mindestens 2 reaktive Gruppen aufweist
Der erfindungsgemässe immunologische Indikator kann in Trockenform vorliegen, beispielsweise in gepulverter Form, und er kann sich auf einem aufsaugenden Trägermaterial befinden
Bei der Herstellung des erfindungsgemässen Indikators werden zweckmässigerweise die Miknobenzellen in einer Flüssigkeit suspendiert, die gegebenenfalls bereits das Antigen enthält; dabei wird das Kupplungsmittel zugesetzt, das in der Lage ist, mit einer reaktiven Gruppe der Oberfläche der Mikrobenzellen und des Antigens zu reagieren. 

  Wenn man die Mikrobenzellen zuerst nur mit dem Kupplungsmit   tel,    das mindestens 2 reaktive Gruppen aufweist, umsetzt, dann reagiert eine der reaktiven Gruppen des Kupplungsmittels mit den Mikrobenzellen unter Ausbildung einer covalenten Bindung. Die zweite noch nicht gebundene reaktive Gruppe des Kupplungsmittels ist in der Lage eine covalente Bindung mit einer reaktiven Gruppe in der Antigensubstanz zu bilden, wenn sie mit dieser in Berührung tritt, wobei sich wieder eine covalente Bindung ausbildet. Wenn die Antigensubstanz, die an die Mikrobenzellen gekuppelt werden soll, in der flüssigen Suspension der Mikrobenzellen bereits anwe  send ist, wenn das Kupplungsmittel zugegeben wird, dann wird sofort der erfindungsgemässe spezifische immunologische Indikator gebildet.



   Der erfindungsgemässe Indikator, bei dem an Mikrobenzellen eine Antigensubstanz über das Kupplungsmittel chemisch gebunden ist, kann in der speziellen, in der Folge näher beschriebenen Weise verwendet werden.



   Die Mikrobenzellen des immunologischen Indikators bzw. Testsystems können irgendwelche selbstreproduzierende Mikroorganismen sein, die sich abhängig von oder unabhängig von anderen Organismen fortpflanzen. Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterienzellen können verwendet werden, ferner sind auch die Zellen von Pilzen und Protozoenzellen anwendbar und auch Virenzellen sind für einige Testsysteme verwendbar. Dies sind im allgemeinen einzellige Organismen, die manchmal in Klumpen oder Aggregaten miteinander verbunden sind. Die Zellen können in dieser Form angewandt werden, vorausgesetzt, dass ihre Aggregatgrösse kein Trägerteilchen bildet, das so gross ist, dass das mit diesem gebildete Testsystem in Anwesenheit einer Substanz, die homolog zu der an die aggregierten Zellen gebundenen Antigensubstanz ist, nicht agglutiniert.

  Im allgemeinen sind die bevorzugten Mikrobenzellen, Bakterienzellen oder Aggregate derselben, die einheitliche Form und Grösse aufweisen, und maximale Aussenabmessungen im Bereich von etwa 0,2 bis 10 Micron besitzen. Obwohl es nicht vorzuziehen ist, kann auch eine Mischung aus verschiedenen aber einheitlichen Zellen verwendet werden. Bei diesen Bakterien gehören zu den verwendbaren Mikrobenzellen diejenigen, der Abteilung I des Pflanzenreiches zu der die Klassen   1,11    und 111, Ordnung I gehören. Zur Klasse III Ordnung I der Mikrobenzellen gehören die intrazellularen Virenorganismen, die Grössen im Bereich von etwa 0,2 Micron aufweisen.



   Bezüglich der kompletten Aufzählung der verwendbaren Bakterienzellen sei auf  Bergey's Manual of Determinative Bacteriology von R. S. Breed, E. G. D. Murray, N. R. Smith 7.



  Ausgabe 1947, (Williams und Wilkins Company) verwiesen.



  Besonders geeignet sind Bakterien der Klasse II Unterordnung II Familie IV (Pseudomonadaceen) und der Klasse II Ordnung IV Familie IV (Enterobacteriaceen). Man nimmt an, dass alle Stämme I bis IV zur Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugte Zellen darstellen. Auch die Klasse II Ordnung IV Familien V (Brucellaceen), X (Lactobacillaceen) und XIII (Bacillaceen) sind bevorzugte Mikroorganismen. Sowohl die Ordnungen I als auch   II    der Klasse III der Organismen können angewandt werden, wenn Partikeln einer geringeren Grösse von etwa 0,2 Mikron oder noch kleiner gewünscht sind. Insbesondere die Viralen der Ordnung   II    sind von sehr geringen Grössenabmessungen wodurch ihre Verwendbarkeit begrenzt ist.



   Besonders bevorzugte Bakterienzellen sind Brucella abortus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii, und Pseudomonas fragi. Die Hefewachstumsphase der Pilzzellen ist auch zur Durchführung der erfindungsgemässen Herstellung des Indikators bevorzugt. Besonders bevorzugt ist die übliche erhältliche Hefe, nämlich Saccharomyces cerevisiae.



   Die Mikrobenzellen können in ihrem natürlichen Zustand verwendet werden, d. h. das Kupplungsmittel kann mit ihnen umgesetzt werden und die Antigensubstanz kann mit Hilfe des Kupplungsmittels gebunden sein. Wenn jedoch die natürlichen pathogenen Eigenschaften irgendwelcher Mikrobenzellen als gefährlich angesehen werden müssen, dann kann die natürliche Antigenitität und damit die pathologischen Eigenschaften dadurch entfernt werden, dass man die Mikrobenzellen mit Inaktivierungsmitteln behandelt oder abtötet Die gebräuchlichsten Inaktivierungsmittel sind Formaldehyd und Phenol.

  Es ist bemerkenswert, dass für den Fall, dass Mikrobenzellen mit einem derartigen Schutzmittel vorbehandelt und dann noch abgewandelt wurden, indem Kupplungsmittel und Antigensubstanzen an sie gebunden wurden, die auf der Zellenoberfläche natürlich vorkommenden Antigengruppen genügend modifiziert wurden, so dass sie inaktiv wurden. Um irgendwelche Zellen, die natürliche Antigenaktivität aufweisen vollständig auszuschalten, kann das hergestellte Testsystem mit einem Serum enthaltenden Antikörper an das Antigen gebunden werden, das im natürlichen Zustand auf der Zellenoberfläche anwesend ist, wobei hiedurch ein Komplex gebildet wird, der bei weiteren Testen nicht mehr stört. Wenn z. B.

  Escherichia coli für die Indikatorpartikel des Indikators verwendet werden und die Antikörper für Escherichia coli in der Testprobe anwesend sind, dann kann die Reaktion zwischen dem Indikator und seinem Antikörper durch die Adsorption der Escherichia coli-Zellen des Indikators mit Antiseren blockiert werden, die den entsprechenden Antikörper enthalten. Deshalb kann man nicht mehr annehmen, dass die erfindungsgemäss verwendeten Mikrobenzellen ihre natürliche Antigenität besitzen.



   Falls gewünscht wird, können die Mikrobenzellen gefärbt werden, um die visuelle Unterscheidbarkeit des erhaltenen Indikators von dem umgebenden Hintergrund zu verbessern. Im allgemeinen werden Farbstoffe wie Hämatoxylin, Fuchsin und Kristallviolett zu diesem Zweck verwendet Eine andere, gegebenenfalls vorgenommene Behandlung besteht darin, dass man die Zellen mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen, Äthern usw. wäscht, um Polysaccharid- oder Wachsschichten zu entfernen, die anwesend sein können.



   Die Kupplungsmittel können mit den reaktiven Gruppen sowohl der Mikrobenzellen als auch der Antigensubstanzen umgesetzt werden, und sie sind im allgemeinen Verbindungen, die zwei oder mehr der folgenden reaktiven Gruppen aufweisen: Azogruppen, Sulfonsäuregruppen, Fluorgruppen, die mit Nitrogruppen kombiniert sind, Acide, Imine und reaktive Chlorgruppen, die mit einem Ring verbunden sind, der eine geeignete Resonanzstruktur besitzt. Diese reaktiven Gruppen sind in der Lage, mit den primären Aminogruppen, mit den SH-Gruppen (Mercaptogruppen) und mit den Hydroxylgruppen in den Polymerketten der Antigensubstanzen und an der Oberfläche der Mikrobenzellen zu reagieren.



   Als Kupplungsmittel seien beispielsweise angeführt: Bisdiazobenzidin, Bis-diazobenzidin-disulfonsäure, Tetraazo-pphenylendiamin,   Difluordinitrobenzol,    verschiedene Carbodiimide, Toluoldiisocyanat, Cyanurchlorid, Dichlor-s-triazin und N-t-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat. Einige dieser Kupplungsmittel, insbesondere die cyanurierenden Mittel sind in der Lage, die Zellen, zu der Zeit, wo sie mit Gruppen der Oberfläche der Mikrobenzellen kuppeln, so zu schützen, dass bei Verwendung dieser Kupplungsmitteln keine getrennte Vorbehandlung zum Schutz der Zellen notwendig ist. Bei Verwendung der zuletzt aufgezählten Verbindung werden die Indikatorteilchen am besten zuerst mit einem succinilierenden Mittel, beispielsweise Bernsteinsäureanhydrid behandelt.

 

   Zur Bildung von Material zur Herstellung des immunologischen Indikators wird das Kupplungsmittel zuerst mit den Mikrobenzellen zur Reaktion gebracht, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, und dann wird dieses Material mit der Antigensubstanz unter Bildung des Indikators dann gemischt, wenn dieses gebraucht wird. Das Material zur Herstellung des Indikators kann als handelbarer Artikel betrachtet werden, da er hergestellt und verkauft werden kann so dass ihn der Verbraucher zur Herstellung eines Indikators oder Testsystems für jede beliebige Antigensubstanz verwenden kann.  



   Bei einer bevorzugten Ausführungsart des Inberührungbringens der Mikrobenzellen und der Antigensubstanz mit dem Kupplungsmittel unter Bildung des erfindungsgemässen immunologischen Indikators werden die Mikrobenzellen und die Antigensubstanz in einer Flüssigkeit suspendiert und dann wird das Kupplungsmittel unter kräftigem Mischen zugesetzt Ein anderes Verfahren des gleichzeitigen Zusammenbringens besteht darin, dass man die Mikrobenzellen und die Antigensubstanz einer Lösung zugibt, die das Kupplungsmittel enthält. Diese Art des Zusammenbringens schränken die kreuzweise Kupplung der Mikrobenzellen und die kreuzweise Kupplung der Moleküle der Antigensubstanz ein.



   Im allgemeinen kann jede beliebige Antigensubstanz zu einem erfindungsgemässen immunologischen Indikator gekuppelt werden. Unter dem Begriff  Antigensubstanz  ist ein Material zu verstehen, das, wenn es in das Kreislaufsystem eines Tieres eingeführt wird, den entsprechenden Antikörper liefert Unter diesen breiten Begriff, fallen daher Serumantigene, wie z. B.   y-Globulin    und Serumalbumin und auch die Blutgruppensubstanzen A und B, die zur Testung der verschiedenen Bluttypen dienen. Mikrobenantigene können an den Indikator gekuppelt werden und es kann dann entweder die Mikrobe selbst oder ihr Antikörper in den Flüssigkeiten festgestellt werden. Antigene Hormonsubstanzen, die in Flüssigkeitssystemen des Organismus anwesend sein können, können auch an den Indikator gekuppelt werden.

  Auch Proteinhydrolyseprodukte und Enzyme können als Antigensubstanzen verwendet werden. Die Mikrobenantigene oder Antikörper können von bakterieller, pilzlicher, parasitologischer oder virenartiger Natur sein. Die Hauptforderung, die an die Antigensubstanzen gestellt wird, ist die, dass sie mindestens eine Gruppe in ihren Polymerketten aufweisen, die mit der reaktiven Gruppe von mindestens einem der bekannten Kupplungsmittel reagieren kann. Soweit bekannt ist, erfüllen alle Antigensubstanzen diese Forderung.



   Die Antigensubstanz kann ein natürlich vorkommendes Material sein oder sie kann ein künstlich hergestelltes Material sein. Einige natürlich vorkommende Substanzen, die zu einem erfindungsgemässen immunologischen Indikator gekuppelt werden können, sind: Ovalbumin, Tuberculin, Insulin, das Hormon Choriongonadotropin (CGTH), und zwar sowohl dasjenige menschlichen als dasjenige tierischen Ursprungs, menschliches Serumalbumin und Pferde-y-globulin.



  Als Tuberculin wird mit Vorteil das käuflich erhältliche Antigenematerial verwendet, das als PPD (tuberculin purified protein derivative) bezeichnet wird. Dieses Material wird aus Tuberculinbakterien gewonnen und ist unter anderem in  The Merck Index , Ausgabe 1968 auf Seite 1087 beschrieben.



   Es gibt drei allgemeine Methoden zur Durchführung der Tests mit den erfindungsgemässen immunologischen Indikatoren. Diese Methoden wenden die Prinzipien der Chromatographie, diejenigen der Agglutination in einer Röhre und die der Agglutination in einer Schicht oder auf einer Platte an. Welche Methode nun tatsächlich ausgewählt wird, hängt im wesentlichen von der Grösse der Mikrobenzellen ab, die verwendet werden.



   Für den chromatographischen Test werden Mikrobenzellen bevorzugt, die die Form von ellipsoidförmigen Stäben besitzen und etwa 0,3 bis 0,4 Mikron lang sind. Für die Platten-Agglutination-Tests können die Mikrobenzellen längere Stäbe sein, die beispielsweise eine Länge im Bereich von 1 bis 3 Mikron und einen Durchmesser im Bereich von 0,5 Mikron besitzen, wobei die Zellen auch Kokkenform aufweisen können. Ein Röhren-Agglutinations-Test kann für einen weiten Grössenbereich der Mikrobenzellen ausgearbeitet werden, wobei der Grössenbereich zwischen etwa 0,2 bis etwa 10 Mikron in jeder Raumrichtung der Mikroben, d. h. in Längsrichtung oder in Querrichtung liegen kann.



   Die Platten- oder Röhren-Agglutinations-Tests beruhen auf der Fähigkeit des immunologischen Indikators zu agglutinieren, wobei sich bei der Agglutination ein erkennbarer Unterschied im Muster zu dem Muster bildet, das der Indikator bei Nichtvorhandensein einer Agglutination zeigt. Diese Art der Testung kann in zwei grundlegend verschiedenen Weisen durchgeführt werden, wobei im ersten Fall eine Agglutination und im zweiten Fall eine Hemmung der Agglutination auftritt. Im Fall der Agglutination wird ein Antigen an die Mikrobenzellen gekuppelt, wobei sich ein Indikator bildet, und dieser wird verwendet, um die Anwesenheit des entsprechenden Antikörpers in der Probe festzustellen. Wenn die Probe den Antikörper enthält, dann agglutiniert der Indikator mit dem Antikörper und dieser Umstand kann durch das Muster festgestellt werden, das der Indikator zeigt.

  Bei der Hemmung der Agglutination wird das Antigen an die Mikrobenzellen gekuppelt, wobei sich ein immunologischer Indikator bildet, das dann mit dem homologen Antikörper zur Testung auf die Anwesenheit von Antigen in der Probe herangezogen wird. Wenn die Probe das Antigen enthält wird der homologe Antikörper von dem Antigen gehemmt oder neutralisiert und der Indikator wird nicht agglutiniert.



  Unter der Bedingung der Nicht-Agglutination wird sich der Indikator der aus unlöslichen Mikrobenzellen und dem gebundenen Antigen besteht aus der Testflüssigkeit abscheiden, wobei sich ein erkennbarer Unterschied im Muster im Vergleich zu dem Muster bildet, das der agglutinierte Indikator zeigt.



   Die Agglutinierung zeigt sich im Fall des Platten-Tests durch die Bildung eines körnigen Musters, während im Fall des Röhren-Tests die Agglutinierung durch eine gleichmässige einheitliche Suspension der Zellen angezeigt wird.



  Wenn beim Platten-Test eine Nicht-Agglutinierung auftritt, so zeigt sich dies in Form eines glatten Musters und im Fall des Röhren-Tests zeigt sich die Nicht-Agglutinierung durch die Sedimentation des Indikators am Boden der Röhre, wobei diese Sedimentation entweder die Form eines Ringes oder eines Fleckes annehmen kann.



   Die gleiche Art der Agglutinierung oder Hemmung der Agglutinierung ist für den Typus der chromatographischen Testung verantwortlich, wobei für den Fall, dass die getestete Probe ein spezielles Antigen oder einen Antikörper enthält, dann von der chromatographischen Lösung eine spezielle Wanderungseigenschaft gezeigt wird. Für den Fall, dass Agglutinierung auftritt, wird beim chromatographischen Test ein Fleck des Indikators auf einen geeigneten chromatographischen Träger, beispielsweise ein Filterpapier, aufgetragen und dann wird ein Tropfen der auf die Anwesenheit des Antikörpers zu testenden Flüssigkeit an der gleichen Stelle aufgetragen und der Rand des Trägers wird mit der Entwicklerflüssigkeit, beispielsweise einer Salzlösung, in Berührung gebracht. Wenn die Probe den Antikörper enthält, dann agglutiniert der Indikator und bildet mit dem Antikörper ein Immunaggregat. 

  Dieses Aggregat wandert nicht weiter, wenn die Entwicklerflüssigkeit vordringt und es wird nur eine geringe Veränderung des Flecks auftreten. Wenn jedoch die Probe keinen Antikörper enthält, dann bildet sich kein Immunaggregat und der Indikator wandert dann weiter sobald die Lösungsmittelfront fortschreitet, wobei sich ein Streifenmuster bildet. Bei der Ausführung eines Tests auf die Hemmung der Agglutinierung wird nach dem chromatographischen Testverfahren ein Fleck des Immunaggregats gebildet, indem man einen Tropfen einer Antikörper enthaltenden Lösung auf einen Tropfen des bereits aufgetragenen immunologischen Indikators aufbringt. Ein Tropfen der auf  die Anwesenheit des Antigens zu testenden Probe wird dann auf den Fleck des Immunaggregates aufgetragen und man lässt eine Lösung im Trägermaterial aufsteigen.

  Es ist auch möglich, den Rand des Trägermaterials direkt mit der Probe zusammenzubringen so dass das Antigen, falls es anwesend ist, mit dem Tropfen des Immunaggregates in Kontakt kommt. Falls die Probe das Antigen enthält, wird das Immunaggregat aufgrund der bevorzugten Reaktion zwischen Antikörper und Antigen zur Dissoziation gebracht und der Indikator wandert dann und bildet ein Streifenmuster. Für den Fall, dass kein Antigen in der Probe anwesend ist, tritt natürlich keine Wanderung des Flecks, der das Immunaggregat enthält, auf.



   Die Erfindung soll anhand der Beispiele näher erläutert werden. In den Beispielen werden die Teile als Gewichtsteile pro Volumen angegeben und die Pufferkonzentrationen werden in Molaritäten M angegeben, falls nicht ausdrücklich angeführt wird, dass andere Bezeichnungsweisen vorliegen.



  Beispiel 1
Ein immunologischer Indikator wurde hergestellt, indem man als Mikrobenzellen, Zellen der Brucella abortus verwendete und es wurde Bis-diazobenzidin (BDB) als Kupplungsmittel angewandt und menschliches Choriongonadotropin (CGZH) als Antigen eingesetzt. Dieser Indikator wurde dann auf ein aufsaugendes Trägermaterial in Verbindung mit dem Antikörper des CGTH aufgetragen und Harnproben wurden dann mit der so erhaltenen Testvorrichtung auf die Anwesenheit von CGTH geprüft. Dieser Indikator funktionierte nach dem in der Folge beschriebenen chromatographischen Mechanismus.



  Herstellung des Reagens
Isotone Salzlösung: Eine   0,8S0Ioige    Salzlösung wurde hergestellt, indem man 8,5 g Natriumchlorid in einem Liter destilliertem Wasser löste.



   Phosphatpuffer: Eine 0,15-molare Pufferlösung eines pH-Wertes von 7 wurde hergestellt, indem man eine trokkene Mischung aus 81 % sekundärem Natriumphosphat (Na2HPO4) und 19   010    primärem Natriumphosphat (NaH2PO4) in destilliertem Wasser auflöste, bis der gewünschte pH-Wert erreicht war.



   Bis-diazobenzidinlösung: Zu 0,92 g Benzidin wurden 100 ml destilliertes Wasser und 6 ml 6-normale Salzsäure gegeben. Es wurden zusätzlich 100 ml destilliertes Wasser der Mischung zugesetzt. Nach der Auflösung des Benzidins wurde die Lösung in einem Eis-Salzkühlbad auf 0   "C    abgekühlt. Sobald sich in der Lösung Eiskristalle zu bilden begannen, wurden 6,5 ml einer   10 /0igen    Lösung aus Natriumnitrit rasch unter Rühren zugesetzt. Das Rühren wurde so lange fortgesetzt, bis die Lösung gegenüber Stärkejodidpapier negativ reagierte. Während des Rührens wurde dafür Sorge getragen, dass die Temperatur niemals auf über etwa 1   "C    anstieg.



   Dieses Material wies eine schwache Gelbfärbung auf.



  Bei der Zugabe des Phosphatpuffers veränderte sich die Farbe in Rotbraun. Die blassgelbe Lösung war bei Zimmertemperatur zwischen 5 und 7 Stunden beständig, bei 4    C    war sie etwa 7 Tage lang stabil. Wenn diese Lösung gefroren wurde und bei -20   "C    aufbewahrt wurde, dann war sie 60 Tage hindurch beständig. Bei einer Lagerung bei -35   "C    war sie mindestens 6 Monate lang beständig.



   Formalinisierung der Mikrobenzellen: Zellen der Brucella abortus wurden 72 Stunden lang bei 37   "C    auf Tryptoseagar gezüchtet und dann wurde der Agar mit einer   0,85%eigen    Salzlösung, die 1   010   Formaldehyd enthielt, weggewaschen. Die Zellen wurden sofort mit Formaldehyd behandelt, indem man sie in einer Kochsalz-Formaldehyd-Lösung 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur (25   "C)    beliess. Die Zellen wurden dann gründlich gewaschen, um den Rest des Schutzmittels (Formaldehyd) zu entfernen. Das Waschen der Zellen der Brucella abortus wurde durchgeführt, indem man die Zellen in destilliertem Wasser suspendierte. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und erneut in destilliertem Wasser suspendiert, wobei diese Verfahrensschritte mehrmals wiederholt wurden.

  Die konservierten Zellen wurden dann gefärbt.



   Färbung der formalinisierten Mikrobenzellen: 2 g der nass zusammengepackten formalinisierten Zellen der Brucella abortus, lqml   2 /Oiges    Ferrosulfat und 5 ml   1 /Oiges    wässriges Hämatoxylin wurden 100 ml destilliertem Wasser zugesetzt und die Mischung wurde 24 Stunden lang ständig gerührt. Die Zellen wurden dauerhaft gefärbt und die Farbe laugte sich nicht aus.



   Herstellung des Indikators: (Formalinisierte Mikrobenzellen-BDB-CGTH) Zellen der Brucella abortus, die mit Hämatoxilin wie oben beschrieben, gefärbt waren, wurden als Indikatorpartikeln für menschliches CGTH herangezogen, das von der Vitamerican Corp. Little Falls, New Jersey, erhalten wurde. Ein Volumen, das 0,5 g zusammengepackter gefärbter Zellen enthielt wurde zu 10 ml einer Salzlösung gegeben, die 20 mg CGTH enthielt und dann wurden 12 ml Phosphatpuffer und 40 ml einer verdünnten BDB-Lösung, die durch Mischen von 8 ml der oben beschriebenen BDB-Lösung mit 32 ml Phosphatpuffer hergestellt wurde zugegeben. Man liess die Kupplungsreaktion unter ständigem Rühren 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur (25   "C)    ablaufen. Der erhaltene braune Komplex wurde dann abzentrifugiert und dreimal durch Zentrifugieren mit destilliertem Wasser gewaschen.

  Da es gewünscht war, diesen Indikator auf einen saug fähigen Träger aufzutragen, wurde ein Anteil von 0,2 g dieses Indikators in einem Mörser homogenisiert. Es wurde eine kräftige Mischung mit einem Tropfen   1 /0igem    Merthiolat vorgenommen und 1 g Saccharosesirup (25   Gew.-01o    pro Volumen) wurde langsam zugegeben.



   Herstellung des Antikörpers für das CGTH. Laboratoriumskaninchen wurden mit Injektionen aus menschlichem CGTH in Freunds komplettem Hilfsstoff in einer Reihe von Impfungen behandelt. Nach einem vorgegebenen Zeitraum wurde den Kaninchen Blut abgenommen und das Serum, das den Antikörper enthielt, wurde vom Gesamtblut abgetrennt. Das angewandte CGTH kann irgendeines der käuflich erhältlichen Präparate sein. Besonders nützlich ist dasjenige, das von der Vitamerican Corp. vertrieben wird, und das eine Aktivität von etwa 2000 bis 2500 internationalen Einheiten (1. U.) pro mg aufweist. Ein typisches Schema für die Injektionsbehandlung und die Abtrennung des Antikörpers ist das folgende: Eine Lösung, die 10 mg CGTH pro ml Salzlösung enthält, wurde mit gleichen Teilen Freunds komplettem Hilfsstoff gemischt.

  Ein Zehntel (0,1 ml) der Mischung wurde in jeden Zehenballen eines Kaninchens injiziert, das   3'k    kg wog. Am Ende eines Zeitraumes von 2 Wochen wurde eine erste Injektion von 0,5 ml einer Lösung verabreicht, die 5 mg CGTH pro ml Salzlösung enthielt. Die Injektion wurde intravenös gegeben. Zwei Tage nach der ersten Injektion wurde eine zweite verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Injektion wurden dem Kaninchen Blutproben abgenommen. Das Antiserum wies einen Titer von   1:2560,    bestimmt durch Hämagglutination, auf.

 

   Testverfahren (chromatographisches Testverfahren): Ein Fleck des oben hergestellten Indikators wurde etwa in einer Entfernung von 19 mm vom Rand eines Stück Filterpapiers aufgetragen und ein Tropfen des obigen Antiserums wurde sodann aufgetragen, wobei sich ein Immunaggregat bildete.



  Der Rand des Papiers wurde dann mit einer normalen Harnprobe einer Nichtschwangeren in Kontakt gebracht. Als der   Harn im Papier hochstieg, blieb der Fleck des Immunaggregats fest am Papier. Dies zeigte, dass das gebildete Immunaggregat durch die üblichen Harnbestandteile nicht zur Dissoziation gebracht wurde. Ein anderer Streifen des Filterpapiers wurde wie oben beschrieben mit einem Fleck aus Immunaggregat versehen und der Rand des Papiers wurde in, eine Harnprobe einer schwangeren Frau eingebracht der Harn stieg im Papier hoch, ein Teil des Immunaggregats dissoziierte und bewirkte eine Streifenbildung oder eine Aufwärtswanderung des gefärbten Indikators aus dem Aggregatfleck, der entsprechenderweise an Farbintensität verlor.



   Bei einem anderen Test wurden die Flecken des Immunaggregats auf verschiedenen Papierstreifen aufgetragen und dann wurden die Harnproben auf diese Streifen aufgetropft. Die Ränder der Streifen wurden dann in eine physiologische Salzlösung eingetaucht. Sobald die Salzlösung über die Flecken hinaus aufstieg, die mit dem Harn einer schwangeren Frau behandelt wurden, wanderte ein Teil des gefärbten Indikators mit, wobei sich ein Streifenmuster bildete.



  Eine relativ geringe Streifenbildung zeigte sich, wenn die Salzlösung über Flecken wanderte, die mit dem normalen Harn einer Nichtschwangeren behandelt wurden.



   Testvorrichtungen wurden zum Testen des Vorhandenseins des Antikörpers für menschliches CGTH hergestellt, indem man Flecken des oben beschriebenen Indikators etwa 1,9 cm vom Rand eines Stückes Filterpapier auftrug. Ein Tropfen Kaninchenserum, das den Antikörper enthielt, wurde auf den Fleck des Indikators auf einen der Streifen aufgetragen und der Rand des Filterpapiers wurde in eine physiologische Salzlösung eingetaucht. Die Salzlösung wanderte über den Fleck ohne dass eine Streifenbildung des Indikators auftrat, wodurch gezeigt wurde, dass sich ein unlösliches Immunaggregat gebildet hatte. Ein Tropfen normalen Kaninchenserums wurde in gleicher Weise mit dem Indikator getestet und es stellte sich heraus, dass ein Abwandern vom Fleck auftrat, wodurch gezeigt war, dass sich kein Immunaggregat gebildet hatte.



   Der oben beschriebene Indikator zeigte auch Agglutinierung durch den Antikörper des menschlichen CGTH, wenn der Agglutiniertest nach dem System des Röhrchentests durchgeführt wurde. Diese Agglutinierungen konnten durch Zugabe geringerer Mengen einer CGTH enthaltenden Lösung zu dem Testmedium leicht gehemmt werden.



   Bei der Herstellung der diagnostischen Zusammensetzungen auf einem aufsaugenden Trägermaterial unter Verwendung eines Indikators, der Mikrobenzellen enthält, ist es wesentlich, dass das aus Zellen bestehende Material durch Behandlung mit einem Schutzmittel, wie oben beschrieben, stabilisiert wird.



   Eine andere Indikatorvorrichtung kann hergestellt werden, indem man den oben beschriebenen Indikator mit dem Antikörper unter Bildung eines Immunaggregats mischt und einen einzigen Fleck auf eine Stelle, die vom Rand des Streifens entfernt ist, aufträgt und trocknet. Bei der Verwendung wird ein Tropfen einer Harnprobe auf diesem Fleck aufgetragen oder an einer Stelle aufgetragen, die sich zwischen diesem Fleck und dem Rand des Papiers befindet, worauf dann das Ende des Streifens in eine Salzlösung eingetaucht wird. Wenn der Harn CGTH enthält, dann dissoziiert das
Aggregat und der gefärbte Indikator wandert mit der Salzlö sung und es bilden sich Streifen. Falls kein CGTH anwesend ist, tritt keine Veränderung auf.



   Andererseits kann auch die Harnprobe als chromatogra phische Entwicklerflüssigkeit verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Testvorrichtung so ge artet, dass das diagnostische Reagens in Form eines Strei fens vorliegt, der beispielsweise dadurch hergestellt wird, dass man ein Band des Indikators und Antikörperaggregats etwa 15 mm vom langen Rand eines Eaton-Dikeman-Filterpapiers Nr. 609, das die Dimension 13   cmx    26 cm aufweist, aufträgt und das Reagens bei Zimmertemperatur trocknen lässt und das Papier der Breite nach in Streifen zerschneidet und diese Streifen bis zu deren Verwendung in einem geeigneten Behälter aufbewahrt.



   Man sieht, dass viele verschiedene Materialien als saugfähige Streifen bei dem beschriebenen Streifentest angewandt werden können. Beispielsweise können viele Arten chromatographischer Materialien angewandt werden und es können auch viele Arten chromatographischer Entwicklerflüssigkeiten verwendet werden.



  Beispiel 2
Escherichia coli wurde als Indikatorteilchen zur Herstellung eines Indikators verwendet, das aus Mikrobenzellen, BDB und CGTH bestand. Dieser Indikator wurde zusammen mit dem Antikörper für CGTH angewandt, wobei ein Agglutinationstest nach dem Plattentyp vorgenommen wurde und eine klinische Feststellung der Schwangerschaft wurde mit diesem Test durchgeführt.



  Herstellung der Reagentien    0,8S0loige    Salzlösung: Es wurden 68 g Natriumchlorid in 8 Litern destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde bei einem atü und 350   "C    30 Minuten lang im Autoklaven behandelt. Sie wurde dann abgekühlt und bei 4   "C    aufbewahrt.



  Die Behandlung im Autoklaven wurde durchgeführt, um die Salzlösung zu sterilisieren.



     1 /0ige    Formaldehydlösung: eine   37 /0ige    Formalinlösung wurde behandelt, indem man gepulvertes Calciumcarbonat zu der Lösung zusetzte und die Mischung 24 bis 28 Stunden lang stehen liess. Das überstehende Material wurde dann in einen anderen Behälter abgegossen und dreimal durch ein hochwertiges, weisses Filterpapier mit gecreppter Oberfläche abfiltriert. Wenn der pH-Wert unter 7 lag, dann wurde er durch Zugabe einer   0,1%eigen    NaOH-Lösung auf 7 eingestellt. Eine ausreichende Menge dieser behandelten   37obigen    Formalinlösung wurde destilliertem Wasser zugesetzt, so dass sich eine   l0loige    Lösung ergab.



   Phosphatpufferlösung: es wurden 100 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,4 hergestellt, indem man 80,8 ml einer Natriumphosphatlösung mit 19,2 ml einer Kaliumphosphatlösung bei 20   "C    mischte. Die Natriumphosphatlösung enthielt 53,726 g Na2HPO4   -    12H2O pro Liter destilliertem Wasser. Die Kaliumphosphatlösung enthielt 20, 414 g KH2PO4 pro Liter destilliertem Wasser.



   Bis-diazobenidin (BDB): 0,640 g Benzidindihydrochlorid (Benzidin   2HCl)    wurden in 100 ml einer   0,56%eigen    Salzsäurelösung in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben aus Pyrexglas gelöst. Dieser Kolben wurde auf eine mit Eis gefüllte magnetische Rührvorrichtung gegeben und der magnetische Rührer wurde in die Lösung eingetaucht. Wenn die Temperatur 4   "C    erreicht hatte, wurde ein 5-ml-Anteil einer Natriumnitritlösung, die durch Zugabe von 0,68 g NaNO2 zu 10 ml Wasser hergestellt wurde, mit einer serologischen Pipette aufpipettiert und tropfenweise zu der Benzidinlösung während einer Zeit von 7 bis 10 Minuten gleichmässig zugegeben, wobei der magnetische Rührer mit einer Geschwindigkeit von 200 Umdrehungen pro Minute lief. 

  Es wurde alle 4 bis 6 Sekunden ein Tropfen Natriumhydridlösung zugegeben, wobei die Natriumnitritlösung ebenfalls eine Temperatur von 4   "C    aufwies. Die Lösung wurde kontinuierlich 20 Minuten lang gerührt, und nach dieser Zeit wurde sie sofort eingefroren und bei -60   "C    in einer Anzahl von 1 Gramviolen aufbewahrt. Die Lösung kann sich sogar bei einer Tempera tur von 0   OC    bis 5   "C    zersetzen und daher wurde sie eingefro ren, damit sie stabil gehalten wurde. Sie kann dann erwärmt  werden, wenn sie zur Verwendung gebracht wird.



   Antikörper für das CGTH. Eine Emulsion, die 10 mg CGTH pro ml enthält, wurde hergestellt, indem man 100 mg gereinigtes CGTH in 5 ml der obigen Salzlösung löste und 5 ml des kräftig gemischten kompletten Freunds Hilfsmittel zugab und zur Herstellung einer Emulsion schüttelte. Eine Menge von 0,2 ml der Emulsion wurde in jeden Fussballen eines gesunden Kaninchens injiziert, das sich in standardisierter Laboratoriumsumgebung befand, wobei das Kaninchen eine Gesamtmenge von 0,8 ml der Emulsion (8 mg CGTH) injiziert erhielt.



   Dem Kaninchen wurden dann eine Reihe von Injektionen verabreicht, wobei jede aus einer 0,5 ml Lösung bestand, die hergestellt wurde, indem man ausreichend gereinigtes CGTH in   0,85 /Oiger    Salzlösung löste, so dass eine Konzentration von 5 mg pro ml erhalten wurde. Die Injektionen wurden in die Ohrvenen gegeben. Diese folgenden Injektionen wurden an den folgenden Tagen nach der ersten Emulsionsinjektion verabreicht und zwar am 22. Tag, am 24.,   38      40.,    71., und 73. Tag. Zwei Proben von 40 bis 50 ml Blut wurden dem Kaninchen durch Kardiapunktur sowohl am 50.



  als auch am 83. Tag entnommen. Die roten Blutkörperchen dieser Proben wurden vom Serum jeder Probe abgetrennt, indem man das Blut in einem Zentrifugierröhren bei etwa 25   "C    etwa 2 Stunden lang ausflocken liess und das darüberstehende Serum wurde dann in ein Röhrchen mit einem geringeren Durchmesser (weniger als 30 mm) gegeben und das Röhrchen 30 Minuten lang in ein Wasserbad von 56   "C    gegeben.



   10 mg mit Formaldeyd behandelter roter Blutkörperchen des Schafes (lyophilisiert) wurden dann pro ml der Serumporbe zugegeben und 15 Minuten bei 25   OC    gemischt, um heterophile Antikörper aus dem Serum zu adsorbieren. Das adsorbierte Serum wurde mittels Zentrifugieren von den roten Blutkörperchen getrennt, wobei während des Abzentrifugierens etwa die tausendfache Erdbeschleunigung herrschte.



   Eine Menge von 40 ml zusammengepackter, roter Blutkörperchen des Schafes wurden für diese Adsorption hergestellt, indem man 200 ml frisches, rotes   Schafblut,    das in Alserver-Lösung dispergiert ist, abzentrifugierte und die dar überstehende Flüssigkeit entfernte und dann dreimal mit   0,85 /Oiger    Salzlösung wusch, wobei pro Waschung 120 bis 200 ml Salzlösung angewandt wurden. Zu den so erhaltenen roten Blutkörperchen wurden 460 ml der oben angegebenen Salzlösung und 500 ml einer   3%eigen    Formalinlösung des pH-Wertes 7,3 gegeben. Die dabei erhaltene Suspension wurde gemischt und man liess sie 18 bis 20 Stunden lang bei 37   OC    stehen.

  Die roten Blutkörperchen wurden dann durch Zentrifugieren entfernt und sie wurden fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen wobei bei jedem Waschvorgang etwa 200 ml destilliertes Wasser verwendet wurde. Es wurde dann eine ausreichende Menge an destilliertem Wasser zugegeben, so dass sich eine   20 /0ige    Suspension der Zellen ergab. Diese Suspension wurde bei   4"C    aufbewahrt bis sie dann zur Adsorption verwendet wurde.



   Mikrobenzellen: Die Zellen der Escherichia coli wurden erhalten, indem man einen Darmabstrich eines toten Labora   toriumskaninchens    in einer Hirn-Herz-Infusionsbrühe (HHI Brühe) züchtete. Ein Volumen von 68 ml einer gut   gewach-    senen Kultur (18 Stunden) wurde verwendet, um 3 Liter der Hirn-Herz-Infusionsbrühe zu beimpfen, wobei die Brühe vor der Impfung auf Sterilität geprüft wurde. Die Zellen wurden   4'    Stunden lang bei 37   OC    unter Schütteln bebrütet. Die so er haltenen Zellen wiesen einheitliche Grösse und Form auf.



  Herstellung des Indikators
Die drei Liter an suspendierten Escherichia coli-Zellen wurden mit 10 000 Umdrehungen pro Minute, 10 Minuten lang abzentrifugiert, um die überschüssige Flüssigkeit von den zusammengepackten Zellen zu isolieren. Das darüberstehende Material wurde abgegossen und die zurückbleibenden zusammengepackten Zellen wurden mit etwa 45 ml einer Formaldehydlösung, die mit 37 % Calciumcarbonat behandelt war, zusammengebracht, um eine Tötung der Escherichia coli zu gewährleisten. Man liess das Formalin mit den Zellen eine Stunde lang in Berührung und nach dieser Zeit wurden die Zellen dreimal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen und dann in 1600 ml einer   l0lcigen    Formaldehydlösung 21 Stunden lang bei Zimmertemperatur (25   "C)    suspendiert.

  Diese Zellen wurden dann abzentrifugiert und als zusammengepackte, mit Schutzmittel behandelte Zellen isoliert. Die zusammengepackten Zellen wurden dann erneut mit 500 ml der oben beschriebenen Salzlösung suspendiert und bei 4   "C    aufbewahrt. Die Konzentration der Zellen betrug 4 %, wie eine Messung mit einem Hämatokrit ergab.



   Ein Teil der oben beschriebenen Suspension der Zellen wurde zentrifugiert um ein Volumen an zusammengepackten Zellen zu gewinnen und 0,5 ml dieser zusammengepackten Zellen wurden entfernt und 10 ml der oben beschriebenen Salzlösung zugegeben, der vorher 20 mg CGTH, 12 ml Phosphatpuffer und 40 ml verdünnte BDB-Lösung zugegeben worden waren. Die verdünnte BDB-Lösung wurde hergestellt, indem man 8 ml BDB mit 32 ml Phosphatpuffer zusammenbrachte. Das CGTH hatte eine Aktivität von 36 000 internationalen Einheiten pro mg und wurde bei der Vitamerican Corp. gekauft.

  Diese Mischung wurde kontinuierlich 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur geschüttelt und dann wurde der gebildete Indikator durch Zentrifugieren gewonnen und dreimal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen und sodann zentrifugiert und erneut in einer 1 :50 Verdünnung von Rinder-Serumalbumin (30   Olo)    in der obigen Salzlösung suspendiert. Das Rinder-Serumalbumin (BSA) wurde bei der Armour  & Co. erworben.



   Die erhaltene Suspension des Indikators zeigte eine bräunliche Farbe und es stellte sich heraus, dass sie über weite Temperaturbereiche stabil war.



  Vorprüfung des Indikators
Zur Bestimmung der geringsten feststellbaren Mengen an CGTH wurden normale Harnproben hergestellt, indem man ihnen bekannte Mengen an CGTH zusetzte. Das oben hergestellte Indikatorsystem wurde dann zusammen mit dem obigen Antikörper für CGTH (AkCGTH) zur Durchführung eines Agglutinationstests nach dem Plattentyp angewandt.



   Bei dieser Prüfung wurde der obige Indikator erneut in ausreichender Menge an 1:   50-BSA-Salzlösung    resuspendiert, wobei eine   8 /Oige    Zellkonzentration erhalten wurde.

 

  Darauffolgend wurden drei Lösungen der oben beschriebenen Antikörperlösung hergestellt, indem man einen Teil der Antikörperlösung mit 250 Teilen der oben beschriebenen Salzlösung sowie mit 500 Teilen der oben beschriebenen Salzlösung und ferner mit 1000 Teilen der oben beschriebenen Salzlösung verdünnte. Diese Verdünnungen wurden als 1: 250, 1 :500 und   1:1000    bezeichnet. Harnproben jeder der folgenden Konzentrationen an CGTH wurden hergestellt, indem man 0,25 ml einer Vorratslösung aus 4 mg CGTH pro ml Salzlösung (3600 internationale Einheiten pro mg) zu 100 ml einer Harnprobe einer nichtschwangeren Frau zugab und dann in der Serie mit Salzlösung 2,25, 4,5, 6, 9, 18 und 36 internationalen Einheiten CGTH pro ml Harn und Salz verdünnte. Ein Teil dieser Harnprobe wurde dann als Leerwert aufbewahrt.



   Ein Tropfen jeder dieser Harnproben wurde mit einem   Tropfen der geeigneten Antikörperverdünnung gemischt und die Mischung wurde auf eine Platte aufgetragen. Dann wurde ein Tropfen der oben beschriebenen   8%eigen    Suspension des Indikators den Zellen, die sich bereits auf der Platte befanden, zugesetzt und gemischt. Die Ergebnisse dieser Testreihe werden in der unten angeführten Tabelle 1 angegeben.

  In dieser Tabelle bedeutet  -  Agglutination und daher ein körniges Aussehen in der Suspension auf der Platte,   wäh-    rend  +  ein glattes, nicht agglutiniertes Muster auf der Platte bedeutet
Tabelle 1 CGTH-Konzentration Verdünnungen an CGTH-Antikörper im Harn in internat Einheiten pro ml   1: 250      1:

   500    1 :1000    0 (Leerwert)   
2,25 - - 
4,5 - - +
6,0 - + +
9,0 + + + 18,0 + + + 36,0 + + +
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass für den Fall, dass kein CGTH in der Harnprobe anwesend ist, Agglutination eintritt Diese Erscheinung ist darauf zurückzuführen, dass die Harnprobe kein CGTH enthält, das bevorzugt mit dem Antikörper des CGTH reagieren könnte, so dass der Antikörper des CGTH mit dem Indikatorsystem agglutiniert und das körnige Aussehen der balligen oder klumpigen Zellen auf dem benetzten Teil der Platte liefert.

  Wenn man 2,25 internationale Einheiten CGTH pro ml einer Harnprobe zusetzt, dann ist noch immer genug CGTH-Antikörper in dem System anwesend, dass bei Umsetzung des gesamten CGTH noch eine ausreichende Menge an CGTH-Antikörper anwesend ist, der ein Zusammenballen der Zellen oder eine Agglutination selbst bei einer Verdünnung von   1:1000    liefert.



  Wenn Harnproben, die 4,5 internationale Einheiten CGTH pro ml enthalten, mit drei Verdünnungen an Antikörper des CGTHs getestet wurden, dann setzt sich der Antikörper mit dem CGTH bei Verdünnungen zwischen   1:500    und   1:1000    vollständig um, so dass das Aussehen bei einer Verdünnung von   1:1000    nicht körnig ist, sondern ein glattes Muster von suspendierten Indikatorzellen geliefert wird, d. h. dass in diesem Fall keine Agglutination auftritt Man sieht, dass mit 6,0 internationalen Einheiten an CGTH pro ml die nötige Menge an Antikörper zwischen den Verdünnungen von   1    :250 und 1 :

  :500 liegt, wie dies auch zu erwarten war, da eine grössere Menge an CGTH anwesend ist und daher auch eine grössere Menge an Antikörper der CGTHs notwendig ist, um eine vollständige Reaktion mit dem CGTH hervorzurufen. In diesem Fall tritt daher das körnige Muster bei einer Verdünnung von   1    :250 auf. Aus Tabelle 1 sieht man, dass sehr geringe Mengen an CGTH im Harn, nämlich etwa 4,5 internationale Einheiten CGTH pro ml dann festgestellt werden können, wenn man geringe Konzentrationen an Antikörper des CGTHs im Testsystem, nämlich Verdünnungen von   1:10000    oder weniger, anwendet. Es hat sich auch herausgestellt, dass durch eine Verdoppelung der Harnmenge, nämlich durch eine Verwendung von zwei Tropfen, Konzentrationen an CGTH, die nur 2 internationale Einheiten CGTH pro ml betragen, festgestellt werden können.



   Um die genauen Zeiten, die zur Entwicklung des körnigen Musters in einem Bereich von CGTH-Antikörperkonzentrationen und Zellkonzentrationen festzustellen, wurden die folgenden zusätzlichen Tests aufgeführt.



   Teile des Indikators wurden in einer ausreichenden Menge der oben beschriebenen BSA 1 :50 Verdünnung in Salzlösung wieder suspendiert, so dass Konzentrationen von 0,625 %, 1,25 %, 2,5    /0    und 5 % Zellen erhalten wurden. Sodann wurde eine Verdünnungsreihe an CGTH-Antikörperlösungen mit Hilfe der obigen BSA hergestellt und zwar 1 :50 in Salzlösung, so dass die Verdünnungen   1:125,      1:250,      1: 500, 1: 1000, 1: 2000,      :4000,1    :8000 und   1:16000er-    halten wurde. Vier Tropfen jeder der CGTH-Antikörperverdünnungen wurden in getrennten Parallelenreihen auf die Oberfläche einer kreuzweise schraffierten Glasplatte aufgetragen.

  Dem ersten Tropfen jeder dieser Verdünnungen wurde ein Tropfen der niedrigsten Konzentration der Indikatorzellsuspensionen zugesetzt Dem zweiten Tropfen jeder Verdünnung des CGTH-Antikörpers wurde ein Tropfen einer   1,25%eigen    Suspension zugesetzt und den dritten und vierten Tropfen jeder der Verdünnungen ein Tropfen der   2,5 /0igen,    bzw.   Obigen    Zellsuspensionen zugefügt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt, wobei die Zeit bis zur Entwicklung eines körnigen Agglutinationsmusters für jede Testmischung in Sekunden angegeben ist.



  Die Bezeichnung  S  in der Tabelle zeigt an, dass in diesem Fall eine ungenügende Menge an CGTH-Antikörper in der Antikörperverdünnung anwesend war, so dass in diesem Fall keine Agglutination der Zellen auftrat und daher das Muster glatt blieb.



   Tabelle 2
Agglutinationszeiten in Sekunden Konzentratio- Verdünnung an CGTH-Antikörper nen des Indikators, % 1:125 1:250 1:500 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000 0,625 34 50 213 85 107 280 S S 1,25 31 30 36 58 56 150 120 S 2,5 25 31 43 62 92 140 S S 5,0 35 30 55 60 75 S S S
Die in Tabelle 2 angeführten Agglutinationszeiten zeigen, dass eine relativ kurze Zeitperiode notwendig ist, um die Agglutination festzustellen, wobei Agglutination beim tatsächlichen Test dann die Abwesenheit von Schwangerschaft bedeutet. Aus diesem Grund kann Schwangerschaft nach dem Plattenagglutinationstest mit dem obigen Indikator in einer Zeit von etwa einer Minute oder in noch kürzerer Zeit festgestellt werden. Dies ist ein wesentlich kürzerer Zeitraum als derjenige, der bei den Röhrchen-Agglutinationssystemen angewandt werden muss, die auf der Verwendung von roten Blutkörperchen beruhen. 

  Auch die Muster, durch die die Erscheinung der Agglutination von dem Fehlen der Agglutination unterschieden wird, sind sehr klar gezeichnet und es gibt praktisch bei diesen Tests keine unklaren, dazwi  schenliegenden Muster, bei denen es zweifelhaft ist, ob Agglutination oder keine Agglutination aufgetreten ist. Es ist daher möglich, die Reagentien so auszuwählen, dass genau bestimmte Muster für die Diagnose der Schwangerschaft erhalten werden können.



   Tabelle 2 zeigt auch, dass ein weiter Bereich an CGTH Antikörperverdünnungen angewandt werden kann, und dass auch ein weiter Bereich an Indikator-Konzentrationen verwendbar ist. Die Konzentration des Indikators in BSA 1 :50 Verdünnung in Salzlösung kann bei einem verwendbaren Testsystem im Bereich von weniger als 1 % bis etwa 12    /0    liegen.



   Zur Prüfung des Indikators des Beispiels 2 mit tatsächlichen Harnproben wurden 16 Harnproben von 16 nichtschwangeren Frauen gewonnen, wobei 4 dieser Frauen unter einer regelmässigen Behandlung mit empfängnisverhütenden Pillen standen. Die Testmethode war die gleiche wie die oben angegebene. Dies heisst, ein Tropfen der Harnprobe wurde mit einem Tropfen einer 1 :1000 CGTH-Antikörperverdünnung gemischt und dann wurde ein Tropfen dieser Mischung auf eine Glasplatte gegeben und ein Tropfen einer   4obigen    Suspension des oben beschriebenen Indikators wurde der Mischung, die bereits auf der Platte anwesend war, zugegeben. In all diesen 16 Fällen, bildete sich ein körniges Muster, das Agglutination anzeigte, und deshalb der Test anzeigte, dass keine Schwangerschaft vorlag.

  Dieses Testergebnis zeigt an, dass falsche, positive Resultate nicht zu den Schwierigkeiten des obigen Indikators gehören, und dass für diese spezielle Art der Testung Hormonspiegel, die durch schwangerschaftsverhütende Pillen hervorgerufen werden, nicht stören.



  Klinischer Test unter Verwendung eines Indikators
31 gefrorene Harnproben wurden verwendet, und die Tests wurden ausgeführt, wobei die Gesundheitsbedingungen der Patienten, von denen diese Proben genommen wurden, unbekannt waren. Ein bekannter Harn einer Schwangeren wurde als Kontrollwert mitaufgenommen und ebenso ein Harn einer Nichtschwangeren als weiterer Kontrollwert.



  Die Plattentests wurden in der oben beschriebenen Weise durchgeführt und mit Plattentests verglichen, die mit den gleichen Harnproben aber mit einem käuflich erhältlichen
Plattentest zur Bestimmung der Schwangerschaft, der aus einem Indikatorsystem aus Latexpartikeln in Kombination mit CGTH bestand, durchgeführt.



   Der Indikator wurde als   40/Die    Suspension verwendet
Die Antikörperlösung bestand aus einer 1 :1000 Verdün nung der oben beschriebenen Antikörperlösung in Kochsalzlösung. Das Testverfahren bestand darin, dass man einen Tropfen jeder Harnprobe mit einem Tropfen der Antikörperlösung vermischt und dann je einen Tropfen dieser Mi schung auf eine reine Glasplattenoberfläche gab und dann einen Tropfen einer   4obigen    Indikatorsuspension zusetzte und mischte. Die Ergebnisse wurden mit + als positiv bezeichnet, d. h. es zeigte sich ein glattes Muster, durch das angezeigt war, dass die Agglutination gehemmt war und daher dieses Ergebnis einen positiven Test auf Schwangerschaft darstellte.

  Mit negativ, also mit einem - Zeichen wurde die Anwesenheit eines körnigen Musters bezeichnet, d. h. eines
Musters, das Agglutination zeigte und daher anzeigte, dass keine Schwangerschaft vorlag.



   Der Test mit dem käuflich erhältlichen Testsystem wurde genau nach den auf der Packung angegebenen Instruktionen durchgeführt und die Ergebnisse wurden als schwanger und nichtschwanger mit plus und minus   bezeich-    net. Diese Ergebnisse sind in der unten angeführten Tabelle 3 aufgeführt.



   Tabelle 3
Klinische Studien der Ergebnisse Unbekannte Indikator Käuflich erhältliches Urinprobe Nr. des Beispiels 2 Schwangerschaftstestsystem    1 f -   
2 +    -   
3 + +
4 +   +   
5 +   +   
6 +    -   
7 + +
8 + kein Versuch
9 + + 10 + 11 +    -    12 + + 13 + + 14 + + 15 + + 16 +    -    17 + 18 +    -    19 + + 20 + 21 + + 22   +    kein Versuch 23 + 24 + + 25 + 26 + + 27 + + 28 + + 29   +    + 30   +    kein Versuch 31   +    kein Versuch
Aus der obigen Tabelle ist ersichtlich, dass bei Durchfüh rung des Testes mit Hilfe des Indikators nach Beispiel 2 alle
Harnproben als Harnproben von schwangeren Frauen beur teilt wurden.

   11 der 27 Harnproben, die mit dem käuflich er hältlichen Testsystem durchgeführt wurden, zeigten negative
Ergebnisse, d. h. gemäss diesem Test sollten diese Harnpro ben von nichtschwangeren Frauen stammen. Es wurde dann von der die Proben liefernden Stelle bekannt gegeben, dass alle unbekannten Harnproben von schwangeren Frauen stammten, wobei die Proben im Zeitraum zwischen wenigen
Wochen Schwangerschaft und   81L    Monaten Schwangerschaft abgenommen wurde.



   Der bekanntermassen von einer Schwangeren stam mende Harn und bekanntermassen von einer Nichtschwan geren stammende Harn wurden nur mit dem Indikator des
Beispiels 2 getestet und deshalb wurden diese Werte nicht in die Tabelle 3 aufgenommen. Die Ergebnisse bei diesen beiden Tests waren jedoch wie erwartet, d. h. negativ für den Harn der Nichtschwangeren und positiv für den Harn der Schwangeren, die sich in der 8. Woche der Schwanger schaft befand.



   Beispiel 3
Im Unterschied zum oben angegebenen Beispiel 2 wurde ein Indikator nach einer zweistufigen Reaktion hergestellt, indem man zuerst Zellen der Escherichia coli einer Pufferlö sung zugab und dann eine BDB-Lösung aus einem immuno logischen Indikator zusetzte. Zur Herstellung eines Indika  tors wurde dann eine CGTH-Lösung zugefügt, und die Kupplungsreaktion wurde dann ausgeführt.



  Herstellung der Reagentien
Salz- Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7. Es wurden 150 ml einer sekundären Natriumphosphat-Kochsalzlösung (Na2HPO4) mit Hilfe von 75 ml einer primären Natriumphosphat-Salzlösung (NaH2PO4) auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht. Die erste Lösung wurde hergestellt, indem man 150 ml einer   0,5molaren      Na2HPO4    7H2O-Lösung mit 350 ml destilliertem entionisiertem Wasser und 500 ml einer   0,85%eigen    Kochsalzlösung mischte. Die primäre Natriumphosphat-Kochsalzlösung wurde hergestellt, indem man 150 ml einer   0,5molaren      NaH2PO4    H2O-Lösung mit 350 ml destilliertem, entionisiertem Wasser und 500 ml einer   0,85%eigen    Salzlösung mischte.



   Salz-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert 7,5. Es wurden 180 ml der oben beschriebenen sekundären Natriumphosphat-Kochsalzlösung mittels der oben beschriebenen primären Natriumphosphat-Kochsalzlösung auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht.



   BDB-Lösung: Es wurden 1 Vol.-Teil einer 0,025-molaren Benzidinhydrochloridlösung (Benzidin   2HCl)    in 0,36-molarer HCI einem Volumen einer 0,1-molaren NaNO2-Lösung in destilliertem entionisiertem Wasser zugesetzt und man liess die erhaltene Mischung zwei Minuten lang reagieren. Dann wurde die Mischung auf einen pH-Wert von 7 gebracht, indem man gleiche Volumina der Mischung des oben beschriebenen Salz-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7 und 0,31-molare NaOH in destilliertem Wasser zugab. Sofort nachher wurden 6 ml und 2 ml Anteile der BDB-Lösung in Behälter gegeben, die verschlossen und versiegelt wurden und bei -83   "C    eingefroren wurden. Diese BDB-Lösungen wurden bei Verwendung bei +4   "C    aufgetaut.



   Zellen der Escherichia coli: die Zellen der Escherichia coli wurden in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise mit Formaldehyd behandelt und dann zu einer   1,40liegen    Zellsuspension verdünnt und diese wurde in 50 ml Zentrifugengläser pipettiert und mit 3100 Umdrehungen pro Minute 15 Minuten lang zentrifugiert. Das darüberstehende Material wurde dann verworfen und die zusammengepackten Zellen wurden erneut suspendiert, indem man sie zuerst mit einem Vortex mischte, bis das Produkt glatt erschien und dann wurden 20 ml der Salzlösung des Beispiels 2 zugegeben. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und das darüberstehende Material verworfen. Diese Salzwaschung wurde bei zwei weiteren Waschungen zweifach durchgeführt.

  Eine Menge von 0,2 ml der erhaltenen zusammengepackten Zellen wurde in 2 ml der oben beschriebenen Salzlösung sususpendiert Diese Suspension wurde dann eine Stunde lang bei 4   "C    aufbewahrt. Nach dieser Zeit wurden 2 ml einer   1:5    Verdünnung der obigen BDB-Lösung in der Phosphatlösung des Beispiels 2 zugegeben und die Mischung wurde in eine Rotationsschüttelapparatur bei 4   "C    gegeben und 30 Minuten lang im Dunkeln geschüttelt. Die Zellen wurden dann 5 Minuten lang bei 4   "C    abzentrifugiert und zweimal mit 4 ml einer kalten Salz-Phosphatpufferlösung, deren pH-Wert 7,5 betrug, gewaschen, wobei sich eine relativ stabile Suspension bildete.



   Daraufhin wurden 1,6 ml des kalten Salz-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,5 und 0,8 ml CGTH in 6 ml einer Salzlösung, die 4 mg Kochsalz pro ml enthielt, zu der Zellsus pension zugefügt. Das hiebei erhaltene Indikatorsystem wurde zur Testung vorbereitet, indem man die Mischung einmal mit 25 ml BSA   1:50    in Salzlösung wusch und bei 300 Umdrehungen pro Minute 5 Minuten lang abzentrifugierte und das Material in einem Vortex-Mischer erneut suspendierte. Eine 0,9-ml-Lösung von BSA 1 :50 in Kochsalzlösung wurde dann zugegeben, um den Indikator erneut zu suspendieren, worauf es dann in einem Kühlschrank gelagert wurde. Ein Anteil von 0,3 ml dieses obigen Präparats wurde bei Zimmertemperatur 4 Stunden lang auf der Schüttelmaschine geschüttelt. Die Suspension wurde dann eine Stunde lang bei 37   "C    auf einer Schüttelmaschine behandelt.

  Die Suspension wurde zweimal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen und einmal mit BSA   1:50    in Salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden dann erneut zu 0,3 ml in BSA   1: 50    in Salzlösung suspendiert, wobei eine   10%ige    Zellenkonzentration erhalten wurde.



   Ein indirekter Agglutinationstest wurde dann durchgeführt, indem man einen Tropfen der Zellensuspension mit einem Tropfen jeder der Antikörperlösungen mit steigender Verdünnung vermischte. Die Verdünnungen waren   1:250,      1: 500    und   1:1000.    Ein glattes Muster zeigte eine gute, indirekte Agglutination an und ein derartiges Muster zeigte sich bei beiden Verdünnungen 1 :1000. Wenn auch dieses Muster nicht so stark war, wie die beiden anderen, wurde es als glatte Agglutination betrachtet. Dies zeigt, dass Indikatormaterial getrennt hergestellt und aufbewahrt werden kann und zur Kupplung von Antigenmaterialien verwendet werden kann, die nachher zur Testung herangezogen werden können.



  Beispiel 4
Ein immunologischer Indikator wurde zur Testung von Harnproben auf die Anwesenheit von CGTH mit Hilfe der Kupplung von menschlichem CGTH auf Hefezellen mit Hilfe des chemischen Kupplungsmittels BDB hergestellt.



  Das Indikatorsystem wurde in Kombination mit dem Antikörper für CGTH zur Ausführung eines Tests auf die Hemmung der Agglutination verwendet
Ein Gramm der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde ausgewogen und dreimal mit 200 ml der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen. Die angewandte Hefe war diejenige, die unter dem Handelsnamen  Fleischmanns aktive Trokkenhefe  vertrieben wird. Die Hefezellen wurden dann wieder suspendiert, und zwar in 400 ml einer 1    /0    Formaldehyd enthaltenden Kochsalzlösung. Man liess die Suspension bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang unter manchmaligem Umschütteln stehen. Die Zellen wurden dann mit 2000 Umdrehungen pro Minute, während einer Zeit von 10 Minuten abzentrifugiert und die zusammengepackten Zellen entfernt und in 200 ml der oben beschriebenen Salzlösung bei 4   "C    aufbewahrt.

  Bei der Messung im Hämatokrit zeigte die Suspension einen Wert von 1,4   010.   



   Zu 0,5 ml der zusammengepackten, mit Formaldehyd behandelten Hefezellen wurden 12 ml des oben beschriebenen Phosphatpuffers und dann 6 ml einer Kochsalzlösung zugegeben, die 20 ml CGTH   pro. 10    ml enthielt und dann wurden die Zellen mit 40 ml einer   1:5    Verdünnung der obigen BDB Lösung zusammengebracht. Die Reaktion wurde unter ständigem Rühren während 20 Minuten bei Zimmertemperatur durchgeführt. Das erhaltene Indikatorsystem wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und dreimal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen, wobei nach der Waschung die zusammengepackten Zellen erneut in einer BSA Salzlösung der Verdünnung   1:50    suspendiert wurden. Die erhaltene Suspension zeigte im Hämatokrit einen Wert von   6 olo.   

 

   Die 6    /0ige    Zellsuspension wurde dann mit CGTH-Antikörper einer Verdünnung von   1:500    verwendet, um zwei
Harnproben auf die Anwesenheit von CGTH zu prüfen. Ein Anteil von 0,2 ml der   obigen    Zellsuspension wurde einmal gewaschen und mit BSA   1:50    in Kochsalzlösung auf die üb liche Konzentration verdünnt, um ein Endvolumen von 0,2 ml zu erreichen. Ein Tropfen eines Harns einer Frau, von der bekannt war, dass sie schwanger ist, wurde mit einem   Tropfen der CGTH-Antikörperlösung gemischt und die Mischung wurde 2 Minuten lang stehen gelassen. Dann wurde ein Tropfen dieser Mischung auf eine Glasplatte gegeben.



  Ein Tropfen des Indikators wurde mit dem auf der Glasplatte befindlichen Material gemischt. Es bildete sich ein glattes Muster, das das Vorhandensein einer Schwangerschaft anzeigte. Der Test wurde mit dem Harn einer Nichtschwangeren wiederholt und in kurzer Zeit bildete sich ein körniges agglutiniertes Muster.



   Dieses Beispiel zeigt, dass Hefezellen als Indikatorpartikel in den Indikatoren verwendet werden können. Diese Zellen bringen den Vorteil mit sich, dass sie in trockener, stabiler Form käuflich erworben werden können.



  Beispiel 5
Ein Indikator wurde hergestellt, indem man Escherichia coli als Mikrobenzellen verwendete, ein Carbodiimid als Kupplungsmittel anwandte und CGTH als Antigensubstanz verwendete. Dieser Indikator wurde sowohl zur Prüfung der Agglutination als auch zur Prüfung der Hemmung der Agglutination verwendet Herstellung der Reagentien
Mikrobenzellen: die Zellen der Escherichia coli wurden wie in Beispiel 2 gezüchtet, aus dem Zuchtmedium isoliert und mit Formaldehyd behandelt. Ein Volumen von 20 ml einer   2,5obigen    Suspension wurde auf diese Weise hergestellt. Diese Suspension wurde abzentrifugiert und 0,5 ml der zusammengepackten Zellen wurden zur Herstellung des Indikators verwendet
Kupplungsmittel: es wurden 0,2 g N,N-Dicyclohexylcarbodiimid in 0,5 ml Tetrahydrofuran gelöst und dann wurden 1,0 ml destilliertes Wasser zu der Lösung zugegeben.



   Antigensubstanz: es wurden 40 mg CGTH in 2 ml destilliertem Wasser gelöst. Das verwendete CGTH hatte eine Aktivität von 2590 internationalen Einheiten pro mg und wurde bei der Vitamerican Corp., Little Falls, New York erworben.



   Lösung des CGTH-Antikörpers: Anteile der Antikörperlösung und der   0,8S0loigen    Kochsalzlösung, die nach Beispiel 2 hergestellt wurde, wurden verwendet, um Verdünnungen des CGTH-Antikörpers von   1:50,      1:100    und   1:200    herzustellen.



  Herstellung des Indikators
0,5 ml des zusammengepackten Zellenvolumens der Zellen der Escherichia coli wurden fünfmal mit kaltem Wasser gewaschen und dann in 2 ml CGTH-Lösung suspendiert. Die Lösung des Kupplungsmittels wurde dann zu den suspendierten Zellen und dem CGTH zugegeben, um die entsprechende Kupplung zu erreichen. Die Mischung wurde dann geschüttelt und 24 Stunden bei 25   "C    aufbewahrt. Die folgenden Waschungen wurden durchgeführt, um den Indikator von irgendwelchen anhaftenden Verunreinigungen zu befreien.

  Diese Waschungen wurden wie folgt durchgeführt: dreimal mit 0,01-molarer Natriumcarbonatlösung, dreimal mit 0,01-molarer Salzsäure, dreimal mit destilliertem Wasser,   einmal mit 1 0loiger NaC1-Lösung, die einen pH-Wert von 2,3    aufwies, einmal mit einer 1 :20 Verdünnung der Salz-Phosphatlösung des Beispiels 3 in   0,8s0loiger    Salzlösung, die einen pH-Wert von 7,0 aufwies und einmal mit einer 1 :50 Verdünnung des BSA in   0,85 /Oiger    Salzlösung. Der gewaschene Indikator wurde dann erneut bis zu einer Zellkonzentration von 8 % in BSA 1 :50 in   0,8s0loiger    Salzlösung suspendiert. Diese   8 /0ige    Suspension wurde in einem kalten Raum aufbewahrt und für den Test wie unten angegeben entnommen.



   Eine Vor-Agglutination wurde durchgeführt, indem man einen Tropfen jeder der oben angeführten Antikörper-Verdünnungen mit einem Tropfen der Suspension des Indikators an verschiedenen Stellen der Glasplatte vermischte. Ein Vergleichsversuch wurde durchgeführt, indem man einen Tropfen einer 1: 50 Verdünnung eines normalen Kaninchenserums (normal rabbit serum = NRS) in 0,85 % Salzlösung mit einem Tropfen der Indikator-Suspension an getrennten Stellen der gleichen Platte zusammenbrachte. Die hiebei erhaltenen Ergebnisse werden in der unten angeführten Tabelle 4 veranschaulicht, in der die Bezeichnung  S  angibt, dass das Muster glatt war, d. h. dass keine Agglutination aufgetreten ist, während die Bezeichnung  G  anzeigt, dass das Muster körnig war, d. h. dass Agglutination aufgetreten war.



   Tabelle 4
Indirekte Agglutinationstests Indikator Antikörperverdünnungen Vergleichs
1:50 1:100 1:200 versuch
NRS Beispiel 5, 8% G G S S
Tabelle 4 zeigt, dass Agglutination bei den Verdünnungen   1:50    und   1:100    auftrat, dass jedoch ungenügende Mengen an CGTH-Antikörper in der Verdünnung   1:200    anwesend waren, so dass in diesem Fall keine Agglutination des Indikators auftrat. Der Vergleichsversuch zeigte ein glattes Muster, das anzeigt, dass das System mit einer NRS-Lösung nicht sofort agglutiniert.



   Weitere Tests wurden ausgeführt, indem man 0,5 ml einer Harnprobe einer schwangeren Frau mit 0,5 ml einer 1 :100 Antikörperverdünnung in einem Teströhrchen zusammenbrachte und die Mischung 5 Minuten lang bei 25   C    stehen liess. Es wurde dann 1 Tropfen aus dem Teströhrchen entnommen und mit einem Tropfen der   8%eigen    Suspension des Indikators auf einem Glasplättchen vermischt.



  Es wurde ein glattes Muster beobachtet, das anzeigte, dass die durch den CGTH-Antikörper hervorgerufene Agglutination des Indikatorsystems durch die Anwesenheit von CGTH in der Harnprobe gehemmt worden war.



   Der Test wurde unter Verwendung von 0,5 ml einer Harnprobe einer nichtschwangeren Frau wiederholt, wobei sich innerhalb kurzer Zeit ein körniges Muster entwickelte.



   Dieses Beispiel zeigt, dass Carbodiimid als Kupplungsmittel zum Binden der Antigensubstanz an die Mikrobenzellen verwendet werden kann.



  Beispiel 6
Zwei zusätzliche Indikatoren wurden gemäss der Vorschrift des Beispiels 5 hergestellt. Die angewandten Antigene waren menschliches Serumalbumin (human serum albumin = HSA) und Pferde-y-globulin. Der Indikator für menschliches Serumalbumin wurde hergestellt, indem man 10 mg menschliches Serumalbumin pro   0,25    ml des Volumens der zusammengepackten Zellen der Escherichia coli verwendete, anstelle der Verwendung von CGTH. Der Indikator für Pferde-y-globulin wurde hergestellt, indem man 40 mg dieses Antigens pro 0,25 ml des zusammengepackten Zellvolumens der Escherichia coli-Zellen anstelle des CGTHs verwendete.

 

   Der Agglutinationstest wurde durchgeführt, indem man einen Tropfen jedes der hergestellten Indikatoren mit einem Tropfen einer 1 :10 Verdünnung jedes der entsprechenden Antiseren in   0,85 /0iger    Kochsalzlösung vermischte. Ein Vergleichsversuch wurde bei jedem der Tests durchgeführt, indem man einen Tropfen einer 1 :10 Verdünnung eines  normalen Kaninchenserums in   0,85 /0iger    Kochsalzlösung anwandte.



   Die Tropfen der Antiseren verursachten eine gute Agglutination des Musters der entsprechenden Indikatoren. Durch normales Kaninchenserum wurde keine Agglutination bewirkt Beispiel 7
Die Indikatoren und die Agglutinationstests des Beispiels 6 wurden mit gleichen Resultaten wiederholt, indem man N-t-Butyl-5-methylisoxazolium-perchlorat anstelle von Carbodiimid als Kupplungsmittel verwendete.



   Dieses Kupplungsmittel wurde verwendet, indem man 10 ml einer   2,5obigen    Suspension der mit Formaldehyd behandelten Zellen des Beispiels 2 anwandte und 5 bis 10 Minuten lang zentrifugierte um die darüberstehende Lösung zu entfernen. Die Zellen wurden dann viermal mit kaltem Wasser gewaschen und wieder suspendiert und zwar in 20 ml einer   0,1%eigen    Natriumbicarbonatlösung in destilliertem Wasser.



  Eine Menge von 3 mg Bernsteinsäureanhydrid wurde dann zugegeben und die Zellen wurden über Nacht bei 4   "C    geschüttelt. Die Zellen wurden zentrifugiert und noch dreimal mit Wasser gewaschen worauf dann die succinilierten Zellen in 5 ml destilliertem Wasser wieder suspendiert wurden.



  Eine Pipette wurde verwendet, um den Zellen 10 Mikroliter Triäthylamin zuzugeben. Sodann wurden 17 mg N-t-Butyl-5methylisoxazoliumperchlorat zugegeben. Dieses Kupplungsmittel ist unter dem Namen Woodward's Reagenz  L  bekannt Das so gebildete Material zur Herstellung eines immunologischen Indikators wurde verwendet, um die im Beispiel 6 beschriebenen Antigene in den dort angegebenen Mengen zu kuppeln. Menschliches Serumalbumin und Pferde-y-globulin wurden an die Zellen der Escherichia coli nach dem oben angeführten Verfahren gekuppelt, wobei eine Umsetzung mit 1 :10 des Kaninchen-Antikörpers bezüglich menschlichen Serumalbumins und eine Umsetzung mit   1:10    des Kaninchenantikörpers gegen Pferde-y-globulin jeweils Agglutinationen lieferte. Keine Agglutination wurde hingegen hervorgerufen, wenn normales Kaninchenserum 1 :10 verwendet wurde.



  Beispiel 8
12 verschiedene Indikatoren wurden hergestellt, indem man gemäss Beispiel 2 die Formaldeyhdbehandlung der Mikrobenzellen durchführte und die Kupplung des Antigens an diese Mikrobenzellen mit Hilfe BDB durchführte. Es wurden die folgenden Mikrobenzellen verwendet: Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii und Pseudomonas fragi und die Antigene, die in Kombination mit diesen Indikatorpartikeln angewandt wurden waren menschliches Serumalbumin, Pferde-y-globulin und menschliches Insulin.



  Agglutinationstests nach dem Plattentyp wurden durchgeführt.



   Der Bacillus subitlis und der Bacillus pumilus wurden in der gleichen Weise gezüchtet, wie für die Zellen der Escherichia coli in Beispiel 2 beschrieben wurde. Der Lactobacillus leichmannii wurde während der gleichen Zeit unter der gleichen Temperatur von 37   "C    auf einer Brühe gezüchtet, die wie folgt zusammengesetzt war: 890 ml Wasser, 100 ml Tomatensaftfiltrat, 10 ml  Bacto-Tween 80 , 7,5 g Hefeextrakt 7,5 g Pepton, 10 g Dextrose und 2 g sekundäres Natriumphosphat Die Brühe wies einen pH-Wert von 6,8 auf und war im Autoklaven 10 Minuten lang bei 121   "C    unter-einem Druck von 1 atü zur Sterilisierung behandelt worden.



   Die Zellen der Pseudomonas fragi wurden   4'±    Stunden lang bei Zimmertemperatur (25   "C)    in einer vorher sterilisierten Brühe gezüchtet, die aus 1 Liter Wasser, 5 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Dextrose und 1 g sekundärem Natriumphosphat bestand.



   Die gewonnenen Zellen wurden mit Formalin behandelt und 0,25 ml des zusammengepackten Zellenvolumens jeder der beschriebenen Zellen wurden für das in Beispiel 2 beschriebene Kupplungsverfahren verwendet Es wurden hiezu drei Ansätze jeder dieser Zellen in 6 ml des in Beispiel 2 beschriebenen Phosphatpuffers suspendiert und zu jeder Portion der suspendierten Zellen wurden die folgenden Antigene zugegeben, die in 5 ml einer 0,85%igen Kochsalzlösung gelöst waren. Als Antigene wurden verwendet: 3 mg mensch.



  liches Serumalbumin, 40 mg Pferde-y-globulin und 20 mg Insulin. Dann wurden 20 ml einer   1:5    Verdünnung der BDB Lösung des Beispiels 2 in Phosphatpuffer zugegeben um ähnliche Kupplungsreaktionen durchzuführen.



   Jedes der 12 genannten Materialien zur Herstellung von Indikatoren wurde mit dem entsprechenden Antikörper und mit gewöhnlichem Serum als Vergleichsversuch getestet.



  Die Indikatoren, die menschliches Serumalbumin bzw. Pferde-y-globulin enthielten, wurden mit einer 1 :50 Verdünnung des im Kaninchen gebildeten Antikörpers für menschliches Serumalbumin bzw. des im Kaninchen gebildeten   Antikör-    pers für Pferde-y-globulin in Salzlösung getestet. Die Insulin Indikatoren wurden mit einem unverdünnten Insulin-Antikörper enthaltenden Meerschweinchenserum in Salzlösung getestet. Die Vergleichsversuche jedes der 12 Tests wurden durchgeführt, indem man eine 1 :10 Verdünnung eines gewöhnlichen Kaninchenserums in Kochsalzlösung prüfte. Die jedem der Antigene entsprechenden Antikörper agglutinierten jeder der vier Indikatoren, die mit den einzelnen Antigenen hergestellt wurden, und bei den Vergleichsversuchen wurde jeweils keine Agglutination gefunden.



   Die Erfindung betrifft sämtliche immunologischen Indikatoren des Typs  Mikrobenzellen-Kupplungsmittel-Antigensubstanz  die zur Durchführung sehr vieler Tests und zur Herstellung von Testvorrichtungen verwendet werden können.



   PATENTANSPRUCH 1
Immunologischer Indikator, dadurch gekennzeichnet, dass er Mikrobenzellen enthält, an die über eine covalente chemische Bindung eine Verbindung gebunden ist, die ausserdem über eine weitere covalente Bindung an ein Antigen gebunden ist.



   UNTERANSPRÜCHE
1. Indikator nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen Bakterienzellen, Pilzzellen, Parasitenzellen, Protozoenzellen oder Virenzellen sind.



   2. Indikator nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen gleiche Form und Grösse aufweisen und in einer Richtung eine maximale Ausdehnung im Bereich von 0,2 bis 10 Mikron besitzen.



   3. Indikator nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen mit einem Inaktivierungsmittel vorbehandelte Mikrobenzellen sind.

 

   4. Indikator nach Patentanspruch I oder Unteranspruch   3, dadurch    gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen ge   färbte    Mikrobenzellen sind.



   5. Indikator nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass er in Form eines saugfähigen Materials   vor-    liegt.



   6. Indikator nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Serumantigen, vorzugsweise   y-GIobulin,    Serumalbumin oder eine Blutgruppensubstanz, ein Mikrobenantigen, eine antigene Hormonsubstanz, ein Proteinhydrolyseprodukt oder ein Enzym ist.



   7. Indikator nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen Ovalbumin, Tuberculin, Insulin, das 

**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.



   

Claims (1)

1. **WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **. normalen Kaninchenserums in 0,85 /0iger Kochsalzlösung anwandte.

   Die Tropfen der Antiseren verursachten eine gute Agglutination des Musters der entsprechenden Indikatoren. Durch normales Kaninchenserum wurde keine Agglutination bewirkt Beispiel 7 Die Indikatoren und die Agglutinationstests des Beispiels 6 wurden mit gleichen Resultaten wiederholt, indem man N-t-Butyl-5-methylisoxazolium-perchlorat anstelle von Carbodiimid als Kupplungsmittel verwendete.

   Dieses Kupplungsmittel wurde verwendet, indem man 10 ml einer 2,5obigen Suspension der mit Formaldehyd behandelten Zellen des Beispiels 2 anwandte und 5 bis 10 Minuten lang zentrifugierte um die darüberstehende Lösung zu entfernen. Die Zellen wurden dann viermal mit kaltem Wasser gewaschen und wieder suspendiert und zwar in 20 ml einer 0,1%eigen Natriumbicarbonatlösung in destilliertem Wasser.

   Eine Menge von 3 mg Bernsteinsäureanhydrid wurde dann zugegeben und die Zellen wurden über Nacht bei 4 "C geschüttelt. Die Zellen wurden zentrifugiert und noch dreimal mit Wasser gewaschen worauf dann die succinilierten Zellen in 5 ml destilliertem Wasser wieder suspendiert wurden.

   Eine Pipette wurde verwendet, um den Zellen 10 Mikroliter Triäthylamin zuzugeben. Sodann wurden 17 mg N-t-Butyl-5methylisoxazoliumperchlorat zugegeben. Dieses Kupplungsmittel ist unter dem Namen Woodward's Reagenz L bekannt Das so gebildete Material zur Herstellung eines immunologischen Indikators wurde verwendet, um die im Beispiel 6 beschriebenen Antigene in den dort angegebenen Mengen zu kuppeln. Menschliches Serumalbumin und Pferde-y-globulin wurden an die Zellen der Escherichia coli nach dem oben angeführten Verfahren gekuppelt, wobei eine Umsetzung mit 1 :10 des Kaninchen-Antikörpers bezüglich menschlichen Serumalbumins und eine Umsetzung mit 1:10 des Kaninchenantikörpers gegen Pferde-y-globulin jeweils Agglutinationen lieferte. Keine Agglutination wurde hingegen hervorgerufen, wenn normales Kaninchenserum 1 :10 verwendet wurde.

   Beispiel 8 12 verschiedene Indikatoren wurden hergestellt, indem man gemäss Beispiel 2 die Formaldeyhdbehandlung der Mikrobenzellen durchführte und die Kupplung des Antigens an diese Mikrobenzellen mit Hilfe BDB durchführte. Es wurden die folgenden Mikrobenzellen verwendet: Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii und Pseudomonas fragi und die Antigene, die in Kombination mit diesen Indikatorpartikeln angewandt wurden waren menschliches Serumalbumin, Pferde-y-globulin und menschliches Insulin.

   Agglutinationstests nach dem Plattentyp wurden durchgeführt.

   Der Bacillus subitlis und der Bacillus pumilus wurden in der gleichen Weise gezüchtet, wie für die Zellen der Escherichia coli in Beispiel 2 beschrieben wurde. Der Lactobacillus leichmannii wurde während der gleichen Zeit unter der gleichen Temperatur von 37 "C auf einer Brühe gezüchtet, die wie folgt zusammengesetzt war: 890 ml Wasser, 100 ml Tomatensaftfiltrat, 10 ml Bacto-Tween 80 , 7,5 g Hefeextrakt 7,5 g Pepton, 10 g Dextrose und 2 g sekundäres Natriumphosphat Die Brühe wies einen pH-Wert von 6,8 auf und war im Autoklaven 10 Minuten lang bei 121 "C unter-einem Druck von 1 atü zur Sterilisierung behandelt worden.

   Die Zellen der Pseudomonas fragi wurden 4'± Stunden lang bei Zimmertemperatur (25 "C) in einer vorher sterilisierten Brühe gezüchtet, die aus 1 Liter Wasser, 5 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Dextrose und 1 g sekundärem Natriumphosphat bestand.

   Die gewonnenen Zellen wurden mit Formalin behandelt und 0,25 ml des zusammengepackten Zellenvolumens jeder der beschriebenen Zellen wurden für das in Beispiel 2 beschriebene Kupplungsverfahren verwendet Es wurden hiezu drei Ansätze jeder dieser Zellen in 6 ml des in Beispiel 2 beschriebenen Phosphatpuffers suspendiert und zu jeder Portion der suspendierten Zellen wurden die folgenden Antigene zugegeben, die in 5 ml einer 0,85%igen Kochsalzlösung gelöst waren. Als Antigene wurden verwendet: 3 mg mensch.

   liches Serumalbumin, 40 mg Pferde-y-globulin und 20 mg Insulin. Dann wurden 20 ml einer 1:5 Verdünnung der BDB Lösung des Beispiels 2 in Phosphatpuffer zugegeben um ähnliche Kupplungsreaktionen durchzuführen.

   Jedes der 12 genannten Materialien zur Herstellung von Indikatoren wurde mit dem entsprechenden Antikörper und mit gewöhnlichem Serum als Vergleichsversuch getestet.

   Die Indikatoren, die menschliches Serumalbumin bzw. Pferde-y-globulin enthielten, wurden mit einer 1 :50 Verdünnung des im Kaninchen gebildeten Antikörpers für menschliches Serumalbumin bzw. des im Kaninchen gebildeten Antikör- pers für Pferde-y-globulin in Salzlösung getestet. Die Insulin Indikatoren wurden mit einem unverdünnten Insulin-Antikörper enthaltenden Meerschweinchenserum in Salzlösung getestet. Die Vergleichsversuche jedes der 12 Tests wurden durchgeführt, indem man eine 1 :10 Verdünnung eines gewöhnlichen Kaninchenserums in Kochsalzlösung prüfte. Die jedem der Antigene entsprechenden Antikörper agglutinierten jeder der vier Indikatoren, die mit den einzelnen Antigenen hergestellt wurden, und bei den Vergleichsversuchen wurde jeweils keine Agglutination gefunden.

   Die Erfindung betrifft sämtliche immunologischen Indikatoren des Typs Mikrobenzellen-Kupplungsmittel-Antigensubstanz die zur Durchführung sehr vieler Tests und zur Herstellung von Testvorrichtungen verwendet werden können.

   PATENTANSPRUCH 1 Immunologischer Indikator, dadurch gekennzeichnet, dass er Mikrobenzellen enthält, an die über eine covalente chemische Bindung eine Verbindung gebunden ist, die ausserdem über eine weitere covalente Bindung an ein Antigen gebunden ist.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Indikator nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen Bakterienzellen, Pilzzellen, Parasitenzellen, Protozoenzellen oder Virenzellen sind.

   2. Indikator nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen gleiche Form und Grösse aufweisen und in einer Richtung eine maximale Ausdehnung im Bereich von 0,2 bis 10 Mikron besitzen.

   3. Indikator nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen mit einem Inaktivierungsmittel vorbehandelte Mikrobenzellen sind.

   4. Indikator nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen ge färbte Mikrobenzellen sind.

   5. Indikator nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass er in Form eines saugfähigen Materials vor- liegt.

   6. Indikator nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Serumantigen, vorzugsweise y-GIobulin, Serumalbumin oder eine Blutgruppensubstanz, ein Mikrobenantigen, eine antigene Hormonsubstanz, ein Proteinhydrolyseprodukt oder ein Enzym ist.

   7. Indikator nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen Ovalbumin, Tuberculin, Insulin, das

   Hormon Choriongonadotropin (CGTH), sowohl dasjenige menschlichen als auch dasjenige tierischen Ursprungs, menschliches Serumalbumin oder Pferde-y-globulin ist.

   PATENTANSPRUCH II Verfahren zur Herstellung des immunologischen Indikators nach Patentanspruch - 1, dadurch gekennzeichnet, dass Mikrobenzellen, ein Antigen und eine Verbindung, die mindestens 2 reaktive Gruppen aufweist, miteinander umgesetzt werden, wobei eine dieser reaktiven Gruppen mit den Mikrobenzellen unter Bildung einer covalenten chemischen Bindung reagiert und die andere der erwähnten reaktiven Gruppen mit dem Antigen reagiert, wodurch erreicht wird, dass über diese Verbindung das Antigen an die Mikrobenzellen gebunden ist.

   UNTERANSPRÜCHE 8. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikrobenzellen Bakterienzellen, Pilzzellen, Parasitenzellen, Protozoenzellen oder Virenzellen verwendet 9. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen gleiche Form und gleiche Grösse aufweisen und in einer Richtung eine maximale Ausdehnung im Bereich von 0,2 bis 10 Mikron besitzen.

   10. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikrobenzellen solche verwendet, die mit einem Inaktivierungsmittel behandelt wurden.

   11. Verfahren nach Patentanspruch II oder Unteranspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man gefärbte Mikrobenzellen verwendet 12. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man als Verbindung, die mindestens 2 reaktive Gruppen aufweist, Bis-diazobenzidin, Bis-diazobenzidindisulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, ein Carbodiimid, Toluoldiisocyanat, Cyanurchlorid, Dichlor-s-triazin oder N-t-Butyl-5-methylisoxazolium-perchlorat verwendet 13.

   Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Suspension der Mikrobenzellen in Anwesenheit des Antigens herstellt und diese Suspension mit der Verbindung, die mindestens 2 reaktive Gruppen aufweist, zusammenbringt, wobei eine dieser reaktiven Gruppen mit den Mikrobenzellen und die andere mit dem Antigen reagiert und man Mikrobenzellen, Antigen und die reaktive Verbindung eine ausreichende Zeit in Berührung hält, so dass die Reaktion zwischen den Partnern auftritt und dann den so erhaltenen immunologischen Indikator von der flüssigen Suspension entfernt.

   14. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mikrobenzellen zunächst mit der Verbindung, die mindestens 2 reaktive Gruppen aufweist, umsetzt, wobei eine dieser reaktiven Gruppen mit den Mikrobenzellen unter Bildung einer covalenten chemischen Bindung reagiert und die andere der genannten reaktiven Gruppen im ungebundenen Zustand verbleibt, und dass man sodann die Umsetzung mit dem Antigen vornimmt, wobei das Antigen an die zweite der reaktiven Gruppen gebunden wird.

   15. Verfahren nach Unteranspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mikrobenzellen vor der Umsetzung mit der Verbindung, die mindestens 2 reaktive Gruppen aufweist, mit einem Inaktivierungsmittel behandelt.

   PATENTANSPRUCH III Verwendung des Indikators nach Patentanspruch I zur Feststellung von Antigenen oder Antikörpern.

   UNTERANSPRÜCHE 16. Verwendung nach Patentanspruch III, dadurch gekennzeichnet, dass man den Indikator zusammen mit dem Antikörper des im Indikator gebundenen Antigens zur Prüfung auf das Antigen verwendet.

   17. Verwendung nach Unteranspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Indikator als erste Abscheidung auf einem saugfähigen Material befindet, die vom Rand dieses saugfähigen Materiales entfernt ist und dass sich auf dieser ersten Abscheidung eine zweite Abscheidung befindet, die den Antikörper des im Indikator gebundenen Antigens enthält.

   18. Verwendung nach Unteranspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man den Indikator als Abscheidung eines Immunaggregates aus dem Indikator und dem Antikörper des im Indikator gebundenen Antigens auf einem saugfähigen Material verwendet, auf dem er sich in Entfernung vom Rand dieses Materials befindet.

   19. Verwendung nach Patentanspruch III oder einem der Unteransprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen des Indikators inaktivierte Mikrobenzellen sind.