CH529102A

CH529102A - Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung

Info

Publication number: CH529102A
Application number: CH1563765A
Authority: CH
Inventors: Beat Dr Iselin; Heini Dr Kappeler; Bernhard Dr Riniker; Werner Dr Rittel
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1964-08-13
Filing date: 1965-11-12
Publication date: 1972-10-15
Also published as: AT309701B

Description

Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung
Es wurden bereits Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, dass sie am Aminoende als erste a-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen, vgl. z.B. Schweizer Patent Nummer 499 497.

Als Peptid mit sehr guter ACTH-Wirkung ist darin das H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH (D-Ser1-ss'-24-Corticotropin) beschrieben.

Es wurde nun gefunden, dass das entsprechende Peptid, das an Stelle der Argininreste in 17,18-Stellung Lysinreste enthält, eine bessere adrenocroticotrope Wirkung aufweist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung des D-S eryl-L-tyrosyl-L-seryl-L- methionyl-L-glutamyl-(oder L-glutaminyl)-L-histidyl-Lphenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-propyl L-valyl-glycyl -L-lysyl -L-lysyl-L-lysyl-L -lysyl-L-prolyl-L-valyl- L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolins und seines C-terminalen Amids und ihrer Säureadditionssalze und Komplexe.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen.

Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen und vor allem diejenigen, die ihnen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen, die sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle. Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z.B.

Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z.B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren a-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, aufweisen.

Die neuen Verbindungen besitzen, wie bereits erwähnt, eine wesentlich stärkere ACTH-Aktivität als die entsprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration an der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden, z.B. an Stelle des natürlichen Hormons.

Die neuen Peptide werden nach den für die Herstellung von Peptiden mit grosser Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt unter Verwendung einer D-Aminosäure als Nterminaler Aminosäure. Dabei werden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Hervorzuheben ist besonders auch die sogenannte Feststoffträgersynthese (vgl.

Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85, 2149 [1963]), bei der das Peptid vom Carboxylende, das esterartig an ein Polymeres gebunden ist, aufgebaut wird, indem man die Aminosäuren der Reihe nach ankondensiert. Als Kondensationsmethoden sind z.B. die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode zu erwähnen. Beispielsweise kann man eines der Aminosäure- bzw. Peptidmoleküle in Form eines Esters mit einem weiteren Aminosäure- bzw. Peptidmolekül, das eine geschützte Aminogruppe enthält, in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie eines Carbodiimids oder eines Phosphorigsäureesterhalogenids, verknüpfen, oder man kann mit dem Aminosäure- bzw. Peptidester mit freier Aminogruppe eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe), z.B. ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid (z.

B. aus N-Äthyl5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat, s. Woodward et al., J.Am.

Chem.Soc. 89, 1011 [1961]), oder einem aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylthiolester oder Nitrophenylester, umsetzen. Umgekehrt kann auch eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit freier Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe) mit einer Aminosäure bzw. einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe (und geschützter Carb oxylgruppe), z.B. einem Phosphitamid, zur Reaktion gebracht werden.

An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z.B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, oder Amidbildung, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden.

Die Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzyl- oder Tritylrest geschützt werden.

Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher dadurch gekennzeichnet, dass man die zum Aufbau der neuen Peptide nötigen Aminosäuren bzw. deren aktivierte Derivate unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei die L-terminale Aminosäure gegebenenfalls in Form des Amids eingesetzt wird und wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive funktionelle Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen intermediär schützt und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt, indem man das erhaltene Peptid durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.

Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass man das die ersten 3 Aminosäuren, z.B. H-D-Ser-Tyr-Ser-OH enthaltende Tripeptid (die abgekürzte Schreibweise bezieht sich auf L-Aminosäuren, wenn das D- nicht besonders bezeichnet ist), oder das ausserdem die 4. Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit dem Heptapeptid bzw. Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 kondensiert, vorzugsweise nach der Azidmethode, und dann das Decapeptid mit dem Tetradecapeptid der Aminosäuren 11-24 kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, vor allem mittels des p-Nitrophenylesters, verwendet.

Im letzten Fall braucht der p-Nitrophenylester des Decapeptids nicht als solcher isoliert zu werden, sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Decapeptid mit freier Carboxylgruppe, p-Nitrophenol und Dicyclohexylcarbodiimid gebildet werden. Das Decapeptid liegt also als a-Amino-geschütztes Peptid mit freier Carboxylgruppe oder mit einer p-Nitrophenylestergruppe vor. Das Tetradecapeptid wird in Form eines Esters, vorzugsweise des tert. Butylesters, oder des a > -Amids verwendet. Die in den zu kondensierenden Peptidbruchstücken vorhandenen Seitenketten Aminogruppen werden vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe geschützt. Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure abgespalten werden.

Nach einem weiteren bevorzugten Verfahren wird das die ersten 4 Aminosäuren enthaltende Tetrapeptid H-D-Ser Tyr-Ser-Met-OH mit dem Eicosapeptid der Aminosäuren 5-24 kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Azidmethode verwendet. Die a-Aminogruppe des Tetrapeptidhydrazids bzw. -azids wird vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonlygruppe geschützt. Das Eicosapeptid kann als freies Peptid oder als Ester, insbesondere tert.-Butylester, oder als Pro24-Amid vorliegen. Auch im Eicosapeptid werden die Seitenketten Aminogruppen vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppe durch die tert. - Butylestergruppe geschützt.

Nachdem man durch Kondensation der Peptidbruchstücke das Tetracosapeptid erhalten hat, dessen a-Aminogruppe und Seitenketten-Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und dessen Endcarboxylgruppe und Seitenkettencarboxylgruppe durch die tert. -Butylestergruppe geschützt sind, können alle diese Schutzgruppen gleichzeitig durch saure Hydrolyse, beispielsweise mit Trifluoressigsäure, abgespalten werden. Liegt die Endcarboxylgruppe nicht als tert.-Butylestergruppe, sondern als Amidgruppe vor, so werden Peptidamide erhalten. Peptidhydrazide erhält man beispielsweise, wenn man ein Peptid mit endständiger Niederalkylestergruppe mit Hydrazinhydrat behandelt.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.

B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4 Amino-salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxyben- zoesäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxy äthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Suffanilsäure.

Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geegineten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.

Man kann sie auch mit den in der ACTH-Therapie üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wirkung, wie z.B.

Oxypolygelatine, Polyphloretinphosphat, Carboxymethylcellulose, oder den oben erwähnten schwerlöslichen Metallverbindungen, insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, kombinieren.

In den folgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.

Die dünnschichtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet: System 43 A: tert. -Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (100:40:10) System 45: sec.-Butanol-3% wässriges Ammoniak (100:44) System 100: Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6:11) System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (30:20:6:24)
Folgende Abkürzungen werden verwendet: Z = Carbobenzoxy BOC = tert.-Butyloxycarbonyl tBu = tert.-Butyl.

Beispiel 1 1. Z.Lys(BOC)-Lys(BOC) NHNH2
10 g Z .Lys(BOC)-Lys(BOC) OCH3 (hergestellt aus Z Lys(BOC)-OH + Lys(BOC)-OCH3 mittels Dicyclohexylcarbodiimid) werden in 160 ml Methanol gelöst und mit 7,8 ml Hydrazinhydrat versetzt. Man lässt die klare Lösung während 24 Stunden bei 25 stehen und engt dann auf etwa 1/3 des ursprünglichen Volumens ein. Beim Versetzen mit 200 ml Wasser fällt ein öliger Niederschlag aus, der sich beim Abkühlen und Zerreiben verfestigt und pulverisiert werden kann. Man nutscht ab, wäscht mit Wasser und trocknet das Rohprodukt. Es wird durch einmaliges Umkristallisieren aus Methanol-Essigester-Petroläther gereinigt und weist dann einen F. von 118-119,5" auf.

Auf Silicagel-Dünnschichtplatten werden folgende Rf-Werte erhalten: Rf (43 A) = 0,40
Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,75
2. Z Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-OH
1,87 g Z Lys(BOC)-Lys(BOC) NHNH2 werden in 15 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst und auf 250 abgekühlt. Dazu tropft man langsam 2,07 ml 4,35n Salzsäure und anschliessend 0,66 ml 5n Natriumnitritlösung. Man rührt während 10 Minuten bei -10" und gibt dann eine Lö sung von 692 mg L-Prolin in 4,2 ml Dimethylformamid
Wasser (2:1) zu. Schliesslich werden noch bei 100 1,82 ml Triäthylamin zugetropft und dann die Reaktionslösung über
Nacht bei 0 und während weiterer 2 Stunden bei Raumtem peratur stehengelassen.

Man engt sodann im Hochvakuum auf ein Volumen von etwa 4 ml ein und versetzt den klebri gen Rückstand mit 25 ml Wasser. Durch Abkühlen auf 0 und Zerreiben kann er pulverisiert werden. Man nutscht ab, wäscht mit wenig Wasser und trocknet im Hochvakuum bei 40". Zur Reinigung des nicht kristallisierbaren Rohproduktes wird eine multiplikative Verteilung nach Craig im Lösungs mittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlen- stoff (35:13:15:15) [Puffer=28,5 ml Eisessig+ 19,25 g
Ammoniumacetat in 960 ml Wasser] mit Phasenvolumina von je 10 ml durckgeführt.

Nach 220 Stufen isoliert man aus den
Verteilungselementen Nr. 49-73 (uox =61; K =0,39) durch Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Am moniumacetates chromatographisch reines, jedoch amorphes
Tripeptidderivat vom F. etwa 70-80". Im Dünnschichtchro matogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten:
Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,19
Rf (43 A) = 0,29
Rf(45) = 0,52
3. Z Lys(B OC)-Lys(B OC) -Pro-Val-Lys(B OC)-Val-Tyr
ProOtBu
2,4 C; g Z Lys(B Z.Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro.OH zu OH und 3,12 g n Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 30 ml abso lutem Chloroform gelöst.

Man gibt bei 0 0,845 g Dicyclo hexylcarbodiimid zu, rührt während 1 Stunde bei 0 und lässt dann während 30 Stunden bei 25 stehen. Der ausge schiedene kristalline Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und mit ein wenig Essigester gewaschen. Zum Filtrat gibt man
150 ml Essigester und extrahiert die organische Phase bei 0^ dreimal mit je 30 ml 3 %iger Weinsäurelösung zur Entfernung des überschüssigen Pentapeptids. Man wäscht noch mehrmals mit Wasser bis zur neutralen Reaktion und dampft dann zur
Trockne ein. Zur Abtrennung von lipophilen Verunreinigun gen löst man den Rückstand in 10 ml Methanol und 20 ml
Essigester und fällt das Octapeptid durch Zugabe von 120 ml
Petroläther als schmierige Masse aus, die im Vakuum bei 40 getrocknet wird.

Das so erhaltene Rohprodukt (3,1 g) wird zur endgültigen Reinigung einer Craig-Verteilung im
System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (30:10:3:30) [Puffer wie unter 2. angegeben] über 225 Stufen mit Phasenvolumina von je 10 ml unterworfen. Das chromatographisch einheitliche Octapeptidderivat wird beim Einengen des Inhaltes der Elemente Nr. 65-96 (umax=78; K=0.53) zur Trockne und Wegsublimieren des Ammoniumacetates im Hochvakuum als weisses amorphes Pulver vom F. etwa 130-140 erhalten. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf (43 A) = 0,74 Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,54 Rf (Benzol-Aceton = 1:1) = 0,33 4.

H Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val Tyr-Pro-OtBu
1,46 g Z Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC) Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 40 ml Methanol nach Zugabe von 300 mg 10%iger Palladiumkohle in einer Schüttelente mit Kohlendioxyd-Absorption hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach 20 Min. bereits beendet. Nach 1 Stunde wird der Katalysator abfiltriert, mit Methanol nachgespült und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Man erhält in quantitativer Ausbeute das chromatographisch einheitliche decarbobenzoxylierte Octapeptidderivat als weisses amorphes Pulver vom F. etwa 110-120 . Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf (43 A) = 0,53
Rf (Chloroform-Methanol = 9: 1) = 0,34 5.Z.

Lys (BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr Pro-OtBu
1,98 g Z Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)- Lys(BOC) NHNH2 (Schweizer Patent Nr. 485 670) werden in 22 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf -25" tropfenweise unter Rühren mit 3,4 ml 2,115n Salzsäure und dann mit 0,378 ml 5n Natriumnitritlösung versetzt. Die klare Lösung wird während 15 Minuten bei -10" weitergerührt und dann mit einer auf -5" vorgekühlten Lösung von 1,313 g des oben beschriebenen Octapeptidderivates in 4 ml Dimethylformamid versetzt. Man spült noch mit 1 ml Dimethylformamid nach und tropft dann langsam bei -5" 1,05 ml Triäthylamin zu.

Das Reaktionsgemisch wird noch während 30 Minuten gerührt und dann während 15 Stunden bei 0 stehengelassen. Schliesslich wird bis zur Bildung eines viskosen Öles konzentriert und daraus durch Zugabe von 20 ml Wasser eine schmierige Masse ausgefällt. Diese wird unter Erwärmen in 20 ml Methanol wieder gelöst und das Peptid durch Zugabe von 30 ml Wasser aber mals ausgefällt. Beim Kühlen auf 0 und Zerreiben erhält man eine pulverige Aufschlämmung, die filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Dieses Rohprodukt wird zur Reinigung einer Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (60:20:3 :60) [Puffer wie unter 2. angegeben] mit Phasenvolumina von je 20 ml unterworfen.

Nach 218 Stufen isoliert man aus den Elemen ten Nr. 105-134 (umax= 121; K= 1,25) durch Einengen zur Trockne und Absublimieren des Ammoniumacetates im Hochvakuum chromatographisch einheitliches geschütztes
Tetradecapeptid als weisses, amorphes Pulver vom F. etwa 180-190 . Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:
Rf (43 A) = 0,80
Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,49
6. H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC) Lys(BOC)-Lys(B OC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-
Pro-OtBu
1,66 g Z Lys(B Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(B OC)-Lys(BOC) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(B OC)-Val-Tyr-Pro OtBu werden in 40 ml Methanol mit 300 mg Palladiumkohle (10% Pd) wie üblich hydriert.

Beim Einengen der filtrierten Hydrierlösung zur Trockne erhält man direkt das chromatographisch einheitliche Produkt (1,49 g) als amorphes Pulver, das unscharf bei etwa 175-190 schmilzt. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf (43 A) = 0,41 Rf (Chloroform-Methanol = 9 :1) = 0,24 7.

BOC.D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr Pro-OtBu
378 mg B OC-D-Ser-Tvr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe- Arg-Try-Gly-OH (Case 5503, G.Nr. 10 583/64) und 451 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(B OC) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr Pro OtBu werden in 4 ml absolutem Pyridin suspendiert und nach Zugabe von 0,15 ml Wasser und 0,32 ml 1n Salzsäure während 10 Minuten bei 50 gerührt. Zur trüben Suspension gibt man dann 145 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und nach 3 Stunden nochmals eine gleich grosse Menge. Man rührt noch während weiterer 3 Stunden bei 50 und lässt dann über Nacht bei 0 stehen.

Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und 3mal mit je 0,8 ml 90 %igem Pyridin nachgewaschen. Das Filtrat wird mit 45 ml Benzol versetzt, wobei ein pulveriges Rohprodukt ausfällt, das abfiltriert und bei 45" getrocknet wird. Durch Umfällen aus Methanol-Benzol-Petroläther wird.der grösste Teil der lipophilen Verunreinigungen abgetrennt, worauf die endgültige Reinigung mittels einer Craig-Verteilung erfolgt im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10 :3,17 :5:

4) [Puffer wie unter 2. angegeben] über 300 Stufen, mit Phasenvolumina von je 10 mi. Aus den Verteilungselementen Nr. 5185 (UmaX=67; K=0,29) isoliert man durch Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Ammoniumacetates bei 40 im Hochvakuum 445 mg chromatographisch reines geschütztes Tetracosapeptidacetat als amorphes Pulver vom F. etwa 205-210 (Zersetzung). Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf (43 A) = 0,63 Rf (100) = 0,60 Rf (Chloroform-Methanol = 75:25) = 0,42 8.

H D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Bro- OH (D-Ser-Lysz7Xl8-sst-24-Corticotropin)
370 mg geschütztes Tetracosapeptidderivat werden in 7,4 ml 90 %iger Trifluoressigsäure gelöst und während 45 Minuten bei 25 stehengelassen. Die Lösung wird dann auf etwa 2 ml eingeengt, mit 20 ml Wasser verdünnt, nochmals eingeengt und zuletzt liophilisiert. Man erhält das Trifluoracetat des freien Tetracosapeptids, das zur Umwandlung in das Acetat in wenig Wasser gelöst und durch eine Säule = = 12,5 mm; 1=15 cm) von schwach basischem Ionen- austauscher (z.B. Merck Nr. II) in der Acetatform filtriert wird. Das Eluat wird auf etwa 3 ml konzentriert, lyophilisiert und im Hochvakuum bei 40 nachgetrocknet.

Man erhält 316 mg chromatographisch und elektrophoretisch einheitliches Acetat des D-Ser'-Lys'718-ss'-24-Corticotropins als weisses, amorphes Pulver.

Im Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxyd im System 101 weist die Verbindung einen Rf-Wert von 0,40 auf (sst-24-Corticotropin unter gleichen Bedingungen 0,51).

Sie wandert bei der Elektrophorese (16 Vol/cm) bei pH 6,1 (Pyridinacetatpuffer) in 2 Stunden 8,4 cm gegen die Kathode.

Beispiel 2
Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her: D-Ser'-Lys'7, 18-ss -Corilcotropin-Hexaacetut 0,5 mg ZnSO4+7H2O 1,23 mg Na3PO4+12H2O 1,38 mg Mannit 40,0 mg
Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 1 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt. Man erhält eine Suspension mit einem pH von 7,6.

Beispiel 3
Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her: D-Ser'-Lys17,18-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg ZnS04+7 H2O 1,23 mg Mannit 40,0 mg und eine Lösungsampulle mit folgender Zusammensetzung der Lösung: NasPO4+12H2O 1,38 mg Versene - Fe-3 0,1 mg dest. Wasser ad 1,0 ml
Vor Gebrauch werden der Inhalt der Trockenampulle und der Lösungsampulle vermischt. Die erhaltene Suspension hat ein pH von 7,6.

Beispiel 4
Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her: D -S er1-Lys17,18-ss 4-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg Gelatine 280,0 mg Phenol 5,0 mg dest. Wasser . ad 1,0 ml
Beispiel 5
Eine steril filtrierte wässrige Lösung von D-Serl-Lyst7Xl3- sst-24-Corticotropin-Hexaacetat wird unter aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt und in Vials abgefüllt und lyophilisiert, so dass ein Trockenvial erhalten wird, das folgende Komponenten enthält: D-Ser1-Lysl7,18-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg Natrium-Polyphloretinphosphat (86,5%ig) 23,20 mg NaCI 12,28 mg
Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt.

Beispiel 6
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser1-Lys17,18-ss1-24-corticotropin-Hexaacetat 1,0 mg ZnCl2 10,5 mg Na2HPO4 1,7 mg Benzylalkohol 17,0 mg NaC1 2,5 mg NaOH ad pH 8,0 Aqua dest ad 2 ml
Beispiel 7
2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 11 000 werden in etwa 5,7 ml 10 %iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.

In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser'-Lys'7,18-ss124- Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml: D-Ser1-Lyst72s8-sst-24-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg Natronlauge bis pH 7,4 Merthiolat 0,02 mg Aqua dest. 1,0 ml
Beispiel 8
2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 105tsiger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.

In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser1-Lyst7Xt8-sst-24- Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst.

Zu dieser Lösung wird 1 ml einer salzsauren Zinkchloridlösung (pH 2,8) mit 5,2 mg Zinkchlorid pro ml gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml aufgefüllt.

Beispiel 9
2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.

In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser1-Lys11,18-,l1-24 Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst.

Zu dieser Lösung werden 1 ml einer salzsauren Lösung (pH 2,8) enthaltend 5,2 mg Zinkchlorid und 0,85 mg Dinatriumphosphat (wasserfrei) gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Man füllt mit Wasser auf ein Volumen von 10 ml auf.

Beispiel 10
Man löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumacetat, 2,5 mg Natriumchlorid und 2,0 mg D-Ser1-Lys17,18-ss124- Corticotropin-Hexaacetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. Die Lösung wird bei 1200 20 Minuten autoklaviert. Das pH ist nach der Sterilisation 3,7.

Beispiel 11
Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumchloridlösung 0,5 mg D-Ser9-Lys17so8-sst-24-Corticotropin-Hexaacetat und säuert die Lösung mit 0,ln Salzsäure auf pH 3,2 an. Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie in Beispiel 1 hitzesterilisiert.

Beispiel 12
In 0,8 ml destilliertem Wasser werden 7,05 ml Glycin und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und 0,055 ml 0,1n HCI zugefügt. Anschliessend wird 1,0 mg D-Ser1-Lys17,18-ss124- Corticotropin-Hexaacetat- in der Lösung aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 1200 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.

Beispiel 13
In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von
10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml In Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0,1n Salzsäure hergestellt. In dieser Lösung werden 4,0 mg D-Ser1-Lys'7,18-ss 9-24-Corticotropin-Hexaacetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Beispiel 14
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser9-Lyst7 t8-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 1,0 mg ZnCl2 5,25 mg Na2HPO4 2H2O 1,05 mg NaCl 2,0 mg Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3 Dest. Wasser ad 1,0 ml
Beispiel 15
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-ser1-Lys1718-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 1,0 mg ZnCl2 6,30 mg Na2NPO4 2H2O 1,26 mg NaCl 1,5 mg Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3 Dest.

Wasser ad 1,00 ml
Beispiel 16
Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von 0,5 mg D-Ser1-Lysl7sl8-ss 9¯24-Corticotropin-Hexaacetat, 5,25 mg ZnCl2, 1,05 mg Na2HPO4 2H2O und 2,0 mg NaCl vom pH 3,0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wässrigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die so viel Natronlauge enthält, dass eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird,
Beispiel 17
5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 werden in 5 ml 0,1n Natronlauge gelöst. Man filtriert die Lösung, gibt eine Lösung von 2,5 mg D-Ser1- Lys17,18-ss124-Corücotropin-Hexaacetat hinzu, säuert dann mit Essigsäure oder Salzsäure auf pH 4 an und füllt mit Wasser auf 10 ml auf.

Dabei fällt ein Poly-L-glutaminsäure D-Sert-Lys17-18-ssl¯24-Corticotropin-Komplex fein verteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg D-Ser1-Lysl7sl8-ssl-24-Corticotropin als Komplexverbindung.

Beispiel 18
2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht yon etwa 39 600 werden in etwa 5,7 ml 10 %iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.

In dieser Lösung werden dann 4,0 mg D-Ser1-Lys17,18- ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml: D-Ser1-Lys17,18-ss1-24-Corficotropin-Hexaacetat 4,0 mg Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg Natronlauge bis pH 7,4 Merthiolat 0,02 mg Aqua dest ad 1,0 ml
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH Wirkung der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl(oder L glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypto- phyl-glycyl-L4ysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L4ysyl-L-lysyl- L-lySyl-L-lySyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- prolin und ihrer C-terminalen Amide und von Säureadditionssalzen dieser Verbindungen,

dadurch gekennzeichnet, dass man die zu ihrem Aufbau nötigen Aminosäuren bzw.

deren aktivierte Derivate unter Bildung von CONH-Bindun

**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

**WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **. Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.

In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser'-Lys'7,18-ss124- Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml: D-Ser1-Lyst72s8-sst-24-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg Natronlauge bis pH 7,4 Merthiolat 0,02 mg Aqua dest. 1,0 ml Beispiel 8 2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 105tsiger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.

In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser1-Lyst7Xt8-sst-24- Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst.

Zu dieser Lösung wird 1 ml einer salzsauren Zinkchloridlösung (pH 2,8) mit 5,2 mg Zinkchlorid pro ml gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml aufgefüllt.

Beispiel 9 2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.

In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser1-Lys11,18-,l1-24 Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst.

Zu dieser Lösung werden 1 ml einer salzsauren Lösung (pH 2,8) enthaltend 5,2 mg Zinkchlorid und 0,85 mg Dinatriumphosphat (wasserfrei) gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Man füllt mit Wasser auf ein Volumen von 10 ml auf.

Beispiel 10 Man löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumacetat, 2,5 mg Natriumchlorid und 2,0 mg D-Ser1-Lys17,18-ss124- Corticotropin-Hexaacetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. Die Lösung wird bei 1200 20 Minuten autoklaviert. Das pH ist nach der Sterilisation 3,7.

Beispiel 11 Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumchloridlösung 0,5 mg D-Ser9-Lys17so8-sst-24-Corticotropin-Hexaacetat und säuert die Lösung mit 0,ln Salzsäure auf pH 3,2 an. Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie in Beispiel 1 hitzesterilisiert.

Beispiel 12 In 0,8 ml destilliertem Wasser werden 7,05 ml Glycin und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und 0,055 ml 0,1n HCI zugefügt. Anschliessend wird 1,0 mg D-Ser1-Lys17,18-ss124- Corticotropin-Hexaacetat- in der Lösung aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 1200 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.

Beispiel 13 In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von 10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml In Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0,1n Salzsäure hergestellt. In dieser Lösung werden 4,0 mg D-Ser1-Lys'7,18-ss 9-24-Corticotropin-Hexaacetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 1200 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.

Beispiel 14 Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser9-Lyst7 t8-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 1,0 mg ZnCl2 5,25 mg Na2HPO4 2H2O 1,05 mg NaCl 2,0 mg Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3 Dest. Wasser ad 1,0 ml Beispiel 15 Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-ser1-Lys1718-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 1,0 mg ZnCl2 6,30 mg Na2NPO4 2H2O 1,26 mg NaCl 1,5 mg Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3 Dest.

Wasser ad 1,00 ml Beispiel 16 Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von 0,5 mg D-Ser1-Lysl7sl8-ss 9¯24-Corticotropin-Hexaacetat, 5,25 mg ZnCl2, 1,05 mg Na2HPO4 2H2O und 2,0 mg NaCl vom pH 3,0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wässrigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die so viel Natronlauge enthält, dass eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird, Beispiel 17 5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 werden in 5 ml 0,1n Natronlauge gelöst. Man filtriert die Lösung, gibt eine Lösung von 2,5 mg D-Ser1- Lys17,18-ss124-Corücotropin-Hexaacetat hinzu, säuert dann mit Essigsäure oder Salzsäure auf pH 4 an und füllt mit Wasser auf 10 ml auf.

Dabei fällt ein Poly-L-glutaminsäure D-Sert-Lys17-18-ssl¯24-Corticotropin-Komplex fein verteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg D-Ser1-Lysl7sl8-ssl-24-Corticotropin als Komplexverbindung.

Beispiel 18 2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht yon etwa 39 600 werden in etwa 5,7 ml 10 %iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.

In dieser Lösung werden dann 4,0 mg D-Ser1-Lys17,18- ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml: D-Ser1-Lys17,18-ss1-24-Corficotropin-Hexaacetat 4,0 mg Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg Natronlauge bis pH 7,4 Merthiolat 0,02 mg Aqua dest ad 1,0 ml PATENTANSPRUCH 1 Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH Wirkung der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl(oder L glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypto- phyl-glycyl-L4ysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L4ysyl-L-lysyl- L-lySyl-L-lySyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- prolin und ihrer C-terminalen Amide und von Säureadditionssalzen dieser Verbindungen,

dadurch gekennzeichnet, dass man die zu ihrem Aufbau nötigen Aminosäuren bzw.

deren aktivierte Derivate unter Bildung von CONH-Bindun

gen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei die L-terminale Aminosäure gegebenenfalls in Form des Amids eingesetzt wird und wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive funktionelle Gruppen mit geeigneten Schutzgruppen intermediär schützt und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt, indem man das erhaltene Peptid durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Schutzgruppe für die Aminogruppen die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und als Schutzgruppe für die Carboxylruppe die tert.-Butylestergruppe verwendet.

2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man sämtliche Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure abspaltet.

3. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man D-Seryl-L-tyrosyl L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl- L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-Lvalyl-L-tyrosyl-L-prolin oder seine Säureadditionssalze herstellt.

PATENTANSPRUCH II Verwendung der nach dem Verfahren von Patentanspruch I erhaltenen Peptide oder Peptidamide zur Herstellung von Peptid-Komplexen mit verlängerter Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man Komplexe mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder Zinkhydroxid dadurch herstellt, dass man eine wässrige Lösung, welche das Peptid oder Peptidamid und ein wasserlösliches Zinksalz enthält, mit einem Alkalimetallhydroxid, -phosphat oder -pyrophosphat umsetzt.