CH529725A

CH529725A - Verfahren zur Herstellung der 1-Glutaminsäure

Info

Publication number: CH529725A
Application number: CH926368A
Authority: CH
Inventors: Sumino Yasuhiro; Isobe Kazuko; Okazaki Hisayoshi; Kanzaki Toshihiko; Fukuda Hideo
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1967-08-22
Filing date: 1968-06-21
Publication date: 1972-10-31
Also published as: ES356323A1; DE1767955A1; JPS524628B1; DE1767955B2

Description

Verfahren zur Herstellung der l-Glutaminsäure
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der l-Glutaminsäure durch Züchtung von Mikroorganismen in einem Essigsäure enthaltenden Kulturmedium.

Es sind verschiedene Mikroorganismen bekanntgeworden, welche l-Glutaminsäure in Kulturmedien herzustellen oder anzureichern vermögen. Diese für industrielle Herstellung der l-Glutaminsäure verwendeten Mikroorganismen erheischen im allgemeinen für ihr Wachstum Biotin, wobei sich herausstellt, dass die Fähigkeit zur Produktion der l-Glutaminsäure in Gegenwart von Biotin in einer Menge, welche ein gewisses Ausmass des Kulturmediums überschreitet, stark vermindert wird. Dadurch werden unangenehme Massnahmen für die Kontrolle der Wirkung des Biotins im Kulturmedium während des Züchtungsvorganges erforderlich. Hinzu kommt, dass bei den meisten üblichen und wirtschaftlichen Nährquellen, wie z. B.

Molassen, Stärkehydrolysat, Maisflüssigkeit und Hefeextrakten zu viel Biotin vorhanden ist, um unter Verwendung der bekannten Mikroorganismen derartige Methoden erfolgreich durchführen zu können, es wäre denn, man würde die Wirkung von Biotin in geeigneter Weise einstellen, was aber nach den bekannten Methoden praktisch unmöglich ist.

Ferner ist bekannt, dass man l-Glutaminsäure durch Züchtung von Mikroorganismen in einem Essigsäure enthaltenden Kulturmedium herstellen kann. Zufolge der schlechten Ausbeute an l-Glutaminsäure sind aber die bisher bekanntgewordenen Methoden industriell nichtverwertbar.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich nun auf eine wirtschaftlich und industriell geeignete Methode zur Herstellung der l-Glutaminsäure durch Züchtung eines Mikroorganismus, welcher durch die Anwesenheit von Biotin nicht beeinträchtigt wird, und dies unter Verwendung der billigen Essigsäure als Kohlenstoffquelle, wobei man l-Glutaminsäure in guter Ausbeute und bei hoher Reinheit erhält.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen l-Glutaminsäure erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium oder Micrococcus, welcher kein Biotin, sondern eine ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen verlangt, in einem Kulturmedium züchtet, welches anorganische Salze, eine ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen oder ein Salz oder einen Ester derselben mit einem mehrwertigen Alkohol, eine Stickstoffquelle und als Kohlenstoffquelle eine von sämtlichen vorgenannten Verbindungen verschiedene, C, H und 0 enthaltende organische Verbindung enthält, dass man bei der Züchtung die Konzentration der Kohlenstoffquelle durch Essigsäurezugabe auf einem Wert von höchsten 1 Gew.-Teil, bezogen auf 100 Vol.-Teile des Kulturmediums,

wobei sich Gewichtsteile und Volumteile jeweils wie g und cm3 verhalten, hält, nachdem der Verbrauch der Kohlenstoffquelle im ursprünglichen Kulturmedium deren Konzentration auf weniger als 1 Gew.-Teil, bezogen auf 100 Vol.-Teile des Kulturmediums, herabgesetzt hat, und dass man die im Kulturmedium erzeugte und angereicherte l-Glutaminsäure abtrennt.

Die für das erfindungsgemässe Verfahren verwendbaren Mikroorganismen sind beispielsweise Brevibacterium thiogenitalis D248, Brevibacterium thiogenitalis D253, Brevibacterium thiogenitalis D254, Brevibacterium sp. 111-S09, Brevibacterium flavum BN-1 1, Corynebacterium sp. Nr. 1602, Corynebacterium sp. Nr. 186, Micrococcus glutamicus Nr. 534-MS-023 und Micrococcus glutamicus Nr. 541-MS117.

Als ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen kommen beispielsweise Oleinsäure, Palmitoleinsäure, Linolsäure, Linolensäure oder Arachidonsäure in Frage. Es sei hervorgehoben, dass die ungesättigte Fettsäurequelle, welche im vorliegenden Verfahren verwendet wird, beispielsweise eine ungesättigte Fettsäure, ein Salz davon, z. B. das Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalz, und ein mehrwertiger Ester, wie z. B. ein Glycerid, z. B. Specköl oder Olivenöl, sein kann. Im allgemeinen genügt es, wenn man derartige ungesättigte Fettsäurequellen in einer Menge von etwa 50 bis 1000 y/cm3 dem Kulturmedium zugibt.

Die im anfänglichen Kulturmedium verwendbare Kohlenstoffquelle kann irgendeine beliebige, bisher verwendete Kohlenstoffquelle sein, wie z. B. Molasse, Stärkehydrolysat, sowie Essigsäure.

Die beim vorliegenden Verfahren verwendbaren Stickstoffquellen sind beispielsweise Maisflüssigkeit, entfettetes Sojabohnenmehl, Ammoniak und Harnstoff.

Beim vorliegenden Verfahren verwendbare anorganische
Salze sind beispielsweise Natriumphosphat, Kaliumphosphat,
Calciumchlorid und Magnesiumsulfat.

Beim vorliegenden Verfahren ist es vollständig unnötig und dies im Gegensatz zu den bekannten Methoden - die
Biotinwirkung zu regeln, da das erfindungsgemäss erhältliche
Resultat durch die Anwesenheit von Biotin im Kulturmedium nicht beeinflusst wird.

Beim vorliegenden Verfahren kann die als Kohlenstoff quelle verwendete Essigsäure in Form von Salzen, wie z. B.

das Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder Calciumsalz an stelle der freien Essigsäure verwendet werden. Verwendet man Essigsäure als anfängliche Kohlenstoffquelle, so wird deren Konzentration im Kulturmedium vorzugsweise auf nicht mehr als etwa 2 Gew.-Teile auf 100 Vol.-Teile des an fänglichen Kulturmediums gehalten. Nach dem Zeitpunkt, bei welchem der ursprüngliche Kohlenstoffquellengehalt auf weniger als 1 Gew.-Teil - bezogen auf 100 Vol.-Teile des Kulturmediums - verringert worden ist, erfolgt die Erzeugung von l-Glutaminsäure unter Kontrolle der Essigsäurekonzen tration im Medium dermassen, dass die Konzentration einen
Wert von höchstens 1 Gew.-Teil auf 100 Vol.-Teile nicht übersteigt.

Um die Essigsäurekonzentration im Kulturmedium zu regeln, wird man die Menge an gelöstem Sauerstoff im Kul turmedium vorzugsweise prüfen; wenn diese Menge nicht mehr als etwa 5 Teile pro Million Teile bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 8 beträgt, kann die Essigsäurekonzentra tion als im gewünschten Bereich eingestellt gelten. Die Ein stellung des pH-Wertes wird vorzugsweise durch Zugabe einer Base, wie z. B. wässrigem Ammoniak oder Harnstoff, durchgeführt, wobei diese letzteren als ein Teil der Stick stoffquelle verwendet werden können.

Wie aus den obigen Erläuterungen hervorgeht, kann man
Essigsäure als alleinige hauptsächliche Kohlenstoffquelle während der ganzen Züchtung verwenden. Dabei ist zu be achten, dass man bei Verwendung von Essigsäure als alleinige hauptsächliche Kohlenstoffquelle äusserst reine Kristalle von l-Glutaminsäure erhalten kann.

Die im Kulturmedium in der besagten Weise erzeugte l-Glutaminsäure wird in an sich bekannter Weise gewonnen, beispielsweise durch Filtrieren der Kulturbrühe, durch Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf etwa 3,2 durch Zugabe von Salzsäure, und schliesslich durch Sammeln der Niederschläge von l-Glutaminsäure.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.

In der nachstehenden Beschreibung und in den Ansprüchen bedeuten die Abkürzungen 1 , mg , cm3 , r.p.m. , kg , ppm und IFO Liter, Milligramm, Kubikzentimeter, Umdrehungen pro Minute, Kilogramm, Teile pro Million, bzw. Institute for Fermentation Osaka .

Beispiel 1
Ein Kulturmedium, enthaltend 2,0% Glucose, 0,5 % Harnstoff, 0,1% KH2P04, 0,05%MgSO4 7H2O, 0,5%Maisflüs- sigkeit und Natriumoleat (100 y/cm3 bezogen auf Oleinsäure), wird in Mengen von jeweils 20 cm3 in 200 cm3 Erlenmeyerkolben gegossen und diese Kolben sterilisiert.

Einer der in der folgenden Tabelle aufgezählten neun Stämme wird im Medium angeimpft und bei 28" C während 24 Stunden mit einem Rührer bei 200 r.p.m. bebrütet.

Ein Hauptkulturmedium, enthaltend ein enzymatisches Hydrolysat von süsser Kartoffelstärke (5 % reduzierender Zucker), Molassen (5% Zucker) 1,5% Harnstoff, 0,1% KH2PO4, 0,05 % MgSO4 7H20, 0,5 % Maisflüssigkeit und Natriumoleat (300 y/cm3 bezogen auf Ölsäure), wird in Mengen von jeweils 70 cm3 in 200 cm3 konische Kolben eingeführt und darin sterilisiert. Jeweils 3,5 cm3 dieser Saatkultur werden dem Hauptkulturmedium zugegeben und die Züchtung mit Hilfe eines rotierenden Rührwerks bei 200 r.p.m. und bei 30 C vorgenommen. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden gibt man Harnstoff in einer Menge von 0,5 %, bezogen auf die Kulturbrühe, hinzu.

Nach etwa 30 Stunden Inkubation, d. h., nachdem der verbleibende Zuckergehalt im Kulturmedium eine Konzentration von weniger als 1 Gew.-Teil- bezogen auf 100 Vol.-Teile des Mediums - erreicht hat, gibt man in Abständen gewisse Mengen an Essigsäure so hinzu, dass die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Medium etwa 5 ppm oder weniger beträgt, während man wässriges Ammoniak tropfenweise so hinzu gibt, dass das Kulturmedium auf einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 7,3 gehalten wird. Die Züchtung ist nach 48 Stunden beendet. Die Resultate befinden sich in der folgenden Tabelle.

Mikroorganismus l-Glutaminsäure- Endmenge an Gesamtmenge an Ausbeute an menge vor Zugabe l-Glutaminsäure zugesetzter 1-Glutaminsäure der Essigsäure (mg/cm3) Essigsäure (%) bezogen auf zuge (mg/cm3) setzte Essigsäure (%) Brevibacterium thiogenitalis D-248 52 66 2,5 58 Brevibacterium sp. 111809 45 53 1,8 44 Brevibacterium thiogenitalis D-253 46 55 2,0 46 Brevibacterium thiogenitalis D-254 47 54 1,6 44
Corynebacterium sp.

No. 1602 50 62 2,3 53 Corynebacteriurn sp. No. 186 51 65 2,5 55
Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 48 57 2,0 46
Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 50 60 2,2 48
Brevibacterium flavum BN-11 49 59 2,1 46
Beispiel 2
Brevibacterium thiogenitalis D-248, gezüchtet in einem Sakaguchikolben, wird in 30 1 eines sterilisierten Saatkulturmediums der gleichen Zusammensetzung wie jenes von Beispiel 1 angeimpft und während 16 Stunden bei 28" C gezüchtet.

5 1 der so erhaltenen Kultur werden in 100 1 eines sterilisierten Hauptkulturmediums, enthaltende Molassen (5 % als Zucker) FeSO4 7H2O (0,05%), Harnstoff (0,1%), Mais flüssigkeit (0,3%), KH2PO4 (0,2%), MgSO4 7H2O (0,05%) und Natriumoleat (200 y/cm3 als Oleinsäure), werden unter Rühren und unter Belüftung von 25 1 pro Minute während 48 Stunden (mit einem Rührwerk, welches mit 150 r.p.m.

arbeitet) gezüchtet. Nachdem der verbleibende Zuckergehalt im Kulturmedium 1,0% erreicht hat, beginnt man mit der kontinuierlichen Zugabe einer 50 %igen wässrigen Essigsäurelösung zum Kulturmedium, so dass die Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium in einem Bereiche von 0 bis 2 ppm gehalten werden kann. Die Züchtung wird während 48 Stunden durchgeführt, wobei man gleichzeitig eine wässrige Ammoniaklösung der Kulturlösung zugibt, um den pH-Wert dieser letzteren automatisch in einem Bereiche von etwa 7 bis 7,3 zu halten.

Mittels eines Bioversuchs der resultierenden Kulturbrühe, unter Verwendung von Lactobacillus arabinosus, kann festgestellt werden, dass 60 mg/cm3 l-Glutaminsäure erzeugt worden sind. Die Ausbeute an l-Glutaminsäure beträgt, bezogen auf die verbrauchte Essigsäure, etwa 46,5 %.

Die erzielte Kulturbrühe wird filtriert und das Filtrat durch Zugabe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,2 ein gestellt, wobei sicll Kristalle ausscheiden. Die Kristalle wer den gesammelt. Auf diese Weise erhält man 6,1 kg l-Glut- aminsäure.

Beispiel 3
Ein Kulturmedium, enthaltend 2,0% Glucose, 0,5 % Harn stoff, 0,1% KH2PO4, 0,05 % MgSO4 7H2O, 0,5 % Maisflüs sigkeit und Natriumoleat (100 y/cm3, als Oleinsäure berech net) wird jeweils in Portionen von 20 cm3 in 200 cm3 Erlen meyerkolben gegossen und sterilisiert. Einer der in der fol genden Tabelle aufgezählten zehn Mikroorganismen wird im Kulturmedium geimpft und bei 280 C während 24 Stunden mit einem Rührwerk, welches mit 200 r.p.m. arbeitet, gezüchtet.

Ein Hauptkulturmedium, enthaltend 1,2% Ammoniumacetat, 0,3 % Maisflüssigkeit, 0,1% KH2PO4, 0,05 % MgSO4
7H2O, 0,001% MnSO4 4H2O, 0,01% FeSO4 7H2O, 0,005% CaCl2 2H20, Natriumoleat (200 y/cm3, berechnet als Oleinsäure), Vitamin B1 (100 y/cm3, berechnet als Hydrochlorid) und Phenolrot (10 mg/l), wird jeweils in Mengen von 70 cm3 in 200 cm3 Kolben eingetragen und darin sterilisiert. Jeweils 3,5 cm3 der so erhaltenen Saatkulturen werden im Hauptkulturmedium geimpft und die Züchtung erfolgt bei 32 C mit einem Rührwerk, welches mit 200 r.p.m. Iäuft.

Um die Essigsäurekonzentration im Kulturmedium zu kontrollieren, wird zu Beginn der Züchtung jeder Kolben mit einer Analysiervorrichtung für gelösten Sauerstoff ausgerüstet. Sobald die Menge an im Kulturmedium gelöstem Sauerstoff mehr als 5 ppm Teile ausmacht (was bedeutet, dass der grösste Teil der Essigsäure aufgebraucht worden ist) versetzt man das Kulturmedium mit Eisessig, um dessen Konzentration auf etwa 0,1%, bezogen auf das Volumen des Kulturmediums, zu bringen, während man den pH-Wert des Kulturmediums durch Zugabe einer wässrigen Ammoniaklösung unter Zuhilfenahme der Farbänderung mittels Phenolrot auf etwa 7 bis 8 einstellt. Die Züchtung wird dann unterbrochen, und zwar gemäss den Angaben in der folgenden Tabelle, wobei die Essigsäure in einer Menge von etwa 15%, bezogen auf das Volumen des anfänglichen Kulturmediums, konsumiert worden ist.

Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle.

Mikroorganismus Züchtungsdauer Ausbeute an (Std.) I-Glutaminsäure bezogen auf die
Essigsäurezugabe (%)
Brevibacterium thiogenitalis D-248 45 52
Brevibacterium sp. 111-S09 51 45
Brevibacterium thiogenitalis D-253 43 50
Brevibacterium thiogenitalis D-254 43 48
Corynebacterium sp. No. 1602 48 45
Corynebacterium sp. No. 186 42 53
Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 43 41
Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 45 48
Brevibacterium flavum BN-11 50 45
Brevibacterium flavum ATCC 14067 43 31 Bemerkung: Brevibacterium flavum ATCC 14067 erheischt für sein Wachstum Biotin und wird als Kontrollversuch verwendet.

Beispiel 4
Brevibacterium thiogenitalis D-248, gezüchtet in einem Sakaguchikolben, wird in 30 1 eines sterilisierten Saatkulturmediums gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 3 geimpft, in einen 501 Fermentierbehälter gegeben und während 16 Stunden in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise bei 28 C gezüchtet. 5 1 der so erhaltenen Kultur werden in 1001 eines sterilisierten Hauptkulturmediums geimpft, welches 1,2% Ammoniumacetat, 0,1% Maisflüssigkeit, 0,1% KH2P04, 0,05% MgS04 7H2O, 0,01% FeS04 7H20, 0,01% CaC12 2H20, 0,001% MnS04 4H20 und Natriumoleat (250 y/cm3, berechnet als Oleinsäure),

Thiaminhydrochlorid (100 y/l) in einem 200 Fermentierbehälter, worauf dieses Medium bei 32 C unter Belüftung bei 30 1/Minute und unter Rühren mit einem Rührwerk, das mit 240 r.p.m.

arbeitet, gezüchtet. Sobald die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Kulturmedium 500 ppm Teile oder mehr beträgt, führt man kontinuierlich eine sterilisierte 40 %ige Eisessiglösung dem Kulturmedium hinzu, um die Essigsäurekonzentration auf etwa 0,1% einzustellen, bezogen auf das Volumen des anfänglichen Kulturmediums. Die Züchtung erfolgt während 48 Stunden, wobei der pH-Wert des Kulturmediums durch Zugabe einer wässrigen Ammoniaklösung zum Kulturmedium auf etwa 7,0 bis etwa 8,0 eingestellt wird, wodurch 15% der Essigsäure, bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Kulturmediums, verbraucht werden.

Durch einen Biotest der erzielten Kulturbrühe in gleicher
Weise wie in Beispiel 3 kann man feststellen, dass 48 mg/cm3 l-Glutaminsäure erzeugt worden sind. Die Ausbeute an l-Glutaminsäure, bezogen auf die konsumierte Essigsäure, beträgt 49 %. Die erzielte Kulturbrühe wird filtriert und das pH des Filtrates durch Zugabe von Salzsäure auf etwa 3,2 eingestellt, wobei ein Niederschlag sich abtrennt, welcher ge sammelt und umkristallisiert wird. Auf diese Weise erhält man 6,6 kg l-Glutaminsäure.

Die in den Beispielen dieser Beschreibung verwendeten, verschiedenen Stämme sind beim Institute for Fermentation, in Osaka, Japan (IFO) unter den folgenden Nummern de poniert worden:
Stamm IFO Nr.

Brevibacterium thiogenitalis D-248 IFO-12331 Brevibacterium sp. 111-S09 IFO-12332 Brevibacterium thiogenitalis D-253 IFO-12400 Brevibacterium thiogenitalis D-254 IFO-12401 Corynebacterium sp. No. 1602 IFO-12399 Corynebacterium sp. No. 186 IFO-12398 Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 IFO-12523 Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 IFO-12524 Brevibacterium flavum BN-11 IFO-12525

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung der l-Glutaminsäure, dadurch gekennzeichnet, dass man einen l-Glutaminsäure erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Brevibacterium, Corynebactut im oder Micrococcus, welcher kein Biotin, sondern eine ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen verlangt, in einem Kulturmedium züchtet, welches anorganische Salze, eine ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen oder ein Salz oder einen Ester derselben mit einem mehrwertigen Alkohol, eine Stickstoffquelle und als Kohlenstoffquelle eine von sämtlichen vorgenannten Verbindungen verschiedene, C, H und 0 enthaltende organische Verbindung enthält, dass man bei der Züchtung die Konzentration der Kohlenstoffquelle durch Essigsäurezugabe auf einem Wert von höchstens 1 Gew.-Teil, bezogen auf 100 Vol.-Teile des Kulturmediums,

wobei sich Gewichtsteile und Volumteile jeweils wie g und cm3 verhalten, hält, nachdem der Verbrauch der Kohlenstoffquelle im ursprünglichen Kulturmedium deren Konzentration auf weniger als 1 Gew.-Teil, bezogen auf 100 Vol.-Teile des Kulturmediums, herabgesetzt hat, und dass man die im Kulturmedium erzeugte und angereicherte 1-Glutaminsäure ab trennt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus einen der folgenden verwendet: Brevibacterium thiogenitalis D 248 (IFO-12331), Brevibacterium thiogenitalis D 253, Brevibacterium thiogenitalis D 254, Brevibacterium sp. 111-S09, Brevibacterium flavum BN-11, Corynebacterium sp. Nr. 1602, Corynebacterium sp. Nr. 186, Micrococcus glutamicus Nr. 534-MS-023 oder Micrococcus glutamicus Nr. 541-MS-117 (IFO-12524).

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als ungesättigte Fettsäure Ölsäure, Palmitoleinsäure, Linolsäure, Linolensäure oder eine Mischung davon verwendet.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die ursprüngliche Kohlenstoffquelle Essigsäure enthält.

4. Verfahren nach Unteranspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Essigsäure vor der Essigsäurezugabe nicht höher als 2 Gew.-Teile, bezogen auf 100 Vol. Teile des ursprünglichen Kulturmediums, wobei sich Gewichtsteile und Volumteile wie g und cm3 verhalten, ist.

5. Verfahren nach Patentanspruch und einem der Unteransprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man einen der folgenden Stämme verwendet: Stamm IFO Nr.

Brevibacterium thiogenitalis D-248 IFO-12331 Brevibacterium sp. 111-SO9 IFO-12332 Brevibacterium thiogenitalis D-253 IFO-12400 Brevibacterium thiogenitalis D-254 IFO-12401 Corynebacterium sp. No. 1602 IFO-12399 Corynebacterium sp. No. 186 IFO-12398 Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 IFO-12523 Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 IFO-12524 Brevibacterium flavum BN-11 IFO-12525