Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphathexose der Formel
EMI1.1
worin B Purin, Pyrimidin oder ihre N-Acyl-Derivate bedeutet.
Nucleosiddiphosphathexose kann als chemisches Reagens wie Antioxidationsmittel oder Ernährungswirkstoff mit Vorteil verwendet werden.
A. R. Todd, J. Chem. Soc., 2843 (54), berichtet, dass Pyridimiumsalz von Uridin 5'-phosphat mit Glucose-1-phosphat in Gegenwart von Dicyclohexilcarbodiimid (DCC) kondensiert, wobei Uridinphosphatglucose erhalten wird. H. G. Khorana, J.
Am. Chem. Soc., 83, 695 ('61), offenbart, dass Uridin 5'diphosphat in Gegenwart von DCC mit Morpholin reagiert, wobei Uridin 5'-phosphoromorpholidat gebildet wird, das mit Glucose-1-phosphat Uridindiphosphatglucose ergibt. Das Ausgangsmaterial von Uridin 5'-phosphat wurde durch Schützen von in 2'-, 3'-Stellungen gelegenen Hydroxylgruppen von Uridin mittels Gruppen wie Isopropyliden oder Acetylradikal, Inreaktionbringen nur der 5'-Hydroxylgruppe mit Phosphorsäure und Entfernen der schützenden Gruppen, wobei Nucleosid 5'-monophosphat erhalten wurde, gebildet. Andererseits wird Nucleinsäure durch chemische oder enzymatische Vorgänge zersetzt. Diese Verfahren sind jedoch mit Nachteilen behaftet. Insbesondere wenn als Ausgangsmaterial Nucleoside verwendet werden, muss, gemäss diesen Verfahren, dass Uridin 5'-phosphat gereinigt werden.
DCC ist andererseits ein sehr teures Material. Ferner wird im Rahmen dieser Verfahren ein hoher Anteil an Nebenprodukten wie symmetrische Pyrophosphate, z. B. P'.P2-Diuridinphosphat, und intermolekulare cyclische Phosphate gebildet, so dass die Nucleosiddiphosphathexoseausbeute unerwünscht vermindert wird. Alle diese Vorgänge oder Verfahren sind sehr kompliziert und unwirtschaftlich.
Gemäss einem Vorschlag von A. M. Michelson, J. Chem.
Soc., 3459 ('56), wird bei in 2'- und 3'-Stellungen gelegenen Hydroxylgruppen geschütztes Nucleosid mit Benzylphosphorodichlorid in Reaktion gebracht, um Nucleosid 5'-benzylphosphorodichlorid zu erhalten, letzteres mit Glucose-1-phosphat in Reaktion gebracht, die mit Phosphatgruppen verbundenen Schutzgruppen werden durch Reduktion entfernt und schliesslich werden die 2'-, 3'-Schutzgruppen entfernt, um Nucleosiddiphosphatglucose zu erhalten. Dieses Verfahren ist mit den Nachteilen behaftet, dass Schutzgruppen eingeführt und entfernt werden müssen und dass im letzten Schritt die Nucleosiddiphosphatglucose sich leicht zersetzt, mit dem höchst unerwünschten Resultat, dass die Endausbeute an Nucleosiddiphosphatglucose stark reduziert wird.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zu schaffen, das eine einfache und wirtschaftliche Herstellung von Nucleosiddiphosphathexose unter Vermeidung der Nachteile bekannter Verfahren dieser Art erlaubt. Das Verfahren soll die direkte Umwandlung von bei 2'-, 3'-Hydroxylgruppen nicht geschütztem Nucleosid in Nucleosid 5'-phosphorodihalogenid und die direkte Zugabe von Hexose-1-phosphat in ein das Dihalogenid enthaltendes Reaktionsmedium erlauben, wobei folglich das Dihalogenid nicht isoliert werden muss.
Dementsprechend kann Nucleosiddiphosphathexose direkt aus Nucleosid gebildet werden. Ein Schützen von 2'-, 3'-Stellungen und die Entfernung der Schutzgruppen ist dabei nicht mehr notwendig.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphathexose ist dadurch gekennzeichnet, dass Nucleosid 5'-phosphorodihalogenid der Formel
EMI1.2
worin B die vorstehend genannte Bedeutung hat und X Halogen bedeutet, in einem organischen Lösungsmittel mit einer Hexose- 1 -phosphatverbindung in Reaktion gebracht und das Reaktionsprodukt zwecks Hydrolyse mit Wasser behandelt wird.
Die nachfolgende Beschreibung erörtert beispielsweise Ausführungsformen der Erfindung.
Nucleosid 5'-phosphorodihalogenid wird in einem organischen Lösungsmittel mit Hexose-1-phosphat in Reaktion gebracht und das Produkt wird hydrolysiert. Praktisch alle Derivate können dabei mit Erfolg verwendet werden, wobei jedoch die Derivate, deren ein oder mehr mit C-Atomen von Purin oder Pyrimidin verbundene H-Atome durch Aminogruppen, Acylamino-, Hydroxyl- oder Alkylgruppen substituiert sind, bevorzugt werden. Beispiele für solche Derivate sind Hypoxanthin, Guanin, Adenin, Uracil, Cytosin, N-Acetyladenin usw. Auf diese Weise erhaltenes Nucleosiddiphosphathexose kann auf herkömmliche Weise gereinigt und isoliert werden. Das so erhaltene Produkt besitzt die Formel
EMI2.1
worin B die vorstehend genannte Bedeutung hat. Die Hexosehälfte enthält Glucose, Galactose, Mannose, Fructose, Sorbose usw..
Das Endprodukt kann in Form eines Alkalisalzes wie Lithiumsalz vorliegen.
Nucleosid 5'-phosphorodihalogenid kann gemäss einem praktisch beliebigen herkömmlichen Verfahren erhalten werden. Beispiele für mit Erfolg verwendbare Halogenide sind Chloride, Bromide, Fluoride und Jodide. Beispiele für solche Verfahren sind die folgenden: Nucleosid wird mit einer Mischung von polaren organischen Lösungsmitteln, Phosphoroxytrihalogenid, Wasser und Picolinen in Reaktion gebracht; Nucleosid wird in einem organischen Lösungsmittel mit einer Mischung von Phosphoroxytrihalogenid, Ameisensäure und organischen Basen behandelt; Nucleosid wird in einem polaren organischen Lösungsmittel mit Pyrophosphorylchlorid und mit anorganischen Salzen von organischen Aminen behandelt; Nucleosid wird in einem polaren organischen Lösungsmittel mit einer Mischung von Phosphoroxytrihalogenid, Alkohol und tert. cyclisches Amin behandelt;
Nucleosid wird in eine Lösung von Trialkylphosphat mit Phosphoroxytrihalogenid behandelt oder bei in 2'- und 3'-Stellungen gelegenen Hydroxylgruppen nicht geschütztes Nucleosid wird in einem polaren organischen Lösungsmittel mit einer Mischung von Phosphoroxytrihalogenid, Wasser und Pyridin behandelt.
Nucleosid 5'-phosphorodihalogenid kann in seiner freien Form verwendet werden. Andererseits können die aus Nucleosid gemäss den vorstehend erörterten Verfahren erhaltenen Reaktionslösungen wie sie sind, d. h. in ihrem Entstehungszustand verwendet werden. Mit anderen Worten braucht Nucleosid 5'-phosphorodihalogenid nicht isoliert zu werden. Im letzteren Fall kann die Reaktionslösung Phosphproxytrihalogenid und/oder Pyrophosphorylchlorid enthalten, die als Phosphorylatierreagens wirken. Solche Reagentien sollten möglichst wenig verwendet werden. Wenn ihrer zu viel verwendet wird, beeinträchtigen ihre in der Reaktionslösung verbleibenden Reste die Reaktion mit dem Hexose-1-phosphat. Dabei entstehen ferner unerwünschte Zwischenprodukte.
Beispiele für mit Erfolg verwendbare polare Lösungsmittel sind Nitrile wie Acetonitril oder Propionitril, Nitroverbindungen wie Nitromethan, Nitroäthan oder Nitrobenzol, cyclische Ather wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Dichloromethan, Ketone wie Aceton oder Acetophenon, trialkylsubstituierte Phosphate wie Trimethylphosphat, Triäthylphosphat, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid.
Die Höhe des Hexose-1-phosphatanteils hängt von der Zusammensetzung des jeweils das Nucleosid 5'-phosphorodihalogenid sowie Begleitmaterialien wie Phosphoroxytrihalogenid und Pyrophosphorylchlorid enthaltenden polaren organischen Lösungsmittels ab, wobei das Hexose-1-phosphat:Nucleosid 5'-phosphorodihalogenid Molverhältnis vorzugsweise 1:1 bis 10:1 beträgt.
Amine können in die Reaktion gegeben werden.- Beispiele für mit Erfolg verwendbare Amine sind tert. cyclische Amine wie Pyridin, sek. cyclische Amine wie Morpholin, tert. kettenförmige Amine mit 4 oder mehr C-Atomen wie Tributylamin oder n-Octylamin. Tert. Amine werden bevorzugt, da sie die gebildeten Wasserstoffhalogenide zu fixieren helfen und zum glatten Verlauf der Reaktion beitragen. Sie können in Form von Salzen mit Hexose-1-phosphat verwendet werden. Das Amin:Nucleosid 5'-phosphorodihalogenid Molverhältnis kann 2:1 bis 15:1 betragen.
Die Reaktion mit der Hexose-1-phosphat kann bei einer -20 C bis +400C, vorzugsweise -100C bis +15ob, betragenden Temperatur durchgeführt werden. Wenn die Reaktion bei einer mehr als 40OC betragenden Temperatur durchgeführt wird, entstehen Nebenprodukte. Beispielsweise wird zufolge Lösung von Nucleosidbindungen Nucleinsäurebase gebildet.
Bei weniger als - 20'C betragenden Temperaturen beansprucht die Reaktion eine unerwünscht lange Durchführungsperiode oder Dauer.
Das Reaktionsprodukt von Nucleosid 5'-phosphorodihalogenid und Hexose-1-phosphat wird zwecks Herbeiführung von Hydrolyse mit Wasser behandelt. Das so erhaltene Produkt kann gemäss einem beliebigen herkömmlichen Verfahren, z. B. jenen mit Aktivkohle oder Ionenaustauschern, gereinigt werden.
Beispiel 1
3,9 g Adenosin 5'-phosphorodichlorid wurden bei 0-20C unter Rühren in 50 ml Dimethylformamid gegeben und 15 g Di(tributylammonium)salz von Glucose- 1-phosphat wurden in die so erhaltene Lösung gegeben. Nach etwa zwei Stunden wurde die resultierende Lösung mit 300 ml Wasser gemischt und das pH mittels einer wässrigen NaOH Lösung bei 7.0 eingependelt.
Die so erhaltene wässrige Adenosindiphosphatglucose enthaltende Lösung wurde durch eine mit Dowex 1 x 2 (Chlorid Typ) gefüllte Säule hindurchgeführt. Nach Waschen mit einer kleinen Menge Wasser wurde das Harz mit einer gemischten Lösung von Lithiumchlorid und Chlorwasserstoffsäure behandelt, um eine Adenosindiphosphatglucose enthaltende Fraktion zu erhalten, die mit Lithiumhydroxid zu pH 4 eingependelt und dann bei einer weniger als 40OC betragenden Temperatur zur Trockne kondensiert wurde. Der so erhaltene Rückstand wurde in etwa 50 ml Methanol gelöst. Aceton wurde in die Lösung gegeben, um als Niederschlag einen weissen Feststoff zu erhalten. Der so erhaltene Feststoff wurde filtriert und bei 60oC getrocknet, um 5,4 g kristallines Lithiumsalz von Adenosindiphosphatglucose zu erhalten. Ausbeute: 80%.
Beispiel 2
10 ml Phosphoroxytrichlorid, 126 ml Wasser und 9,8 ml Pyridin wurden mit 20 ml Acetonitril gemischt. 4,9 g Uridin wurden bei 0-5 C unter Rühren in die Mischung gegeben.
Nach etwa drei Stunden wurde etwa 30 ml einer Lösung von 12 g Glucose-1-phosphat in Dimethylsulfoxid und darauffolgend 20 g Tributylamin in die Lösung gegeben. Nach etwa 5 Stunden wurde die Lösung mit etwa 500 ml Wasser gemischt und durch eine mit 50 ml Aktivkohle gefüllte Säule hindurchgeführt. Die Säule wurde mit einer Ammoniak-Methanol Mischung gewaschen. Die so gewaschene Lösung wurde unter reduziertem Druck kondensiert und dann wie in Beispiel 1 mit einem Ionenaustauscherharz behandelt, um eine Uridindiphosphatglucose enthaltende Fraktion zu erhalten, die wie in Beispiel 1 weiterbehandelt wurde, um schliesslich 7,3 g kristallines Lithiumsalz von Uridindiphosphatglucose zu erhalten. Ausbeute: 84,0%.
Beispiel 3
21 ml Phosphoroxytrichlorid und 0,8 ml Wasser wurden mit 50 ml Tributylphosphat gemischt, 5 g Inosin wurden in die so erhaltene Mischung gegeben und die Reaktion während 3 Stunden bei 0-50C durchgeführt. In die so erhaltene Lösung wurden 20 n-Octylammoniumsalz von Galactose-1-phosphat gegeben. Die Lösung wurde während 3 Stunden bei einer Temperatur von 20OC gehalten. Die resultierende Lösung wurde in 500 ml Eiswasser gegossen und darauffolgend wie in Beispiel 1 behandelt. 6,8 g kristallines Lithiumsalz von Inosindiphosphatgalactose wurden erhalten (Reinheitsgrad = 85,7%).
Beispiel 4
6 ml Phosphorylchlorid wurden in 20 ml Acetonitril gegeben. 4,8 g Cytidin wurden unter Rühren bei 020C in die Lösung gegeben. Nach etwa 5 Stunden wurden 50 ml Äthyl äther zwecks Fällung von Cytidin 5'-phosphorodichlorid in die resultierende Lösung gegeben. Der Niederschlag wurde mit Äthyläther gründlich gewaschen und in etwa 30 ml Dimethylformamid gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde auf etwa 10oC abgekühlt und 18 g n-Octylammoniumsalz von Mannose1-phosphat wurden dann unter Rühren eingegeben. Nach etwa vier Stunden wurde die resultierende Lösung gleich wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 8,2 g kristallines Lithiumsalz von Cytidindiphosphatmannose erhalten wurden (Reinheitsgrad = 82,5 %).
Beispiel 5
4 g Xanthosin 5'-phosphorodichlorid wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. 10 g Di(tributylammonium)glucose-1 phosphat wurden bei 10 C unter Rühren in die Lösung gegeben. Nach etwa 4 Stunden wurde die Lösung mit etwa 300 ml Eiswasser gemischt und dann gleich wie in Beispiel 1 behandelt. 4,8 g kristallines Lithiumsalz von Xanthosindiphosphatglucose wurden erhalten (Reinheitsgrad = 83,5%).
Beispiel 6
Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Adenosin 5'-phosphorodibromid statt Adenosin 5'-phosphorodichlorid und sonst gleichen Bedingungen wiederholt. 4,9 g kristallines Lithiumsalz von Adenosindiphosphat wurden erhalten (Reinheitsgrad = 82%).
Beispiel 7
Beispiel 1 wurde unter Verwendung von 5,6 g von Adenosin 5'-phosphorodijodid statt Adenosin 5'-phosphorodichlorid und sonst gleichen Bedingungen wiederholt. 4,6 g kristallines Lithiumsalz von Adenosindiphosphatglucose wurden erhalten (Reinheitsgrad = 83%).
Beispiel 8
3,7 g Uridin 5'-phosphorodifluorid wurden in 45 ml Dioxan gelöst. 13 g Tributylammoniumsalz von Glucose-1-phosphat wurden bei iOoC in die Lösung gegeben und die Reaktion während etwa 4 Stunden fortgesetzt. Die so erhaltene Lösung wurde wie in Beispiel 1 behandelt, um 2,8 g kristallines Lithiumsalz von Uridindiphosphatglucose zu erhalten (Reinheits grad = 80,4%).
Beispiel 9
8 ml Tetrachlorpyrophosphat wurden mit 30 ml Dichlormethan gemischt und 5,8 g Cytidin wurden bei 02CC unter Rühren in die Lösung gegeben. Nach etwa vier Stunden wurden 40 ml einer Lösung von 25 g Tributylammoniumsalz von Glucose-1-phosphat in Dimethylsulfoxid tropfweise in die Lösung gegeben und die Reaktion während 6 Stunden durchgeführt.
Die resultierende Lösung wurde wie in Beispiel 1 behandelt und 8,7 g kristallines Lithiumsalz von Cytidindiphosphatglucose wurden erhalten (Reinheitsgrad = 84,4%).
Beispiel 10
Beispiel 1 wurde unter Verwendung von 4,1 g N-Acetyladenosin statt Adenosin und sonst gleichen Bedingungen wiederholt, wobei 5,3 g kristallines Lithiumsalz von N-Acetyladenosindiphosphatglucose erhalten wurden (Reinheitsgrad = 83,2%).
Beispiel 11
Beispiel 2 wurde unter Verwendung von 14 ml Morpholin statt Tributylamin und sonst gleichen Bedingungen wiederholt, wobei 7,5 g kristallines Lithiumsalz von Uridindiphosphatglu cose erhalten wurden (Reinheitsgrad = 84,8 %).