CH547352A - Procede de fabrication de zeaxanthine. - Google Patents

Description

  
 



   La   pressente    invention se rapporte à la préparation par biosynthèse du pigment jaune appelé zéaxanthine ou   3,3'-dihydroxy-ss    carotène par culture d'un microorganisme producteur de cette substance.



   Elle   concerne    un procédé de fabrication de zéaxanthine par culture d'un microorganisme du genre   Flavobacter    producteur de ce pigment selon la revendication du brevet principal, caractérisé par le fait que ce microorganisme est la bactérie   Flavobac teriunt      aquatile    ATCC   N     11947 ou un mutant de cette   bactérie.   



   Selon une forme d'exécution   particuliere    du procédé suivant   l'inventiom    on prépare une culture du microorganisme   Flavobac-      rerizml      aquatile    ATCC N" 11947, que   l'on    inocule ensuite à un milieu nutritif placé dans un fermenteur et contenant, à titre de sources principales de carbone et d'azote assimilables par le microorganisme. au moins un hydrate de carbone et au moins une substance contenant des acides aminés libres. On entretient la croissance de la   bactérie    dans le fermenteur en assurant une oxygénation suffisante du milieu de culture ainsi que le maintien d'une température adéquate, de l'ordre de 28 à   30    C, et d'un pH appro   pne.   



   Lorsque les cellules bactériennes sont parvenues à un stade de croissance   suffisant,    de préférence lorsque la culture est dans la phase de croissance exponentielle, et quand les cellules ont atteint un stade de production de zéaxanthine, stade aisément décelable grâce à la coloration jaune de ce pigment, on poursuit la culture de ces cellules à une température   comprise    entre 22 et   25' C,    dans des conditions d'oxygénation   suffisantes,    et dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins un hydrate de carbone à raison de 15 à 35   mg:

  :      ml,    ainsi qu'une source d'azote amine assimilable contenant des acides aminés libres, en maintenant par addition progressive de ces deux substances dans le milieu de fermentation un rapport sensiblement constant entre leurs quantités respectives.



   L'hydrate de carbone, constituant la source de carbone   princi-    pale assimilable par le microorganisme, peut être choisi parmi des substances telles que le glucose, le lactose ou le sucrose. Cette source   principale    de carbone assimilable peut également être constituée par un mélange de ces substances.



   Parmi les substances susceptibles d'entrer dans la composition de la source principale d'azote aminé, on peut citer par exemple la liqueur de trempage de maïs, les extraits de levure, les hydrolysats de protéine, en particulier les produits obtenus par hydrolyse acide ou enzymatique de protéines d'origine végétale telles que les protéines, de soja ou d'arachide, et/ou   l'hydrolysat    de caséine ap   pelte    tryptone .

  Cette source d'azote aminé peut également contenir une substance préparée par hydrolyse acide ou enzymatique d'une biomasse   récuperee    à titre de sous-produit de la   biosynthese    d'un pigment   caroténoide    par culture d'une   bactérie    du genre   Fla-   
   vohacler    en particulier par hydrolyse d'une biomasse de Flavobac   er    cultivée pour préparer de la zéaxanthine et dont on a extrait le pigment.



   On poursuit ensuite la culture dans ces conditions pendant un temps   suffisant.    pour obtenir dans   le'milieu    de culture une quantité substantielle de zéaxanthine, ce pigment étant présent dans les cellules. On peut également, à la fin de cette période, interrompre l'addition progressive des sources de carbone et d'azote et laisser la composition du milieu de culture en fonction de la consommation des substances   nutritives    par le microorganisme.



   Les résultats expérimentaux ont montré que, lorsque la culture du microorganisme est effectuée selon ce procédé, la production de zéaxanthine est notablement   supérieure    a celle d'une culture de ce microorganisme effectuée dans les conditions pratiquées habituellement.



   On peut ensuite, éventuellement   après    concentration du bouillon de culture, extraire la zéaxanthine des cellules à   l'aide    d'un solvant organique polaire tel que   l'acétone,    I'alcool éthylique ou
 un solvant chloré comme le chloroforme.



   Selon une variante on peut séparer la biomasse du milieu de culture, par exemple par centrifugation, décantation ou filtration.



  La biomasse peut être utilisée telle quelle, par exemple   Åa    titre d'additif dans l'alimentation des poules, ou faire l'objet d'un traitement d'extraction à   l'aide    d'un solvant organique polaire.



   Selon un mode d'exécution du procédé particulièrement avantageux, on prépare une culture de la bactérie   Flavohacterium      aqua-      tille    ATCC   N       11947    que   l'on    inocule à un milieu nutritif aqueux placé dans un fermenteur et contenant une source principale de carbone constituée par un hydrate de carbone ou un mélange d'hydrates de carbone. de préférence à raison de 6 à   8%    en poids, ainsi qu'une source   principale    d'azote amine assimilable.

  On entretient la croissance du microorganisme en assurant une oxygénation   suffisante    du milieu. ainsi que le maintien d'une température adéquate, de l'ordre de 28 à 30 C et d'un pH approprié, compris entre 6,5 et 8,0, de préférence entre 7,0 et 7,5.



   Lorsque la concentration du milieu en hydrate de carbone atteint, par valeurs décroissantes, une valeur comprise entre 15 et 35   mgíml.    on ajuste la température du milieu entre 22 et   25    C et on introduit dans le fermenteur, de   façon    progressive, c'est-à-dire soit par une alimentation continue, soit par quantités successives, au moins un hydrate de carbone et au moins une source de carbone assimilables. On peut introduire ces substances dans le fermenteur soit séparément, soit mélangées pour constituer un substrat nutritif. Cette addition est effectuée à un débit tel que la teneur du milieu de culture en hydrate de carbone reste comprise entre 15 et 35   mg/ml    et que les quantités respectives d'hydrate de carbone et de source d'azote aminé soient dans un rapport constant.

  A cet effet on introduit de préférence dans le   f,enmenteur    un substrat contenant ces substances, selon le débit voulu pour maintenir la teneur du milieu en hydrate de carbone entre 15 et 35   mgi'ml,    la composition chimique du substrat étant telle que les quantités pondérales respectives d'hydrate de carbone et de substance aminée assimilables qu'il contient soient dans un rapport constant, de préférence compris entre 1,6 et 3,4.



   Pendant cette fermentation.   Ie    pH du milieu de culture est ajusté entre 6,5 et   8,0,    de préférence entre 7,0 et 7,5. L'ajustement du pH peut être effectué à   l'aide    de solutions alcalines telles que des solutions aqueuses d'hydroxyde de sodium, d'hydroxyde de potassium ou d'ammoniaque ou à   l'aide    d'un courant d'ammoniac. On utilise de préférence ces deux   dernières    substances car elles constituent également des sources d'azote aminé assimilables par le microorganisme.



   On poursuit ensuite cette culture pendant un temps suffisant pour obtenir dans le milieu une quantité substantielle de zéaxanthine. On peut également continuer la culture après arrêt des additions progressives de substances nutritives et laisser la composition du milieu évoluer en fonction de la consommation des substances nutritives par le microorganisme.



   Des résultats   particulièrement    intéressants ont été obtenus en cultivant, comme décrit précédemment, des cellules mutantes préparées par action de la   l-méthyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine,    ci   après    dénommée NTG, sur la   bactérie      Flavobacterium    aquatile
ATCC   N     11947 selon un procédé de mutation   original    remarquable par le fait que   l'on    fait agir la NTG sur la   bactérie    au sein d'un milieu solidifié.



   Selon une forme d'exécution particulière de ce procédé de mutation. on prépare une culture de la bactérie, que   l'on    dilue dans une solution physiologique stérile. La solution obtenue est ensuite mélangée dans une boîte de Petri avec une solution aqueuse de NTG dans les proportions convenables, par exemple avec un volume équivalent d'une solution aqueuse de NTG contenant   I    à 10 mg de cette substance par ml. On verse ensuite sur la solution obtenue de   L'aga    fondu que   l'on    mélange soigneusement à la solution. Lorsque   L'aga    est solidifié on maintient le milieu solide obtenu à une température d'incubation convenable, par exemple entre 25 et   28 - C    jusqu'à l'apparition de colonies dans le milieu solidifié. 

  Les colonies sont ensuite prélevées et repiquées plusieurs fois de suite sur des supports solides   nutritifs.     



   Le microorganisme mutant obtenu peut ensuite faire l'objet d'un ou de plusieurs autres traitements de mutation ultérieurs en milieu   solidifé.   



   Les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, celle-ci n'étant toutefois pas limitée aux conditions qui y sont décrites.



   Dans ces exemples, les compositions des milieux nutritifs sont exprimées en pourcentages pondéraux.



   Exemple I
 On prépare une culture de la bactérie   Flavobacterium    aquatile
ATCC   N"    11947 que   l'on    inocule à raison de 5% en volume à un milieu nutritif aqueux contenu dans un fermenteur. Ce mélange   nutritif, préalablement stérilisé à 120 C C pendant 40 minutes et re-    froidi à 28" C, et dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, présente la composition suivante:

  :
 glucose (stérilisé séparément
 en solution concentrée) 7,0 %
 liqueur de trempage de maïs 1,6 %
 hydrolysat de caséine (tryptone) 0,8 %
 extrait de levure 1,8 %
 sulfate de magnésium 0,5    Ó   
 huile de maïs 0,08%
 eau du robinet balance à 100%
 Le microorganisme est cultivé dans le fermenteur à   28' C,    sous aération et agitation énergiques, avec ajustement continu du pH du milieu entre 7,2 et 7,3 par addition automatique d'une solution aqueuse diluée d'ammoniaque.



   La culture exécutée dans ces conditions présente une phase de latence de 6 à 7 heures, et la production de zéaxanthine commence   aprés    14 heures de culture.



   Lorsque la teneur en glucose du milieu de fermentation atteint, par valeurs décroissantes, 25 mg/ml, c'est-à-dire 24 heures   aprés    le début de la culture, on ajuste la température du milieu à   240 C    et on introduit de façon progressive dans le fermenteur, selon un débit tel que la teneur en glucose du milieu reste sensiblement constante, un substrat nutritif préalablement stérilisé dans un réservoir séparé, dont le pH est ajusté à 7,2 et dont la composition est la suivante:
 glucose 32 %
 liqueur de trempage de mais 4,7%
 hydrolysat de caséine (tryptone) 4,3%
 extrait de levure 5,5%
 eau du robinet balance à 100%
 Cette addition progressive est poursuivie pendant 20 heures, la température du milieu étant maintenue à   24    C.



   Après une durée totale de culture de 50 heures, on mesure la teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine par chromatographie en couche mince et par spectroscopie dans l'ultraviolet.



   La teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine ainsi mesurée est de 16   ,ug/ml.   



   A titre de comparaison la bactérie est cultivée selon un procédé traditionnel. A cet effet elle est inoculée, à raison de 5% en volume, à une même quantité d'un milieu nutritif préalablement stérilisé et refroidi à   28" C,    dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1, et dont la composition est la suivante:
 glucose 10,0 %
 liqueur de trempage de maïs 1,85%
 hydrolysat de caséine (tryptone) 1,25%
 extrait de levure 2,1 %
 sulfate de magnésium 0,5 %
 huile de maïs 0,08%
 eau du robinet balance à 100%
 La culture est exécutée sous agitation et aération énergiques, avec ajustement continu du pH entre 7,2 et 7,3. La phase de latence observée est de 8 heures et la production de zéaxanthine commence après 15 heures de culture.

  On ajuste la température du milieu à   24 C    après 24 heures de culture. 55 heures après le début de la culture, la teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine, déterminée comme décrit précédemment, est de 4   zg/ml.   



   Exemple 2
 On prépare une culture de la bactérie   Flavobacterium    aquatile
ATCC   N"    11947 dans un milieu nutritif aqueux dont le pH est
 ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
 glucose 3,0%
 extrait de levure 1,0%
 hydrolysat de caséine (tryptone)   1,0%   
 sulfate de magnésium 0,5%
 eau du robinet balance   à 100%   
 Cette culture, qui contient S g de cellules du microorganisme par litre de milieu nutritif, est ensuite diluée dans le rapport 1:108 (en volume) par une série d'opérations successives dans une solution physiologique stérile contenant 0,9% en poids de chlorure de sodium.



   On mélange ensuite soigneusement   I    ml de cette solution avec 1   ml    d'une solution aqueuse de NTG contenant S mg/ml de cette substance, dans une boîte de Petri. On ajoute ensuite 10   ml    d'agar fondu sur la solution ainsi préparée et   l'on    mélange complètement l'agar et la solution. Lorsque l'agar est solidifié, la boîte de Petri est incubée à une température de l'ordre de 25 à 28" C, jusqu'à l'apparition de colonies dans le milieu solidifié, c'est-àdire pendant 2 à 4 jours. On sépare ensuite les colonies de la boîte de Petri puis on les étale sur des supports en agar nutritif en l'absence de   NTG,    en plusieurs opérations successives.



   La souche mutante obtenue est ensuite inoculée à raison de 5% en volume à 100 ml d'un milieu nutritif stérile dont le pH est ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
 glucose   3,0%   
 extrait de levure 1,0%
 hydrolysat de caséine (trytone) 1,0%
 sulfate de magnésium 0,5%
 eau du robinet balance à 100%
 Le microorganisme est cultivé dans ce milieu à   28'    C et en conditions aérobies pendant 24 heures, puis cette culture est à nouveau inoculée à 2 litres d'un milieu nutritif de même composition.



  Après 24 heures de fermentation dans les mêmes conditions, cette dernière culture est inoculée, à raison de 5% en volume, à un milieu nutritif aqueux contenu dans un fermenteur. Ce milieu nutritif, préalablement stérilisé à   120"C    pendant 40 minutes et refroidi à   28" C,    présente un pH ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, et possède la composition suivante:

  :
 glucose (stérilisé séparément
 en solution concentrée) 7,0 %
 liqueur de trempage de maïs 1,6 %
 hydrolysat de caséine (tryptone) 0,8 %
 extrait de levure 1,8 %
 sulfate de magnésium 0,5 %
 huile de maïs 0,08%
 eau du robinet balance à 100%
 Lorsque la teneur en glucose du milieu de culture atteint, par valeurs décroissantes, 25 mg/ml, c'est-à-dire 22 heures après le début de la culture, on ajuste la température du milieu à   24  C    et   l'on    introduit, selon un débit tel que la teneur en glucose du mi  lieu reste sensiblement constante, un substrat nutritif préalablement stérilisé, dont le pH est ajusté à 7,2 et dont la composition est la suivante: 

  :
 glucose   32,0%   
 liqueur de trempage de maïs   4,7 /0   
 hydrolysat de caséine (tryptone)   4,30,o   
 extrait de levure   5,5 < )   
 eau du robinet balance à   100 /,   
 Cette addition progressive est poursuivie pendant 20 heures. la température du milieu étant maintenue à   24-C.   



   Après une durée totale de culture de 48 heures, la concentration du milieu en glucose a atteint 5 mg/ml, et sa teneur en zéaxanthine, mesurée comme décrit dans l'exemple 1, est de 40   ,ug/ml.    

Claims (1)

1. REVENDICATION

   Procédé de fabrication de zéaxanthine par culture d'un microorganisme du genre Flavobacter producteur de ce pigment selon la revendication du brevet principal, caractérisé par le fait que ce microorganisme est la bactérie Flavobac zerium aquatile ATCC N 11947 ou un mutant de cette bactérie.

   SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que le mutant est obtenu par action de la l-méthyl-3-nitro-l-nitroso-gua- nidine sur ladite bactérie au sein d'un milieu solidifié.

   2. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que l'on cultive le microorganisme en conditions aérobies à une température comprise entre 28 et 30 C dans un milieu nutritif contenant au moins un hydrate de carbone et au moins une source d'azote aminé assimilable contenant des acides aminés libres, qu'on laisse décroître la teneur du milieu en hydrate de carbone jusqu'à une valeur comprise entre 15 et 35 mg/ml, que l'on ajuste la température du milieu de fermentation entre 22 et 25 C,

   que l'on ajoute progressivement au milieu de fermentation au moins un hydrate de carbone assimilable selon un débit tel que la teneur du milieu de fermentation en hydrate de carbone soit comprise entre 15 et 35 mgiml et au moins une source d'azote aminé assimilable contenant des acides aminés libres, tout en maintenant la température du milieu entre 22 et 25 C.

   3. Procédé selon la revendication ou selon la revendication et la sous-revendication 2, caractérisé par le fait que l'on ajoute progressivement au milieu de culture des quantités respectives d'hydrate de carbone et de source d'azote aminé qui, exprimées en valeurs pondérales, sont dans un rapport compris entre 1,6 et 3,4.