CH551009A - Verfahren zur herstellung markierter antikoerper gegen reagin-immunoglobuline. - Google Patents

Description

  
 



   Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung markierter Antikörper gegen Reagin-Immunoglobuline oder gegen Fragmente von Reagin-Immunoglobuline, dadurch gekennzeichnet, dass man ein radioaktives Atom oder eine fluoreszierende Gruppe in Antikörper gegen Reagin Immunoglobuline oder Fragmente davon einführt.



   In der österr. Patentschrift Nr. 288 593 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Reagin-Ig in wässerigen Testproben beschrieben, welches im wesentlichen dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Probe, z. B. eine Körperflüssigkeit wie Blutserum oder Blutplasma in vitro mit einem wasserunlöslichen Polymer, welches vorzugsweise in Teilchenform vorliegt, und an welches ein Testallergen gebunden ist, zusammenbringt, worauf man das Polymer mit dem   Testallergen    und dem Reagin-Ig entweder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig, die mit einem radioaktiven Atom bzw.

   einer radioaktiven Gruppe markiert sind, oder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig und Reagin-Ig, welches mit einem radioaktiven Atom oder einer radioaktiven Gruppe markiert ist, zusammenbringt, anschliessend das unlösliche Polymer mit den daran befindlichen Substanzen aus der Flüssigkeit abtrennt und schliesslich die Strahlung, die von dem unlöslichen Polymer mit den daran befindlichen Substanzen ausgestrahlt wird, oder die Strahlung, die von der abgetrennten Flüssigkeit ausgestrahlt wird, misst oder die Wirkung derselben untersucht.



   Ist in der Probe ein Reagin-Ig vorhanden, welches gegen das Allergen gerichtet ist, so wird markiertes Reagenz an die unlösliche Phase gebunden, die anschliessend eine Strahlung emittieren wird. Die letztere erhöht sich, wenn die Konzentration an Reagin-Ig in der Testprobe zunimmt. Die Strahlung der flüssigen Phase wird im Gegensatz dazu bei sich erhöhender Konzentration an Reagin-Ig abnehmen, weil mehr markiertes Reagenz an die unlösliche Phase gebunden wird.



  Die gemessenen Strahlungswerte, die bei dieser Methode für die Testprobe erhalten werden, können mit den Werten von Kontrollproben verglichen werden.



   Reagin-Ig kann aus dem Serum allergischer Patienten sowie in seltenen Fällen aus dem Serum von Patienten, die Reagin-Ig-bildende Tumore im Gewebe aufweisen, gewonnen werden. Reagin-Ig kann mit den verschiedenen Methoden zur Abtrennung von Proteinen gereinigt werden, z. B. durch Gelfiltration,   Ionenaustauscher-Chromatographie    und Elek   trophorese. Ahnlich    wie andere Immunoglobuline kann Reagin-Ig chemisch oder enzymatisch in ein Antigenbindendes Fragment und ein Fragment, welches die Trägersubstanz für die klassenspezifisch bestimmenden Gruppen ist, gespalten werden.



   Die markierten Antikörper sind in radioimmunologischen Methoden verwendbar, z. B., wie oben ausgeführt ist, für die Bestimmung der Anwesenheit von Reagin-Ig.



   Antikörper gegen Reagin-Ig können nach bekannten Methoden zur Immunisierung von Versuchstieren hergestellt werden, z. B. durch wiederholte subkutane Injektionen kleiner Mengen von Antigenen in Mischung mit einem geeigneten Zusatzmittel, z. B. Freundscher Mineralölsuspension. Die Antikörper, die von dem Tier, z. B. einem Kaninchen, gebildet werden, können aus dem Blutserum des Tieres gewonnen werden.



   Spezifische Antikörper, das sind Antikörper, die gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen des Reagin-Ig gerichtet sind, können erhalten werden, indem man die Immunisierung mit den aus den Reagin-Ig-Molekülen abgespalteten Fragmenten, die die bestimmenden Gruppen enthalten, vornimmt oder indem man die spezifischen Antikörper aus einer Mischung von Antikörpern isoliert, die durch Immunisieren mit nativem Reagin-Ig gewonnen worden sind.



   Spezifische Antikörper, die gegen Reagin-Ig gerichtet sind, können gegebenenfalls aus dem Antiserum auch durch übliche immunosorbierende Techniken isoliert werden; beispielsweise kann Reagin-Ig mit Bromacetylcellulose gekuppelt werden, worauf die Antikörper, die an das gekuppelte Reagin-Ig gebunden sind, durch Erniedrigung des pH-Wertes freigesetzt werden.



   Es ist in einigen Fällen vorteilhaft, spezifische Antikörper gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen in dem Reagin-Ig zu verwenden, damit eine besonders hohe Sicherheit und Genauigkeit während der Versuche erreicht werden.



   Die Markierung von Reagin-Ig und Antikörpern gegen   keagin-Ig    mit radioaktiven Isotopen kann in üblicher Weise vorgenommen werden, wobei ein für diese Zwecke geeignetes Isotop z. B. aus 125J besteht (Methode nach Hunter und Greenwood). Auch die Markierung mit einer fluoreszierenden Gruppe kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z. B.



  mit einem Fluoreszeinderivat wie Fluoreszeinisothiocyanat.



   Die Bestimmung der Radioaktivität kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z. B. mit Hilfe von Leuchtdetektoren. Auch die Fluoreszenz kann in üblicher Weise gemessen werden.



   Das Verfahrensprodukt kann auch zur quantitativen Be   stimmung    von Reagin-Ig dienen. Für diesen Zweck wird eine serielle Verdünnung des Testserums analysiert; das Ergebnis ergibt sich durch Vergleich mit der Wirkung einer Standardlösung, die in analoger Weise analysiert worden ist.



   Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.



   Beispiel 1
A) Herstellung von Antikörpern gegen das Fc-Fragment des Reagin-Ig
Kaninchen wurden intramuskulär mit einer Mischung aus 0,5 mg Fc-Fragment des Reagin-Ig (hergestellt nach Schweizer Patent 534 878) in 0,2 ml 0,15 m Natriumchloridlösung und 0,8 ml vollständiger Freundscher Zusatzlösung injiziert.



  Die Immunisierung wurde nach 14 Tagen und dann jede Woche drei Wochen lang wiederholt. Nachdem weitere 10 Tage vergangen waren, wurde den Kaninchen Blut entnommen, aus welchem das Antiserum durch Koagulieren und Entfernung des Koagulates gewonnen wurde.



   Das Antiserum wurde durch Adsorption während einer Stunde bei 370 C und 16 Stunden bei 40 C spezifisch gemacht.



  Nach dem Abzentrifugieren wurde die Spezifität des Antiserums durch   Immunoelektrophorese    gegen normales Menschenserum und durch   Ochtorlony-Geldiffusionsanalyse    gegen reine Immunoglobuline A, G und M, sogenannte leichte Polypeptidketten aus normalem Immunoglobulin G und Bence-Jones-Proteine getestet; dabei konnte die Spezifität gegen Reagin-Ig festgestellt werden.



   Antikörper gegen das Fc-Fragment wurden aus diesem Antiserum isoliert, in folgender Weise: 2 g eines Komplexes aus Bromacetylcellulose und Reagin-Ig wurden mit 34 ml einer Lösung vermischt, die etwa 95 mg Immunoglobulin enthielt, die aus dem Antiserum durch Ionenaustauscherchroma   tographie    isoliert worden war. Die gewonnene Suspension wurde bei pH 7 und 40 C zwei Stunden aktiviert und anschliessend mit 20 000   xg    20 Minuten bei 100 C zentrifugiert.

 

  Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, die Cellulose wurde mit 0,15 m   NaCl-8    m Harnstoff (pH 6-7) gewaschen, anschliessend wurde wieder zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde. Dieses Waschverfahren wurde solange wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit frei von Protein war. Der Cellulose-Protein-Komplex wurde zu 9   ml    0,1 m Glycin-HCl-Puffer (pH 3,1) gegeben und unter Rühren bei 370 C 40 Minuten inkubiert. Die ganze Lösung wurde dann zentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 1200   ml    0,01 m Tris-HCl, 0,1 m NaCl   (pH 7,1) bei 40 C 48 Stunden dialysiert. Diese Lösung enthiet Antikörper in einer Menge von ungefähr 1 mg pro ml, die gegen das Fc-Fragment des Reagin-Ig und damit also auch für das gesamte Reagin-Ig spezifisch sind.

  Dieses Antikörpermaterial reicht zur Durchführung von mehr als 10 Millionen Bestimmungen aus.



   B) Markierung von Antikörpern, die gegen das Fc-Fragment des Reagin-Ig spezifisch sind.



   Die Markierung wurde mit   125J    nach der Methode von Hunter und Greenwood,  Nature  194 (1962), Seite 495, durchgeführt.



   Die Markierung kann auch in entsprechender Weise durchgeführt werden, wie dies im Beispiel 2 für Antikörper gegen Reagin-Ig beschrieben ist.



   Die markierten Antikörper können für das Bestimmungsverfahren nach Patent 534 878 verwendet werden.



   Beispiel 2
Markierung von Antikörpern gegen Reagin-Ig
A) Herstellung von Antikörpern gegen Reagin-Ig
Antikörper gegen Reagin-Ig wurden hergestellt durch Immunisierung von Kaninchen mit Reagin-Ig auf gleiche Weise wie unter Beispiel 1 A beschrieben.



   B) Radioaktives Jod   (12sJ)   
Jod-125, trägerfrei, gelöst als NaJ in 0,1 m NaOH und frei von Reduktionsmitteln wurde verwendet.



   C) Herstellung von Jodmonochlorid
Jodmonochlorid wurde hergestellt gemäss J. L. Izzo, W.



  F. Bale, M. J. Izzo und A. Roncone, J. Biol. Chem., 239, Nr. 11, 3742 (1964) und der Jodgehlat wurde bestimmt durch Reduktion des gesamten Jods zu Jodid mit Hilfe von Arsentrioxyd und nachfolgende Titration mit 0,1 m AgNO3. Die   JC1-Stammlösung    enthielt 2,54 mg J/ml in 0,02 m   KCI,    2,0 m NaCI und 1,0 m   HC1    und ist bei Raumtemperatur wenigstens 18 Monate lang stabil. Vor Gebrauch wurde die   JC1-Stammlösung    auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Als Verdünnungsmittel wurde eine   HCl-NaCl-Lösung    bereitet, deren Konzentration für jeden Versuch individuell eingestellt wurde, um verlässlich Werte oberhalb der Minimalkonzentration an   HC1    und NaCl zu erhalten, bei welchen JCI als Stabil bekannt ist   IR.    W. Helmkamp, M. A.

  Conteras und W. F. Bale: Int. J. appl. Radiat. Isotopes, 18, 737 (1967)].



   D) Markierungsverfahren
Die Jodierung beruht auf   Helmkamps    Modifizierung der Jodmonochloridmethode nach McFairlane   [A.    S. McFairlane, Nature, 182, 53 (1958)], mit weiteren Abänderungen [J. L.



  Izzo, W. F. Bale, M. J. Izzo und A. Roncone, J. Biol. Chem.



  239, Nr. 11 (1964), 3743, W. F. Bale, R. W. Helmkamp, T. P. Davis, M. J. Izzo, R. L. Gooland, M. A. Contreras und I. L. Spar, Proc. Soc. Exp. Med., 122 (1966), 407, und R. W.



  Helmkamp, M. A. Contreras und W. F. Bale, Int. J. appl.



     Radial    Isotops, 18 (1967), 737].



   Antikörper gegen Reagin-Ig (100   ,zug)    wurden markiert in einem Molverhältnis von   JCl    zu Antikörper gegen Reagin-Ig von 2:1 und JC1 zu   125J    von 1:1. Folgende Lösungen wurden verwendet:
Lösung I: Antikörper gegen Reagin-Ig wurde in 0,2   m      tris-HC1-Puffer,    pH 8, mit einer Konzentration von 10,0 mg/ml gelöst.



   Lösung II: Das Verdünnungsmittel für die   JC1-Stamm-    lösung wurde durch Auflösen von 5,84 g   NaC1    in 35 ml 2,0 m HC1 und 65 ml destilliertem Wasser bereitet.



   Lösung III: Die Endlösung von Jodmonochlorid wurde bereitet durch Verdünnen von 100   ,cel    der JCl-Stammlösung mit 20,2 ml Lösung II.



   Lösung IV: 44,29   ,ul    von Radiojodid (4,0 mCi) wurden zu 25   zur    Lösung III zugegeben und vor Gebrauch in einem Eisbad belassen. Alle Lösungen wurden kühlgehalten und die Jodierungsreaktion wurde bei Eistemperatur durchgeführt.



  Die Reagentien wurden in der folgenden Reihenfolge in kleine Glasröhrchen gegeben:
Zu 200   ul    Borat-Carbonat-Puffer (0,4 m, pH = 9,1) und 10   fzl    Lösung I (100   g    Antikörper gegen Reagin-Ig) wurden 50   ,ul    Lösung IV zugesetzt und sofort kräftig gemischt. Nach 60 sec wurden 20   ,6ll    0,1 m   Na2S203,    50   zur    20/oiges KJ und 200   yl      50/obiges    Human-Serum-Albumin-Blau (HSA-Blau) zugesetzt. Das HSA-Blau wurde gemäss Melani [F. Melani,   K M.    Bartelt, R. Conrads, E. F. Pfeiffer, Z. klin. Chem., 4.



  Jahrg. 1966 (Heft 4)] bereitet. Letzteres wurde zur Verminderung von Strahlenschäden und zur Verminderung der Adsorption von Antikörpern gegen Reagin-Ig an den Glaswänden zugegeben. Zubereitungen von mit 125J jodierten Antikörpern gegen Reagin-Ig können gereinigt werden durch Sephadex (R) (vernetztes Dextran) oder Sepharose (R) (Agargel), u. zw. durch Gelfiltration oder durch Ionenaustauscher wie Dowex (R) oder Amberlite (R). Fraktionen aus der Kolonne wurden gewonnen bei   +40    C in 0,1 m   tris-HC1-Puffer,    pH = 7,72, mit einem Gehalt von 5   o/o    HSA. Fraktionen, die die markierten Antikörper gegen Reagin-Ig enthielten, wurden gesammelt und in gefrorenem Zustand aufbewahrt.

 

   Diese Methode ergab 81,34   o/o    Bindung von gesamten jodierten Antikörpern gegen Reagin-Ig. Das markierte Immunoglobulin enthielt etwa 1 Atom 125J und etwa 1 Atom 127J pro Molekül (MW 150 000) und hatte eine spezifische Aktivität von etwa 16 mCi/Mg. 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Herstellung markierter Antikörper gegen Reagin-Immunoglobuline oder gegen Fragmente von Reagin Immunoglobulinen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein radioaktives Atom oder eine fluoreszierende Gruppe in Antikörper gegen Reagin-Immunoglobuline oder Fragmente davon einführt.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das radioaktive Atom ein Jodisotop ist.

   2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Jodisotop 125J ist.