Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikum-Glykosids der Zusammensetzung C > 2H76024, das das Aglykon Chromomyzinon und die Reste von drei Desoxyzuckern enthält, von welchen zwei mit Oliose und Olivose identisch sind.
Für das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Antibiotikum-Glykosid wird die folgende Strukturformel
EMI1.1
vorgeschlagen.
Das erwähnte Antibiotikum-Glykosid stellt eine pharmakologisch wirksame Substanz dar und sie kann in Arzneimitteln zur Behandlung bösartiger Neubildungen eingesetzt werden. Es wird angenommen, dass dieses Antibiotikum-Glykosid einen Wirkungsmechanismus besitzt, gemäss dem es die DMS-abhängige RNS-Synthese, also die von der Desoxyribonukleinsäure abhängige Ribonukleinsäure-Synthese in verschiedenen biologischen Systemen hemmt, beispielsweise in grampositiven und säurefesten Bakterien, in Geschwulstzellen usw.
Das neue Antibiotikum-Glykosid stellt ein gelbes amorphes Pulver dar, das in Alkoholen, Estern leicht, in Wasser aber schwer löslich ist. Schmelzpunkt 162-165 "C (unter Zersetzung).
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikum-Glykosids der Zusammensetzung C52H76O24, dass das Aglykon Chromomyzinon und die Reste von drei Desoxyzuckern enthält, von welchen zwei mit Oliose und Olivose identisch sind, ist dadurch gekennzeichnet, dass die das Antibiotikum-Glykosid produzierende Kultur Actinomyces olivovariabilis sp. nov., auf einem Nährboden gezüchtet wird, der die Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff sowie Mineralsalze enthält, wobei nach der Beendigung des Züchtungsprozesses das Myzelium abgetrennt wird und das Filtrat der Kulturflüssigkeit bis zu der Erreichung eines pH-Wer.
tes von 2 bis 4 angesäuert wird, wonach dann das Antibiotikum-Glykosid mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, der Extrakt eingedampft und aus dem erhaltenen Produkt das erwünschte Endprodukt mit einem organischen Lö-' sungsmittel ausgefällt und isoliert wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens wird als Nährboden ein Nährboden verwendet, der 2 Gew.-% Sojamehl, 2 bis 4 Gew.- /0 Stärke, 2,0 Gew.-0/o Glukose, 0,5 Gew.- /0 Natriumchlorid, 0,5 Gew.- /o Calciumcarbonat, 0,4 Gew.-0/o Ammoniumsulfat, 0,04 Gew.-0/o Monokaliumphosphat oder Dikaliumphosphat und den Rest auf 100 Gew.-% Wasser enthält, wobei der pH-Wert des Nährbodens im Bereich von 6,8 bis 7,0 liegt.
Ein weiterer bevorzugter Nährboden zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens ist ein Nährboden, der 1,0 Gew.- /0 Maisquellwasser 2,0 Gew.- /0 Stärke, 2,0 Gew.-0/o Glukose, 0,5 Gew.-% Natriumchlorid, 0,5 Gew.-0/o Calciumcarbonat, 0,4 Gew.-% Ammoniumsulfat sowie den Rest auf 100 Gew.-% Wasser enthält, wobei der pH-Wert des Nährmediums 6,8 bis 7,0 beträgt.
Ferner wird bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens als organisches Lösungsmittel zur Extraktion des Antibiotikum-Glykosides vorzugsweise Essigsäureäthylester oder Butanol verwendet und als organisches Lösungsmittel zur Fällung des gewünschten Endproduktes bevorzugt Diäthyläther oder Hexan eingesetzt.
Wie bereits erwähnt wurde, enthält das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Antibiotikum-Glycosid das Aglykon Chromomyzinon und die Reste von drei Desoxyzuckern, wobei von diesen Desoxyzuckern zwei mit Oliose und Olivose identisch sind. Diese beiden genannten Desoxyzucker sind in einer Reihe von Artikeln beschrieben, die in der Zeitschrift Chemie der Naturverbindungen , 1967, Seiten 331 und 405 sowie in der gleichen Zeitschrift, 1969, Seite 109 geschrieben wurden.
Der zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens herangezogene Mikroorganismus Actinomyces olivovariabilis sp. nov. ist in der UdSSR im Laboratorium für Kulturen beim Unions-Forschungsinstitut für Antibiotika unter der Nummer 975 und in der Kollektion der Antibiotika produzierenden Kulturen beim Unions-Forschungsinstitut für Antibiotika in der Internationalen Assoziation der bakteriologischen Kollektionen I AMC unter der Nummer 337 registriert worden. Dieser Mikroorganismus Actinomyces olivovariabilis sp. nov. weist die folgenden morphologischen Merkmale und physiologischen Eigenschaften auf: Die Sporenträger auf allen Nährböden sind spiralförmig, auf kurzen Zweigen einzeln oder strauchartig angeordnet. Die Spiralen sind zusammengepresst und sehen wie Knäuel aus; die Sporen sind länglich und oval, der Überzug ist glatt.
Auf dem Mineralnährboden Nr. 1 von Gause wird ein gemässigtes Wachstum beobachtet, die Kolonien sind flach, wachsen tief ins Agar hinein, das Luftmyzelium ist mässig entwickelt, samtartig, dunkelgrau. Das Substratmyzelium ist olivengrau; das lösliche Pigment fehlt. Auf dem organischen Nährboden Nr. 2 von Gause wird ein gemässigtes Wachstum beobachtet, das Luftmyzelium ist samtartig, schwach entwickelt, von graulichvioletter Farbe; das Substratmyzelium ist dunkelolivenfarbig; der Nährboden hat die Schattierung des Substratmyzeliums; auf dem Nährboden mit Tyrosin wird ein gemässigtes Wachstum beobachtet, das Luftmyzelium ist schwach entwickelt, von grauer Farbe, das Substratmyzelium ist dunkelumbrafarbig. Ferner bildet der Mikroorganismus kein Melanin und verdünnt Gelatine nicht. Er peptonisiert Milch am 20.
Tage, bildet H2S und ist nicht in der Lage, Stärke zu hydrolysieren.
Ferner reduziert er auch Nitrate nicht.
Wenn man bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens ein chromatographisch reines Antibiotikum Glykosid erhalten will, dann wird das isolierte Endprodukt der Reinigung nach der Methode der Säulenchromatographie bzw. Dünnschichtchromatographie auf Silikagel unterworfen, wobei als Lösungsmittelsystem Chloroform plus Methanol oder Benzol plus Aceton eingesetzt wird.
Die zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eingesetzte Kultur des Mikroorganismus Actinomyces olivovariabilis sp. nov. ist eine neu isolierte Aktinomyzeten Art, die die folgenden weiteren morphologischen Merkmale besitzt: die Sporenträger auf allen benutzten Nährböden sind spiralförmig und auf kurzen Zweigen einzeln oder strauchartig angeordnet. Die Spiralen sind stark zusammengepresst, mit 1-3 Windungen, manchmal sehen diese wie Knäuel aus; die Sporen sind länglich oder oval, der Überzug ist glatt.
Auf dem Mineralnährboden Nr. 1 von Gause wird ein gemässigtes Wachstum beobachtet, die Kolonien sind flach und wachsen tief ins Agar hinein. Das Luftmyzelium ist mässig entwickelt, samtartig, dunkelgrau ( A 2 nach Bondarzew, W 5 nach Prauser). Das Substratmyzelium ist olivengrün, dunkelnussfarben (H 1; K 5 nach Bondarzew C65-Coz nach Prauser). Das lösliche Pigment fehlt. Auf dem Nährboden von Capek und ZR, von Krasilnikow werden nach dem Charakter dem Wachstum nach unbedeutende Unterschiede von dem oben beschriebenen Nährboden nachgewiesen.
Auf dem Glukose-Asparagin-Nährboden wird ein gutes Wachstum nachgewiesen, das Luftmyzelium ist samtartig, mässig entwickelt, von grauer Farbe. Das Substratmyzelium ist dunkelolivenfarbig, dunkelbraun (b 6, E 4 nach Bondarzew). Manchmal hat der Nährboden die Schattierung des Substratmyzeliums.
Auf dem Glyzerin-Asparagin-Nährboden wird ein gutes Wachstum nachgewiesen, die Kolonien sind uneben, manchmal rissig. Das Luftmyzelium fehlt. Das Substratmyzelium ist beige (L 7 nach Bondarzew). Das lösliche Pigment fehlt.
Auf dem Stärke-Ammonial-Nährboden wird ein gemässigtes Wachstum nachgewiesen. Das Luftmyzelium ist samtartig, mässig entwickelt, von grauer Farbe. Das Substratmyzelium ist von olivengrauer, manchmal von dunkelbrauner Farbe (L 5 nach Bondarzew; Osr nach Prauser). Das lösliche Pigment fehlt.
Auf dem Hafer-Nährboden wird ein gutes Wachstum beobachtet. Das Luftmyzelium ist samtartig, mässig entwikkelt, von dunkelgrauer Farbe mit grünlicher Schattierung (H3 nach Bonarzew, C 6 r nach Prauser). Das Substratmyzelium ist von dunkelbrauner bis dunkelolivegrüner Farbe. Der Nährboden hat die Schattierung des Substratmyzeliums, mit dem Alter wird der Nährboden manchmal hellhimbeerfarben.
Auf dem organischen Nährboden Nr. 2 von Gause wird ein gemässigtes Wachstum beobachtet. Das Luftmyzelium ist samtartig, schwach entwickelt, von graulich-violetter bis hellgraulicher Farbe (a 3, a 6 nach Bondarzew). Das Substratmyzelium ist dunkelolivengrün bis dunkelbraun. Der Nährboden hat die Schattiewng des Substratmyzeliums.
Auf dem Nährboden mit Tyrosin wird ein gemässigtes Wachstum nachgewiesen. Das Luftmyzelium ist schwach entwickelt, von grauer Farbe. Das Substratmyzelium ist dunkelumbrafarbig (p 2 nach Bondarzew), bis dunkelbraun. Melanin wird nicht gebildet.
Die physiologischen Merkmale der neuen Antibiotika Art werden durch folgende Angaben gekennzeichnet: sie verdünnt Gelatine nicht; peptonisiert Milch am 20. Tag; bildet H2S; hydrolysiert Stärke nicht; reduziert Nitrate nicht.
Die Assimilation der Kohlenstoffquellen auf dem Nährboden von Pridham-Gottlieb: Glukose +++ Maltose +++ Arabinose ++ Saccharose + Xylose ++ Mannit Ramnose - Inosit ++ Raffinose
In der Aktinomyzeten-Kulturflüssigkeit wurde eine Pigment vom Anthozyanentypus nachgewiesen.
Im Laufe der Untersuchungen trat eine grosse Heterogenität der Kultur in Erscheinung, die sich in der spontanen Bildung einer grossen Menge von morphologischen und physiologischen Varianten mit stabilen Merkmalen ausdrückte.
Die genannten Kultur Actinomyces olivovariabilis sp.
nov. wird auf den Nährboden inokuliert und die Fermentation wird beispielsweise bei einer Temperatur von 27 bis 28 "C während 130-140 Stunden durchgeführt. Hiernach wird die erhaltene Kulturflüssigkeit vom Myzelium abfiltriert und das Filtrat wird in der Regel mit Salzsäure, Schwefelsäure oder mit einer anderen beliebigen Mineralsäure bis pH von 2-4 angesäuert, dann wird das Endprodukt mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Äthylazetat, Butylazetat, Butanol u. a. extrahiert. Die Extraktion ist vorzugsweise mit Äthylazetat oder Butanol durchzuführen.
Zur Gewinnung des Endproduktes von höherer Qualität wird das Extrakt der Behandlung mit wässriger Natriumbikarbonatlösung unterworfen, worauf die wässrige Phase mit einer Mineralsäure (Salzsäure, Schwefelsäure oder mit einer anderen beliebigen) bis pH von 2-4 angesäuert und mit dem organischen Lösungsmittel nochmalig extrahiert wird:
Das erhaltene Extrakt wird im allgemeinen bis zum minimalen Volumen eingedampft und das Endprodukt wird mit einem Lösungsmittel, z. B. mit Hexan, Petroleumäther oder Diäthyläther u. a. gefällt. Die besten Resultate können unter Anwendung von Hexan oder Diäthyläther erhalten werden.
Zur Herstellung des chromatographisch reinen Antibioti kum-Glykosids wird es der zusätzlichen Reinigung nach der
Methode der Säulen- und Dünnschichtchromatographie auf Silikagel in Lösungsmittelsystemen Chloroform/Methanol (9 1) oder Benzol/Azeton (1 1) nacheinander unterworfen.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden folgende Beispiele der Verwirklichung des Verfahrens zur Herstellung des Antibiotikum-Glykosids angeführt.
Beispiel. 1
Das Impfmaterial der Kultur Actinomyces olivovariabilis sp. nov. in einer Menge von 5-10 Vol.-% wird auf den Nährboden folgender Zusammensetzung in Gew.-0/o: Sojamehl 2,0; Stärke - 2,0; Glykose - 2,0; Natriumchlorid - 0,5; Kalziumkarbonat - 0,5; Ammoniumsulfat - 0,4; disubstituiertes Kaliumphosphat - 0,04 in einen Behälter von 100 1 Volumen inokuliert. Der Fermentationsprozess wird bei einer Temperatur von 26-28 "C während 140 Stunden durchgeführt.
Dann wird das Kulturmyzelium abfiltriert und 40 1 erhalte nen Filtrats werden mit 100/obiger Salzsäure bis pH von 2-2,5 (potentiometrisch) angesäuert.
Die Extraktion wird dreimal mit Äthyl < tzetat (15, 10 und 7 1) durchgeführt, die vereinigten Äthylazetatextrakte werden mit Wasser vom Säureüberschuss gewaschen (pH der Wasserwäsche - 5) und im Vakuum bis 0,1 des ursprünglichen Volumens eingedampft. Das Konzentrat wird dreimal mit 50/obiger wässriger Natriumbikarbonatlösung (1, 0,5 und 0,3 1) extrahiert.
Das Extrakt wird mit 100/obiger Salzsäure bis pH von 2-2,5 (potentiometrisch) angesäuert, nachher dreimal mit Äthylazetat (0,4 1 und zweimal zu 0,2 1) extrahiert Das vereinigte Äthylazetatextrakt wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und das Antibiotikum wird mit der dem Volumen nach 10facher Hexanmenge gefällt.
Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Hexan gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute des ungereinigten Endproduktes beträgt 3 g. 0,5 g des ungereinigten im Gemisch Chloroform/Methanol (9 :1) gelösten Antibiotikum-Glykosids werden durch die Säule (15 x 700) geleitet, die mit 30 g Silikagel gefüllt ist, welches keine Eisenionen enthält.
Die Entwicklung und die Elution wird mit demselben Ge misch durchgeführt. Die Analyse der erhaltenen Fraktionen wird nach der Methode der Dünnschichtchromatographie in demselben System von Lösungsmitteln durchgeführt. Die das Antibiotikum-Glykosid enthaltenden Fraktionen werden im Vakuum bis zur Trockne eingedampft, in einem geringen Volumen von Äthylazetat gelöst und auf eine Platte mit Silikagel aufgetragen. Nach der Trocknung werden diese im oben beschriebenen Lösungsmittelsystem chromatographiert.
Aus der Zone mit Rf 0,55-0,6 wird durch die Elution mit Methanol mit darauffolgendem Konzentrieren im Vakuum und Umfällung mit Hexan aus Äthylazetat das chromatographisch reinellBlOTlKUM[Glykosid erhalten. Das Antibiotikum-Glykosid wird in Form von gelbem amorphem Pulver isoliert, das im Methyl- oder Äthylalkohol, in Estern leicht, im Wasser schwer löslich ist. Schm. p. 162-165 "C (unter Zersetzung).
Berechnet in %: C 57,56 H 7,02 C52H76O24 Gefunden in 0/o: C 57,90 H 7,02
Das Äquivalentgewicht (bestimmt durch Titration mit 0,1 N Natronlauge im Medium Methanol/Benzol) beträgt 1073.
Berechnet für C52H76024 - 1084. [a] D - 49 + 2 (mit 0,5; Äthanol).
Methanol
X 230; 280; 317, 330, (Inflektion), 412 nm (El /cm 174, 380, 59, 5, 80) max y (Nujol, cm-') 3400-3450; 1720; 1635; 1580; 1520; 1180; 1070; 1010; 910; 840.
Beispiel 2
Bis zur Stufe der Extraktion des Antibiotikums-Glykosids wird der Prozess analog dem Beispiel 1 durchgeführt.
Die Extraktion wird dreimal mit Butanol (12 1; 8 1 und 5 1) durchgeführt. Die vereinigten Extrakte werden mit einem geringen Volumen von Wasser gewaschen und im Vakuum bis 0,3 des ursprünglichen Volumens eingedampft. Das Konzentrat wird dreimal mit 50/obiger wässriger Natriumbikarbonatlösung extrahiert (1,6; 0,75 und 0,45 1). Das vereinigte Sodaextrakt wird mit 100/obiger Salzsäure bis pH von 2-2,5 (potentiometrisch) angesäuert, nachher dreimal mit Butanol extrahiert (0,5 1 und zweimal 0,2 1). Das vereinigte Butanolextrakt wird mit einer geringen Menge von Wasser gewaschen und bis zur Trockne eingedampft.
Der Rest wird in einer geringen Menge von Äthylazetat gelöst und mit Diäthyläther gefällt.
Die Ausbeute von Antibiotikum-Glykosid beträgt 2,8 g.
Zur Herstellung des chromatographisch reinen Antibiotikums wird die Reinigung analog dem Beispiel 1 durchgeführt.