Zur Züchtung von Gewebezellen und Mikroorganismen sind in den letzten Jahren eine Reihe von Apparaten und Vorrichtungen entwickelt worden. Vielfach geht die Züchtung von Gewebezellen mit derjenigen von Mikroorganismen - wie.z.B.
der Züchtung von Viren Hand in Hand. Die entsprechenden Apparate werden jeweils dem gewünschten Verfahren angepasst.
Sowohl Gewebezellen als auch Mikroorganismen werden für verschiedene Zwecke gezüchtet. So werden unter anderem Gewebezellen in Substraten gezüchtet, d. h. künstlich vermehrt um anschliessend mit den für eine Vermehrung vorgesehenen Viren angeimpft zu werden. Die Viren ihrerseits vermehren sich -quasi als Parasiten- auf den lebenden Zellen und können anschliessend an diese Vermehrung zur Herstellung von Vaccinen geerntet werden. Gewebezellen werden aber auch an und für sich gezüchtet - sei es zur Herstellung von Enzymen oder für die Erzeugung von Proteinen.
Das hier gefundene Verfahren mit der zugehörigen apparativen Vorrichtung eignet sich insbesondere für die Herstellung sogenannter diploider Zellen. Diploide Zellen werden vor allem für die Herstellung von Human-Vaccinen gezüchtet.
Sie allein können und dürfen für die Herstellung von Virus Vaccinen verwendet werden, welche in der Human-Medizin zur Anwendung gelangen.
Diploide Zellen haben die Eigenschaft, dass sie sich in ihrer ursprünglichen Form, d. h. eben der diploiden Form, nur auf einem festen Träger vermehren und nur in einer einzelligen Schicht. Eine solche Schicht nennt sich Monolayer und ist in der Literatur ausgiebig beschrieben.
Die einfachste Apparatur und das einfachste Verfahren zur Erzeugung solcher diploiden Zellen besteht darin, dass die entsprechende Züchtung in einer Glasflasche mit flachem Boden durchgeführt wird. Die für die Züchtung benötigte Flüssigkeit, welche vielfach eine komplizierte Zusammensetzung aus Serum, Vitaminen, Salzen, Antibiotika usw. aufweist, wird in die Flaschen eingefüllt und mit den zu züchtenden Gewebezellen angeimpft. Die angeimpften Zellen sinken langsam auf den Boden der Flasche, setzen sich dort fest und beginnen sich unter geeigneten Bedingungen flächenmässig zu vermehren. Nachdem der ganze Flaschenboden überdeckt ist, können die Zellen geerntet werden - z. B. durch Ausgiessen des überstehenden Substrates und anschliessendes Auskratzen der Zellen - oder aber die Zelldecke verbleibt auf dem Flaschenboden und wird direkt mit einer Virus-Suspension sekundär angeimpft.
Die Viren dringen in die Zellen ein und vermehren sich dort in bekannter Weise und können anschliessend selbst geerntet werden. Die Ernte sowohl der Zellen als auch der Viren ist eine nicht sehr einfache Angelegenheit. Oft haften die Organismen ziemlich fest auf der Unterlage und die sterile Entfernung ist umständlich.
Wie erwähnt, vermehren sich diploide Zellen auf einer Oberfläche nur in einer einzelligen Schicht. Es ist leicht ersichtlich, dass demzufolge grosse Flächen notwendig sind, um nur relativ kleine Zellsubstanzmengen-zu züchten. Es wurden dann verschiedene Apparate-Typen entwickelt, welche diesem Übelstand Rechnung tragen. Gefässe mit übereinanderliegenden Glas- oder Metallscheiben, liegende Gefässe mit horizontaler Achse und vertikalen rotierenden Scheiben usw. Alle diese Apparate haben aber Nachteile: entweder sie sind schwer zu reinigen, d. h. von der Zellsubstanz zu befreien oder die Flächen sind relativ klein, wie dies beispielsweise bei den sogenannten < cRoller-Tube -Apparaten der Fall ist, bei welchen eine Anzahl zylindrischer Gläser in ein grosses Rad eingesteckt und langsam rotiert werden.
Gegenstand dieser Erfindung ist ein mit einer apparativen Vorrichtung verbundenes Verfahren, welches auf einfache Weise Züchtung auf einer grossen Oberfläche, automatische Ernte ohne Öffnung des Apparates und Arbeiten unter absoluter Sterilität gestattet.
Es ist ein Verfahren zur Züchtung von Gewebezellen und Mikroorganismen in einem mit rotierbaren Flächen versehenen Behälter, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Animpfung der Zellen und Mikroorganismen bei kleiner Tourenzahl der Flächen erfolgt und deren Auswaschung bei einer erhöhten Tourenzahl.
Bei der Durchführung des Verfahrens wird am besten wie folgt vorgegangen:
Das zur Züchtung der Zellen verwendete Substrat wird in einen Apparat eingefüllt, in welchem sich eine mit verschiedenen Tourenzahlen rotierbare, geeignete Haftfläche befindet.
Die Haftfläche ist so ausgebildet, dass diese teilweise in das Substrat ragt, teilweise in den Gasraum des Gefässes. Während der Impf- und Wachstumsperiode wird die Tourenzahl sehr klein gehalten, so dass sich die Zellen festsetzen können.
Nach beendetem Wachstum kann das Substrat abgelassen, Vi rus-Impfmateriaf zugegeben und die Viren direkt auf der Zellschicht gezüchtet werden. Für die Ernte wird die Tourenzahl der Haftfläche so weit gesteigert, bis sich das Zellmaterial durch Reibung mit der Flüssigkeit von dieser Haftfläche löst und entleert werden kann.
Sofern Zellen gezüchtet werden, welche sehr stark haften, wird vor der Ernte dem Substrat am besten eine körnige Substanz zugegeben wie z. B. Quarzsand, Kunststoffgranulat, Kieselgur usw. Durch die erhöhte Reibung durch solche Substanzen können auch fest haftende Zellen - vor oder nach der Virus-Impfung - von der Haftfläche entfernt werden. Die Zugabe von solchen Granulaten ist auch geeignet, eine gute Reinigung des gesamten Apparates zu bewerkstelligen, so dass dieser vor dem nächsten Ansatz nicht demontiert werden muss.
Es versteht sich von selbst, dass das ganze Prozedere im allgemeinen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden muss, so wie in der übrigen Fermentiertechnik bekannt. Die Drehrichtung der Haftfläche kann geändert werden, wenn dies z.B. für die gute Entfernung der Zellen und der Granulate nötig ist.
Ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung ist eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, die dadurch gekennzeichnet ist, dass in einem Behälter eine spiralförmig aufgewickelte Fläche so angeordnet ist, dass diese Fläche um ihre horizontale Achse rotiert werden kann.
Unter Bezugnahme auf Fig. 1 werden nun bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben:
In einem für die Fermentation, d. h. die Züchtung geeigneten Behälter, ist eine in horizontaler Lage eingebaute Spirale 1 aus Metall, Glas oder Kunststoff eingebaut, welche an der Aussenseite 2 und an der Innenseite 3 offen ist. Wird diese spiralförmige Fläche um ihre Längsachse 4 rotiert, so durchströmt das Kultursubstrat die gesamte Oberfläche der Spirale
1, indem die Flüssigkeit bei 2 einströmt und bei 3 die Spirale verlässt. Die Kulturflüssigkeit wird nur so hoch ion den Behälter eingefüllt, dass genügend Gasraum im Behälter zur Verfügung steht, um eine einwandfreie Begasung des Substrates zu gewährleisten.
Die Drehung der Spirale kann dadurch erfolgen, dass. der ganze Behälter von aussen rotiert wird, oder aber die Spirale ist auf eine Achse 4 montiert, welche von aussen durch eine sterile Abdichtung 5 in Rotation versetzt werden kann. Diese zweite Art des Antriebs der Spirale 1 hat insofern einen Vorteil, als die für die Zufuhr von Flüssigkeiten und Gasen vorgesehenen Anschlüsse 6 statisch sind, d. h. nicht mitrotieren. Die Spirale 1 kann auf ihren Seitenflächen offen sein, wobei allerdings eine weniger klare Geometrie der Flüssigkeitsströmung vorhanden ist, als wenn sie durch die beiden seitlichen Abschlussplatten 7 abgeschlossen ist.
Der Behälter hat unten geeignete, sterile Abflussöffnungen für die Entleerung und die Ernte 8. Für die Rotation sind verschiedene Geschwindigkeiten vorgesehen, d. h. eine langsame für die Animpfung und für die Gewebevermehrung und eine grössere für die Auswaschung und die Ernte. Der ganze Apparat ist so konstruiert, dass er entweder gesamthaft im Autoklaven sterilisiert werden kann (unter Abkupplung des Antriebes) oder aber so, dass er direkt durch innere oder äussere Beheizung sterilisiert wird. Für kleinere Einheiten kann der Behälter die Form eines liegenden Glaszylinders 9 haben, der vermittels der Zugstangen 10 und den beiden Deckeln 11 verschlossen ist. Die Achse 4 kann vorzugsweise auch als Hohlkörper ausgebildet sein und zwar so, dass die Heizung und Kühlung durch die eingebauten Röhren 12 erfolgt.
Wird nun der beschriebene Apparat z. B. mit Gewebezellen angeimpft und mit einer entsprechenden Kulturflüssigkeit gefüllt, so wachsen die Zellen auf der Spiraloberfläche, wenn diese nur ganz langsam rotiert wird. Die Zellen können anschliessend durch schnelle Rotation entfernt- oder aber direkt mit den zu züchtenden Viren angeimpft werden. Die Auswaschung erfolgt wie oben beschrieben, dh. durch Rotation allein, oder aber durch Zusatz eines geeigneten abrasiven Mittels.