CH559720A5 - - Google Patents

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CH559720A5
CH559720A5 CH1306768A CH1306768A CH559720A5 CH 559720 A5 CH559720 A5 CH 559720A5 CH 1306768 A CH1306768 A CH 1306768A CH 1306768 A CH1306768 A CH 1306768A CH 559720 A5 CH559720 A5 CH 559720A5
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M Brugger
B Kamber
B Riniker
P Sieber
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Description


  
 



   Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer hypocalcämisch wirksamer Peptide der Formel I
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 -Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr   -Ala-lle-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-Z,    worin Z für OH oder   NH    und R für Wasserstoff oder eine freie oder acylierte Aminogruppe steht, und entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginund Glutaminreste durch den Asparaginsäure- bzw. Glutaminsäurerest   undioder    der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, sowie Säureadditionssalze und Komplexe der genannten Peptide. Vorzugsweise steht Z für NH und R für Wasserstoff oder NHz.



   Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren wie Salzsäure, Essigsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Sulfonsäuren, wie Niederalkansulfonsäuren, Benzol- oder Toluolsulfonsäure zu nennen.



   Acylgruppen für die Acylierung der   N-Aminogruppe    sind die Reste von Carbonsäuren, wie aliphatischen, aromatischen, araliphatischen Carbonsäuren, insbesondere von niederen Alkansäuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäuren. von monocyclischen aromatischen Carbonsäuren wie unsubstituierter und substituierter Benzoesäure, von unsubstituierten und Arylsubstituierten Aryl-niederalkylcarbonsäuren wie Phenylessigsäure, von 5- bis 6gliedrigen heterocyclischen Säuren mit Stickstoff, Schwefel und/oder Sauerstoff als Heteroatomen, wie Pyridincarbonsäuren, Thiophencarbonsäuren, oder von Heterocyclyl-niederalkansäuren wie Pyridylessigsäure, Imidazolylessigsäure, worin die Substituenten der Ringe z.B. Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Niedercarbalkoxygruppen sind.

  Weiter sind als Acylreste vor allem Acylreste von Aminosäuren, besonders   -Aminosäuren,    wie z.B. der Pyroglutamylrest zu nennen, ferner Acylreste, die sich von Kohlensäure oder Thiokohlensäure bzw. ihren Estern oder Amiden ableiten, z.B. Niederalkyloxycarbonylgruppen wie Äthoxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, ferner unsubstituiertes und wie oben angegeben substituiertes Benzyloxycarbonyl. Carbamoyl und Thiocarbamoyl sowie N-substituiertes Carbamoyl und Thiocarbamoyl, z.B. N-Niederalkylcarbamovl, N-Phenyl-carbamoyl, N-Phenyl-thiocarbamoyl.



   Unter Komplexen sind die in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu langkettigen Peptiden entstehen und diesen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche Stoffe sind beispielsweise beschrieben für ACTH und andere adrenocorticotrop wirksame Peptide. Zu nennen sind z.B. anorganische Verbindungen, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze wie Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, ferner Alkalimetallpolyphosphate wie z.B.  Calgon N ,  Calgon 322 ,  Calgon 188  oder   .Polvron    B   12".    Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine. z.B.

  Polyoxygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen. vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z.B. Protamin oder Polyglutaminsäure.



   Die neuen Verbindungen, insbesondere die Verbindung der Formel 1, worin R und Z für   NR.    stehen weisen eine hypocalcämische Wirkung auf. Sie senken den Plasma- Calcium- und -Phosphatgehalt des Blutes von Säugetieren, wie durch Versuche an Wistar-Ratten nachgewiesen wurde. An perfundiertem isoliertem Katzen-Schienbein bewirken die Verbindungen eine verminderte Calcium-Resorption.



   Die Verbindungen senken auch am Menschen den Plasma Calciumspiegel des Blutes bei intravenöser Gabe von 0,01 bis 5 mg in 0,1-m. Acetatpuffer vom pH 4,6 und können dementsprechend bei Hypercalcämie verwendet werden. Ein besonderer Vorteil der Anwendung dieser Verbindungen besteht im Fehlen jeglicher antigener Wirkung.



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der Formel I und entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginund Glutaminreste durch den Asparaginsäure- bzw. Glutaminsäurerest und/oder der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, und ihrer Säureadditionssalze ist dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren, wobei   Prolin3    gegebenenfalls als Aminosäureamid und Cystein gegebenenfalls als Desaminosäure bzw. als N-acylierte Aminosäure vorliegen, bzw. deren aktivierte Derivate.



  unter intermediärem Schutz der von der Reaktion auszuschliessenden funktionellen Gruppen, unter Bildung der Peptid-Bindungen entsprechend miteinander kondensiert, wobei die beiden Mercaptogruppen im ersten Teil der Sequenz durch Oxydation zur Disulfidbrücke vereinigt werden.



   Die erhaltenen Verbindungen können in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe übergeführt werden.



   Bei der Synthese der Endprodukte wie auch aller benötigten Zwischenprodukte verwendet man als Schutzgruppen besonders die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten sowie einige neue Schutzgruppen in Betracht, die durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abgespalten werden können. So verwendet   man    z.B. als Schutzgruppen für Aminogruppen Acyl-, Aryl- oder Aralkylgruppen wie Formyl-, Acetyl-, Trifluoracetyl-, Benzoyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, Benzylsulfonyl-, Benzolsulfenyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, 2,4-Dinitrophenyl-, Benzyl- oder Triphenylmethylgruppen oder von der Kohlensäure oder Thiokohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls, z.B.



  wie oben für aromatische Reste angegeben, substituierte Carbobenzoxygruppen, z.B. Carbobenzoxy, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy oder p-Methoxycarbobenzoxy, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und   p-(p'- Methoxy-phenylazo)-    -benzyloxycarbonyl, aromatische Oxycarbonylgruppen wie Tolyloxycarbonyl, aliphatische Oxycarbonylgruppen wie Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl oder vor allem   tert.-Butloxycarbonyl,      aromatischaliphatische    Oxycarbonylgruppen wie 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolyl-isopropyloxycarbonyl und insbesondere 2-p-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl (vgl. schweiz. Patent Nr. 509 266) Carbamoyl, Thiocarbamoyl, N-Phenylcarbamoyl und -thiocarbamoyl.

 

   Carboxylgruppen werden beispielsweise durch Amidoder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt. Die Amid- und Hydrazidgruppen können gegebenenfalls substituiert sein, die Hydrazidgruppe z.B. durch die Carbobenzoxygruppe, die Tritylgruppe, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder die 2-p-Diphenylisopropyloxycarbonylgruppe. Zur Veresterung geeignet sind z.B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Äthanol, Cyanmethylalkohol oder insbesondere tert.-Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z.B. gegebenenfalls substituierte Benzylalkohole, wie p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol.



   Phenole und Thiophenole wie p-Nitrothiophenol, 2,4,5-Trichlorphenol, p-Nitrophenol, p-Cyanophenol, Pentachlorphenol oder p-Methansulfonylphenol, weiter z.B. N-Hydroxysuccinimid und N-Hydroxyphthalimid.  



   Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste können z.B. durch Verätherung,beispielsweise mit Ben   zylalkohol    oder vorzugsweise mit tert.-Butanol geschützt werden, sie brauchen aber nicht notwendig geschützt zu werden.



  Die Mercaptogruppen der Cysteinreste werden z.B. durch Acylgruppen wie den unsubstituierten oder wie oben erwähnt substituierten Carbobenzoxyrest oder vorzugsweise durch gegebenenfalls substituierte Arylmethylgruppen wie Benzyl, p-Nitrobenzyl, Diphenylmethyl oder Trityl geschützt.



  Die Iminogruppe des Histidins braucht nicht unbedingt geschützt zu werden, jedoch kann es vorteilhaft sein, sie zu schützen, z.B. durch den Tritylrest oder durch die in Ber.



  100 (1967), 3838 - 3849 beschriebenen   2,2,2-Trifluor-l-tert.-    -butyloxycarbonylamino-   oder - 1 - benzyloxycarbonylamino-    äthylgruppen.



   Diese Gruppen können auch zum Schutz der Hydroxylund Mercaptogruppen verwendet werden.



   Vorzugsweise verwendet man zum Schutz der Carboxylgruppe der Seitenkette und gegebenenfalls der terminalen Carboxylgruppe die tert.-Butylestergruppe, zum Schutz der Aminogruppe der Seitenkette die tert. Butyloxycarbonylgruppe. für die Hydroxylgruppen der Serin-, Threonin- und   Tyrosinreste.    sofern diese überhaupt geschützt werden, die tert.-Butyläthergruppe und, wenn erwünscht, zum Schutz der Iminogruppe des Histidins die   2,2,2-Trifluor- 1 -tert.-butyloxy-    carbonylaminoäthylgruppe. Alle diese Schutzgruppen können, wenn erwünscht, in einer Stufe durch saure Hydrolyse, z.B. mittels Trifluoressigsäure, abgespalten werden. Trityl zum Schutze der Mercaptogruppe kann mittels Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff. Benzyl mit Natrium in flüssigem Ammoniak entfernt werden.



   Die Oxydation der Mercaptoverbindungen zum Disulfid erfolgt z.B. mit 1,2-Dijodäthan. Wenn die Mercaptogruppen durch Trityl geschützt sind, erfolgt die Abspaltung der Tritylgruppen und Bildung der Disulfidbrücke vorzugsweise nach dem im Schweizer Patent Nr. 498 805 beschriebenen Verfahren, beispielsweise mit Jod in Methanol.



   Bei der Herstellung der Na-Acylderivate kann die Acylgruppe als x-Aminoschutzgruppe verwendet werden.



   Erfindungsgemäss werden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft, wobei gegebenenfalls auf einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird. Man arbeitet zweckmässig nach den für die Herstellung langkettiger Peptide, unter Berücksichtigung der Di   sulfid-Brücke.    geeigneten Verknüpfungsmethoden, wie sie aus der Literatur bekannt sind.



   Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt daher, z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter   x-Aminogruppe    und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit   freier a-Aminogruppe    und freier oder geschützter, z.B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter x-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter   x-Aminogruppe    umsetzt.

  Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in ein Säureazid-, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylester, p-Nitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccin   imidester.    N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester, N-Hydroxypiperidinester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N,N'-Carbonyl-diimidazols, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphitamid aktiviert werden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode.



   An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, wie oben erwähnt.



   Es wurde gefunden, dass es vorteilhaft ist, von einer Sequenz auszugehen, welche die ersten 10 N-terminalen Aminosäuren umfasst und mit diesem N-Terminus die gesamte restliche Sequenz zu kondensieren. Man kann aber auch die genannte N-terminale Sequenz mit dem Fragment bis zur 28.



  Aminosäure (Glycin) mit freier C-terminaler Carboxylgruppe verknüpfen und das Octacosapeptid mit dem Tetrapeptid der Aminosäuren 29-32 kondensieren. Diese Kondensation wird beispielsweise nach der Methode der gemischten Anhydride durchgeführt. Falls die Kondensation der Sequenz 1-10 mit der C-terminalen Sequenz 11-32 ausgeführt wird, verwendet man vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode nach Wünsch (Carbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid). Im folgenden wird die Herstellung des N-terminalen Decapeptids (1-10) näher erläutert.



   Es kann z.B. aus den Sequenzen 1-4 und 5-10 oder 1-5 und 6-10 oder 1-6 und 7-10 oder 1-7 und 8-10 aufgebaut werden, wie aus den Fig. 1-6 ersichtlich; man kann jedoch auch andere Bruchstücke zum Aufbau der Sequenz 1-10 verwenden.



  Als Schutzgruppe für   die a-Aminogruppe    am Cysteinl wird vorzugsweise die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder eine äquivalente, durch saure Hydrolyse abspaltbare Gruppe verwendet, oder wenn ein   Na-acyliertes    Dotriacontapeptid hergestellt werden soll, die entsprechende Acyl- z.B. Acetylgruppe. Daneben verwendet man zweckmässig als Mercaptoschutzgruppen solche, die selektiv gegenüber der durch saure Hydrolyse abspaltbaren   Na-Aminoschutzgruppe    (z.B. tert. Butyloxycarbonylgruppe) abgespalten werden können, z.B.



  die Benzyl- oder Tritylgruppe. Die terminale Carboxylgruppe des Decapeptids braucht nicht notwendig geschützt zu werden, z.B. nicht, wenn Kondensationen nach der Azid- oder Anhydridmethode ausgeführt werden. Man kann diese Gruppe aber auch durch Veresterung, wie oben angegeben, schützen, z.B. durch Veresterung mit Methanol (Abspaltung der Estergruppe mit verdünnter Natronlauge) oder mit Benzylalkohol oder Analogen (Abspaltung der Estergruppe z.B. mit Natrium in flüssigem Ammoniak). Der Schutz der Aminogruppen der Zwischenprodukte erfolgt mittels der üblichen Schutzgruppen, z.B. Carbobenzoxy, Trityl, tert.-Butyloxycarbonyl oder 2-para-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl. Die Carboxylgruppen der Zwischenprodukte werden, wenn erforderlich, in der üblichen Weise verestert. 

  Die Hydroxygruppen des Serin- und Threoninrestes können durch Verätherung, z.B. mit tert.-Butanol oder Äquivalenten geschützt werden.



   In den folgenden Figuren bedeutet: 1. die Azidmethode 2. die Methode der gemischten Anhydride 3. die Methode der aktivierten Ester, besonders p-Nitrophe nylester (ONP) oder Hydroxysuccinimidester (OSU) 4. die Carbodiimidmethode 5. die Methode nach Wünsch BOC tert.-Butyloxycarbonyl, DPC p-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl, Z Carbobenzoxy.



  TRI Trityl.



  Bzl Benzyl, OtBu tert.-Butylester,     OBzl    Benzylester, ONB p-Nitrobenzylester, OMe Methylester, tBu tert.-Butyläther, Ac Acetyl.



   Die p-Nitrobenzylester- und Benzylestergruppen werden in Methionin-haltigen Sequenzen mit Natrium in flüssigem Ammoniak, sonst durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiumkohle abgespalten, die Carbobenzoxygruppe ebenfalls durch Hydrogenolyse, die   N-Tritylgmppe    mit wässriger Essigsäure, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure, die   Diphenylisopropyloxycarbonylgruppe    mit wässeriger Essigsäure oder z. B. mit einem Gemisch von Eisessig, Ameisensäure (82,8%ig) und Wasser   (7:1:    2) wie im schweiz. Patent Nr. 509 266 beschrieben. Der p-Nitrobenzyloder Methylester kann mit Hydrazinhydrat in das Hydrazid übergeführt werden. Mit verdünnter Natronlauge wird die Methylestergruppe hydrolysiet. Der tert.-Butylester wird mit Trifluoressigsäure gespalten, ebenso der tert.-Butyläther.

  Die S-Tritylgruppen werden mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff entfernt, die S-Benzylgruppe mit Natrium in flüssigem Ammoniak, wobei gegebenenfalls vorhandene Benzyl oder p-Nitrobenzylestergruppen gleichzeitig abgespalten werden. Der Ringschluss zum Disulfid erfolgt   zB.    durch Oxydation mit   1,2-Dijodäthan,    derjenige der   S-Trityl-geschützten    Verbindungen mit Jod in Methanol.



   Die mit der N-terminalen Sequenz zu verbindende C-terminale Sequenz umfassend die 11. bis 32. bzw. 11. bis 28.



  Aminosäure wird beispielsweise aus den Sequenzen 11-16, 17-20, 21-28 und 29-32 zusammengesetzt, wie Fig. 7 zeigt.



   In diesem Schema sind die Hydroxylgruppen der Threoninreste und des Tyrosinrestes geschützt, dies ist nicht unbedingt erforderlich. Es können auch andere Teilsequenzen miteinander vereinigt und andere Schutzgruppen verwendet werden.



   Fig. 8 zeigt den Aufbau des Hexapeptids (in Form des Hydrazids) der Aminosäuren 11-16. Es kann nach der Azidmethode mit der Sequenz 17-28 oder 17-32 verknüpft werden
Die Sequenz 17-28 kann nach der Azidmethode aus den Fragmenten 17-20 und 21-28 aufgebaut werden.



   Fig. 9 zeigt die Synthese des Tetrapeptidhydrazids der Aminosäuren 17-20, Fig. 10 den Aufbau des Octapeptids 2128. Nach der Verknüpfung der beiden Sequenzen wird die   Z-Aminoschutzgruppe    abgespalten (die Carbobenzoxygruppe durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiumkohle) und das so erhaltene Dodecapeptid mit geschützten Seitenketten nach der Azidmethode mit dem Hexapeptidhydrazid 11-16 (Fig. 8) kondensiert.



   Die so erhaltene Sequenz 11-28 kann mit dem Tetrapeptidamid der Aminosäuren 29-32, dessen Herstellung Fig. 11 zeigt, verbunden werden, z.B. nach der Methode von Wünsch. Man erhält dann das geschützte Docosapeptidamid 11-32. Aus diesem kann man die   sc-Aminoschutzgruppe    abspalten [Carbobenzoxy z.B. hydrogenolytisch, DPC mit 90%iger Essigsäure oder Eisessig-Ameisensäure   (82,8%ig)-Wasser      (7:1:    2)] und die so erhaltene Verbindung mit freier a-Aminogruppe nach Entfernung der Essigsäure mit dem N-terminalen Decapeptid (Fig. 1-6) verknüpfen, beispielsweise nach der Methode der gemischten Anhydride oder nach Wünsch.



   Man kann aber auch die Sequenz 11-28 mit freier C-terminaler Carboxylgruppe nach Abspaltung der   sc-Aminoschutz-    gruppe in der genannten Weise, mit dem N-terminalen Decapeptid nach der Methode der gemischten Anhydride verknüpfen und das so erhaltene Produkt mit dem Tetrapeptidamid 29-32 kondensieren, zB. nach Wünsch.



   Aus dem geschützten Dotriacontapeptidarnid werden die Schutzgruppen abgespalten, beispielsweise mit Trifluoressigsäure, oder mit konzentrierter Salzsäure.



   Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise dis Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzug mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure.



  Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure,   4Aminobenzoesäure.    4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.



   Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterialien.



   Die Erfindung wird im folgenden Beispiel beschrieben.



  Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.



   In der   Dünnschichtchromatographie    werden die folgenden Systeme verwendet: System 43 C : tert. Amylalkohol-Isopropanol-Wasser    (51: 21: 28)    System 45 : sec.   Butanol-3%iges    wässeriges Ammoniak  (70: 30) System   52    : n-Butanol-Eisessig-Wasser   (75: 7,5: 21)    System 70 : Äthylacetat-Pyridin-Wasser   (40: 20: 40)    System 79 : n-Butanol-Pyridin-Wasser   (34: 33 : 33)    System 101 A :   n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser       (42: 24: 4:

   30)        Fig. 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly   
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  Das Trifluoracetat des freigesetzten Dotriakontapeptidamides wird sodann durch Zufügen von 60 ml absolutem und peroxidfreiem   Ather    als amorphes Pulver ausgefällt, abzentrifugiert, in 10 ml frischem Äther suspendiert, nochmals zentrifugiert, und der Rückstand bei   30     getrocknet. Zur Umwandlung in das Acetat löst man das Trifluoracetat in 3 ml Wasser und filtriert durch eine mit 0,02-n. Essigsäure äquilibrierte Säule von schwach basischem Ionenaustauscher (z.B. Merck Nr. II; = 7,5 mm; 1 = 20 cm). Man wäscht mit 0,02-n. Essigsäure bis zur Folin-negativen Reaktion, konzentriert das Eluat auf ein Volumen von ca. 5 ml und filtriert es durch eine Säule von Bio-Gel P 6, äquilibriert in   0,1-n.    Essigsäure (Volumen des   Gelbettes    = 200 ml).

  Das Eluat wird dünnschichtchromatographisch analysiert (Alox, System 52). Die Hauptfraktionen (Maximum bei ca. 100 - 120 ml) werden vereinigt, im Rotationsverdampfer (Innentemperatur nicht über   20 )    zur Trockne eingeengt, in 5 ml Wasser wieder gelöst und lyophilisiert. Das so erhaltene Produkt wird zur endgültigen Reinigung einer Craig Verteilung über 500 Stufen im Lösungsmittelsystem n-Butanol-Eisessig-Wasser   (4:1:    5, Vol.) mit Phasenvolumina von je 3 ml unterworfen. Aus den Verteilungselementen Nr. 141180 (Max. bei Nr. 162; K = 0,48) isoliert man beim Einengen zur Trockne (Rotationsverdampfer, Innentemperatur höchstens   20 ),    Lösen in 0,1-n. Essigsäure und Lyophilisieren das chromatographisch und elektrophoretisch einheitliche   Dotriakontapeptidamid    als weisses, amorphes Pulver.



  In der Dünnschichtchromatographie weist es folgende Rf Werte auf: auf  Alox  D-O (Fa Camag; Rf (52) = 0,56
Aluminiumoxid mit 8% Gips) Rf (79) = 0,66
Rf (45) = 0,45 auf Cellulose    Selecta     1440 Rf (45) = 0,51  (der Fa. Schleicher und Schuell, Fertig platten) Rf (101A) = 0,60 Elektrophorese auf Cellulose    Selecta     1440 pH 1,9,   1/2    Stunden, 280 V:
Laufstrecke = 3,5 cm zur Kathode.

 

  Das Ausggangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1. Z-Asn-Leu-OMe
16,7 g H-Leu-OMe und 46,0 g Z-Asn-ONP werden in 100 ml frisch destilliertem   Dimethylformamid    gelöst. Die Lösung wird 19 Stunden bei   25     stehen gelassen. Hierauf gibt man 1,2 Liter Wasser zu und nutscht die kristalline Fällung ab. Das Dipeptidderivat wird bei   40     im Vakuum getrocknet und dann zweimal aus Methanol-Wasser umkristallisiert.



  F.   180-181";      [D20    = +90 (c = 2,05 in Chloroform).



  2. H-Asn-Leu-OMe
15,0 g Z-Asn--Leu-OMe werden in 400 ml t-Butanol-Wasser (9: 1) gelöst und in Gegenwart von 2 g Palladium-Kohle (10% Pd) hydriert. Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht und bei 400 eingedampft. Der Rückstand wird direkt weiter verwendet.  



  3. Z-Gly-Asn-Leu-OMe
4,4 mMol H-Asn-Leu-OMe werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst und dann 5,5 mMol Z-Gly-p-Nitrophenylester zugegeben. Die klare, gelbe Lösung wird 18 Stunden bei   27     belassen. Dann wird im Hochvakuum bei   40     eingedampft, getrocknet und der Rückstand mit Essigester versetzt, wobei er kristallisiert. Nach 1 Stunde bei   0     wird abgenutscht und getrocknet. Dann wird das Produkt nochmals in 25 ml Essigester suspendiert, zerrieben, abgenutscht und getrocknet; F.   1540.   



  4. H-Gly-Asn-Leu-OMe
1,3 g Z-Gly-Asn-Leu-OMe werden unter Erwärmen in 100 ml Methanol gelöst und die auf Raumtemperatur abgekühlte Lösung wird in Gegenwart von 0,3 g Palladiumkohle (10% Pd) hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird vom Katalysator abgenutscht und zur Trockne verdampft. Dabei werden 760-mg H-Gly-Asn-Leu-OMe in amorpher Form erhalten.



  5. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe
710 mg H-Gly-Asn-Leu-OMe und 1,36   g-BOC-Cys(TRI)-    -OH werden in 12 ml Acetonitril gelöst und die auf   0     gekühlte Lösung wird mit 820 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 30 Minuten bei   0     und 60 Stunden bei   28     wird vom Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit Petroläther versetzt, zerrieben, die Petrolätherlösung abgegossen und das unlösliche Produkt in Essigester aufgenommen. Die Essigesterlösung wird bei   0     mit verdünnter Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als farbloses Harz erhaltene Tetrapeptidderivat wird zur Reinigung mehrmals aus Aceton-Äther gefällt.

  Ausbeute: 1,2 g Pulver, das nach Dünnschichtchromatographie an Silicagel einheitlich ist; Rf = 0,39 im System Chloroform-Methanol   (9:1).   



  6.   BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NHNH,   
988 mg   BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe    werden in 20 ml Methanol gelöst und zu der auf   0     gekühlten Lösung werden 2 ml Hydrazinhydrat zugegeben. Nach 14 Stunden bei   2"    werden 200 ml eiskalte 0,5-n. Essigsäure zugegeben, die abgeschiedene Fällung wird gründlich zerrieben, abgenutscht, mit Eiswasser neutral gewaschen und im Vakuumexsikkator über Nacht getrocknet. Das rohe BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn -Leu-hydrazid wird durch 2maliges Umfällen aus Methanol Wasser gereinigt. Bei Dünnschichtchromatographie aus Silicagelplatten ist Rf = 0,2 im System Chloroform-Methanol (9:1).



  7. BOC-Met-Leu-Gly-OMe
5 g Z-Leu-Gly-OMe [J. am. chem. Soc. 78, 2126 (1956)] werden in 200 ml Methanol gelöst u. die auf   0     gekühlte Lösung wird in Gegenwart von 1 g Palladiumkohle (10% Pd) unter intensivem Rühren bei   0     hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht, und das Filtrat im Vakuum bei 250 Badtemperatur eingedampft. Der ölige Rückstand wird ohne Trocknung mit 4 g BOC-Methionin versetzt und das Gemisch in 100 ml Acetonitril gelöst. Dann wird im Vakuum auf ein Volumen von 60 ml eingeengt, auf   0     gekühlt und es werden 4,5 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach Entgasen mit Stickstoff wird 30 Minuten bei   0     und 18 Stunden bei   25     belassen.

  Dann wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit Petrol äther unter Zerreiben gewaschen, die Petrolätherlösung abgegossen und das unlösliche Produkt getrocknet. Dann wird es in Essigester gelöst und die Lösung mit verdünnter Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.



  Der Rückstand wird zur Reinigung in der minimalen Menge peroxydfreiem Aceton gelöst und durch Zugabe von peroxydfreiem Äther gefällt; dabei wird das Tripeptidderivat BOC -Met-Leu-Gly-OME als festes Pulver erhalten.



  8. H-Met-Leu-Gly-OMe
3 g des unter 7) erhaltenen   Tripeptidderivates    werden mit 60 ml 0,4-n. HCL in Essigester versetzt und das Reaktions Gemisch wird 90 Minuten bei   25     belassen. Dann wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand (H-Met-Leu-OMe -Hydrochlorid) 24 Stunden bei 0,01 Tor über Ätznatron getrocknet.



  9. TRI-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe
1,23 g H-Met-Leu-Gly-OMe, HCI und 1,43   TRI-Cys(TRI)-    -OH werden mit 15 ml Acetonitril und 300 mg N-Methylmorpholin versetzt. Nach Abkühlen auf   0     wird 800 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei   0     und 45 Stunden bei   30     unter Stickstoff ge   gerührt.    Dann wird abfiltriert, das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Petroläther zerrieben. Die Petroläther-Lösung wird abgegossen, der Rückstand getrocknet und in Essigester gelöst. Die Essigesterlösung wird bei   0     mit Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.

  Zur Reinigung wird das Rohprodukt (schwach gelbliches Harz) in möglichst wenig Methanol gelöst und die Lösung an einer in Methanol bereiteten Säule von Sephadex LH-20 (2,5 + 90 cm) chromatographiert. Es werden Fraktionen à 4 ml aufgefangen, einzeln eingedampft und ihre Reinheit mittels Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten im System Chloroform-Methanol   (99:1)    kontrolliert.



  10. H-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe
1,11 g des unter 9) erhaltenen Tetrapeptidderivates werden gelöst in 15 ml 75%iger Essigsäure und 1 Stunde bei 300 belassen. Dann wird im Hochvakuum zurTrockne eingedampft und der Rückstand mit peroxydfreiem Äther zerrieben. Das dabei erhaltene feste Pulver (essigsaures Salz von   H-Cys(TRI)-    -Met-Leu-Gly-OMe) wird abgenutscht, mit Äther gewaschen und getrocknet, Ausbeute: 695 mg.



  11. H-Thr(tBu)-OMe
12,92 g (40 mMol) Z-Thr(tBu)-OMe werden in 200   ml    Eisessig und 3 g Pd-Kohle (10%) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach einer Stunde beendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei   35     eingedampft Nach dem Trocknen am Hochvakuum bei   35     resultieren 7,3 g eines Öls, das gemäss Dünnschichtchromatogramm einheitlich ist und direkt weiter verwendet wird.

 

  12.   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OMe   
19,3 g (38,6 mMol) DPC-Ser(tBu)-OH, Cyclohexylaminsalz werden in 500 ml Chloroform aufgenommen und bei   0     dreimal mit 25 ml   l-n.    Zitronensäure und fünfmal mit 40 ml halbgesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird eingedampft und der erhaltene Schaum in 250 ml Essigester aufgenommen.



  Man gibt 5,36 ml (38,6 mMol) Triäthylamin zu, kühlt die Lösung   auf - 100    ab und versetzt unter Rühren mit 5,13 ml (38,6 mMol) Isobutylchlorocarbonat. Es wird 10 Minuten   bei -10"    gerührt und dann die   auf 120    gekühle Lösung von 7,3 g (38,6 mMol) H-Thr(tBu)-OMe in 100 ml Essigester so zugetropft, dass die Reaktionstemperatur - 100 nie über  steigt. Nach beendetem Eintragen wird noch eine Stunde bei   - 100    gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Lösung wird vom ausgeschiedenen Tri äthylamin-Hydrochlorid abfiltriert und bei   0     dreimal mit je 20 ml   1 -n.    Zitronensäure und fünfmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Rohprodukt   (Öl):    22,07 g.

  Zur Reinigung wird 1 g an einer Silicagelsäule (2,5 cm, 30 cm) chromatographiert. Mit Petroläther Essigester   (1:1)    werden nach einem Vorlauf von 110 ml 787 mg reines Produkt eluiert. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton (7: 3) ist Rf = 0,51.



  13.   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH,   
4,253 g (7,4 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OMe in 18 ml Methanol werden mit 5,55 ml (ca. 110 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und 10 Stunden bei Zimmertemperatur und 2 Stunden bei   40     stehen gelassen. Die Reaktionslösung wird in 450 ml Essigester aufgenommen und viermal mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird auf ca. 15 ml eingeengt und    mit ca. 5 ml Petroläther versetzt. l Über Nacht kristallisieren    3,17 g des Hydrazids vom F. 132-1340 aus. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton (7: 3) ist Rf = 0,40.



  14. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe
900 mg DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NHNH2 in 12 ml Dimethylformamid werden   bei 200    mit 2,0 ml 2,0-n. HCI in Essigester und dann mit 210 mg t-Butylnitrit versetzt. Nach 15 Minuten   bei -100      lasst    man die   auf -10"    gekühlte Lösung von 680 mg des essigsauren Salzes von H-Cys(TRI)-Met -Leu-Gly-OMe in 9 ml Dimethylformamid zutropfen und gibt dann noch 350 mg N-Methylmorpholin zu. Die Reaktionstemperatur soll bei diesen   Zugaben 5    nicht überschreiten.



  Dann rührt man 1 Stunde   bei -5"    und 18 Stunden bei   25".   



  Hierauf dampft man im Vakuum und dann im Hochvakuum auf ein kleines Volumen ein und fällt das Rohprodukt durch Zugabe von Eiswasser aus. Das Produkt wird gründlich zerrieben, die wässerige Lösung abgegossen und das unlösliche Hexapeptidderivat getrocknet. Zur Reinigung wird es je zweimal aus Methanollösung durch Zugabe von Wasser und dann aus Essigesterlösung durch Zugabe von Petroläther ausgefällt. Man erhält 480 mg   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-    -Met-Leu-Gly-OMe.



  15. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH
2.3 g des nach 14) hergestellten Hexapeptidderivates werden in 100 ml Dioxan-Wasser   (4:1)    gelöst und 5 ml   l-n.    Natronlauge zugegeben. Nach 90 Minuten bei   27     wird die überschüssige Natronlauge durch Zugabe von etwas festem Kohlendioxyd abgestumpft, die Lösung im Vakuum auf ein Volumen von etwa 10 ml eingeengt und hierauf 80 ml eiskalte, 2%ige wässerige Zitronensäurelösung zugegeben, das ausgefallene Hexapeptidderivat und gründlich zerrieben, abgenutscht und, mit mehreren Portionen Eiswasser gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.



  16. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH  (essigsaures Salz)
870 mg des unter 15) erhaltenen   Hexapeptidderivates    werden in 15 ml 80%iger Essigsäure gelöst, und die Lösung wird 6 Stunden bei   30     belassen, Hierauf wird im Hochvakuum bei   30     zur Trockne eingedampft, der Rückstand 1 Stunde bei   30     getrocknet und dann mit peroxidfreiem Äther versetzt und das entstandene Pulver gründlich zerrieben. Es wird abgenutscht, mit viel Äther nachgewaschen und getrocknet.



  17.   BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-CysfTRI)-     -Met-Leu-Gly-OH
1,0 g   BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NHNH2    wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst und die   auf - 100    gekühlte Lösung unter Rühren mit 1,5 ml 2,0-n. HC1 in Essigester und 143 mg t-Butylnitrit versetzt, Nach 15 Minuten   bei 100    werden weitere 10 ml   auf - 100    gekühltes Dimethylformamid, 1,0 g fein gepulvertes   H-Ser(tBu) -Thr(tBu)-Cys(TRI) -Met-Leu-Gly-    -OH (essigsaures Salz) und 400 mg N-Methylmorpholin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird unter Stickstoff 1 Stunde   bei -10"    und 48 Stunden bei   28     gerührt.

  Hierauf wird am Hochvakuum auf ein Volumen von ca. 6 ml eingeengt und das Decapeptidderivat durch Zugabe von 100 ml Eiswasser gefällt. Der entstandene Niederschlag wird zerrieben, abgenutscht und im Vakuumexsikkator über Ätznatron getrocknet.



  Zur Reinigung wird das Produkt je zweimal aus Methanollösung durch Zugabe von peroxydfreiem Äther und zweimal durch Fällen aus Methanol-Wasser gereinigt. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelplatte Rf 43c = 0,48; Rf in Chloroform-Methanol (= 85: 15 = 0,35).
EMI15.1     




   -Gly-OH
300 mg   BOC-CysCflLI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-      -CysCURI)-Met-Leu-Gly-OH    werden in 100 ml Methanol gelöst und im Verlauf   von 1    Stunde zu einer intensiv gerührten Lösung von 400 mg Jod in 120 ml Methanol getropft. Nach beendeter Zugabe rührt man 45 Minuten weiter und entfärbt dann die auf   0     gekühlte Lösung mit   1 -n.    wässriger Natriumthiosulfatlösung. Dann engt man im Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 10 ml ein und fällt das Decapeptidderivat durch Zugabe von 100 ml eiskalter,   I Siger    wässriger Essigsäurelösung aus. Nach Zerreiben, Abnutschen und Waschen mit Eiswasser trocknet man das Produkt im Exsikkator über Ätznatron.

  Das Produkt wird zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10: 3 :   5 : 4) unterworfen    (Puffer: 29 ml Eisessig, 19 g Ammoniumacetat, mit Wasser auf 1 Liter aufgefällt); die das reine Decapeptidderivat enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und die Lösung wird eingedampft.



  Zur Entfernung von Ammoniumacetat wird das Produkt in Chloroform gelöst und die Lösung 3mal mit verdünnter Zitronensäurelösung und 3mal mit Waser gewaschen und dann zur Trockne eingedampft.



  19. Z-Asp(OtBu)-Phe-OCH,
3,0 g Phenylalaninmethylester-hydrochlorid werden zusammen mit 6,17 g Z-Asp(OtBu)-ONP in 25 ml absolutem N,N-Dimethylformamid zu einer klaren Lösung gelöst und unter Rühren mit 1,93   ml    Triäthylamin versetzt. Die tiefgelbe Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann in viel Essigester aufgenommen und dreimal mit verdünnter wässriger Zitronensäurelösung, fünfmal mit verdünnter wässriger Sodalösung und zuletzt mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung gewaschen so lange, bis die Waschflüssigkeit neutral bleibt Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und das entstandene äther- und   chloroformlösliche      Öl    durch Säulenchromatographie an Silicagel (die Substanz wird mit Toluol und Toluol/Äther   4:1    eluiert) gereinigt; 

   man erhält ein farbloses, öliges Produkt.



   An Silicagel ist der Rf-Wert in Chloroform-Methanol (9: 1) 0,75; in Chloroform-Aceton   (1:1)    0,67.



  20.   H-Asp(OtBu)-Phe-OCHs,    HCl
770 mg des Dipeptides Z-Asp(OtBu)-Phe-OMe werden in 200 ml Methanol gelöst und unter Zusatz von 0,60 ml Chlorwasserstoff in Dioxan (3,0-N, 1,8 mMol) und 200 mg Palla  diumkohle-Katalysator (10%) mit Wasserstoff in der Schüttelente bei Raumtemperatur decarbobenzoxyliert. Nach Beendigung der sehr schnellen Wasserstoffaufnahme wird filtriert, eingedampft, in Essigester von etwas Unlöslichem abfiltriert und mit Äther gefällt.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Chloroform-Methanol   (9:1)    ist Rf = 0,62; Rf 43C = 0,63.



  21.   Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH,   
550 mg H-Asp(OtBu)-Phe-OCH3,   HC1    werden zusammen mit 574 mg Z-Gln-ONP in 2,5 ml absolutem N,N-Dimethylformamid gelöst und mit 0,20 ml Triäthylamin .während 15 Stunden bei   30-33     Badtemperatur gerührt. Anschliessend wird in viel Essigester wie unter 19. beschrieben ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft.



  22.   H-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCHs,    HCI
4,4 g Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3 werden in 300 ml Methanol nach Zugabe von 2,4 ml Chlorwasserstoff in Dioxan (3,0 N, 7,2 mMol) und 900 mg 10%igem Palladiumkohle-Katalysator mit Wasserstoff bei Raumtemperatur in der Schüttelente decarbobenzoxyliert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird filtriert und am Vakuum zur Trockene eingedampft. Der gelbliche, feste Rückstand wird zweimal mit Äther verrieben und ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe verwendet.



  23.   Z-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3   
3,68 g Z-Thr(tBu)-OH, Dicyclohexylammoniumsalz werden in Essigester dreimal mit verdünnter wässriger Zitronensäurelösung und dreimal mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung geschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das daraus resultierende, wasserklare   o1    wird mit 3,34 g   H-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCHs,      HC1    in 40 ml Methylenchlorid gerührt, 0,9 ml Triäthylamin beigefügt und die Lösung von 1,54 g Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Methylenchlorid zugetropft. Man wäscht nach mit 10 ml Methylenchlorid und rührt die Suspension bei Raumtemperatur 14 Stunden.

  Dann stellt man 2 Stunden in den Kühlschrank, filtriert vom festen Niederschlag ab, den man mit wenig Methylenchlorid wäscht und schüttelt das Filtrat in viel Essigester wie bei 19. beschrieben aus. Der amorphe Eindampfrückstand wird mit Äther-Hexan   (1:1)    verrieben und getrocknet.



  24.   H-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH5   
4,3 g   Z-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3    werden in 300 ml Methanol mit 1 g   10%igem    Palladium-Kohle-Katalysator wie üblich hydriert, nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme filtriert und eingedampft. Der Eindampfrückstand, ein fester, farbloser Schaum, wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt.



  25.   Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH5   
Aus 3,5 g Z-Tyr(tBu)-OH, Dicyclohexylammoniumsalz wird in Essigester wie unter 23. beschrieben mit Zitronensäure die Säure freigesetzt und das erhaltene, klare   öl    mit 3,29 g   H-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH,    in 80 ml Acetonitril gerührt. Dazu gibt man 1,31 g Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form und rührt 24 Stunden bei Zimmertemperatur.



  Nun wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, dieser mit etwas Acetonitril gewaschen, und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in viel Chloroform gelöst und ausgeschüttelt und zwar dreimal mit verdünnter wässriger Zitronensäurelösung, dreimal mit verdünnter wässriger Sodalösung und viermal mit gesättigter Kochsalzlösung. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und der Rückstand in Methanol-Essigester   (1:    8) gelöst und mit Petroläther in der Kälte gefällt. Die Fällung wird wiederholt. Das geschützte Pentapeptid resultiert als feinkörniges, amorphes Pulver.



  26.   H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCHI   
4,0 g   Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCHS    werden in 100 ml absolutem vorhydriertem N,N-Dimethylformamid unter Zusatz von 1,4 g 10%iger Palladium-Kohle bei Zimmertemperatur mit Wasserstoff decarbobenzoxyliert.



  Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird mit 400 ml Methanol verdünnt, filtriert und im Vakuum eingedampft.



  Der farblose, feste Rückstand wird ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe verwendet.



  27.   Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCHs   
Aus 2,85 g Z-Thr(tBu)-OH, Dicyclohexylammoniumsalz wird in Essigester wie unter 23. beschrieben mittels Zitronensäure die Säure freigesetzt, und das erhaltene Öl von Z-Thr (tBu)-OH mit 3,33 g   H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-    -Phe-OCH3 in 80 ml Acetonitril bei Zimmertemperatur gerührt. Dazu werden in fester Form 1,20 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben und es wird 23 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abfiltrieren des ausgefallenen Dicyclohexylharnstoffes, den man mit drei Portionen à 7 ml Acetonitril wäscht, wird am Vakuum eingedampft und der Rückstand dreimal aus Essigester/Alkohollösung mit Petroläther gefällt.



  28. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe  -NHNH2
1,3 g   Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu) -Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-    -OCH3 werden in 30 ml Methanol gelöst und bei   0     mit 0,6 ml Hydrazinhydrat versetzt. Man belässt drei Tage im Kühlschrank, wobei ein gallertiger Niederschlag ausfällt. Diesen verfestigt man durch Zugabe von Äther, filtriert und kristallisiert den Rückstand aus Äthanol/Äther um.



  29. Z-Lys(BOC)-Phe-OMe
25,0 g Z-Lys(BOC)-ONP und 10,7 g H-Phe-OMe,   HC1    in 70 ml Dimethylformamid werden unter Rühren bei Raumtemperatur mit 6,9 ml Triäthylamin versetzt und noch 18 Stunden gerührt. Nach Verdünnen mit Essigester wird mit Kaliumcarbonatlösung Nitrophenol-frei gewaschen, mit   0,1-m.   



  Zitronensäure und Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Aus Essigester-Hexan kristallisiert das geschützte Dipeptid vom F.   78-80 .   



   Rf = 0,45 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel im System Chloroform-Aceton   (8 : 2).   



  30. Z-Lys(BOC)-Phe-NH-NH2
27 g des obigen Dipeptidmethylesters werden in 135 ml warmem Methanol gelöst, bei Raumtemperatur mit 25 ml Hydrazinhydrat versetzt und 16 Stunden stehen gelassen. Das Kristallisat wird mit 135 ml Wasser versetzt, abgenutscht und gut mit Wasser gewaschen. F.   173-1740    nach Umkristallisieren aus Methanol-Wasser. Rf = 0,3 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel im System Chloroform-Methanol (95 : 5).

 

  31. Z-Lys(BOC)-Phe-His-OMe
5,4 g Z-Lys(BOC)-Phe-NH-NH2 in 40 ml Dimethylformamid werden   bei -16"    mit 6,8 ml 3,66-n.   HC1    in Dioxan und dann mit 1,5 ml t-Butylnitrit versetzt Nach 10 Minuten bei   - 100      bis - 150    werden 3,5 ml Triäthylamin zugegeben.



  3,64 g H-His-OMe, 2   HC1    werden fest zugesetzt, anschliessend 4,2 ml Triäthylamin zugetropft. Man lässt innert 1 Stunde auf   0     erwärmen, wobei durch Zugabe von insgesamt 0,8 ml Triäthylamin ein pH von ca. 7 eingestellt wird. Nach Rüh  ren über Nacht bei   0     wird in 250ml Wasser gegossen und das schmierige Produkt durch Zerreiben mit Wasser pulvrig gewonnen. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol   (9:1)    ist Rf = 0,4).



  32.   H-Lys(BOC)-Phe-His-OMe   
6,8 g Z-Lys(BOC)-Phe-His-OMe in 140 ml Methanol werden in Gegenwart von 1 g 10%iger Pd-Kohle hydriert. Nach beendigter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eigedampft und der Rückstand sofort weiterverarbeitet.



  33. Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-OMe
Der unter 32. erhaltene Tripeptidmethylester (5,4 g) und 4.5 g Z-Asn-ONP werden in 20 ml Dimethylformamid 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Zugabe von Äther-Hexan wird das Peptidderivat ausgefällt, abfiltriert und mit Äther Nitrophenol frei gewaschen. Gereinigt wird durch Umfällen aus Dimethylformamid-Ather. Das Produkt ist dünnschichtchromatographisch einheitlich.



  34.   ZAsn-Lys(BOC)-Phe-His-NH-NH2   
3,97 g Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-OMe werden in 20 ml siedendem Methanol gelöst. Zu der noch etwa 300 warmen Lösung werden 2,5 ml Hydrazinhydrat zugesetzt und es wird während 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.



  Durch Zugabe von Wasser wird das Peptidhydrazid ausgefällt, abfiltriert und mit Wasser Hydrazin frei gewaschen.



  Das Produkt wird aus Dimethylformamid-Wasser umgefällt.



  35. Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH
4 g Z-Phe-Pro-OH werden in Methanol-Wasser   (4:1)    gelöst und in Gegenwart von Palladiumkohle (10% Pd) hydriert.



  Nach beendeter Wasserstoffaufnahme wird vom Katalysator abgenutscht, das Filtrat zur Trockne eingedampft und der Rückstand (H-Phe-Pro-OH) getrocknet. Er wird mit 1,1 g N-Methylmorpholin und soviel Wasser versetzt, dass das Produkt eben in Lösung geht. Die Lösung wird mit Dimethylformamid soweit verdünnt, dass eine klare Lösung verbleibt, dann   auf -5"    gekühlt. Hierzu gibt man die Lösung des gemischten Anhydrides von Z-Thr(tBu)-OH, die wie folgt bereitet wird:
3,6 g Z-Thr(tBu)-OH werden in 40 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst, 1,8 ml absolutes Triäthylamin zugegeben und die   auf - 100    gekühlte Lösung mit 1,7 g Chlorkohlensäure-isobutylester versetzt.

  Nach 5 Minuten   bei -100    wird ungeachtet des ausgeschiedenen   Triäthylarninhydrochlorids    das gesamte Reaktionsgemisch zu der obigen Dipeptidlösung gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde   bei -5"    und 18 Stunden bei   5     belassen. Dann wird vom Ungelösten abfiltriert, das Eluat im Vakuum vom Tetrahydrofuran und im Hochvakuum vom Dimethylformamid befreit und der Rückstand mit Natriumbicarbonatlösung versetzt. Die unlöslichen Anteile werden durch Waschen mit Äther entfernt, die wässrige Phase mit Essigester überschichtet und angesäuert. Das Tripeptidderivat wird mit Essigester ausgetragen und die Essigesterlösung mit Wasser neutral gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen wird   Z-Thr(tBu)-Phe-    -Pro-OH als farbloses harzortiges Produkt erhalten.

  Zur Reinigung wird es mehrmals aus Benzol-Petroläther umgefällt.



  36. Z-lle-Gly-OMe
2,23 g Z-Ile-OH-dicyclohexylammoniumsalz werden in Essigester suspendiert und mit 0,2-m. Zitronensäure angesäuert. Die erhaltene Essigester-Lösung wird neutral gewaschen, getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 15 ml Acetonitril gelöst, zu der Lösung werden 750 mg H-Gly-OMe, HCI zugegeben und bei   0     unter Rühren 0,84 ml Triäthylamin. Nach 10 Minuten gibt man 1,24 g Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt über Nacht bei   0".   



  Die Fällung wird abfiltriert und das Filtrat wird zur Trokkene eingedampft, der Rückstand in 30 ml Essigester aufgenommen und filtriert. Die Essigesterlösung wird mit 0,2-m.



  Zitronensäure und gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum auf etwa 10 ml eingeengt. Nach Zugabe von 25 ml Hexan kristallisiert das geschützte Dipeptid aus, F. 120-1220. Rf = 0,53 im System Chloroform-Methanol (95: 5) im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel.



  37. H-lle-Gly-OMe
3,36 g Z-Ile-Gly-OMe werden in 100 ml Methanol und 10 ml   l-n.    Salzsäure gelöst und in Gegenwart von 0,5 g Pd Kohle   (10%)    hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel vollständig verdampft. Der erhaltene Schaum ist im Dünnschichtchromatogramm aus Silicagel einheitlich; Rf = 0,26 in Chloroform-Methanol (95: 5).



  38. Z-Ala-lle-Gly-OMe
2,39 g des obigen Dipeptidester-hydrochlorids und 3,78 g Z-Ala-OPN in 40 ml Dimethylformamid werden unter Rühren mit 1,4 ml Triäthylamin versetzt und die entstandene Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdünnen mit Essigester wird mit verdünnter Kaliumcarbonatlösung Nitrophenol-frei gewaschen, anschliessend noch mit 0,1-m. Zitronensäure und Wasser gewaschen. Ein Teil des Tripeptidderivats bleibt während des Ausschüttelns ungelöst, es wird abfiltriert. Die Essigesterlösung wird nach dem Trocknen vollständig eingedampft. Der Rückstand besteht ebenfalls aus reinem Produkt. F.   190-191",    Rf = 0,5 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel im System Chloroform-Metha   nol(95:5).   



  39. H-Ala-lle-Gly-OMe
2,0 g   Z-Ala-ile-Gly-OMe    werden in 40 ml Methanol unter schwachem Erwärmen gelöst, dann in Gegenwart von 300 mg Pd-Kohle (10%) hydriert. Nach beendigter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat vollständig zur Trockene eingedampft. Der im Dünnschichtchromatogramm einheitliche Rückstand wird sofort weiterverarbeitet.



  40.   Z- Thr(tBu)-A la-lle-Gly-OMe   
1,36 g des obigen Tripeptidesters und 2,6 g Z-Thr(tBu) -ONP werden in 3 ml Dimethylformamid während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Tetrapeptidderivat wird durch Äther ausgefällt, abfiltriert und mit Äther Nitrophenol frei gewaschen. Das Produkt wird durch Umfällen aus Dimethylformamid-Äther gereinigt.



  41.   H- Thr(tBu)-Ala-lle-GIy-OMe   
5,66 g der obigen Carbobenzoxyverbindung werden in 50 ml Dimethylformamid und in Gegenwart von 1 g Pd-Kohle (10%) hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators über einer Schicht aus 2 g Norit wird das Dimethylformamid im Hochvakuum bei   40     vollständig verdampft. Der amorphe Rückstand wird roh weiterverarbeitet.

 

  42.   H-Thr(tBu)-Ala-lle-Gly-OH   
4,3 g des Tetrapeptidmethylesters werden in 43 ml Methanol unter gelindem Erwärmen gelöst. Nach Abkühlen auf 200 werden 12 ml l-n. Natronlauge zugegeben. Nach 5, 10 und 15 Minuten werden je 5 ml Wasser zugesetzt. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur werden 12 ml 1 N Salzsäure zugegeben, vom Methanol im Vakuum befreit und mit n-Butanol extrahiert. Die Butanol-Lösung wird mit Wasser chloridfrei gewaschen, dann ohne zu trocknen im Vakuum zur Trok  kene verdampft. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe eingesetzt.



  43.   Z-Gln-Thr(tBu)-Ala-lle-Gly-OH   
Das oben erhaltene Tetrapeptidderivat (4,2 g) wird zusammen mit 4,8 g Z-Gln-ONP und 1,35 ml Triäthylamin in 30 ml Dimethylformamid 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Zugabe von Äther wird das Produkt ausgefällt, dann abgenutscht und mit Äther Nitrophenol-frei gewaschen. Nach Lösen in wassergesättigtem n-Butanol wird bei   0     mit   l-n.    Salzsäure ausgeschüttelt, darauf mit Wasser chloridfrei gewaschen und ohne zu trocknen im Vakuum bei   40     eingedampft. Durch nochmaliges Umfällen aus Dimethylformamid-Äther wird das Produkt rein erhalten.

  Nach Trocknen im Hochvakuum bei   40     über Phosphorpentoxid wird bei der potentiometrischen Titration mit 0,1 n.-NaOH in 80% Methanol ein Äquivalentgewicht von 693 erhalten, berechnet 680.



  44.   H-Gln-Thr(tBu)-Ala-lle-Gly-OH,    HCI
3,40 g Z-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH werden in 70 ml warmem Dimethylformamid gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur gibt man 5 ml l-n. Salzsäure und 500 mg Pd-Kohle (10%) zu und hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird der Katalysator über 1 g Norit abgenutscht und das Filtrat im Hochvakuum bei   40     auf etwa 10 ml eingeengt. Diese Lösung wird in 100 ml Äther eingetropft, das ausgefallene Material abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das im Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknete Produkt ergibt bei der potentiometrischen Titration mit   0,1-n.    Natronlauge in 80% Methanol einen Gehalt von 91%.



  45.   Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-A la-lle-Gly-OH   
2,8 g Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH und 0,77 ml abs. Triäthylamin werden in 30 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst und die   auf - 100    gekühlte Lösung wird tropfenweise mit 700 mg Isobutylchlorocarbonat versetzt, wobei darauf geachtet wird, dass die   Temperatur -50    nicht übersteigt. Dann wird 10 Minuten   bei -10"    belassen und hierauf eine   auf 200    vorgekühlte Lösung von 2,5 g   H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH,    HCI in 65 ml Dimethylformamid-Wasser   (9: 1)    zugegeben.



  Dann setzt man tropfenweise 1,2 ml Triäthylamin zu und belässt 1 Stunde   bei 100    und 18 Stunden bei   00.    Hierauf wird im Vakuum und dann im Hochvakuum bei   40     Badtemperatur auf ein Volumen von etwa 15 ml eingeengt und dann durch Zugabe von 100 ml eiskalter, 2%iger Essigsäure ausgefällt. Man nutscht ab, wäscht mit Eiswasser, trocknet und fällt zur Reinigung zweimal aus Methanol-Wasser um, Ausbeute 3,9 g Oktapeptidderivat.



  46.   H-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-lle-Gly-OH   
3,6 g des unter 45) erhaltenen Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln -Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH werden in 100 ml 80%iger Essigsäure gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10% Pd) hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme nutscht man vom Katalysator ab und dampft die Lösung zur Trockne ein. Das als farbloser Firn erhaltene essigsaure Salz des Oktapeptidderivats wird im Hochvakuum getrocknet.



  47.   Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-Kis-      Thr(tssu)-Phe-Pro-GIn-Thr-     (tBu)-Ala-lle-Gly-OH
1,60 g Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-hydrazid werden mit 25 ml Dimethylformamid versetzt, hierauf wird auf 200 gekühlt und dann werden 4 ml 2.5-n. wässrige Salzsäure zugegeben. Man rührt   bei 200.    bis vollständige Lösung des Hydrazids eingetreten ist. Dann werden 2,0 ml   1 ,0-n.    Natriumnitritlösung zugetropft, das Reaktionsgemisch wird   auf - 10'    erwärmt und 20 Minuten   bei -100    belassen. Dann werden eine   auf - 100    gekühlte Lösung von 1,50 g H-Thr(tBu)-Phe -Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH (essigsaures Salz) in 25 ml 80%igem Dimethylformamid und 1,11 g N-Methylmorpholin zugegeben.

  Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden bei   0     belassen. Hierauf wird im Hochvakuum auf ein Volumen von ca. 8 ml eingedampft und durch Zugabe von eiskalter, 1 %iger Essigsäure gefällt. Nach Abnutschen und Trocknen im Vakuumexsikkator wird das Rohprodukt zur Reinigung zweimal aus Dimethylformamid-Essigester umgefällt. Die Ausbeute an geschütztem Dodekapeptid beträgt 2,1 g.



  48. H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr    (tBu)-Ala-lle-Gly-OH   
1,85 g des obigen geschützten Dodekapeptids werden in 50 ml 90%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 0,4 g Palladiumkohle (10% Pd) wie üblich hydriert. Das nach Abnutschen des Katalysators, Eindampfen der Lösung und Trocknen im Hochvakuum verbleibende essigsäure Salz von    H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-    -Ala-Ile-Gly-OH wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet.



  49.   Z-Thr(tBu)-Tyr(But)-Thr(But)-Gln-Asp(OBut)-Phe-Asn-     -Lys(BOC)-Phe-His-Thr(But)-Phe-Pro-Gln-Thr(But)    -Ala-lle-Gly-OH   
2,30 g   Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-      -NH-NH2    werden in 35 ml Dimethylformamid gelöst und zu der   auf -20"    gekühlten Lösung 3,5 ml 3-n. wässrige Salzsäure getropft. Dann gibt man 2,7 ml 0,9-n.   Natriumnitrit-    lösung zu und lässt das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei   -10"    stehen. Hierauf werden die   auf -10"    gekühlte Lösung von 1,72 g H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro -Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH (essigsaures Salz) in 30 ml 90%igem Dimethylformamid und 1,0 g N-Methylmorpholin zugetropft.

  Man lässt die Mischung 18 Stunden bei   0"    stehen, engt dann im Hochvakuum zur öligen Konsistenz ein und fällt das Produkt durch Zugabe von 100 ml eiskalter 2%iger Zitronensäurelösung aus. Der Niederschlag wird gründlich zerrieben, abzentrifugiert, 4mal mit kleinen Rationen Eiswasser nachgewaschen und im Vakuumexsikkator über Ätznatron getrocknet. Zur Reinigung wird mehrmals aus Dimethylformamid-Essigester umgefällt.



  50.   Z-Ala-Pro-NH2   
2,8 g H-Pro-NH2 und 7,57 g Z-Ala-ONP werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und die gelbe Lösung wird 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird im Hochvakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Essigester versetzt und das entstehende Pulver gründlich zerrieben.



  Nach Abnutschen und Trocknen werden 5,5 g Z-Ala-Pro   -NH2    von F.   164-165"    erhalten.



  51.   Z-Gly-Ala-Pro-NHy   
5,1 g des obigen Dipeptidderivats werden unter Erwärmen in 200 ml eines vorhydrierten t-Butanol-Wasser   (9:1)-    Gemisches gelöst. Die auf Raumtemperatur abgekühlte Lösung wird in Gegenwart von 1 g Palladium-Kohle (10% Pd) hydriert. 

  Nach beendeter Hydrierung wird die Lösung sofort bei   30     Badtemperatur und 0,01 Torr. zur Trockne eingedampft, der Rückstand von   H-Ala-Pro-NH3    in 300 ml auf   -20"    gekühltem Dimethylformamid gelöst und dann die wie folgt bereitete Lösung des gemischten Anhydrids von Z-Gly -OH zugegeben: 3,7 g Z-Gly-OH und 2,65 ml absolutes Tri äthylamin werden in 25 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und zu der   auf - 10'    gekühlten Lösung 1,85 g Chlorkohlensäureäthylester unter Rühren und Kühlen derart zugetropft.



  dass die Temperatur -50 nicht übersteigt. Hierauf wird auf   -10  gekühlt, 5 Minuten stehen gelassen und dann das Gemisch ungeachtet des ausgeschiedenen Triäthylamin-hydrochlorids zur obigen Lösung von H-Ala-Pro-NH2 gegeben.



  Nach 1 Stunde bei -10  und 18 Stunden bei 0  wird die Lösung filtriert und das Filtrat im Vakuum und dann   ina    Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Dann wird mit 1   Li-    ter Chloroform versetzt, von Triäthylaminhydrochlorid abgenutscht, die Chloroformlösung 2mal mit je 20 ml halbgesät- tigter Natriumchloridlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das erhaltene Tripeptidderivat zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagel Rf = 0,58 (in Methanol).



  52.   H-Gly-Ala-Pro-N   
3,8 g des unter 51. erhaltenen rohen Tripeptidderivates werden wie unter 51. beschrieben hydriert. Der nach Abnutschen des Katalysators und Eindampfen des Lösungsmittelgemisches verbleibende Rückstand zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagel in Methanol Rf = 0,15, Ausbeute 2,2 g.



  53.   Z-Val-Gly-Ala-Pro-NHp   
Das unter 52. erhaltene rohe Tripeptidamid wird in 30 ml Dimethylformamid gelöst. Zu der Lösung gibt man 4,1 g Z -Val-p-Nitrophenyl-ester. Nach 18 Stunden bei   Raumtempe-    ratur wird die gelbe Lösung zur Trockne verdampft, der Rückstand mit Essigester versetzt, zerrieben, abgenutscht, das gallertige Pulver in 2 Liter Chloroform gelöst, die Lösung 2mal mit je 20 ml   5%iger    Zitronensäure und 2mal mit halbgesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Dann wird die Chloroformlösung mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.



  Der Eindampfrückstand wird unter Erwärmen mit 100 ml Essigester versetzt und nach Stehen bei 0  das als festes Pulver ausgeschiedene Tetrapeptidderivat abgenutscht, F. 205   210 ,    Rf-Wert auf Silicagelplatten   =    0,80 in Chloroform Methanol   1).   



  54.H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
1,1 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 0,3 g Palladium--Kohle (10% Pd) hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird vom Katalysator abgenutscht, die Lösung eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum bei   35     Badtemperatur getrocknet Dabei wird das Tetrapeptid H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 als farblose Substanz erhalten, Rf-Wert = 0.20 (Silicagelplatten, System Chloroform Methanol = 1:1).



  55.Z-Thr(tBu)-Tvr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn     -Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-A Ja-  -lle-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2   
800 mg Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)   .Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-    -Ala-Ile-Gly-OH. 510 g H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 und 120 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 9 ml Dimethylformamid unter Rühren bei   45     gelöst und hierauf 120 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei   45     insgesamt 12 Stunden gerührt, wobei nach 3 und 7 Stunden jeweils noch je 20 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 20 mg N-Hydroxysuccinimid zugegeben werden. Dann wird in 200 ml Äther eingegossen und der feine Niederschlag abgenutscht.

  Zur Reinigung wird das Produkt einer Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10: 3: 5: 6, Puffer wie unter 30) unterworfen.



  56.   H-Thr(?Bu)-Tyr(tBu)- Jhrf tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-   
Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Glu-Thr(tBu)-Ala  -Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
227 mg des unter 55. erhaltenen geschützten Docosapeptidamids werden in 10 ml   90%iger    Essigsäure gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 100 mg Palladiumkohle (10% Pd) unter intensivem Rühren hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Den Rückstand löst man in   wassergeslittigtem    n-Butanol und schüttelt dreimal mit kleinen Portionen   5%iger    Natriumcarbonatlösung und zweimal mit wenig Wasser aus.

  Dann dampft man die   Butanol-Lösung    ohne sie vorher zu trocknen im Hochvakuum bei 350 Badtemperatur ein und trocknet den Rückstand im Hochvakuum. Man erhält so 185 mg des decarbobenzoxylierten   Docosspeptids    als farbloses Harz.
EMI19.1     
   -Gly-Thr(Bu) -TyrflB)-Thr(tBu)-GIn-A sp(O tBu)-Phe- -Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-   
EMI19.2     
 -Met-Leu-Gly-OH,

   288 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)   -Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-    -Pro-Glu-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 und 23 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 2 ml absolutem Di   methylforrnarnid    unter   Erwärmten    gelöst und nach Abkühlen auf Zimmertemperatur mit 31 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt Das Gläschen wird sodann mit Stickstoff bespült, zugeschlossen und   während    15 Stunden bei   45     stehen gelassen. Man filtriert den entstandenen kristallinen Dicyclohexylharnstoff ab, wäscht zweimal mit je 0,5 ml Dimethylformamid, engt das Filtrat im Hochvakuum auf das halbe Volumen ein und fällt das Rohprodukt durch Zugabe von 20 ml Benzol und 120 ml   Pein > läther    aus.

  Zur Reinigung wird es noch einmal aus Methanol-Benzol-Hexan umgefällt, abfiltriert und bei   450    bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Man erhält so das geschützte Dotriakontapeptidamid als amorphes Pulver, das bei der Dünnschichtchromatographie einen Hauptflecken und verschiedene Nebenprodukte aufweist. Es kann in diesem Zustand zur Abspaltung der Schutzgruppen eingesetzt werden.



     Beispiel    2
EMI19.3     
 -Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile   -Gly-Val.Gly-A la-Pro-NH±    (Calcitonin M)
EMI19.4     
 -Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe -Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala -lle-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 werden bei 0  mit 0,6 ml konzentrierter Salzsäure übergossen, das Gefäss wird mit Stickstoff gespült, verschlossen und bei 0  während 10 Minuten gerührt. Man kühlt dann auf   ca. -60"    ab, evakuiert im Hochvakuum und engt die Lösung unter langsamen Steigern der Temperatur bis auf   0     zum Sirup ein. Nach Zugabe von 0,4 ml Wasser wird lyophilisiert, der Rückstand in 0,2 ml 0,1 -n. 

  Essigsäure gelöst und zur Umwandlung in das Acetat durch eine   Säule ( = 6 mm; I = 100 mm) von schwach basischem    lonenaustauscher   (z.B.    Merck Nr. II), der mit   0.1 -n.    Essigsäure äquilibriert worden ist, filtriert. Das Eluat wird bis auf ein Volumen von 0,5 ml konzentriert, lyophilisiert, bei   40     im Hochvakuum nachgetrocknet und schliesslich durch Stehenlassen im offenen Gefäss mit der Luftfeuchtigkeit äquilibriert. Man erhält so das Acetat von Calcitonin M als was   serlösliches,    weisses   Pusher.     



   Das als Ausgangsmaterial verwendet geschützte Dotri   acontapeptidamid    kann wie folgt hergestellt werden: 1. H-Gly-Asn-Leu-OMe
2,0 g Z-Gly-Asn-Leu-OMe (vom F.   158-159     nach Umkristallisation aus Methanol-Wasser) werden unter Erwärmen in 20 ml Methanol gelöst und mit 200 mg Palladiumkohle (10% Pd) bis zur Beendigung der Wasserstoffaufnahme hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat bei   40     Badtemperatur zur Trockene eingeengt, wobei der Tripeptidmethylester direkt in kristalliner, reiner Form (1,34 g; F.   138-139")    erhalten wird. Er kann nötigenfalls aus Methanol-Essigester-Petroläther umkristallisiert werden. [Rf52 = 0,22 (auf Silicagel)].



  2.   BOC-Cys-(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe   
5,7 g H-Gly-Asn-Leu-OMe, 9,2 g BOC-Cys(TRI)-OH und 4,16 g N-Hydroxysuccinimid werden in 200 ml Dimethylformamid gelöst, auf   0"    gekühlt und unter Rühren mit 5,57 g Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form versetzt. Man rührt noch während 1 Stunde bei   0 ,    lässt dann über Nacht bei ca.   20     stehen, engt im Hochvakuum auf ein Volumen von ca. 100 ml ein und filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab. Das Filtrat wird sodann in Hochvakuum bis zur Bildung einer klebrigen Masse weiter eingeengt, in 200 ml n-Butanol gelöst und nacheinander mit Wasser, 5%iger Weinsäurelösung,   1-n.    Natriumbicarbonat, und wiederum mit Wasser gewaschen.

  Die Lösung wird nun auf ein Volumen von ca. 50 ml konzentriert, und daraus das Tetrapeptid-derivat durch Zugabe von 300 ml Petroläther ausgefällt.



  Man reinigt durch Umfällen aus Dimethylformamid-Wasser und aus Methanol-Essigester-Petroläther und erhält so das Tetrapeptidderivat als amorphes Pulver vom Schmelzpunkt   145-148 .    Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf: Rf 115 = 0,68; Rf (Aceton) = 0,59); Rf (Chloroform-Methanol   8 : 2) =    0,60.



  3.   BOC-Cys(TR5)-Gly-Asn-Leu-NHNH   
2,7 g BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe werden in 22 ml Methanol gelöst, auf   0"    gekühlt und mit 2,2 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach ca. 30 Minuten bei   0"    lässt man die Lösung über Nacht bei ca.   20     stehen, kühlt wieder auf   0 C    ab und versetzt dann mit 102 ml 3%iger eiskalter Essigsäure.



  Die Fällung wird gut homogenisiert, abfiltriert und auf der Nutsche mit eiskalter, 3 %iger Essigsäure bis zur Folin-negativen Reaktion der Waschflüssigkeit gewaschen und anschliessend getrocknet. Man erhält 2,2 g chromatographisch reines Tetrapeptid-hydrazid vom Zersetzungspunkt ca.   195 C.    Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf (Chloroform-Methanol 8 : 2) = 0,30; Rf (Aceton-Methanol 9: 1) = 0,53.



  4. BOC-Met-Leu-Gly-OMe
6,72 g Z-Leu-Gly-OMe werden in 50 ml Methanol mit 500 mg Palladiumkohle (10% Pd) bis zur Beendigung der Wasserstoffaufnahme hydriert. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum auf ca. 10 ml eingeengt, mit 30 ml Dimethylformamid verdünnt und im Hochvakuum nochmals auf ca. 20 ml konzentriert. Dazu gibt man unter Eiskühlung 7,7 g BOC-Met-OCP, lässt die klare Lösung während 6 Stunden bei   20     stehen und verdampft das Lösungsmittel im Hochvakuum. Der ölige Rückstand wird in Essigester gelöst und nacheinander bei   0"    mit 5%iger Pottaschelösung, 0,2-n. Salzsäure und schliesslich mit Wasser gewaschen, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt.

  Der ölige Rückstand wird aus Benzol Petroläther kristallisiert; F.   126-127 ;    auf Silicagel ist Rf 43 C = 0.66; Rf (Toluol-Aceton   1:1) =    0,58.



  5. H-Met-Leu-Gly-OMe, Hydrochlorid
3,24 g BOC-Met-Leu-Gly-OMe werden in 13 ml 3,8-n -Chlorwasserstoff in Essigester gelöst und während 30 Minuten bei   20     stehen gelassen. Durch Zugabe von 100 ml Petroläther wird das Tripeptidesterhydrochlorid als klebrige Masse ausgefällt und die überstehende Lösung abdekantiert.



  Durch Zerreiben mit 100 ml peroxidfreiem Äther bei   0"    wird ein feinpulveriges Produkt erhalten, das abfiltriert und über Kaliumhydroxid bei Zimmertemperatur im Exsikkator bis zur Gewichtskonstanz getrocknet wird. Die Verbindung ist chromatographisch rein, jedoch amorph und stark hygroskopisch. Sie weist auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf: Rf 43 C = 0,48; Rf (Toluol-Aceton   1:1)    = 0,35.



  6. TRI-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe
3,22 g TRI-Cys(TRI)-OH,   1,27    g H-Met-Leu-Gly-OMe -Hydrochlorid und 0,74 ml Triäthylamin werden in 32 ml Acetonitril gelöst und 1,54 g Dicyclohexylcarbodiimid wird in fester Form zugegeben. Die vorerst klare Lösung, aus der sich Dicyclohexylharnstoff ausscheidet, wird während 16 Stunden bei   20     stehen gelassen. Man kühlt alsdann auf   0 ,    gibt 100 ml Wasser zu, homogenisiert und filtriert die weisse Fällung ab.



  Sie wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann während 5 Minuten bei   40     mit 50 ml Essigester fein zerrieben. Der unlösliche Dicyclohexylharnstoff wird bei Zimmertemperatur abfiltriert und mit 20 ml Essigester gewaschen. Aus dem Filtrat wird das Tetrapeptidderivat durch Zugabe von 300 ml Petroläther als gallertiger Niederschlag ausgefällt, abfiltriert und getrocknet. Beim Umfällen dieses Rohproduktes aus Methanol-Essigester-Petroläther erhält man ein chromatographisch einheitliches Produkt vom F. ca.   215 .    Auf Silicagel weist es folgende Rf-Werte auf, im System: CHC13-Methanol (97: 3) Rf = 0,57; in n-Butylacetat Rf = 0,51.



  7.   H-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-OMe,    Acetat
Zu einer Lösung von 1,862 g TRI-Cys (TRI)-Met-Leu -Gly-OMe in 16 ml Eisessig werden 4 ml Wasser so zugetropft, dass sich der gebildete Niederschlag jeweils wieder löst. Die klare Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann bei   0"    mit 12 ml Wasser versetzt, filtriert und der Niederschlag mit kalter 50%iger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wird am Hochvakuum bei   30     zu einem Öl eingedampft, dieses mit Wasser verrieben und lyophilisiert.



  Das erhaltene weisse Pulver wird 15 Stunden über Kaliumhydroxid am Hochvakuum getrocknet Das Produkt erweist sich im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel als einheitlich. In Toluol-Aceton   (7:3)    Rf = 0,28, in Chloroform-Methanol (95: 5)-Ff = 0,48.



  8.   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe   
2,284 g   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH2    (vgl. Beispiel 1, sub 13) in 15 ml Dimethylformamid werden   bei -20"    mit 6,5 ml 1,53-n. Chlorwasserstoff in Essigester und 0,51 ml t-Butylnitrit versetzt und 15 Minuten   bei -10"    gerührt. Nach Zugabe von 1,4 ml Triäthylamin wird die   auf - 10'    gekühlte Lösung von 1,406 g H-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe-Acetat in 10 ml Dimethylformamid zugetropft. Das pH der Reaktionslösung beträgt dann   5.    Durch Zugabe von 2 Tropfen Triäthylamin in Dimethylformamid   ,8    ml Triäthylamin mit Dimethylformamid auf 10 ml aufgefüllt] wird das pH 7-8 eingestellt. 

  Nach 5, 10 und 20 Minuten wird mit je 2 Tropfen Triäthylaminlösung das pH wieder auf 7-8 erhöht. Nachher bleibt dieser Wert konstant. Die Reaktionslösung wird eine Stunde   bei -10"    und 15 Stunden bei   0"    gehalten. Dann wird vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat bei   30     am Hochvakuum zu einem Öl eingedampft. Durch Zerreiben mit Wasser erhält man ein Pulver, das mit Wasser gewaschen und dann mit Wasser zerrieben  und lyophilisiert wird. Durch zweimaliges Zerreiben mit 10 ml Benzol-Petroläther (1: 2) wird das Hexapeptidderivat rein erhalten. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton (7: 3) ist Rf = 0,42.



  8a.   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-OH   
5,7 g DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH2 in 50 ml Dimethylformamid werden   bei 150    mit 16,35 ml 1,53-n. Chlorwasserstoff in Essigester und 1,4 ml t-Butylnitrit versetzt und 15 Minuten   bei -10"    stehen gelassen. Nach Zugabe von 3,5   ml    Triäthylamin wird eine   auf - 100    gekühlte Lösung von 3,63 g H-Cys(TRI)-OH und 1,4 ml Triäthylamin in 40 ml Dimethylformamid und 16 ml Wasser zugetropft, eine Stunde bei   - 100    gerührt und 15 Stunden bei   0     gehalten. Die klare Lösung wird bei   40     am Hochvakuum eingedampft, der Rückstand in Essigester und Wasser aufgenommen und die organische Phase mit zu 50% gesättigter Kochsalzlösung gewaschen.

  Das nach Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Öl wird in wenig Essigester gelöst und in 300 ml Petroläther (bei   0     gerührt) getropft. Das Produkt fällt als leicht gelbliches Pulver aus. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Chloroform-Methanol (7: 3) ist Rf = 0,62.



  8b. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-OH
909 mg DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-OH werden in 10 ml Methylenchlorid gelöst, mit 12 ml Monochloressigsäure in Wasser [aus 75 g Chloressigsäure und 25 ml Wasser] versetzt und bei Raumtemperatur 15 Minuten gerührt. Die Lösung wird dann auf   0     gekühlt, mit 50 ml Wasser versetzt und mit konz. Ammoniak auf pH 6,5 gebracht. Dabei fällt das Produkt als Öl aus. Dieses wird noch zweimal mit Wasser zerrieben, dann in t-Butanol aufgenommen und lyophilisiert Zerreiben des Lyophilisats mit Petroläther liefert ein einheitliches Produkt. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol   (1:1)    ist Rf = 0,40; in Methanol Rf = 0,50.



  9.   H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe   
2 g   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMè    werden bei   45"    in 40 ml 80%igem Eisessig gelöst und anschliessend während 1 Stunde bei   45"    stehen gelassen. Man engt sodann im Vakuum auf ein Volumen von ca. 10 ml ein und lyophilisiert. Der Rückstand wird zur vollständigen Entfernung von Essigsäure in 15 ml tert. Butanol und 1,5 ml Wasser gelöst und nochmals lyophilisiert. Man erhält einen pulverigen Rückstand, der in 5 ml Methanol und 20 ml Essigester gelöst und durch Zugabe von 150 ml Petroläther wieder gefällt wird.

  Nach kurzem Stehenlassen bei   0     wird abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und getrocknet Man erhält ein amorphes Pulver vom F.   1800,    das nur noch Spuren von   2-(p-Biphenylyl)-propanol( - 2)    als einzige Verunreinigung enthält. Das Hexapeptid wird in dieser Form zur Weiterverarbeitung verwendet. Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf: in Chloroform-Aceton (1:1) Rf = 0,48 in Chloroform-Methanol (9:1) Rf = 0,54 in Toluol-Aceton (1:1) Rf = 0,49.



  10.   H-Ser(tBu)-Thr(tBu-Cys(TRI) -Met-Leu-Gly-OH   
1,4 g Hexapeptid-methylester von 9) werden bei   45"    in 16 ml 90%igem Methanol gelöst, auf   20     abgekühlt (wobei das Peptid teilweise wieder ausfällt) und mit 4,32 ml   l-n.    Natronlauge versetzt. Man rührt die Suspension während 25 Minuten bei   22     (nach ca. 15 Minuten ist alles klar gelöst) und fällt dann das Hexapeptid durch Zugabe von 4,32 ml   l-n.   



  Salzsäure und 30 ml Wasser als   feinfiockigen    Niederschlag aus. Man lässt noch während 15 Minuten bei   0     stehen, filtriert, und wäscht mit Wasser, bis das Filtrat frei von Chloridionen ist. Nach Trocknen   über    Kaliumhydroxid und Phosphorpentoxid erhält man 1,3 g Rohprodukt, das zur Reinigung während 5 Minuten bei   80"    mit einer Mischung von 25 ml Dimethylformamid und 60 ml Benzol homogenisiert und durch Zugabe von 120 ml Petroläther gefällt wird. Nach 10 minütigem Stehenlassen bei   0     wird abfiltriert, mit Benzol und Petroläther gewaschen und getrocknet.

  Das so erhaltene, chromatographisch reine Hexapeptidderivat weist einen Zer   setzungspunkt    von ca.   210     auf und ist in vielen Lösungsmitteln sehr schwer löslich Bei der Dünnschichtchromatographie auf   Silicagel    ist Rf 45 = 0,39 Rf 52 = 0,77 Rf 100 = 0,47.



  11.   BOC-Cys(TRJ)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRJ)-     -Met-Leu-Gly-OH
1,04 g   BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2    werden in 8 ml absolutem Dimethylformamid gelöst,   auf 250    gekühlt und dazu langsam 0,92 ml 3,6-n. Salzsäure in Dioxan zugetropft, dann 0,179 ml tert. Butylnitrit Diese Mischung wird während 15   Minuten bei 100    gerührt,   auf 150    abgekühlt und in eine   auf - 150    gekühlte Lösung von 878 mg H-Ser   (tBu)-Thr(tBu)-Crs(TRI)-Met-Leu-Gly-OH    und 0,588 ml Tri   äthylamin    in 12 ml absolutem Dimethylformamid hinein pipettiert Man rührt während ca.   10 Minuten bei 100    und während 3 Stunden bei 00.

  Zur Aufrechterhaltung einer schwach basischen Reaktion (pH ca. 8) gibt man anfänglich noch 2 Mal je 0,065 ml Triäthylamin zu. Die Mischung wird während 15 Stunden bei   0.    stehen gelassen und dann im Hochvakuum bis zur   breiartigen    Konsistenz eingeengt. Durch Zugabe von 50 ml Methanol wird das Decapeptidderivat ausgefällt Man erwärmt die Suspension 5 Minuten auf   40 ,    lässt 10 Minuten bei   0     stehen, filtriert ab und wäscht den Niederschlag mit 20 ml Methanol.

  Man erhält beim Trocknen im Hochvakuum über   Kaliusnhydroxid    und Phosphorpentoxid reines Decapeptidderivat von unscharfem Zersetzungspunkt bei   ca.      220-2300.    Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf: im System Chlorofonn-Methanol (8: 2) Rf = 0,28 im System 70 Rf = 0,55 im System 104 Rf = 0,75 im System 121 A Rf = 0,59.
EMI21.1     




   -Gly-OH
1,7 g BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)   -CysCRI)-Met-Leu-Gly-OH    werden in 170 ml heissem Dimethylformamid gelöst und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur im Verlauf von 1 Stunde zu einer intensiv gerührten Lösung von 2,5   gJod    in 500 ml Methanol getropft.



  Anschliessend rührt man noch eine weitere Stunde und entfärbt dann die auf   0"    gekühlte Lösung mit   l-n.    Natriumthiosulfat fast vollständig. Nach Einengen der Lösung im Vakuum, zuletzt im Hochvakuum bei   40 ,    auf ca. 100 ml fällt man mit   Ather    vollstandig aus, wobei das ausfallende Öl rasch erstarrt. Nach Abgiessen der   Ätherlösung    wird der Rückstand kurz im Vakuum   getrocknet    und dann mit Wasser zerrieben. Das ausgefallene Dekapeptidderivat wird abgenutscht, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Zur Reinigung wird in 25 ml Chloroform gelöst, wenig unlösliches Material abfiltriert, das Filtrat auf etwa die Hälfte eingeengt und mit Hexan ausgefällt. 

  Man erhält das reine Dekapeptidderivat, das im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel Rf 100 = 0,48 zeigt.  



  13.   Z-Asp(OtBu)-Phe-OCH8   
30,3 g Z-Asp(OtBu)-ONP und 18,3 g   H-Phe-OCH3,    HCI werden zusammen in 150 ml Dimethylformamid gelöst, und zu der klaren Lösung 11,8 ml Triäthylamin zugetropft. Die entstandene Suspension wird 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wobei sie sich tiefgelb färbt. Anschliessend wird im Vakuum auf etwa 100 ml eingeengt und in 1 Liter Essigester/Chloroform   (4:1)    dreimal mit 5%iger Zitronensäure, 19mal mit ca. 2-n. Natriumcarbonat und mit gesättigter Kochsalzlösung bis zur neutralen Reaktion ausgeschüttelt. Das Rohprodukt, ein gelbes Öl, wird in Äther mit Aktivkohle behandelt und nach Animpfen aus 650 ml Äther/Hexan   (1:1)    im Kühlschrank kristallisiert. Es bilden sich farblose Nadeln vom F. 74,5-76,5 .

  Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist der Rf-Wert im System Chloroform-Methanol (95: 5)  = 0,74, in Chloroform-Aceton (75: 25) = 0,65.



  14.   H-Asp(tBu)-Phe-OCHs   
48,6 g Z-Asp(OtBu)-Phe-OCH3 werden in 700 ml Methanol nach Zusatz von 33,5 ml 3-n. Chlorwasserstoff in Dioxan und 5 g 10%igem Palladiumkatalysator auf Kohle in der Schüttelente bei Raumtemperatur decarbobenzoxyliert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird filtriert und eingedampft. Man erhält 38,7 g eines weissen Schaums. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol   (9:1)    ist Rf = 0,60; in Chloroform-Aceton   (1:1)    ist Rf = 0,58;   Rfl02E    = 0,42. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung zur nachfolgenden Kondensation eingesetzt.



  15. Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH,
38,6 g des erhaltenen H-Asp(OtBu)-Phe-OCH3, HCI werden mit 42,0 g Z-Gln-ONP in 170 ml Dimethylformamid zu einer klaren, leicht gelben Lösung gelöst und unter Rühren mit 13,9   ml    Triäthylamin langsam versetzt. Es entsteht eine orange Suspension, die 24 Stunden bei   30-35"    Badtemperatur gerührt wird. Während dieser Zeit gibt man weitere 40 ml Dimethylformamid und ausserdem noch 1,39 ml Triäthylamin zu.



   Zur Aufarbeitung wird der Ansatz in 4 Litern Chloroform gelöst und in einer 20stufigen Gegenstromverteilapparatur (Phasenvolumen: untere Phase 400 ml, obere Phase 200 ml pro Gefäss) nacheinander mit 1 Liter 5%iger Zitronensäurelösung, 400 ml gesättigter Kochsalzlösung, 6 Liter ca. 2-n.



  Soda und 2,8 Liter gesättigter Kochsalzlösung gewaschen.



  Nach dem Trocknen und Eindampfen kristallisiert das Tripeptidderivat aus   1,8 1 Äthanol    im Kühlschrank langsam aus.



   Man erhält Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3 vom F. 186-188 .



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform-Methanol   (9:1):    Rf = 0,39; in Chloroform-Aceton   (1:1):    Rf = 0,24; Rf 102E  = 0,69, Rf 89 = 0,46, Rf 43A = 0,65   [D20      = 280    + 10 (c = 1,3% in Dimethylformamid).



   16.   H-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCHs   
7,55 g   Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH2    werden in 400 ml Methanol gelöst, mit 4,1 ml 3-n. Chlorwasserstoff in Dioxan versetzt und in Gegenwart von 2 g Palladium-kohle (10% Pd) hydriert. Nach Abnutschen des Katalysators und Eindampfen erhält man   H-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3,    HCl als farblosen Schaum. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform-Methanol (9: 1);
Rf = 0,13: in Chloroform-Aceton (25: 75) Rf = 0,14;   Rf,02E    =   0,22.   



   17.   Z-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-phe-ocHs   
Die gesamte Menge des Hydrochlorids von 16) wird zusammen mit 7,4 g Z-Thr(tBu)-OSU in 14 ml Dimethylformamid bei Zimmertemperatur gelöst, und zu dieser Lösung werden unter Kühlung im Eisbad 1,72 ml Triäthylamin getropft. Anschliessend wird die bräunliche Suspension 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach üblicher Aufarbeitung in viel Essigester (je dreimaliges Waschen mit 5%iger Zitronensäure und ca. 2-n. Natriumcarbonat, Neutralwaschen mit gesättigter Kochsalzlösung, Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen im Vakuum bei   30-40 )    wird das Rohprodukt in Äthanol mit Aktivkohle behandelt und aus 90 ml Äthanol im Kühlschrank kristallisiert. F. 155-1610.

  Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte gefunden: in Chloroform-Methanol   (9:1):    Rf = 0,52; in Cyclohexan-Aceton   (3 : 7):    Rf = 0,48;-Rf89 = 0,48,   Rf12tA    = 0,76.   [D30      = 40    + 0,50 (c = 2,3% in Dimethylformamid).



  18.   H-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH,   
478 mg   Z-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3    werden in 150 ml Methanol mit 100 ml Palladiumkohle (10%ig) bei Raumtemperatur neutral hydriert. Man erhält 395 mg eines farblosen Schaums von H-Tyr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe   -OCH3,    der ohne weitere Reinigung für die folgende Kondensation verwendet wird. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloro   form-Methanol      (1:1):    Rf = 0,75; in Chloroform-Methanol (9 :1): Rf = 0,17; in Aceton Rf = 0,18;   Rf302E    = 0,23; Rf89 = 0,12.



  19. Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3
687 mg Z-Tyr(tBu)-OH -Dicyclohexylammoniumsalz werden in Chloroform mit wässeriger Zitronensäure ausgeschüttelt, und die erhaltene freie Säure, ein klares Öl, wird in 6,5 ml Tetrahydrofuran mit 0,139   ml    N-Methylmorpholin versetzt   Bei 220    gibt man 0,170 ml Chlorameisensäure-isobutylester zu und rührt eine halbe Stunde bei 220   bis - 100.   



  Dann lässt man das oben beschriebene H-Thr(tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-OCH3 in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst und vorgekühlt zutropfen und spült mit 5 ml desselben Lösungsmittels. Nach   /2    Stunde   bei -10"    rührt man noch 15 Stunden bei Raumtemperatur. Nachher wird am Vakuum eingeengt und in Essigester wie üblich aufgearbeitet (vgl. 17). Das Rohprodukt wird in 15 ml Essigester gelöst, mit 40 ml Äther gefällt und anschliessend aus Methanol im Kühlschrank kristallisiert. Kurze, dicke Nadeln, die beim Trocknen am Hochvakuum bei   50     verwittern. F. 169-173 .

  Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform-Methanol   (9:1)    Rf = 0,46; in Chloroform-Methanol   (1:1)    Rf = 0,95; in Chloroform-Aceton   (1:1)    Rf = 0,44; Rf89 = 0,61;   RfAeeton    = 0,68, Rf102E = 0,73.   [,CC]D21      = 540    + 0,50 (c = 2,0% in Dimethylformamid).



  20.H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3
2,36 g Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3 werden in 450 ml Methanol mit 500 mg 1 %iger Palladiumkohle wie üblich bei Zimmertemperatur hydriert. Man erhält einen farblosen Schaum, der dünnschichtchromatographisch einheitlich ist und als solcher weiterverwendet wird. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform-Methanol   (95 : 5) Rf    = 0,22;   Rfs,    = 0,42.

 

  21.Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH3
Das Produkt von 20) wird zusammen mit 1,48 g Z-Thr (tBu)-OSU in 3 ml Dimethylformamid gelöst und 21 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Verdünnen der Reaktionslösung mit viel Essigester wird wie üblich aufgearbeitet (vgl. 17). Das Rohprodukt wird in 30 ml Essigester-Methanol   (9:1)    warm gelöst und nach Kühlen im Eisbad mit 80 ml Äther gefällt. Man erhält das Produkt als farbloses, amorphes   Pulver vom F. 146-1480. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform Methanol   (9:1):    Rf =   0,55;    in Chloroform-Aceton   (1:1):    Rf =   0,60;    Rf89 = 0,43;   [z]n23    = +6 +   0,50    (c = 2,0 in Dimethylformamid).



  22. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-NH    NH2   
1,91 g Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu) -Phe-OCH3 werden in 80 ml Methanol gelöst und mit 8   ml    Hydrazinhydrat vermischt. Nach 22 Stunden Stehenlassen bei Zimmertemperatur wird das ausgefallene Produkt isoliert und am Hochvakuum bei   60     getrocknet. Man erhält das mikrokristalline Hydrazid vom F.   226.2290    (Zersetzung). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte gefunden: In Chlofoform-Methanol (9: 1): Rf = 0,32; in Cyclohexan-Aceton   (3 : 7):    Rf = 0,23; Rf89 =   0,34.      [X]D20    = + 4  +   1"    (c = 1,0 in Dimethylformamid).



  23. Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-OMe
5,4 g H-Lys(BOC)-Phe-His-OMe (vgl. Beispiel 1) und 4,5 g Z-Asn-ONP werden in 20 mi Dimethylformamid 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Zugabe von Essigester wird das Peptidderivat ausgefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Nach Umkristallisieren aus Methanol schmilzt das Produkt bei   182.1830.    Im Dünnschichtchromatogramm ist   Rflon    = 0,57 (an Silicagel).   []D20      = 280    (c = 1 in Dimethylformamid).



  24.   Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-NH-NH,   
3,97 g Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-OMe werden in 8 ml warmem Dimethylformamid und 12 ml Methanol gelöst. Zu der noch etwa   30     warmen Lösung werden 2,5   ml    Hydrazinhydrat zugesetzt und es wird während 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Durch Zugabe von Wasser wird das Peptidhydrazid ausgefällt, abfiltriert und mit Wasser Hydrazin-frei gewaschen. Das Produkt wird aus Äthanol umkristallisiert, F. =   200-201".    Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rf43e    = 0,5.



  25. H-Phe-Pro-OH
Z-Phe-Pro-OH wird durch katalytische Reduktion (Pd Kohle) in Methanol-Wasser   (4:1)    in das freie Dipeptid übergeführt. Dieses wird nach Einengen der vom Katalysator befreiten Hydrierlösung auf ein kleines Volumen durch Zugabe von Aceton kristallisiert erhalten, und zwar als Dipeptid-Mo   nohydrat vom    F. 125-128.



  26. Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH
20,2 g Z-Thr(tBu)-OSU, 13,3 g H-Phe-Pro-OH (Monohydrat) und 6,54 ml Triäthylamin werden in 80 ml Dimethylformamid gelöst, über Nacht bei ca.   20     stehen gelassen und dann im Hochvakuum bis zur Bildung einer klebrigen Masse konzentriert. Diese wird in 500 ml Essigester gelöst und fünfmal mit je 100 ml   5%iger    Weinsäurelösung und anschliessend bis zur Neutralität mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird zur Trockene eingeengt und der zurückbleibende feste Schaum pulverisiert und im Hochvakuum bei   40     getrocknet. Durch zweimaliges Umfällen aus Essigestser-Petroläther erhält man 13,3 g amorphes, chromatographisch reines Tripeptidderivat mit unscharfem Schmelzbereich bei ca. 75-85 .

  Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist   Rfll"    = 0,68;   RfI A    = 0,57.



  27.   Z-Thr(tBu)-A la-lle-Gly-OMe   
1,36 g H-Ala-lle-Gly-OMe (vgl. Beispiel 1) und 2,5 g Z-Thr(tBu)-OSU werden in 3 ml Dimethylformamid während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Tetrapeptidderivat wird durch   Ather    ausgefällt, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Nach Umkristallisieren aus Äthanol ist F. = 229-2300.   [al,zo    = -43  (c = 1 in Methanol). Rf = 0,55 im System Chloroform-Methanol (95: 5) an Silicagel.



  28.   H-Thr(tBu)-A la-lle-GIy-OMe   
5,66 g der obigen   Carbobenzoxvverbindung    werden in 400   ml    warmem Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Pd-Kohle (10%) hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Methanol im Vakuum bei   40     verdampft. Der feste Rückstsand wird sofort weiterverarbeitet. Rf   =    0,2 im System Chloroform-Methanol (95: 5) an Silicagel.



  29. H-Thr(tBu)-Ala-lle-Gly-OH
4,3 g des Tetrapeptidmethylesters werden in 43 ml Methanol unter gelindem Erwärmen gelöst. Nach Abkühlen auf 200 werden 12 ml 1-n. Natronlauge zugegeben. Nach 5 Minuten werden 20   ml    Wasser und nach weiteren 10 Minuten 12 ml   l-n.    Salzsäure und 20 ml Methanol zugegeben. Die kristalline Fällung wird abfiltriert und mit 90%igem Äthanol gewaschen. Sie schmilzt ab   240     unter Zersetzung. Rf100 = 0,15 an Silicagel.



  30a.   Z-Gln-Thr(tBu)-Ala-lle-Gly-OH   
Das unter 29) beschriebene Tetrapeptidderivat (4,2 g) wird in 110 ml 90%igem Dimethylformamid suspendiert, mit 1,4 ml Triäthylamin versetzt und auf 70  erwärmt, bis die Hauptmenge gelöst ist. Nach Abkühlen auf   25     gibt man 4,8 g Z-Gln-ONP zu, rührt 18 Stunden bei Raumtemperatur, gibt weitere 2,4 g Z-Gln-ONP und 0,7   ml    Triäthylamin zu und rührt noch 20 Stunden bei 50 . Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, die Mutterlauge mit Äther versetzt und das ausgefallene Produkt ebenfalls isoliert. Beide Fraktionen werden zusammen in 60 ml t-Butanol suspendiert, nach Zugabe von 2-n. Salzsäure bis pH 2 gut verrieben und dann durch portionenweise Zugabe von insgesamt 600 ml Wasser gefällt.



  Das Produkt wird abzentrifugiert, noch zweimal mit je 200 ml Wasser gewaschen und lyophilisiert. Es kann aus viel Methanol umkristallisiert werden. F. ab   230     unter Zersetzung. Das Produkt enthält 5 Mol Wasser. Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf100 = 0,4.



  30b.   Z-Gln-Thr(tBu)-Ala-lle-Gly-OMe   
4,6 g des unter 28) beschriebenen H-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly -OMe in 30 ml Dimethylformamid werden mit 3,5 g Z-Gln -ONP versetzt und bei Raumtemperatur gerührt, bis das Gemisch fest wird. Nach Stehenlassen über Nacht wird mit Äther verdünnt, die Fällung abfiltriert und mit Äther Nitrophenol-frei gewaschen. Das geschützte Pentapeptid zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel Rf = 0,14 im System Chloroform-Methanol (95: 5). F.:  >  2500.



  31a. H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH. HCI
3,7 g Z-Gln-Thr(Btu)-Ala-Ile-Gly-OH werden in 150 ml 80%igem Methanol und 5,5 ml   l-n.    Salzsäure suspendiert und in Gegenwart von 2 g Pd-Kohle   (10%o)    hydriert, bis die Substanz gelöst und keine Wasserstoffaufnahme mehr festzustellen ist. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat bei 300 im Vakuum stark eingeengt, mit t-Butanol verdünnt und lyophilisiert. Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist   Rf""    = 0,48.

 

     31 b.    H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe. HCI
14,4 g des unter 30b) beschriebenen Pentapeptidderivats werden in 800 ml   80tOigem    Methanol suspendiert und einige Zeit auf   50     erwärmt Die Suspension wird auf Raumtemperatur gekühlt, mit 20,8 ml Salzsäure und 3 g Pd-Kohle   (10tO-    ig) versetzt und hydriert, bis die Wasserstoffaufnahme beendet  und das Ausgangsmaterial in Lösung gegangen ist. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat im Vakuum bei   40     eingedampft und der Rückstand durch zweimaliges Eindampfen mit Dimethylformamid im Hochvakuum entwässert.



  Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung verwendet.



     Ruf100    = 0,33 im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel.



  32.   Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-A la4le-Giy-OMe   
12,0 g des unter   31b)    beschriebenen Pentapeptid-methylester-hydrochlorids werden in 80 ml Dimethylformamid gelöst. Nacheinander werden unter Rühren bei Raumtemperatur 13,3 g Z-Thr(Btu)-Phe-Pro-OH und 5,75 g N-Hydroxysuccinimid zugegeben, dann bei   0     2,76   ml    Triäthylamin und 6,2 g Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt bei   0 ,    bis die Mischung dick wird, dann wird über Nacht bei   0     stehen gelassen. Nach Einengen im Hochvakuum auf ca. 50 ml wird das Produkt mit 300 ml Äther gefällt. Das isolierte Material wird mit 0,05-m. Zitronensäure und Wasser gewaschen und im Hochvakuum bei   40     getrocknet.

  Gereinigt wird durch Umkristallisieren aus ca.   11    Isopropanol. Man erhält 18,2 g des geschützten Octapeptidderivats. Rf89 = 0,27 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel.



  33.   Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Be-Gly"OH   
10,9 g des unter 32) beschriebenen Octapeptidmethylesters werden in 190 ml 90%igem Methanol unter Erwärmen auf   70"    gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 30   ml    1-n. Natronlauge und 10 Minuten später 160 ml Wasser in kleinen Portionen zugefügt. Dann wird klar filtriert und aus dem Filtrat das Produkt durch Eingiessen in 600 ml 0,05-n.



  eiskalte Salzsäure gefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser neutral gewaschen. Das im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel einheitliche Produkt   (Rf1oo    = 0,45) kann aus Methanol-Wasser umkristallisiert werden.



  34.   H-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-lle-Gly-OH   
3,6 g des unter 33) erhaltenen Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln -Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH werden in 100 ml 80%iger Essigsäure gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10% Pd) hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme nutscht man vom Katalysator ab und dampft die Lösung zur Trockne ein. Das als farbloser Firn erhaltene essigsaure Salz des Octapeptidderivats wird im Hochvakuum getrocknet. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf100 = 0,21.



  35. Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr    (tBu)-Ala-He-Gly-OH   
11,25 g Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-hydrazid, gelöst in 65 ml Dimethylformamid, werden   bei -20"      bis -25"    in 2 Minuten mit 8,4 ml 4,2-n. Chlorwasserstoff in Dioxan versetzt. An   schliessend fügt man bei -15"      bis 200    2,1   mi tert.-Butyl-    nitrit zu und lässt 15 Minuten   bei 150    stehen. Nach Abkühlen   auf 200    werden 4,8 ml Triäthylamin zugegeben, dann eine Lösung von 9,0 g des unter 34) beschriebenen Produktes in 210 ml 90%igem Dimethylformamid. Durch kräftige Kühlung hält man die Innentemperatur auf - 150.

  Im Laufe einer Stunde wird auf   0     erwärmt, wobei durch gelegentliche Zugabe von Triäthylamin das pH auf 7-8 gehalten wird. Insgesamt werden noch 3,5 ml Triäthylamin zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei   0     wird in 3 1 Äther eingegossen, die flockige Fällung abfiltriert und zweimal mit Äther und einmal mit Wasser gewaschen. Das Rohprodukt wird in 500 ml warmem Methanol gelöst und durch Eingiessen in 1,5   1    %ige Essigsäure wieder ausgefällt. Das abfiltrierte und zweimal mit Wasser gewaschene Produkt wird nochmals auf gleiche Weise umgefällt.   Rflol)    = 0,33 (auf Silicagelplatten).



  36. H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr  (tBu)-Ala-lle-Gly-OH
1,7 g des obigen geschützten Dodekapeptids werden in 100 ml   8Q%iger    Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10% Pd) wie üblich hydriert. Nach Abfiltrieren vom Katalysator wird im Hochvakuum bei   30     stark eingeengt und der Rückstand mit tert. Butanol lyophilisiert.



  Das in quantitativer Ausbeute erhaltene, im Dünnschichtchromatogramm   (Rftoo    = 0,1 auf Silicagel) einheitliche Produkt wird sofort weiterverarbeitet.



  37. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn     -Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tssu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala.



   -Ile-Gly-OH   
1,73 g des unter 22) beschriebenen Peptidderivats werden bei   50     in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Abkühlen   auf 200    werden 0,9 ml 4,2-n. Chlorwasserstoff in Dioxan zugetropft. Dann gibt man   bei -15"    0,22 ml tert. Butylnitrit zu und lässt 15 Minuten   bei 150    reagieren. Nun kühlt man wieder   auf 200    ab und lässt 0,52 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 1,6 g des unter 36) beschriebenen Peptidderivats in 40   ml    90%igem Dimethylformamid zutropfen.



  Man erhöht die Temperatur innerhalb 1 Stunde auf   0 ,    wobei durch portionenweise Zugabe von Triäthylamin das pH auf 7-8 gehalten wird. Insgesamt werden 0,25 ml Triäthylamin zugegeben. Nach weiteren 15 Stunden Rühren bei   0     wird das Produkt durch Eingiessen in Äther gefällt, die Fällung abfiltriert und mit Äther und Wasser gewaschen. Zur Reinigung wird einmal aus Dimethylformamid-Essigester und einmal aus Dimethlformamid -0,02 n. Salzsäure umgefällt. Das reine Material zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel   Rflon    = 0,40.



  38.   Z-Ala-pro-NH2   
2,28 g H-Pro-NH2 und 7,57 g Z-Ala-ONP werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und die gelbe Lösung wird 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird im Hochvakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Äther versetzt und das entstehende Pulver gründlich zerrieben. Nach Abnutschen und Trocknen werden 5,5 g Z-Ala -Pro-NH2 von F.   167,5-168,5"    erhalten.   [x]D20      = -74"    (c = 1 in Methanol).



  39.   Z-Gly-Ala-Pro-NH,   
27,1 g des obigen Dipeptidderivats werden in 425 ml Äthanol gelöst und nach Zugabe von 85 ml 1,0-n. wässeriger Salzsäure in Gegenwart von 4,25 g Palladium-Kohle (10% Pd) hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird die Lösung bei   40-50"    Badtemperatur im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird bei   40     in 40 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf   20     abgekühlt. Sodann werden 29,1 g Z-Gly-ONP zugegeben und nach Lösen innerhalb 45 Minuten 11,2 ml absolutes Triäthylamin unter Rühren zugetropft. Danach wird während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.



  Die Suspension wird bei   40     und 0,01 Torr eingedampft und der Rückstand zwischen 600 ml Wasser und 300 ml Äther verteilt. Die wässerige Schicht wird zweimal mit je 300 ml Äther und die Äther-Schicht zweimal mit je 300   ml    Wasser extrahiert. Die wässerigen Fraktionen werden gemeinsam im Vakuum bei 40-500 eingedampft und mehrmals durch   Zu- .   

 

  gabe von Chloroform und Eindampfen von Wasser befreit.



  Der gut getrocknete Rückstand wird bei   40-50"    in 500 ml Essigester aufgenommen, unlösliches Triäthylamin-hydrochlorid abfiltriert und das Filtrat bei   30-40"    mit 10 ml Äther versetzt, worauf Kristallisation eintritt. Nach ca. 20stündigem Stehen bei   + 5     bis   + 100    werden die Kristalle isoliert, gewaschen und getrocknet. F.:   105-106".    Das Produkt enthält 3% Triäthylamin-hydrochlorid. Es kann in dieser Form weiter  umgesetzt werden. Zur Reinigung werden 5,0 g des obigen Rohkristallisats in 10 ml Wasser gelöst und nach Zugabe von 20 ml Methylenchlorid mit 15 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung versetzt.

  Die organische Schicht wird abgetrennt, mit 10 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung extrahiert, die wässerige Schicht wird mit 15 ml Methylenchlorid extrahiert.



  Die vereinigten Methylenchloridlösungen werden mittels wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus 50 ml Essigester kristallisiert. Man erhält 4,4 g Tripeptidderivat, F. 109-1120. Nach Kristallisation aus Aceton-Methanol-Äther (10: 4: 6) werden Kristalle vom F. 144,5-145,5  erhalten (Kristallpolymorphie).   [5C]D2     =    -93"    (c = 1,0 in Methanol). Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel in Chloroform + Methanol (8 : 2) ist Rf = 0,38).



  40.   H-Gly-A la-Pro-NH2   
18,8 g des unter 39) erhaltenen rohen Tripeptidamidderivates werden in 400 ml Dimethylformamid gelöst und in Gegenwart von 1,0 g Palladium-Kohle (10% Pd) hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird filtriert und die Lösung nach kurzem Entgasen in der nächsten Stufe eingesetzt.



  41.   Z-Val-Gly-AIa-Pro-NH2   
Zu der unter 40) erhaltenen Lösung des Tripeptidamids (550 ml) gibt man 20,1 g Z-Val-p-Nitrophenylester und lässt das Gemisch während 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Danach wird bei   50-60"    und 0,01 Torr zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit 300 ml Äther verrieben und filtriert. Der Filterrückstand wird getrocknet und in 210 ml absolutem Äthanol während 15 Minuten bei   70-80"    gerührt, auf   0     gekühlt und filtriert. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von 170 ml absolutem Tetrahydrofuran, 25   ml    Wasser und 110 ml Äther kristallisiert. F. =   209-2110.    Rf-Wert auf Silicagelplatten = 0,42 in Chloroform-Methanol (8 : 2).



  42.   H-Val-Gly-Ala-Pro-NH   
1,1 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 werden in 50 ml 80%igem Methanol gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 0,3 g Palladium-Kohle (10% Pd) hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird vom Katalysator abgenutscht, die Lösung eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum bei   35     Badtemperatur getrocknet. Dabei wird das Tetrapeptid H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 als farblose Substanz erhalten, Rf-Wert = 0,20 (Silicagelplatten, System Chloroform-Methanol =   1:1).   



  43. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn    -Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thrf tBu)-Ala-  -Ile-GIy- Val-Gly-A la-Prn-NH2   
800 mg des unter 37) beschriebenen Peptidderivats, 500 mg H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 und 170 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, im Hochvakuum auf etwa die Hälfe eingeengt und mit 250 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird mit Äther ausgefällt und das Material isoliert. Gereinigt wird durch Craig-Verteilung im Gemisch Methanol-Puffer (wie Beispiel 3, 12)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10: 3: 5: 6), K = 0,29. Das aus der Verteilung isolierte reine Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm   Rflo,    = 0,62 (auf Silicagelplatten).



  44.H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn  -Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala  -lle-Gly-   Val-Gly-A      la-Pro -NH   
300 mg des obigen Peptidderivats werden in 30   ml    80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 100 mg Palladiumkohle (10% Pd) hydriert. Nach vollständiger Decarbobenzoxylierung wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum bei   30     stark eingeengt und der Rückstand aus tert. Butanol lyophilisiert. Der Rückstand wird in 10 ml Methanol gelöst, durch Zugabe von   l-n.    Natriumbicarbonat schwach alkalisch gemacht und durch Eintropfen in   0,1 -n.   



  Natriumcarbonat ausgefällt. Das isolierte Produkt wird   noch-    mals gleich umgefällt. In Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist   Rfloo    =   0,34.   
EMI25.1     




   -Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu) -Phe    -Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-  -Ala-lle-Gly- Val-Gly-Ala-Pro-NH,   
288 mg des obigen Produktes, 181 mg des unter 12) beschriebenen Peptidderivats und 46 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 2 ml Dimethylformamid unter   Oberleiten    von Stickstoff bei   45"    gelöst. Nach Zugabe von 52 mg Dicyclohexylcarbodiimid wird noch 3 Stunden bei   45"    gerührt, darauf mit peroxidfreiem Äther gefällt und das Produkt isoliert. Gereinigt wird durch eine Craig-Verteilung im System Methanol Puffer (wie in Beispiel 3 unter 12) beschrieben Chloroform Tetrachlorkohlenstoff   (11:    3 : 6: 7); K = 0,74.

  Das aus der Verteilung isolierte reine Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm Rf52A   =    0,4;   Rfloo    = 0,35 (auf Silicagel).



   Beispiel 3
EMI25.2     
 -Gln-Asn-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile   -Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2    (Asn'5-Calcitonin M) 53 mg feinst gepulvertes
EMI25.3     

EMI25.4     
 -Gln-Asn-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln -Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 werden in 2 ml konzentrierter Salzsäure bei   0     gelöst und 5 Minuten umgeschwenkt. Dann entfernt man den gasförmig gelösten Chlorwasserstoff am Hochvakuum während 5 Minuten, verdünnt mit 4 ml eiskaltem Wasser und überführt das Produkt in das essigsaure Salz an einer kleinen Säule Amberlite CG-45 (schwach basischer Ionenaustauscher in Acetatform) un lyophilisiert. Man erhält das Produkt in Form eines farblosen Lyophilisats.



   Im UV-Spektrum in 10%iger Essigsäure ist   ),max    = 275 nm   (±      =    1700). Im Dünnschichtchromatogramm an Cellulose (Selecta) ist   Rf4S    = 0,48,   RflolA    = 0,49; an Aluminiumoxid (Alox, Camag) ist   Rf,9    = 0,57.



   In der Elektrophorese wandert die Substanz bei 280 V in 1,5 Stunden auf Cellulose-Selectaplatten in Richtung Kathode bei pH   =    1,9   (Essigsäure-Ameisensäurepuffer):    3,5 cm.

 

   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1.   Z-Gln-Asn-Phe-OCH"   
14,5 g Z-Gln-ONP werden zusammen mit 10,8 g H-Asn -Phe-OCH3, Hydrochlorid (Ann. 688, 259 [1965]) in 100   ml    Dimethylformamid gelöst und langsam mit 4,55 ml Triäthylamin versetzt. Es entsteht eine dicke Paste, die mit 50 ml Dimethylformamid verdünnt wird. Nach 24stündiger Reaktion bei Raumtemperatur wird filtriert und der Rückstand mit Di   methylformarnid    gewaschen. Der so erhaltene Z-Gln-Asn-Phe- -OMe kann aus viel heissem Dimethylformamid umkristallisiert werden. F.261-265  (Zers.)   [&alpha;]D20   = +11  (c = 0,94 in Hexamethylphosphorsäuretriamid).  



  2.   H-Gln-Asn-Phe-OCH,-hydrochlorid   
14,1 g   Z-Gln-Asn-Phe-OCHs    werden in 800 ml Methanol unter Zusatz von 8,5 ml 3-n.   Chlorwasserstoff    in Dioxan und 2,4 g   10tOiger    Palladiumkohle bei 45  hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung weiterverwendet.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rfs2A    = 0,27; Rf45 = 0,31;   Rf43E    =   0,50.   



  3.   Z-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH,   
9,3 g H-Gln-Asn-Phe-OCH8-Hydrochlorid werden mit 11,9 g Z-Thr(tBu)-OSU-in 150 ml Dimethylformamid zu einer klaren Lösung gelöst. Dazu werden 2,85 ml Triäthylamin in 10   ml    Dimethylformamid getropft und 21 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Anschliessend wird am Vakuum eingeengt, der Rückstand in viel Essigester-Chloroform   (9:1)    aufgenommen und ausgeschüttelt mit 2 X 200 ml   5%iger    Zitronensäure und   I    X 100 ml Wasser. Nun filtriert man den unlöslichen Niederschlag ab, schüttelt das Filtrat noch mit 2 X 200 ml 2-n. Sodalösung und 3 X 100 ml Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat und dampft ein.

  Der Eindampfrückstand wird mit dem oben erhaltenen Filtrationsrückstand zusammen aus   DimethylformamidlÄther      (1:1)    umkristalli   siert.F237-241       (Zers.);      [x]D20    =   +8     (c = 1% inDimethylformamid).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52 = 0,59; Rf102E = 0,59; an Aluminiumoxid (Alox) ist Rf43A = 0,59.



  4.   H-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH3   
6,31 g   Z-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH3    werden in 600 ml Methanol zusammen mit 700 mg   1046iger    Palladiumkohle bei Zimmertemperatur in der Schüttelente neutral hydriert.



  Die Substanz geht allmählich in Lösung. Den amorphen Eindampfrückstand setzt man direkt in der nächsten Kondensation ein.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52 = 0,21,   Rflo2A    = 0,21; an Aluminiumoxid ist Rf43A = 0,19.



  5.   Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH,   
Eine Lösung von 5,9 g Z-Tyr(tBu)-OH (freigesetzt aus 8,8 g Z-Tyr(tBu)-OH-dicyclohexylammoniumsalz) in 85 ml Tetrahydrofuran wird mit 1,84 ml N-Methylmorpholin versetzt und bei -33  mit 2,28 ml Chlorameisensäure-isobutylester zur Reaktion gebracht. Man rührt eine halbe Stunde bei -20 bis -12  und lässt dann die   auf 10    abgekühlte Lösung des Tetrapeptidderivates H-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe -OCH3 in 25 ml Dimethylformamid hinzulaufen und spült mit 15 ml Dimethylformamid. Nach Reaktion bei Zimmertemperatur während 19 Stunden wird am Vakuum eingeengt, in Essigester suspendiert und 3mal mit 5%iger Zitronensäurelösung, 3mal mit 2-n. Sodalösung und 5mal mit halbgesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Man filtriert vom suspendierten Rückstand ab und trocknet diesen am Hochvakuum.

  Das Produkt lässt sich aus Methanol kristallisieren.



  F. 216-2190;   [al20    =   +4     (c = 1,0 in Dimethylformamid).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52 = 0,64;   Rf1Ot,A    = 0,70; an Aluminiumoxid (Alox) ist   Rf±3A    = 0,65; Rf80 = 0,17.



  6. H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH3
5,1 g   Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH,    werden in 600 ml Methanol bei Zimmertemperatur mit 800 ml 10%iger Palladiumkohle wie üblich decarbobenzoxyliert. Das erhaltene H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH3 weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende Werte auf: Rf89 = 0,15:   Rfio..,E      =    0,28; Rf in Chloroform-Methanol (9:1) = 0,11.



  7. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH3
Das unter 6. erhaltene Pentapeptidderivat H-Tyr(tBu)   -Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH,,    wird mit 4,3 g Z-Thr(tBu) -OSU in 40 ml Dimethylformamid gelöst und 18 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt wie unter 5. Den in Essigester schwerlöslichen Rückstand kristallisiert man aus Methanol um. F. 206-208 ;   [G1D20    =   + 150    (c = 1,7% in Dimethylformamid); im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf102E = 0,69; Rf89 = 0,28; Rf in Chloroform-Methanol (9:1) = 0,30.



  8. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-NH-NH2
2,0 g Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH3 werden   ion 150      ml    Methanol gelöst und mit 10,7 ml Hydrazinhydrat 6 Stunden bei Zimmertemperatur zur Reaktion gebracht. Man filtriert vom Niederschlag ab, wäscht diesen mit Methanol und trocknet am Hochvakuum über konzentrierter Schwefelsäure. F.   231     (Zers.);   [a]n20    = +40 (c = 0,89 im Dimethylformamid.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rf43e    = 0,57;   Rf4s    = 0,60: Rf102E = 0,58.



  9.   Z- Thr(tBu)-Tyr(tBu) -Thr(tBu)-GIn-Asn-Phe-Asn-Lys-     (BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-lle  -Gly-OH
800 mg Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu) -Thr(tBu) -Gln-Asn-Phe-NH   -NH2    werden in 18 ml Dimethylformamid gelöst,   bei 200    mit 0,58 ml 3-n. Chlorwasserstoff in Dioxan versetzt und mit 0,16 ml t-Butylnitrit vermischt. Man rührt 15 Minuten bei -20   bis - 150,    gibt dann 0,30   ml    N,N-Diisopropyl-äthylamin und 855 mg H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln- -Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH (Acetat) in 20 ml Dimethylformamid (90%ig) zu und rührt bei 0 . Nach zweimal einer Stunde gibt man je 0,075 ml N,N-Diisopropyl-äthylamin (insgesamt 0,15 ml) zu und rührt 15 Stunden bei 0 .

  Dann rührt man den Ansatz in 600 ml Äther ein, lässt den Niederschlag sich absetzen und nutscht ab. Zur Reinigung wird das Rohprodukt einmal aus Dimethylformamid-Essigester und einmal aus Dimethylformamid-wässerige 0,002-n. Salzsäure umgefällt.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf43E E = 0,62; Rf100 = 0,32;   Rf4s    = 0,53; Rf3 =   0,27.   



  10. Z-   Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-A sn-Phe-Asn-Lys-        (BOC)-Phe-FIis-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-lle-
Gly-Fal-Gly-Ala-pro-NH2   
786 mg Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Phe-Asn-Lys (BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu) -Ala-Ile-Gly -OH und 251 mg   H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2    werden zusammen mit 82 mg N-Hydroxysuccinimid in 10 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt und unter Rühren bei   40     mit 90 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Dimethylformamid versetzt.

 

  Nach 3 Stunden bei   40     gibt man weitere 65 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt insgesamt 21 Stunden bei 40 .



  Man verdünnt mit 10 ml Methanol und rührt in 350 ml Äther ein, lässt den Niederschlag sich absetzen und filtriert ihn ab.



  Das Präzipitat wird durch Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:6, Puffer wie in Beispiel 1 unter 18) gereinigt.



   Nach 450 Stufen wird die nach Dünnschichtchromatographie einheitliche Substanz isoliert (K = 0,66).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rf3    = 0,40; Rf45 = 0,42; Rf100 = 0,32.  



  11. H-Thr(rBu)-Tyr(tBu)-Thr(rBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys  (BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile    -Gly-Val-Gly-A la-Pro-NH2   
64 mg Z-Thr(tBu) -Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn -Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-lle -Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 werden in 100   ml    80%iger Essigsäure in Gegenwart von 16 mg 10%iger Palladiumkohle bei Zimmertemperatur in der Schüttelente während 15 Stunden hydriert. Man nutscht vom Katalysator ab, wäscht diesen mit demselben Lösungsmittelgemisch und lyophilisiert. Man erhält 54 mg des Docosapeptid-amid-acetats. Dieses wird in 10 ml warmem Methanol gelöst, mit einigen Tropfen l-n. Natriumbicarbonatlösung auf pH ca 7,5 gestellt und in 50 ml 0,1-n. Sodalösung von   0     eingerührt.



   Man lässt die milchige Fällung sich absetzen, nutscht sie ab, wäscht sie mit Wasser und trocknet
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rfs5i      =      0,50;    Rf110 = 0,61;   Rf52    = 0,21.
EMI27.1     
 -Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys (BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile   -Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH   
EMI27.2     
 -Leu-Gly-OH, 95 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn- -Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu) -Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2, 14 mg N-Hydroxysuccinimid und 10 ml Dimethylformamid werden unter Stickstoff mit 15 mg Dicyclohexylcarbodiimid verrührt.

  Man rührt das Reaktionsgemisch bei   40     insgesamt 20 Stunden, wobei man nach 2 Stunden nochmals 15 mg   Dicyclohexylcarbodiimid    zugibt. Anschliessend trägt man den Ansatz in 300 ml absoluten Äther ein, lässt 2 Stunden im Kühlschrank stehen, nutscht den Niederschlag ab und wäscht ihn mit Äther. Zur Reinigung wird das Rohprodukt im System Methanol-Puffer Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (11: 3: 6: 7, Puffer wie in Beispiel 1 unter 18) über 220 Stufen multiplikativ verteilt.



  Die reinen Fraktionen (Gefässe 104-121; K = 1,0) werden vereinigt, eingedampft und am Hochvakuum bei   40     vom Ammoniumacetat befreit.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf45 = 0,60; Rf96 = 0,59;   Rfloo    = 0,32.



   Beispiel 4
EMI27.3     
 -Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile   -Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2      (N .Acetyl.Calcitonin    M)
EMI27.4     
 -Leu-Gly-Thr(tBu) -Tyr(tBu) -Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe    -Asn-Lys(BOC) -Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-    -Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 werden unter Stickstoffspülung bei   0     in 3   ml    95%iger Trifluoressigsäure aufgenommen und nach vollständigem Lösen 90 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Bei   0     wird mit 50 ml kaltem Äther ausgefällt, die Suspension zentrifugiert und der Niederschlag noch zweimal mit Äther verrieben.

  Das über Ätznatron am Hochvakuum getrocknete Produkt wird zur   Oberführung    in die Acetatform in 3   ml    Wasser aufgenommen, auf eine mit 0,02-n. Essigsäure   äquilibrierte    Säule von schwach basischem Ionenaustauscher (z.B. Merck; 7,5 mm; 20 cm) aufgebracht und mit 0,02-n. Essigsäure eluiert Das Eluat wird bei   25     am Hochvakuum eingedampft, der Rückstand in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Das weisse Pulver wird zur Reinigung einer Craig-Verteilung im System n-Butanol-Eisessig Wasser   (4:1:    5) (3 ml Phasenvolumen) unterworfen.

  Nach 600 Schritten werden die nach Dünnschichtchromatogramm einheitliches Produkt enthaltenden Fraktionen vereinigt, am Hochvakuum bei 250 eingedampft, in Wasser aufgenommen und   Iyophilisiert.    Trocknen über Ätznatron am Hochvakuum bei   Zimmertemperatlr    ergibt ein amorphes Pulver.



   Bei der Elektrophorese auf  Selecta  (pH   1,9;    1¸ Stunden; 280 V) läuft das   Produkt -1,8cm    bei pH 4,8-1,2 cm.



  Im   Dunnschichtchromatogramm    auf    Alox     Rf52 = 0,65;   Rf79      = 0,60,    Rf45 = 0,72; auf  Selecta  Rf45 = 0.55; Rf10lA = 0,63; Rf52 = 0,38.



   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1.   TRI-Cys(TRI)-G!y-Asn-Leu-OMe   
9,1 g TRI-Cys(TRI)-OH und 3,2 g H-Gly-Asn-Leu-OMe werden in   60 ml    Dimethylformamid aufgenommen und unter Rühren bei   0     mit 3,7 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.



  Nach 15 Stunden bei   0     wird vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform-Petroläther kristallisiert. F.   126-1300.   



  Im   Dünnschichtchrosnatogramm    an Silicagel ist Rf = 0,27 im System Chloroform-Methanol (95: 5).



  2.   H-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe.    Acetat
1,8 g TRI-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe werden in   16 ml    Eisessig gelöst und bei Zimmertemperatur tropfenweise mit 4 ml Wasser versetzt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur gibt man   12 ml    Wasser zu, filtriert vom ausgeschiedenen Tritylcarbinol ab und dampft das Filtrat am Hochvakuum bei   40     zur Trockne ein. Der ölige Rückstand wird in tert.-Butanol aufgenommen und lyophilisiert. Es resultiert ein weisses Pulver, welches im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf = 0,45 im System: Chloroform/Methanol (8 : 2) aufweist.



  3. Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe
Zu 1,02 g H-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe, Acetat und 0,9 ml Eisessig in   15 ml    Chloroform werden bei   0     1,9 g Dicyclohexylcarbodiimid trocken zugegeben Nach ca. 10 Minuten ist das Reaktionsgemisch zu einem Brei erstarrt Es wird mit   10 ml    Chloroform verdünnt und die Mischung 4 Stunden bei   0     gerührt. Nach Zugabe von 30 ml Petroläther wird abfiltriert und der Niederschlag aus heissem Chloroform   umkri    stallisiert. F. 156-1580. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,25 im System Chloroform-Methanol (9:1).



  4.   A c-Cys(TRI)-GIy-Asn-Leu- NH-NH,   
Man versetzt 2,42 g Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe in 21 ml Dimethylformamid mit 3,75 ml Hydrazinhydrat und lässt die klare Lösung 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Dann kühlt man auf   0     ab und gibt unter Rühren   150531    Wasser hinzu. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet.



  Zur Reinigung wird aus heissem Methanol umgefällt.   Rf5    = 0,55 im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel.



  5. Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)  -Met-Leu-Gly-OH
1,44 g   Ac-Cys(TR1)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2    werden in   10 ml    Dimethylformamid gelöst und unter Stickstoffspülung bei -10  mit 2,5 ml 2,0-n. Chlorwasserstoff in Essigester und   0,26531    t-Butylnitrit versetzt. Nach 15 Minuten bei -10  wird eine   auf - 100      gekühlte    Lösung von 1,02 g H-Ser(tBu)-Thr   (tBu)-CysClRI)-Met-Leu-Gly-OH    (essigsaures Salz) und   0,84 ml    Triäthylamin in   12 ml    Dimethylformamid tropfenweise so zugegeben, dass die Temperatur -   100    nie übersteigt. Es wird noch eine Stunde bei -10  gerührt und 24 Stunden bei   0     stehen gelassen. 

  Das Produkt fällt als Gel   aus.     



  Die Reaktionsmischung wird auf ca. 5 ml eingeengt, durch Zugabe von 20 ml Methanol vollständig ausgefällt, abfiltriert und mit kaltem Dimethylformamid-Methanol   (1:1)    gewaschen. Nach dreimaligem Verreiben mit kaltem Wasser und Trocknen über Ätznatron wird einmal aus Dimethylformamid-Methanol umgefällt, wodurch das schwer lösliche Produkt in reiner Form erhalten wird. Rf = 0,25 im System Chloroform-Methanol (8: 2) an Silicagel.
EMI28.1     




   -OH
Eine Lösung von 410 mg Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser   (tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH    in 35 ml Dimethylformamid wird bei Zimmertemperatur innert 15 Minuten in eine stark gerührte Lösung von 1,0 g Jod in 150 ml Methanol getropft. Nach beendetem Eintragen wird noch eine Stunde gerührt, dann auf   0     gekühlt und die Reaktionslösung durch tropfenweises Zugeben von   1,0-n.    Natriumthiosulfatlösung entfärbt. Am Wasserstrahlvakuum bei   30     wird zunächst Methanol abgedampft und dann am Hochvakuum   (30 )    auf ca. 10   ml    eingeengt und mit 200 ml Äther versetzt.



  Vom ausgefallenen Harz wird abdekantiert, dreimal mit Äther und dreimal mit Wasser verrieben und über Ätznatron am Hochvakuum getrocknet. Zur Reinigung wird in Chloroform gelöst, filtriert und das Produkt aus dem Filtrat mit Hexan ausgefällt.   Rf,0    = 0,50;   Rf4SC    = 0,35 an Silicagel.
EMI28.2     




      -Giy-Thr(tssu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu).Gln-Asp(OtBu)-Phe-  -Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-  -Ala-lle-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2   
116 mg   Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu).Thr(tBu)-Cys-Met-    -Leu-Gly-OH, 250 mg   H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-       -Asp(OtBu) -Phe-Asn-Lys(BOC) -Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-    -Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 und 16 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 2   ml    Dimethylformamid gelöst und dazu bei Zimmertemperatur 30 mg Dicyclohexylcarbodiimid trocken zugegeben und unter Stickstoffspülung 24 Stunden bei   40     stehen gelassen.

  Der Ansatz wird dann, ohne dass man vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, am Hochvakuum zu einem Öl eingeengt und dieses mit Methanol-Äther   (1:1)    zu einem Pulver verrieben und abfiltriert.



  Das Produkt wird gereinigt durch zweimaliges Umfällen aus Methanol-Äther.   Rf43l;    = 0,50;   Rf52A    = 0,30;   Rfloo    = 0,32; Rf107 = 0,65 an Silicagel.



   Beispiel 5
EMI28.3     
 -Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala   -lle-Gly-Val-Gly-Ala-Prn-NH    (Desamino-Calcitonine M)
EMI28.4     
 -Leu-Gly-Thr(tBu) -Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe   -Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu) -Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-    -Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 werden unter Stickstoffspülung bei   0     mit 0,95 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Man lässt noch 5 Minuten reagieren, legt dann unter Rühren ein Hochvakuum an das Reaktionsgefäss, gibt nach 5 Minuten 40 ml tert.Butanol zu und lyophilisiert. Es resultiert ein voluminöses weisses Pulver. Im Dünnschichtchromatogramm an Cellulose ist Rf45 = 0,54, Rf52 = 0,34, an Aluminiumoxid ist   Rf45      +    0,47,   Rf.,2    = 0,61 und Rf70 = 0,66.



   Das Produkt hat in der Elektrophorese auf Cellulose  Selecta  1440 (pH   1,9;      1/2    Stunden, 280 V) eine Laufstrecke von 1,8 cm; bei pH 4,8   1,2    cm zur Kathode.



   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1. Bmp(TRI)-OH
Man löst 6,37 g frisch destillierte   p-Mercaptopropionsäure    in 100 ml Benzol und gibt bei   0     unter Stickstoffspülung 25,1 g Triphenylchlormethan portionenweise zu. Nach beendetem Eintragen wird die Eiskühlung entfernt. Aus der zunächst klaren Lösung beginnt das Produkt auszufallen. Nach 2 Stunden wird auf   0     gekühlt, filtriert und mit kaltem Methanol   gewaschen.    Umkristallisation aus Methylenchlorid Methanol liefert das reine Produkt vom F. 200 -   201".   



  2. Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe
Zu einer bei   0     gerührten Lösung von 2,62 g Bmp(TRI) -OH und 1,58 g H-Gly-Asn-Leu-OMe in 30 ml Dimethylformamid werden 1,85 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben.



  Nach 24 Stunden bei   0     wird vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat bei   40     zur Trockne eingedampft. Das Produkt wird durch Umfällen aus Methanol gereinigt. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf45 = 0,67.



  3. Pmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2
1,06 g Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe werden in 30 ml Methanol mit 3 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur kristallisiert das Hydrazid bei Animpfen aus. Es wird aus heissem Methanol umkristallisiert. F. 190   194 .    Rf = 0,35 im System Chloroform-Methanol (8 : 2).



  4.   Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-     -Leu-Gly-OH
926 mg   Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH3    werden in 8 ml Dimethylformamid   bei 150    mit 2,21 ml 2,21 -n. Chlorwasserstoff in Essigestser und 0,18 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 15   Minuten bei 100      wird eine auf - 100    gekühlte Lösung von 1,38 g H   Ser(tBu).Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH    und 0,7 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid zugetropft. Es wird noch eine Stunde   bei -10"    gerührt und 15 Stunden bei   0     stehen gelassen. Nach Zugabe von 20 ml Methanol wird abfiltriert, der Niederschlag mit kaltem Methanol gewaschen, dann in Wasser zerrieben, filtriert und über Ätznatron getrocknet.

  Das dünnschichtchromatografisch einheitliche Produkt liegt zu   40%    als Triäthylammoniumsalz vor. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,55 im System Chloroform-Methanol (7: 3).
EMI28.5     




   -OH
Zu einer Lösung von 1,4 g Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser (tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH in 150 ml Dimethylformamid gibt man bei Zimmertemperatur 0,3 ml   1,0-n.   



  Salzsäure. Die Lösung wird innert 30 Minuten zu einer stark gerührten Lösung von 2,25 g Jod in 500 ml Methanol getropft. Die Mischung wird noch eine Stunde bei Zimmertemperatur gerührt, dann auf   0     abgekühlt und durch tropfenweise Zugabe von 1,0-n. wässriger Natriumthiosulfatlösung entfärbt. Nach Zugabe von 1,6   ml    0,5-n. Natronlauge wird bei   40     Badtemperatur auf ca. 20 ml eingeengt, mit ca. 400 ml Äther versetzt und abdekantiert. Der Rückstand wird mit 20 ml Wasser zerrieben, filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und über Ätznatron getrocknet. Das Produkt wird durch Umfällen aus Chloroform-Äther gereinigt. 

  Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rf12lA    = 0,43; Rf100  = 0,34; Rf43 = 0,28.
EMI28.6     
   -Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn- -Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala- -Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2    46 mg
EMI28.7     
 -Gly-OH, 81 mg   H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp-         (OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu) -Phe-Pro-Gln-     -Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2, 9,7 mg N-Hy droxysuccinimid und 13 mg Dicyclohexylcarbodiimid werden in 2 ml Dimethylformamid   3    Stunden bei 45  gehalten. Die klare Lösung wird dann in 40   ml    absolutem Äther bei   0     ge tropft und das ausgeschiedene Produkt abfiltriert. Gereinigt wird durch Umfällen aus Methanol-Wasser.

  Rf45 = 0,38 im
Dünnschichtchromatogramm an Silicagel.



   Beispiel 6    H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-  -Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-  -Ile-Gly- Val-Gly-Ala-Pro-OH   
120 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys  -Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)    -Phe-Asn-Lys(BOC) -Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-     -Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-OtBu werden mit 3   ml    95%iger Trifluoressigsäure   134    Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur aufbewahrt, dann mit peroxidfreiem   Ather    ausgefällt. Das abfiltrierte Produkt wird mit Äther säurefrei gewaschen, dann in 0.02-n. Essigsäure gelöst, durch eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II (schwach basisch, Acetatform) filtriert und das Eluat lyophilisiert.

  Das erhaltene Dotriacontapeptid wandert in der Elektrophorese auf  Selecta  bei pH 1,9 und 280 V in   1    Stunden 3,0 cm zur Kathode, bei pH 4,8 1,5 cm. Rf79 = 0,45; Rf52 = 0,42; Rf45 = 0,40 an     Alox";    Rf52 = 0,28; Rf45 = 0,42; Rf101A = 0,50 an  Selecta".



   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1. H-Pro-OrBu
9,15 g Z-Pro-OtBu werden in 100 ml Methanol und 1,0 g Pd-Kohle (10%) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach 30 Minuten beendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei   30     eingedampft. Das resultierende Öl ist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel einheitlich. Rf =   0,55    im System Chloroform-Methanol   (1:1).   



  2. Z-Ala-Pro-OtBu
10,32 g Z-Ala-ONP und 5,0 g H-Pro-OtBu werden in 10 ml Essigester eine Stunde bei   0     und 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann verdünnt man mit 100 ml Essigester, wäscht mit zu 50% gesättigter Kaliumcarbonatlösung und mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Das resultierende   Öl    ist laut Dünnschichtchromatogramm an Silicagel einheitlich [Rf = 0,65 im System Chloroform-Methanol   (9:1)]    und wird direkt weiter verwendet 3. H-Ala-Pro-OtBu
9,36 g Z-Ala-Pro-OtBu werden in 100   ml    Methanol in Gegenwart von 500 mg Pd-Kohle (10%) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach 90 Minuten beendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei 30  zu einem Öl eingedampft.

  Dieses erweist sich im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel als einheitlich. Rf = 0,35 im System Chloroform-Methanol    < 1:1).   



  4. Z-Gly-Ala-Pro-OtBu
1,65 g Z-Gly-ONP und 1,09 g H-Ala-Pro-OtBu werden in 20 ml Essigester eine Stunde bei   0     und 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Es wird dann mit Essigester verdünnt, mit zu 50% gesättigter Kaliumcarbonatlösung und mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Es resultieren 2,06 g eines dünnschichtchromatographisch einheitlichen öls. Rf = 0,8 im System Chloroform Methanol   (1:1)    an Silicagel.



  5. H-Gly-Ala-Pro-OtBu
2,06 g Z-Gly-Ala-Pro-OtBu werden in 30 ml Methanol in Gegenwart von 300 mg Pd-Kohle (10%) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach 90 Minuten beendet. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat auf ca. 5 ml eingeengt. Man gibt 10 ml Äther zu. Über Nacht kristallisiert das Produkt aus. F. 132-1340; Rf = 0,3 im System Chloroform-Methanol   (1:1)    an Silicagel.



  6. Z-Val-Gly-Ala-Pro-OtBu
3,73 g Z-Val-ONP und 2,99 g H-Gly-Ala-Pro-OtBu werden in 12 ml Essigester eine Stunde bei   0     und 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach dem Verdünnen mit Essigester wird mit zu   50%    gesättigter Kaliumcarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Wasserstrahlvakuum bei 300 eingedampft. Das Öl wird aus Methanol-Wasser kristallisiert. F.   73-750.    Im Dünnschicht   chromatogrammfian    Silicagel ist Rf = 0,42 im System Toluol Aceton   (1:, 1) und    Rf = 0,46 im System Chloroform-Methanol (9   :1).   



  7.   H-Val-Gly-Ala-Pro-OtBu   
533 mg Z-Val-Gly-Ala-Pro-OtBu werden in 10 ml Methanol in Gegenwart von 300 mg Pd-Kohle (10%) bei Zimmertemperatur hydriert, Nach 20 Minuten ist die Wasserstoffaufnahme beendet. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat am Wasserstrahlvakuum bei   30     zu einem öl eingedampft Rf = 0,52 im System Chloroform-Methanol   (1:1)    an Silicagel.



  8. H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn  -Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala    -lle-Gly-OH   
270 mg Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu) -Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu) -Ala-Ile-Gly-OH werden in 30 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 50 mg Pd-Kohle (10%) hydriert, bis die Abspaltung der Carbobenzoxygruppe beendet ist. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung im Hochvakuum bei   30     stark eingeengt und dann aus t-Butanol lyophilisiert. Die Ausbeute ist quantitativ.



  9. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu  -Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe  -Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)    -Ala-lle-Gly-OH    181 mg
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 -Met-Leu-Gly-OH werden in 1,8 ml peroxidfreiem Tetrahydrofuran gelöst und bei   -      bis15     unter Überleiten von Stickstoff mit 0,017 ml N-Methylmorpholin und 0,019   ml      Chlorameisensäure-isobutylester versetzt Nach 10 Minuten    bei dieser Temperatur wird eine Lösung von 255 mg des unter 8) erhaltenen Octadekapeptidderivats in 5 ml 95%igem Dimethylformamid und 0,02 ml N-Methylmorpholin zugefügt. Man rührt noch 30 Minuten bei -10  und 2 Stunden bei 0 . 

  Durch Zugabe von peroxidfreiem Äther wird das Rohprodukt ausgefällt, dieses wird nochmals in Dimethylformamid gelöst und durch Eintropfen in eiskalte 0,02-n. Salzsäure ausgefällt. Zweimaliges Umfällen aus Dimethylformamid-Essigester liefert ein reines Produkt. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rfs2    = 0,43.  
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      -Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tssu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe.   



   -Asn-Lys(BOC)-Phe-His- Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)    -Ala4le-Gly-Val-Gly.Ala-Pro-OtBu   
374 mg des unter 9) beschriebenen Peptidderivats, 160 mg H-Val-Gly-Ala-Pro-OtBu, 46 mg Hydroxysuccinimid und 3 ml Dimethylformamid werden unter Stickstoff bei Raumtemperatur mit 62 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Durch Versetzen mit Äther wird das Produkt ausgefällt, abfiltriert und gut mit Äther und Essigester gewaschen. Das Produkt wird nochmals in Dimethylformamid gelöst und durch Eintropfen in eiskalte 0,05-m. Zitronensäure gefällt.



   Beispiel 7   Ne-Acetyl-Calcitonin    M
100 mg Calcitonin M-Acetat (oder -Hydrochlorid) werden in 5 ml Wasser-Dimethylformamid   (2:1)    gelöst, mit 77 einer 10%igen Lösung von p-Nitrophenylacetat in Dimethylformamid versetzt und durch Zugabe von 0,5 -m. wässeriger Triäthylaminlösung auf pH 9,1 gebracht. Bei diesem pH setzt die Reaktion ein und wird durch kontinuierliche Zugabe von Triäthylamin unter Konstsanthalten des pHs in ca. 1 Stunde zu Ende gebracht. Man fügt sodann 150   al   Eisessig zu und extrahiert dreimal mit je 10 ml Essigester. Die wässerige Phase wird zur Trockne eingeengt und der Rückstand mittels Craig Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser   (4:1:    5) über 170 Stufen gereinigt.

  Aus den Verteilungselementen Nr. 109-138   (r0    = 122; K = 2,5) erhält man beim Einengen zur Trockne das reine   N-Acetyl-Calcitonin    M als amorphes, wasserlösliches Pulver.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Cellulose ( Selecta ) ist   RflolA    = 0,67; an Aluminiumoxid ( Alox  der Fa. Camag) ist   Rf3    = 0,68.



   Bei der Elektrophorese auf Cellulose-Dünnschichtplatten ( Selecta ) wandert die Substanz bei 17 Volt/cm in   1    Stunden bei pH 1,9 2,6 cm zur Kathode, bei pH 8,0 0,6 cm zur Anode.



   Beispiel 8 Mono- und diacetyliertes Calcitonin M
10 mg Calcitonin M-Acetat werden in 2 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, mit 0,5 ml einer 1%igen Lösung von p-Nitrophenylacetat in Dimethylformamid versetzt, mit Stickstoff gespült und das verschlossene Gläschen während 30 Min. bei   40     stehen gelassen. Man gibt sodann 5 ml 2-n.



  Essigsäure zu, extrahiert das überschüssige p-Nitrophenylacetat und das gebildete p-Nitrophenol mit Essigester (2 X 30 ml), dampft die wässerige Phase im Vakuum zur Trockne ein, löst wieder in 0,5 ml 95%iger Essigsäure und lyophilisiert. Das Produkt besteht aus einer Mischung von Monound Diacetylderivat, neben etwas Ausgangsmaterial. Das Monoacetylderivat ist wiederum ein Gemisch von   N -    und   Nt-Derivat,    wie sich in der Elektrophorese bei pH 8 zeigt.



   Die Auftrennung von Ausgangsmaterial, Mono- und Diacetylverbindung erfolgt in der Craig-Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser   (4:1:    5), oder in einer präparativen Dünnschichtelektrophorese auf Celluloseplatten ( Selecta ) bei pH 1,9   (1    Stunden bei 17 Volt/cm); Laufstrecken siehe unten. Das auf diese Weise erhaltene Gemisch der beiden Monoacetylderivate wird wiederum durch präparative Dünnschichtelektrophorese bei pH 8 (Puffer: 0,1 m. Triäthylaminlösung mit Kohlendioxid auf pH 8 eingestellt; 3 Stunden bei 17 Volt/cm) aufgetrennt. Für grössere Substanzmengen wendet man die kontinuierliche, trägerfreie Elektrophorese an, ebenfalls bei pH 8. In beiden Fällen verhält sich   N -Ace-    tyl-Calcitonin M elektrisch neutral, währenddem das   Nt-Ace-    tylderivat zur Anode läuft.



   Die Verbindungen weisen folgende Rf-Werte auf: Na -Acetyl-Calcitonin M auf  Selecta -Cellulose:   Rf1olA    = 0,67; auf Aluminiumoxid ( Alox  der Fa. Camag) Rf52 = 0,68.



  NE-Acetyl-Calicitonin hat in beiden Systemen die gleichen Rf-Werte wie   Na-Acetyl-Calcitonin    M (Calcitonin M weist in diesen Systemen   Rf1olA    = 0,56 und Rf52 = 0,62 auf); Na, Ne-Diacetyl-Calcitonin M zeigt in diesen beiden Systemen   Rf1olA    = 0,75 und   Rf,2    = 0,73.

  Bei der Elektrophorese auf Cellulose-Dünnschichtplatten ( Selecta ) ist die Laufstrecke von N - und von NE-Monoacetyl-Calcitonin M =   -2,6cm    bei pH 1,9; 90 Minuten; 17 Volt/cm; und die von   Na,      Ne-Di-    acetyl-Calcitonin M unter gleichen Bedingungen - 1,3 cm (die von Calcitonin M   -3,7cm).    Bei pH 8,0 wandert   N-Acetyl-    -Calcitonin M in 90 Minuten bei 17 Volt/cm + 0,6 cm, während   Na-Acetyl-Calcitonin    M (ebenso wie Calcitonin M) am   Startpunkt    bleibt.



   Beispiel 9
Das im Beispiel 1 beschriebene Ausgangsmaterial BOC
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 kann auch wie folgt hergestellt werden: 1. BOC-Ser-Thr-OBzl
Man gibt zu einer Lösung von 73,8 g BOC-Ser-OH, Dicyclohexylammoniumsalz in 500 ml Methylenchlorid 47,0 g H-Thr-OBzl, HCl in 300 ml Methylenchlorid, rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur und kühlt dann   auf -5".    Bei dieser Temperatur tropft man eine Lösung von 40,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 90 ml Methylenchlorid zu. Man rührt 3 Stunden   bei -5"    und die ganze Nacht bei Raumtemperatur.



  Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffs und Dicyclohexylamin-Hydrochlorids wird die Lösung ausgeschüttelt, und zwar dreimal mit 0,1-n. Salzsäure, zweimal mit 20%iger Kochsalzlösung, einmal mit 10%iger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit 20%iger Kochsalzlösung und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird auf ca. 600 ml eingeengt, auf   5     gekühlt und von weiterem Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Nach Eindampfen zur Trockne wird der Rückstand zur Reinigung aus Essigester-Hexan kristallisiert.



   F. 110-1110;   [CC]D      = -8,5"    (c = 2 in Dimethylformamid); Rf2 = 0,33 (an Silicagel).



  2. H-Ser-Thr-OBzl, TFA
65,7 g BOC-Ser-Thr-OBzl werden gelöst in 100 ml 90%iger Trifluoressigsäure und die Lösung eine Stunde bei   20     belassen. Hierauf wird sie unter Rühren in 1000 ml trockenen Äther eingetropft, eine Stunde gerührt und über Nacht bei   - 100    stehen gelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und dreimal mit trockenem Äther gewaschen und im Vakuum über Ätznatron getrocknet; F.   128-129";    Rf, = 0,65;   Rfg    = 0,50 (an Silicagel).



  3. BOC-Leu-Ser-Thr-OBzl
52,5 g H-Ser-Thr-OBzl, TFA werden in 145 ml Dimethylformamid gelöst und bei   0     mit einer Lösung von 48,0 g BOC-Leu-ONP versetzt. Man gibt alsdann 21 ml Triäthylamin und 0,75 ml Eisessig zu. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei   0     und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 2,1 Liter Essigester wird die Lösung ausgeschüttelt, und zwar zweimal mit Wasser, zweimal mit   0,1-n.    Salzsäure, zweimal mit 10%iger Kochsalzlösung, achtmal mit 20%iger Kaliumcarbonatlösung, zweimal mit 10%iger und einmal mit 30%iger Kochsalzlösung. 

  Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die Lösung auf ca. 1,4 Liter eingeengt. über Nacht im Eisschrank kristallisiert das geschützte Tripeptid vom F. 114-1160;   [lx]D      = -14"    (c = 2 in Dimethylformamid); Rf2 = 0,25 (an Silicagel).  



  4. H-Leu-Ser-Thr-OZzl, TFA
46,1 g BOC-Leu-Ser-Thr-OBzl werden in   92,5    ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei 200 belassen. Darauf wird unter Rühren trockener Äther (925 ml) zugegeben, eine Stunde bei   0     gerührt und über Nacht bei -10  stehen gelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, dreimal mit trockenem Äther gewaschen und im Vakuum über   Ätz-    natron getrocknet. F.   168-1710;    Rf7 = 0,80 (an Silicagel).



  5.   BOC-Asn-Leu -Ser-Thr-OBzl   
20,8 g BOC-Asn-OH werden in 208 ml Acetonitril aufgeschlämmt, mit 22,7 g Woodward's Reagenz K versetzt und 30 Minuten bei   20     gerührt. Dann   liisst    man unter Rühren 12,6   ml    Triäthylamin so zutropfen, dass die Innentemperatur   +32     nicht übersteigt, kühlt auf   20 ,    und rührt bei dieser Temperatur noch 50 Minuten. Die fast klare Lösung wird auf   0     gekühlt und mit einer ebenfalls auf   0     gekühlten Lösung von 39,1 g H-Leu-Ser-Thr-OBzl, TFA und 10,5 ml Triäthylamin in 257 ml Dimethylformamid versetzt.

  Man rührt das bald erstarrende Reaktionsgemisch über Nacht bei Zimmertemperatur, kühlt auf - 100 ab und rührt noch 2 Stunden bei   - 100.    Hierauf nutscht man die kristalline Fällung ab und wäscht das Tetrapeptidderivat einmal mit kaltem Acetonitril, einmal mit Essigester und dreimal mit Wasser, bis es Chloridfrei ist. Das erhaltene Produkt wird kristallisiert aus 370 ml Dimethylformamid, 3,7   ml    Eisessig und 370 ml AcetonitriL F. 225-226 ; [a]D   = 360    (c = 2 in Dimethylformamid);   Rf     = 0,85 (an Silicagel).



  6. H-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl, TFA
32 g BOC-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl werden in 192 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und 45 Minuten bei   20       belas-    sen. Darauf wird die Lösung auf ca. 40 ml eingeengt, unter Rühren mit 400 ml Äther versetzt und 20 Minuten bei   35     unter Rückfluss gerührt. Alsdann kühlt man die Kristallsuspension   auf - 100    ab und lässt über Nacht bei - 100 ste hen. Die Fällung wird abfiltriert, dreimal mit   Ather    gewaschen und in Vakuum über Ätznatron getrocknet. F.   125-1270;    Rf4 = 0,33 (an Silicagel).



  7. BOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl
26,3 g H-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl, TFA werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst, gekühlt auf 00, nacheinander mit 7,5 ml Triäthylamin, 0,54 ml Eisessig und einer Lösung von 14,4 g BOC-Gly-ONP in 100 ml Dimethylformamid versetzt, bei Raumtemperatur gerührt, bis die Mischung erstarrt, und zwei Tage stehen gelassen. Alsdann gibt man unter Rühren 300 ml Essigester zu und lässt über Nacht bei -10  stehen.



  Die Fällung wird abfiltriert, zweimal mit Essigester und zweimal mit Äther gewaschen, eine halbe Stunde mit 200 ml Wasser verrührt, abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet F.   227-228";    [a]D   = 230    (c = 2 in Dimethylformamid); Rf9 = 0,50 (an Silicagel).



  8.   BOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-OH   
17,0 g BOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl werden in 340 ml Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur gibt man 3,4 g 10%ige Palladium-Kohle zu und hydriert. Die Reduktion ist nach 4 Stunden vollendet.



  Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung am Hochvakuum eingeengt. Dreimaliges Verreiben mit   Ather    liefert ein laut Dünnschichtchromatogramm einheitliches Pentapeptid. F. 181-183 ;   tx]D      = 16,50    (c = 2 in Dimethylformamid); Rf, = 0,65 (an Silicagel).



  9. BOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-N2H2-Z
9,2 g H-Cys(Bzl)-N2H2-Z, HCI werden in 300 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, mit 12,2 g BOC-Gly   -Asn-LeuGer-Thr-OH    versetzt und bei Raumtemperatur bis zur Lösung   gerührt    Sodann kühlt man die Lösung auf   0     ab, gibt 3,28 ml Triäthylamin und 4,88 g N-Hydroxysuccinimid in 100 ml Dimethylformamid zu, kühlt weiter auf 220 ab und gibt 4,36 g Dicyclohexylcarbodiimid in 30 ml Dimethylformamid   zu,    Man rührt eine Stunde   bei 220,    lässt alsdann die Innentemperatur allmählich steigen, und rührt noch 3 Tage bei   Zimmortemperatur,    filtriert von ausgefallenem Di   cyclohexylhamstoff    ab und dampft am Hochvakuum zur Trockne ein.

  Der Rückstand wird verrührt mit einer Mischung von Essigester und 5%iger Zitronensäurelösung, die Fällung abfiltriert, mit Wasser gewaschen, im Vakuum getrocknet, mit trockenem Äther verrührt, filtriert und im Hochvakuum    getrocknet F. 173.1780 [&alpha;]D = -25,5" (c = 2 in Dimethyl-    formamid);   Rfl    = 0,21 (an Silicagel).



  10.H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-N2H2-Z, TFA
13 g BOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-N2H2-Z werden gelöst in 130 ml 90%iger Trifluoressigsäure und die Lösung wird 2 Stunden bei   22     stehen gelassen. Darauf wird die Lösung eingeengt und der Rückstand dreimal mit   Ather    verrührt und im Vakuum über   Ätznatron    getrocknet F. 159-1610.



     Rf,      =0,63      (an    Silicagel).



  11. BOC-Cys(Bzl)-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-N2H2-Z
6,69 g BOC-Cys(Bzl)-OSU und 12,2 g HGly-Asn-Leu   -Ser-Thr-Cys(Bzl)-N2H2-Z,    1,22 TFA werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst Aus einer Lösung von 150 mMol Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid wird unter Rühren soviel Triäthylamin zugetropft, bis das Reaktionsgemisch auf feuchtem   Indikatorpapier    einen pH-Wert von 6,4 zeigt. Die Lösung wird 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt, darauf am Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird zweimal mit 300 ml Essigester verrührt, anschliessend dreimal mit einer Mischung von 150 ml Essigester und 30 ml   5%iger    Zitronensäurelösung, abfiltriert, im Vakuum getrocknet und aus Dimethylformamid-Essigester kristallisiert.

  F. 191-193 ;   = = = -31,5  (c = 2 Dimethylformamid); Rf6 = 0,35 (an    Silicagel).



  12. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-N2H2
6 g BOC-Cys(Bzl)-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-N2H2-Z werden   bei 400    in   700    ml trockenem flüssigem Ammoniak gelöst. Unter Rühren werden beim Siedepunkt des Ammoniaks 973 mg Natrium in solcher Weise zugegeben, dass die Farbe des Reaktionsgemisches nur hellblau wird. Nach 25 Minuten ist die Reduktion vollendet. Man rührt noch 10 Minuten unter Beibehalten der Blaufärbung, gibt alsdann 2,4 ml Eisessig zu und dampft am Hochvakuum (ca. 1 mm) zur Trockne ein.

  Der Rückstand wird mit 12 ml Wasser, 3,2 ml Eisessig und 20 ml Essigester während einer Stunde bei   0     verrührt, die Fällung abfiltriert, zweimal mit 10 ml   1 %iger    Essigsäurelösung und einmal mit 10 ml Essigester gewaschen und im Hochvakuum getrocknet.   Rf5    = 0,65 (an Silicagel).
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   1,0 g BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-N2H3 wird gelöst in 100 ml Dimethylformamid und 500 ml Wasser, das 1,23 mAeq. Chlorwasserstoff enthält. Mit 3,7 ml einer 0,43-n.



  Kaliumhydroxydlösung wird der pH-Wert der Lösung auf 6,8 eingestellt. Unter Beibehalten dieses pH-Wertes werden innerhalb 90 Minuten unter Rühren gleichzeitig zugetropft 247 ml einer   0,01 -m.    Kaliumferricyanidlösung und 4,9 ml einer 0,43-n. Kaliumhydroxylösung. Man rührt noch 90 Minuten bei Raumtemperatur, bringt alsdann mit 0,7 ml Eisessig den pH-Wert der Lösung auf 4,0. Darauf wird die Lösung mit 50 ml   Dowe:s;-2-X8,    Acetatform, anschliessend mit 13 ml   Dowex-50W-X8,    H+-Form, gerührt, filtriert und zur   Trockne eingedampft.

  Der Rückstand wird in 50%igem t-Butanol gelöst, lyophilisiert und im Hochvakuum getrocknet Das Produkt enthält ca. 15% Kaliumacetat Es ist einheitlich in Dünnsrhichtchromatogramm an Silicagel:   Rfs    = 0,63;   Rf6    = 0,70;   Rf7    =   0,75.   



  14. H-Leu-Gly-OEt, HCI
Man löst 14 g ZLeu-Gly-OEt [dargestellt nach J.R.



  Vaughan  & R.L. Osato, J. Am. Chem. Soc. 73, 5553 (1951)] in 150 ml absolutem Äthanol, versetzt mit 11,5 ml einer 6,9-n.



  Chlorwasserstofflösung in Äthanol und hydriert in Gegenwart von 2,8 g Palladium-Kohle   (.1OQ/o    Pd). Nach 1 Stunde wird vom Katalysator abgenutscht und im Vakuum bei 400 Badtemperatur eingedampft. Der Rückstand ist ein Öl und wird direkt weiter verarbeitet. Rf1 = 0,50 (an Silicagel).



  15. BOC-Met-Leu-Gly-OEt
10,5 g BOC-Met-N2H3 in 100 ml Dimethylformamid werden bei   0     mit 14,8 ml Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran (5,39-n; 80 mMol), anschliessend   bei 200    mit 5,4   ml    iso Amylnitrit versetzt. Nach 5 Minuten   bei -20"    wird eine vorgekühlte Lösung von 10,1 g H-Leu-Gly-OEt,   HC1    und 16,9 ml Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Tage bei   0     belassen.



  Dann wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert und das Filtrat im Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigsäureäthylester und wäscht die Lösung nacheinander mit 3 Portionen verdünnter Zitronensäurelösung, 3 Portionen verdünnter Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser. Das nach dem Trocknen und Eindampfen der Lösung erhaltene Rohprodukt wird aus Essigester-Hexan kristallisiert. F.   118-119";      [D      = 300    (c = 2 in Dimethylformamid);   Rfl    = 0,72 (an Silicagel).



  16. BOC-Met-Leu-Gly-OH
9,98 g BOC-Met-Leu-Gly-OEt werden in 300 ml Methanol gelöst. Innerhalb 45 Minuten tropft man bei Raumtemperatur 57 ml 0,59-n. Natronlauge zu und rührt noch 1 Stunde. Alsdann wird mit 0,68-n. Salzsäure der pH-Wert auf 7 gestellt und die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester und Wasser gelöst, und der pH-Wert mit 0,68-n. Salzsäure auf 2 gebracht. Die wässerige Phase wird mit Essigester ausgeschüttelt. Die vereinigten Essigester Phasen werden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigester-Hexan kristallisiert. F.   137-138";      [X]D      = 310    (c = 2 in Dimethylformamid);   Rf3    = 0,74 (an Silicagel).



  17. H-Met-Leu-Gly-OH
6,9 g BOC-Met-Leu-Gly-OH werden in 70   ml    90%iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei   20     stehen gelassen. Darauf wird die Lösung eingeengt, unter Rühren mit 150 ml Äther versetzt und über Nacht   bei -10"    stehen gelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und aufs neue mit 100 ml Äther verrührt, abfiltriert, zweimal mit Äther gewaschen und im Vakuum über Ätznatron getrocknet. F. 134   135 ;    Rf, = 0,52 (an Silicagel).
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   800 mg   BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-N2H3    [enthält 15% Kaliumacetat] werden in 15   ml    Dimethylformamid aufgeschlämmt und 15 Minuten bei   45"    gerührt; ein Teil der Suspension geht in Lösung. Nun kühlt man auf   0     ab und gibt zuerst 1,45 ml Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran (2,0-n) zu, kühlt weiter   auf - 200    ab und gibt alsdann 0,114 ml iso-Amylnitrit zu. Nach 10 Minuten   bei 200    versetzt man mit 0,24 ml Triäthylamin und gibt anschliessend eine vorgekühlte Lösung von 431 mg H-Met-Leu-Gly-OH, 0,57 TFA in 5 ml Dimethylformamid zu. Von einer verünnten Triäthylaminlösung in Dimethylformamid wird soviel Triäthylamin zugetropft bis das Reaktionsgemisch auf feuchtem Indikatorpapier einen pH-Wert von 6 zeigt.

  Die trübe Lösung wird 3 Tage bei   0     belassen, alsdann von der entstandenen Fällung abfiltriert. Das Filtrat wird am Hochvakuum zur Trockne eingedampft; der Rückstand dreimal mit 10%iger Zitronensäurelösung verrührt, das erhaltene Produkt abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet Rf6 = 0,68;   Rf7    = 0,75 (an Silicagel).



   Beispiel 10   Na-Palmitoyl-   
EMI32.2     
 -Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro    -Gln-Thr-Ala-lle-Gly-Val-Gly-Ala-Prn-NH (N -Palmitoyl-    -Calcitonin M) 171 mg Na-Palmitoyl
EMI32.3     

EMI32.4     
 (OtBu) -Phe-Asn-Lys(BOC) -Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln   -Thr(tBu)-Ala- Ile- Gly-Va1-Gly-Ala-Pro-NH2    werden mit 5   ml    eiskalter, analysenreiner, konzentrierter Salzsäure versetzt, bei   0     gerührt bis zur Lösung (ca. 2 Min.) und die Lösung hierauf unter Stickstoff weitere 8 Min. bei   0     belassen. Hierauf befreit man vom gasförmig gelösten Chlorwasserstoff durch lminütiges Evakuieren bei 0,01 Torr., gibt dann 100   ml    t-Butanol zu und lyophilisiert.

  Man erhält dabei 138 mg salzsaures Salz des   NQ-Palmitoyl-Calcitonins    M als farbloses Pulver. Bei Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxid ( Alox ) zeigt das Produkt Rf45 = 0,52, Rf52 = 0,76. Das Produkt zeigt im Test nach Kumar gegenüber Calcitonin M eine deutlich verlängerte Wirkung.



   Das als Ausgangsmaterial verwendete, geschützte Na -Palmitoyl-Dotriacontapeptidamid kann folgendermassen hergestellt werden: 1. Palmitinsäure-p-nitrophenylester (Pal-ONP = Hexade    kansäure-p-nitrophenylester):   
Zu 5,0 g p-Nitrophenol in 60   ml    Chloroform-Äther   (1:1)    werden unter Eiskühlung zunächst 9,4 g Palmitylchlorid und dann 5,0 ml Triäthylamin gegeben. Nach 2 Stunden Kochen unten Rückfluss wird in Essigester aufgenommen und die organische Phase mit 0,5 n. Pottasche und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Bei Kristallisation aus Äther-Petroläther erhält man Blättchen vom F. 64   65"C.   



  2. Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe
1,32 g H-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe und 780 mg   Palmi-    tinsäure-p-nitrophenylester werden in 20   ml    frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst und 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Aus dem nach Abdampfen des Lösungsmittels resultierenden Rohprodukt wird durch Umfällen aus Methanol die Verbindung in dünnschichtchromatographisch reiner Form erhalten.

 

  3.   Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH   
Zu 1,35 g Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe in 40 ml Methanol werden 4,0 ml Hydrazinhydrat gegeben und die Lösung 24 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Am Rotationsverdampfer wird dann bei   25     auf ca. 20   ml    eingeengt und 150 ml 0,5 n. Essigsäure zugegeben. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und über Ätznatron getrocknet Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel zeigt das Produkt   RfooD    = 0,45.  



  4. Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)  -Met-Leu-Gly-OH
1,08 g Pal-Cys-(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2 in 10 ml Dimethylformamid werden bei -15  mit 1,5 ml 2,0 n. Chlorwasserstoff in Essigester und 0,17 ml t-Butylnitrit versetzt.



  Nach 15 Minuten Stehen bei -10  wird eine   auf - 100    gekühlte Lösung von 980 mg H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI) -Met-Leu-Gly-OH und 0,56 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid zugetropft. Nach einer Stunde Stehen bei -10  und 15 Stunden bei   0     werden 30 ml Methanol zugegeben und das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und bei   40     am Hochvakuum getrocknet. Das resultierende Pulver wird dreimal mit je 10 ml Wasser verrieben und dann über Ätznatron getrocknet Umfällen aus Dimethylformamid-Methanol liefert das Produkt dünnschichtchromatographisch rein.
EMI33.1     




   -Gly-OH
Eine Lösung von 670 mg Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser (tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH in 50 ml Dimethylformamid wird bei Raumtemperatur innert 20 Minuten zu einer stark gerührten Lösung von 1,0 g Jod in 150 ml Methanol getropft. Es wird noch eine Stunde gerührt und dann die Reaktionslösung bei   0     durch tropfenweise Zugabe von 1-n. wässerigem Natriumthiosulfat entfärbt Die klare Lösung wird zunächst am Wasserstrahl-, dann am Hochvakuum bei   30     auf ca. 10 ml eingeengt, mit 200 ml    ther-Petroläther      (1:

  :1)    versetzt und abdekantiert Der Rückstand wird nach kurzem Trocknen am Wasserstrahlvakuum dreimal mit je 10 ml Wasser verrieben und über Ätznatron getrocknet Zur Reinigung wird aus Chloroform-Petroläther umgefällt Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rf58    =   0,50.   
EMI33.2     




  -Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn    -Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-    -Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2.



  Zu einer Lösung zu 418 mg
EMI33.3     

EMI33.4     
 290 mg des in Beispiel 2 sub 44 beschriebenen geschützten Docosapeptidamids und 110 mg N-Hydroxysuccinimid in 15 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gibt man unter Rühren und Erwärmen auf 45  135 mg Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt noch 3 Stunden unter Stickstoff weiter bei   45 ,    gibt dann nochmals je 70 mg N-Hydroxysucciimid und Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt weitere 4,5 Stunden bei   450.    Dann kühlt man auf   0     und giesst in 300 ml eiskalten, peroxydfreien Äther.

  Nach 12 Stunden bei 0  nutscht man den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Äther und trocknet in Vakuum bei   40 .    Zur Reinigung löst man das Produkt in Methanol Chloroform   (1:1)    und chromatographiert in diesem Lösungsmittelgemisch aufsteigend an einer Säule von   #Sepbadex#    LH20 der Dimension 110 X 4,2 cm. Es werden Fraktionen à 3 ml aufgefangen und dünnschichtchromatographisch geprüft. Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten ist Rf52A = 0,62.



   Beispiel 11 Na-Lauryl
EMI33.5     
 -Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln -Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2   (N&alpha;-Lauryl-Calcito-    nin M).



  7 mg   N-Lauryl-   
EMI33.6     
 -Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu) -Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu) -Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 werden unter Rühren zu 0,42 ml eiskalter, analysenreiner, konzentrierter Salzsäure gegeben u. unter Stickstoff 10 Minuten bei   0     gerührt Dann wird zur Entfernung des gasförmig gelösten Chlorwasserstoff 1 Minute bei   0     und 0,01 Torr. gehalten, hierauf 6 ml t-Butanol zugegeben und das Gemisch lyophilisiert. Man erhält 5 mg Monohydrochlorid von   N&alpha;-Lauryl-Calcitonin    M.



   In der von Kumar et al. (J. Endocrinology, 33. 469 [1965]) angegebenen Testierungsanordnung zeigt das Produkt eine ge   gegenüber    Calcitonin verlängerte Wirkung.



   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1.   Laurins & re-p-nitrophenylester,    (Lau-ONP = Dodekan    saUre -p-Nisrophenylester)   
Die Verbindung wird nach dem gleichen Verfahren, wie für den   Patmitinsäure-p-nitrophenylester    im Beispiel 10 beschrieben, aus 5,0 g p-Nitrophenol und 7,2 g Laurylchlorid hergestellt.



  2.   Lau-Cys(TRI)-Gfy-Asn-Leu-Oe   
1,5 g Laurinsäure-p-nitrophenylester und 1,65 g H-Cys   (TRI) < 3ly-Asn-Leu-OMe    werden in 25 ml Dimethylformamid während 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Abdampfen des Lösungsmittels und Umfällen aus Methanol liefert das im Dünnschichtchromatogramm einheitliche   Produkt      RfU    = = 0,60 an Silicagel.



  3.   Lau-CyJ(TRI)-Gly-Asn-Lcu-NH-NH,   
1,0 g   Lau-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe    werden in 40 ml Methanol und 4   ml    Hydrazinhydrat 24 Stunden bei Raumtemperatur zum Hydrazid umgesetzt. Die Isolierung erfolgt durch Einengen der Lösung und Fällen mit 0,5 n. Essigsäure.



     Rfroo    = 0,40 an   Silicagel.   



  4. Lau-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)  -Met-Leu-Gly-OH
1,42 g Lau-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2, gelöst in 10 ml Dimethylformamid, werden bei -15  mit 1,38 ml 2 n.



  Chlorwasserstoff in Essigester und 0,14 ml t-Butylnitrit ver   setzt nach    15   Minutell Stehen    bei -10  werden die   auf -10'    gekühlte Lösung von 965 mg H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)   -Met-Leu-GlyOH    und   0,525    ml Triäthylamin in 10 ml Di   methylfornaamid    zugegeben und eine Stunde bei -10  und 15 Stunden bei 0  stehen gelassen.

  Das aus der Reaktionslösung als Gel ausgeschiedene Produkt wird durch Zugabe von 20 ml Methanol vollständig ausgefällt, abfiltriert und dreimal mit je 10 ml Wasser verrieben und über Ätznatron getrocknet Zur Reinigung wird aus heissem Methanol umgelöst
EMI33.7     
  -Gly-OH
Zu einer gerührten Lösung von 1,0 g Jod in 150 ml Methanol werden bei Raumtemperatur 700 mg Lau-Cys(TRI)   -cly-AsnLeuSer(tBu)-Thr(tBu)-CysRI)-    Met-Leu-Gly-OH in 50 ml Dimethylfonnamid innert 20 Minuten getropft und dann noch eine Stunde weiter gerührt Zur Beseitigung des überschüssigen   Oxidatiotnnittels    wird bei   0     tropfenweise 1 n.

 

     Thiosulfatlösung      zugeben    und dann am Wasserstrahl- und Hochvakuum auf ca. 10 ml eingeengt Durch Zugabe von 200 ml Äther-Petroläther   (1:1)    wird ausgefällt, der getrocknete Niederschlag dreimal mit Wasser verrieben, über Ätznatron getrocknet und zur Reinigung aus Chloroform-Petrol äther umgefällt,  6.

  Na-Lauryl
EMI34.1     
  -Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)    -Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr-     (tBu)-A   la4le-Gly-Val-Gly-Ala-Prn-NH,   
Man rührt ein Gemisch von 35 mg des im Beispiel 2 sub 44 beschriebenen geschützten Docosapeptidamids, 24 mg   Nn-      -Lauryl-l   
EMI34.2     
 -Gly-OH, 6 mg N-Hydroxysuccinimid und 0,8 ml Dimethylformamid 1 Stunde unter Stickstoff bei 50 , gibt dann 6 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt weitere 2 Stunden unter Stickstoff bei 500, gibt nochmals je 3 mg N-Hydroxy-succinimid und Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt noch 8 Stunden bei   50     unter Stickstoff.

  Dann giesst man das gesamte Gemisch in 60 ml peroxydfreiem Äther, lässt 18 Std. bei   0     stehen, filtriert den feinen Niederschlag ab und trocknet ihn im Vakuum bei 40 . Man erhält 30 mg des rohen geschützten   Na-Lauryl-dotriacontapeptidamids.    Zur Reinigung löst man das Rohprodukt in Methanol-Chloroform   (1:1)    und chromatographiert aufsteigend über eine im gleichen Gemisch bereitete Säule (1,5 x 30 cm) von Sephadex LH 20. Man fängt Fraktionen à 3 ml auf, dampft sie einzeln ein und prüft auf Reinheit durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten   (RfG2A    = 0,55). Man erhält 15 mg gereinigtes, geschütztes Dotriacontapeptidamid.



   Beispiel 12
EMI34.3     
   -Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-A la4le-      -Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2    (Calcitonin M) 32 mg
EMI34.4     
 -Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu) -Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe    -Asn-Lys(BOC) -Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-    -Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH3 werden in gleicher Weise wie im Beispiel 2 beschrieben von den Schutzgruppen befreit. Das erhaltene Acetat von Calcitonin M verhält sich dünnschichtchromatographisch und elektrophoretisch gleich wie das in Beispiel 2 beschriebene Produkt. Bei Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxid  Alox  (Camag) ist Rf52 = 0,48; Rf45 = 0,41; Rf79 = 0,55. Bei Dünnschichtchromatographie auf Cellulose (Selecta-Fertigplatten S+S Nr. 1440) ist   Rf3o1A    = 0,54; Rf45 = 0,40.

  In der Elektrophorese auf Cellulose (Selecta-Fertigplatten Nr. 1440) ist die Wanderungsstrecke zur Kathode bei 180 V in 1,5 Std. bei pH 9,10 = 4,0 cm, bei pH 4,85 = 4,2 cm.



   Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Dotriacontapeptidamid kann wie folgt hergestellt werden: 1.   BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-     -Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(Ot
Bu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln  -Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
125,6 mg BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu) -Cys(TRI) Met-Leu-Gly-OH und 189,0 mg H-Thr(tBu)-Tyr (tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His    .Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-      -Pro-NH2    werden zusammen mit 31,4 mg N-Hydroxysuccinimid in 2,5 ml N,N-Di-methylformamid unter Stickstoff aufgeschlämmt.

  Man gibt 37 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Dimethylformamid zu und rührt 4,5 Std. bei   45".    Dann giesst man den Ansatz in 250 ml gerührten absoluten Äther, filtriert den flockigen Niederschlag ab und wäscht ihn mit Äther. Man erhält 314 mg des in Methanol schwerlöslichen Produkts.



   Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf100 = 0,51, Rf107 = 0,77; Rf52A = 0,56; Rf43E =   0,65.   
EMI34.5     




   -Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe  -Asn-Lys(tBu)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)    -Ala-lle-Gly-Fal-Gly-Ala-pro-NH2   
219 mg des unter 1 beschriebenen geschützten Dotriakontapeptidamids werden in warmem Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf Raumtemperatur in 30 Minuten in eine Lösung von 124 mg resublimiertem Jod in 30   ml    Methanol eingetropft. Nach zweimaligem Spülen mit je 2,5   ml    Dimethylformamid wird noch 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt und dann bei   0     1,25   ml    1-n. wässerige Natriumthiosulfatlösung langsam zugetropft, bis die Lösung beinahe farblos ist Anschliessend werden 0,05 ml wässerige   2-n.    Natronlauge zugefügt und am Vakuum auf ca. 1/3 Volumen eingeengt.

  Die Lösung wird in 450 ml peroxydfreien Äther eingerührt und der Niederschlag filtriert. Dieser Filtrationsrückstand wird direkt einer Gegenstromverteilung am System   Methanol/ Puffer/Chloroform /Tetrachlorkohlenstoff 11: 3:    6: 7 unterworfen (Puffer wie in Beispiel 1 unter 18). Nach 280 Stufen befindet sich die Substanz in den Gefässen 100 bis 132. Sie wird isoliert und im gleichen System erneut über 560 Stufen verteilt. Das mittels Dünnschichtchromatographie lokalisierte Produkt wird isoliert (K = 0,69) und im Hochvakuum bei   40     vom Ammoniumacetat befreit.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rfs2A    = 0,4;   Rfloo    = 0,35; Rf87 = 0,66;   Rf43ç!    = 0,59.



   Beispiel 13
Das im Beispiel 2 als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Calcitonin M kann aus den Fragmenten 1 - 28 + 29 - 32 wie folgt aufgebaut werden:
EMI34.6     
 -Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe -Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu) -Ala-Ile-Gly-OH 860 mg
EMI34.7     
 -Met-Leu-Gly-OH in 7   ml    Dimethylformamid werden bei   0     mit 0,1 ml Triäthylamin und 292 mg Trichloressigsäure-pentachlorphenylester versetzt und eine Stunde bei   0     unter Stickstoff gerührt.

  Nun gibt man 1,627 g H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr (tBu)-Gln-Asp(OtBu) -Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu) -Phe-Pro-Gln-ThrtBu)-Ala-Ile-Gly-OH (aus 1,75 g der im Beispiel 1, unter 49 beschriebenen Carbobenzoxy-Verbindung durch Hydrierung in   80%iger    Essigsäure hergestellt), 0,09   ml    Triäthylamin und 7 ml Dimethylformamid hinzu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Das nach Eintropfen in eiskalte 0,02 n. Salzsäure ausgefällte Rohprodukt wird durch Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (11: 3 : 6: 7, Puffer wie in Beispiel 1 unter 18) gereinigt. Verteilungskoeffizient K = 0,8.

 

  Die das Octacosapeptidderivat enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, die Lösung stark eingeengt und aus t-Butanol lyophilisiert. Das reine Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf45 = 0,33,   Rfroo    = 0,35 und Rf115 = 0,48 auf.
EMI34.8     
 -Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe   -Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Th r(rBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)- -Ala-lle-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHfa    50 mg
EMI34.9     
   -Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu) -Thr(tBu)    -Gln-Asp(otBu)-Phe   -Asn-Lys(BOC) -Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-    -Ile-Gly-OH und 27 mg H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (Beispiel 2  unter 42) werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung gibt man 2,9 mg N-Hydroxysuccinimid und 8,3 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt die Lösung während 2 Stunden unter Stickstoff.

  Dann fügt man weitere 1,7 mg N-Hydroxysuccinimid und 5,5 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu (beides gelöst in je   0,1    ml Dimethylformamid) und rührt weitere 3 Stunden bei   45".    Hierauf giesst man die klare Lösung in 50 ml Äther, nutscht die Fällung ab, trocknet, zerreibt in wenig Wasser, nutscht ab und fällt das noch feuchte Pulver aus Methanol-Wasser um. Dadurch wird das im Rohprodukt vorhandene, überschüssige Tetrapeptidderivat abgetrennt.



  Das erhaltene geschützte Calcitonin M zeigt die im Beispiel 2 unter 45 angegebenen Rf-Werte.



   Die Abspaltung der Schutzgruppen geschieht wie in Beispiel 2 beschrieben. Das erhaltene, freie Calcitonin M enthält Spuren des Sulfoxidderivates, ist sonst aber rein. Die biologische Aktivität des Produktes beträgt 80 E/mg.



   PATENTANSPRUCH I
Verfahren zur Herstellung neuer Dotriacontapeptide der Formel I
EMI35.1     
   -Thr-G1n-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln.Thr.   



  -Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-Z, worin Z für OH oder NH2 und R für Wasserstoff oder eine freie oder acylierte Aminogruppe steht, bzw. entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginund Glutaminreste durch den Asparaginsäure- bzw. Glutaminsäurerest und/oder der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, oder ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren, wobei Prolin32 gegebenenfalls als Aminosäureamid und Cystein1 gegebenenfalls als Desaminosäure bzw.

  N-acylierte Aminosäure vorliegen, bzw. deren aktivierte Derivate, unter intermediärem Schutz der von der Reaktion auszuschliessenden funktionellen Gruppen, unter Bildung der Pep   tid-Bindungen    entsprechend miteinander kondensiert, wobei die beiden Mercaptogruppen im ersten Teil der Sequenz durch Oxydation zur Disulfidbrücke vereinigt werden.



   UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen der Formel I ausgeht, worin Z für NH2 steht
2. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Carboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe schützt.



   3. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Aminogruppen durch die   tert.-Butyloxycarbo-    nylgruppe schützt.



   4. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Hydroxylgruppen in den Seitenketten durch die tert.-Butyläthergruppe schützt.



   5. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einem intermediär geschützten Peptid der Formel H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr -Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala   -Ile-Gly-Val-GIy-Ala-Pr -NH2,    worin Aminogruppen durch die   tert.-Butyloxycarbonylgrup-    pe, Carboxylgruppen durch die   tert-Butyloxygruppe    und Hydroxylgruppen durch die tert.-Butylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen mittels Säuren abspaltet.

 

   6. Verfahren nach Patentanspruch I, oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man erhaltene Verbindungen der Formel I, worin R für eine freie Aminogruppe steht,   Na.   



  -acyliert.



   PATENTANSPRUCH II
Verwendung von nach dem Verfahren von Patentanspruch I und Unteranspruch 1 erhaltenen Peptiden zur Herstellung von schwerlöslichen Zinkkomplexen dieser Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass man die Peptide mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat, Zinkpolyphosphat   und / oder    Zinkhydroxyd umsetzt.

**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.

Claims (1)

  1. **WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **. unter 42) werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung gibt man 2,9 mg N-Hydroxysuccinimid und 8,3 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt die Lösung während 2 Stunden unter Stickstoff. Dann fügt man weitere 1,7 mg N-Hydroxysuccinimid und 5,5 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu (beides gelöst in je 0,1 ml Dimethylformamid) und rührt weitere 3 Stunden bei 45". Hierauf giesst man die klare Lösung in 50 ml Äther, nutscht die Fällung ab, trocknet, zerreibt in wenig Wasser, nutscht ab und fällt das noch feuchte Pulver aus Methanol-Wasser um. Dadurch wird das im Rohprodukt vorhandene, überschüssige Tetrapeptidderivat abgetrennt.
    Das erhaltene geschützte Calcitonin M zeigt die im Beispiel 2 unter 45 angegebenen Rf-Werte.
    Die Abspaltung der Schutzgruppen geschieht wie in Beispiel 2 beschrieben. Das erhaltene, freie Calcitonin M enthält Spuren des Sulfoxidderivates, ist sonst aber rein. Die biologische Aktivität des Produktes beträgt 80 E/mg.
    PATENTANSPRUCH I Verfahren zur Herstellung neuer Dotriacontapeptide der Formel I EMI35.1 -Thr-G1n-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln.Thr.
    -Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-Z, worin Z für OH oder NH2 und R für Wasserstoff oder eine freie oder acylierte Aminogruppe steht, bzw. entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginund Glutaminreste durch den Asparaginsäure- bzw. Glutaminsäurerest und/oder der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, oder ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren, wobei Prolin32 gegebenenfalls als Aminosäureamid und Cystein1 gegebenenfalls als Desaminosäure bzw.
    N-acylierte Aminosäure vorliegen, bzw. deren aktivierte Derivate, unter intermediärem Schutz der von der Reaktion auszuschliessenden funktionellen Gruppen, unter Bildung der Pep tid-Bindungen entsprechend miteinander kondensiert, wobei die beiden Mercaptogruppen im ersten Teil der Sequenz durch Oxydation zur Disulfidbrücke vereinigt werden.
    UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen der Formel I ausgeht, worin Z für NH2 steht 2. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Carboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe schützt.
    3. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbo- nylgruppe schützt.
    4. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Hydroxylgruppen in den Seitenketten durch die tert.-Butyläthergruppe schützt.
    5. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einem intermediär geschützten Peptid der Formel H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr -Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala -Ile-Gly-Val-GIy-Ala-Pr -NH2, worin Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgrup- pe, Carboxylgruppen durch die tert-Butyloxygruppe und Hydroxylgruppen durch die tert.-Butylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen mittels Säuren abspaltet.
    6. Verfahren nach Patentanspruch I, oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man erhaltene Verbindungen der Formel I, worin R für eine freie Aminogruppe steht, Na.
    -acyliert.
    PATENTANSPRUCH II Verwendung von nach dem Verfahren von Patentanspruch I und Unteranspruch 1 erhaltenen Peptiden zur Herstellung von schwerlöslichen Zinkkomplexen dieser Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass man die Peptide mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat, Zinkpolyphosphat und / oder Zinkhydroxyd umsetzt.
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