Im Zuge von die Zusammensetzung von eiweisshaltigen Na turstoffenlbetreffendenUntersuchungen wurde festgestellt, dass die meisten dieser eiweisshaltigen Naturstoffe ein bei dei
Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von
9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von knapp beieinander liegenden Banden langsamer als Albumin jedoch schileller als y-Globulin wanderndes Protein in sehr geringen und von der Jahreszeit und der Ernihrung (bei Tieren) abhin- gigen Mengen enthalten und dass dieses Protein, mit Ionen gewisser zweiwertiger Metalle chelatisiert, eine hervorragende antiinflammatorische Wirkung besitrt.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, dieses Protein Metall-Chelat in möglichst reiner Form aus natiirlichen
Eiweissquellen zu isolieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Protein-Metall-Chelaten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Protein aus einer natirlichen Eiweissquelle in einem wässrigen Medium mit zweiwertigen Metallionen zusammenbringt und das erhaltene Protein-Metall-Chelat aus dem Reaktionsmedium isoliert.
Bevorzugte, nach dem erflndungsgemiissen Verfahren herzu stellende Protein-Metall-Chelate sind diejenigen, bei denen mindestens 65 Gew.-% des Metallgehaltes aus den Metallen Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kobalt und/oder Kupfer bestehen, wobei die entsprechenden Protein-Magnesium Chelate speziell bevorzugt sind. Diese bevorzugten Protein Metall-Chelate können entweder durch direkte Chelierung unter Verwendung der entsprechenden Metallionen oder auch durch Umchelierung von als Zwischenprodukt hergestellten anderen Metall-Chelaten erzeugt werden.
Zwei speziell bevorzugte Arbeitsverfahren zur Herstellung dieser bevorzugten Protein-Metall-Chelate nach dem erfindungsgemlssen Verfahren werden wie folgt durchgefiihrt:
Eines der beiden bevorzugten Arbeitsverfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Protein-Metall-Chelates, in welchez dieses einen Metallgehalt von 0,1-1,0% aufweist und mindestens 65 Gew.-% dieses Metallgehaltes aus den Metallen Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kobalt und/oder Kupfer besteht und das Protein-Metall-Chelat antiinflammatorische Eigenschaften aufweist und bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von zwei oder drei Banden langsamer als Albumin, jedoch schneller als Globulin wandert,
wird so durchgefiihrt, dass man ein Protein aus einer natiirlichen Eiweissquelle in einem wiissrigen System mit 2-wertigen lonen der Metalle Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kobalt und/ oder Kupfer zusammenbringt, wobei sich das Protein-Metall Chelat bildet und dieses Fraktionierschritten unterwirft, und eine kurzzeitige Erhitzung auf eine Temperatur bis etwa 75 C durchfiihrt, um wirmelabile Proteine abzutrennen und schliesslich das gewflnschte Protein-Metall-Chelat aus dem Reaktionsmedium isoliert.
Das andere bevorzugte Arbeitsverfahren ist das oben er wihnte, bei dem wahrend der Verfahrensführung eine Transchelierung durchgefiihrt wird. In diesem Fall arbeitet man zweckmissigerweise so, dass man ein Protein aus einer natiir- lichen Eiweissquelle in einem wiissrigen System mit zweiwertigen Metallionen, die jedoch keine Magnesium-, Calcium-, Eisen-, Zink-, Kobalt- und/oder Kupferionen sind, zusammenbringt, die das Protein-Metall-Chelat enthaltende Lösung Fraktionierschritten und einer kurzzeitigen Erhitzung auf eine Temperatur von bis zu 75 C zwecks Abtrennung wirmelabiler Proteine unterwirft,
und anschliessend das Protein-Metall Chelat durch Umsetzung mit Ionen der Metalle Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kobalt und/oder Kupfer in ein Metall Chelat dieser Metalle iiberfiihrt, dieses Material isoliert, wobei man ein Protein-Metall-Chelat mit einem Metallgehalt von 0,1-1,0% erhält, in dem mindestens 65% des Gesamtmetall gehaltes von den Metallen Magnesium, Calcium, Eisen, Zink,
Kobalt oder Kupfer gebildet werden.
Speziell vorteilhaft ist es dabei, wenn man das Protein aus einer natiirlichen Eiweiss quelle mit einem wlsrigen System zusammenbringt, das Man ganionen enthilt und das als Zwischenprodukt erhaltene Protein-Mangan-Chelat durch Umsetzung mit entsprechenden
Metallionen in das Protein-Metall-Chelat umwandelt, in wel chem mindestens 65% des Metallgesamtgehaltes von den Metallen Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kobalt oder Kupfer gebildet werden.
Wie bereits erwähnt wurde, ist ein bevorzugtes, nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestelltes Protein-Metall Chelat das entsprechende Protein-Magnesium-Chelat. Dieses kann beispielsweise erhalten werden, indem man durch direkte Umsetzung mit Magnesiumionen oder durch Transchelierung mit Magnesiumionen ein Protein-Magnesium-Chelat bildet, wobei dieses, falls es durch Transchelierung eines als Zwischenprodukt gewonnenen Protein-Mangan-Chelates erzeugt wild, einen Mangangehalt aufweist, der weniger als 10 Gew. % des Gesamtmetallgehaltes des Protein-Metall-Chelates ausmacht.
Das Protein, das dem erfindungsgemässen Verfahren unterworfen wird, und welches zu den Globulinen gehört, kann unter Anwendungan sich bekannter Arbeitsverfahren (vgl.
Ullmann's Enzyklopädie der Technischen Chemie , 3. Auflage, Band 14, Seiten 409-412) aus verschiedensten natiir- lichen Proteinquellen isoliert werden.
Bei den Ausfiihrungsarten des erfindungsgemlssen Verfahrens soll Sorge getragen werden, dass das erwünschte Protein Metall-Chelat in möglichst reiner Form erhalten wird. Es ist daher zweckmässig, im Zuge jedes Verfahrensschrittes diejenige Fraktion auszuwählen und der weiteren Behandlung zu unterwerfen, die dasjenige Protein-Metall-Chelat enthilt, das bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von knapp beieinander liegenden Banden (in der Regel 2 oder 3 je nach Auflösungsvermögen) langsamer als Albumin jedoch schneller als y-Globulin wandert. Diese Substanz soll als Endprodukt in möglichst reiner Form erhalten werden.
Bei der Durchfuhrung des erfindungsgemässen Verfalirens kann das erwiinschte Protein-Metall-Chelat gewonnen werden, indem man eine natiirliche Eiweissquelle mit einem zweiwertigen Metallionen, vorzugsweise Manganionen enthaltenden Puffer extrahiert und die erhaltene Lösung entweder einer Gelscheiben-Elektrophorese unterwirft, und zwar sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8, das in Form von knapp beieinander liegenden Banden langsamer als Albumin, jedoch schneller als y-Globulin wanderndes Material isoliert, oder durch Chromatographieren tiber ein Molekularsieb,
das erwunschte Protein-Metall-Chelat in einer solchen Reinheit erhilt, dass seine antiinflammatorische Wirkung beeinträchtigende Begleitstoffe nur mehr in geringen Mengen vorhanden sind. Es erscheint jedoch angezeigt, der Gel-Elektrophorese oder dem Chromatographieren iiber ein Molekularsieb bereits eine Proteinfraktion zuzuführen, welche in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch fraktioniertes Flllen mittels Salzen und/oder Lösungsmitteln, von der Hauptmenge der das erfindungsgemäss zu isolierende Protein begleitenden Proteins befreit worden ist, um die bei der Gel-Elektrophorese bzw. beim Chromatographieren aufzuarbeitende Substanzmenge möglichst gering zu halten und damit eine schirfere Auflösung der Banden (Fraktionen) erzielen zu können.
Zwecks Isolierens des bei der Gelscheiben-Elektrophoreses mit typischer Geschwindigkeit relativ zu anderen Proteinen wandernden Protein-Metall-Chelats ist es j edoch nicht unbedingt erforderlich, eine Gel-Elektrophorese vorzunehmen oder zu chromatographieren, sondern es können auch, wenn auch in weniger vorteilhafter Weise, andere für das Fraktionieren von Proteinen an sich bekannte Fralttionier- schritte aneinandergereiht werden, wobei es lediglich erforderlich ist, beim Aufsuchen neuer Kombinationen an sich bekannter Methoden bzw.
beim Aufsuchen neuer Wege den Gehalt der erhaltenen Fraktionen an dem bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von knapp beieinander liegenden Banden langsamer als Albumin, jedoch schneller als y Globulin wandernden Protein-Metall-Chelat mittels Gelscheiben-Elektrophorese zu iiberpriifen; sobald mittels des Orientierungshilfsmittels Gelscheiben-Elektrophorese irgend eine Kombination von Fraktionierschritten als brauchbar erkannt worden ist, kann diese Kombination von Fraktionierschritten ohne weitere Kontrolle durch Gelscheiben-Elektrophorese, stets die gleiche Proteinquelle vorausgesetzt, routinemässig wiederholt werden.
Unter Ausniitzung dieser Erkenntnis ist das erfindungsge mässe Verfahren zur Herstellung eines neuen wasserlöslichen Protein-Metall-Chelats mit antiinflammatorischen Eigenschaften, welches bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von zwei oder drei Banden langsamer als Albumin jedoch schneller als y-Globulin wandert, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer dieses Protein in Form eines Metallchelats enthaltenden und durch Extrahieren einer natiirlichen Eiweissquelle mit ein zweiwertiges Metallion enthaltendem Wasser oder mit ein zweiwertiges Metallion und einen Puffer enthaltendem Wasser erhaltenen Lösung von wasserlöslichen Proteinen im Zuge einer Anzahl von beliebig aneinandergereihten Fraktionierschritten,
wobei einzelne Fraktionierschritte gleicher Art gegebenenfalls mehrfach durchgeftihrt werden, darunter ein kurzzeitiges Erhitzen einer das erwunschte Protein enthaltenden Lösung auf eine Temperatur bis etwa 75 C zwecks Abtrennens der wärmelabilsten Proteine, in Form eines 0,1-1,0% Metall aufweisenden Chelats isoliert wild, in welchem zumindest 65 % des Metallgehalts von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu gebildet ist.
Jede unter Verwendung des Orientierungshilfsmittels Gelscheiben-Elektrophorese ermittelte spezielle Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens unterscheidet sich zwangs- lea'fig von jedem anderen bekannten Verfahren zum Isolieren von einheitlichen Proteinen aus Proteingemischen trotzdem prinzipiell beim Isolieren von einheitlichen Proteinen aus Proteingemischen keine anderen als an sich bekannte Fraktionierschritte zur Verfiigung stehen, es also prinzipiell nur mög- lich ist, aus Leo'sung von Proteinen einzelne Proteine bzw.
Proteingemische mittels Lösungsmitteln oder anorganischen Salzen oder mittels Pufferlösungen beim isoelektrischen Punkt fraktioniert zu fallen, aus erzeugten Fällungen bzw. auch aus den eingesetzten Ausgangsstoffen einzelne Proteine bzw.
Proteinfraktionen selektiv unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln und/oder anorganischen Salzen enthaltenden wisserigen Lösungen zu extrahieren, Lösungen von Proteinen auf chromatographischem Wege aufzuarbeiten und durch kurzzeitiges Erhitzen von Ldsungen von Proteinen auf bestimmte Temperaturen selektiv Fällungen zu erzeugen. So wird beispielsweise beim auf die Herstellung einer injizierbaren Arginase abzielenden Verfahren remiss der USA-PS Nr.
2 663 668 ebenso wie beim erfindungsgemässen Verfahren eine natiirliche Eiweissquelle, beispielsweise Rinderleber, mit einem zweiwertigen Metallion, u.zw. Mn++ und/oder Co++, enthaltendem Wasser bei einem ebenfalls fur das erfindungs gemässe Verfahren in Frage kommenden pH-Wert von 7,09,5 extrahiert und anschliessend aus der erhaltenen Lösung durch fraktioniertes Fallen mittels Aceton als zweite Fällung eine arginasereiche Fraktion erhalten,
worauf aus einer wässe- rigen Lösung dieser arginasereichen Fraktion zunächst durch Erhitzen auf 60-80"C und dann durch Zusetzen von Salzen des zweiwertigen Bleis noch störende Fremdproteine ausgefällt werden und aus der erhaltenen klaren Lösung mittels Aceton Arginase ausgefällt wird, die sodann noch durch Zusatz von weiteren Cobaltsalzen zusätzlich aktiviert werden kann.
Bei diesem bekannten, eine Weiterentwicklung bereits früher bekannter Verfahren zum Isolieren von Arginase aus natur- lichen Eiweissquellen darstellenden Verfahren wurde offensichtlich die Arginasewirkung der jeweils erhaltenen Proteinfraktionen als Orientierungshilfsmittel dafür herangezogen, ob es sich bei der in Betracht gezogenen Proteinfraktion um eine brauchbare oder unbrauchbare Fraktion handelt, wobei jedoch diese Entscheidung rein routinemässig im Hinblick auf die seit langem bekannte Wirkung der Arginase getroffen werden konnte.
In Kenntnis der Eigenschaft des erfindungsgemiss herstellbaren Protein-Metall-Chelats bei der Gelscheiben Elektrophorese das oben genannte Wanderungsverhalten zu zeigen, kann zwar ebenfalls die Entscheidung fiber die auszu wählende und weiterzuverarbeitende Fraktion rein routine mässig getroffen werden, jedoch war es, um zur vorliegenden Erfindung zu gelangen, eben erst erforderlich zu erkennen,
dass in natiirlichen Eiweissquellen iiberhaupt ein in Form des oben angegebenen Chelats isolierbares Protein vorliegt und trotz des äusserst geringen Gehaltes natiirlicher Eiweissquellen an diesem Protein aus diesen Eiweissquellen in Form des oben angegebenen Metallchelats nach an sich bekannten Methoden zum Fraktionieren von Proteinen isolierbar ist. Durch die USA-Patentschrift Nr. 2 663 668 und auch durch die iibrige bisher bekannte und das Fraktionieren von Eiweisstoffen betreffende Literatur wird weder die Existenz des in einem erfindungsgemäss herstellbaren Protein-Metall-Chelat enthaltenen Proteins noch die Möglichkeit dieses Protein-Metall Chelat aus naturlichen Eiweissquellen zu gewinnen, nahegelegt.
Die Struktur des erfindungsgemäss in Form eines Metaliche- lats isolierbaren Proteins ist, ebenso wie für die weitaus meisten Proteine, nicht geklärt. Strukturuntersuchungen, welche sich in der Regel iiber mehrere Jahrzehnte erstrecken, sind im Gange. Die fir die Kennzeichnung der Struktur eines Proteins zumindest erforderliche Aminosäurensequenz ist unbekannt.
Im folgenden werden die bisher vorliegenden Ergebnisse der Strukturuntersuchung des erfindungsgemäss isolierbaren Protein-Metall-Chelats angegeben.
Die durchschnittliche Elementaranalyse des Protein-Metall Chelats lautet: 50,02% C, 7,92% H, 25,55% 0, 15,26% N, 0,00% P, < 1% Asche. Der Stickstoffgehalt gemäss dieser Elementaranalyse liegt etwas niedriger als der typischer Proteine, was darauf hindeutet, dass im erfindungsgemäss isolierbaren Protein-Metall-Chelat auch Nicht-Proteine enthalten sind. Diese Tatsache wird durch unter Verwendung eines Jod Schiff-Indikators durchgefflhrte Gelscheiben-Elektrophorese bestätigt. Nach saurer Hydrolyse des Proteins durchgefiihrte Priifungen mit Zuckerreagentien weisen auf die Anwesenheit einer geringen Menge an Kohlehydrat hin, welches wahrscheinlich covalent an das Protein gebunden ist.
Der isoelektrische Punlit des erfindungsgemäss herstellbaren Protein-Metall-Chelats liegt etwa bei einem pH-Wert von 5,5+0,3. Je nachdem, von welcher Seite her man sich an den isoelektrischen Punlit heranbewegt, wird das Protein-Metall Chelat bei pH-Werten von 4,0-6,0 teilweise oder vollständig unlöslich, weshalb Lösungen dieses Chelats pH-Werte von 1,0-4,0 oder 6,0-11,0, vorzugsweise 7,0-8,0 besitzen sollen, um durch Fiillungserscheinungen eine Verringerung der Ausbeute zu vermeiden; ein pH-Wert unterhalb 1,0 bzw. ein pH Wert oberhalb 11,0 soll vermieden werden, da dann die Gefahr einer Denaturierung des Protein-Metall-Chelats besteht.
Das Infrarotspektrum des erfindungsgemlss isolierbaren Metall-Chelats eines Proteins ist, bei pH = 7 bestimmt, typisch fiir Proteine. In der untenstehenden Tabelle sind die Ultraviolettabsorptionsspektren dieses Proteins bei pH = 1,5 in 0,05 n HCI, bei pH = 1,5 in 0,05 n HCI+ 0,10 m KCl bei pH = 7 in Wasser, bei pH = 7 in 0,05 m Phosphatpuffer und bei pH = 13 in 0,15 m KCI, wobei der pH-Wert mit 1 n KOH auf 13 eingestellt wurde, dargestellt.
Ultraviolett-Absorptionsspektren des neuen Protein-Metall helats
Optische Dichte pH1,5 pH7,0 pH7,0 pH13,0 mm y = 0,05 y = 0,15 H2O Puffer KCl-KOH
0,560 mglml 0,434 mg/ml 1,00 mg/ml 0,492 mg/ml 0,492 mg/ml 310 0,066 0,005 0,035 0,00 0,126 300 0,102 0,030 0,090 0,03 0,280 295 0,145 0,066 0,184 0,13 0,353 290 0,236 0,129 0,372 0,18 0,430 285 0,320 0,190 0,510 0,25 0,429 284 0,342 0,204 0,540 0,22 0,430 283 0,355 - 0,560 - 282 0,369 0,219 0,570 0,29 0,438 281 - - 0,580 - 280 0,377 0,244 0,585 0,30 0,430 279 - 0,226 0,590 - 278 0,384 0,227 0,592 0,30 0,420 277 - 0,228 0,590 - 276 0,385 0,226 0,588 0,30 0,411 275 0,385 0,225 0,580 - 0,410 270 0,364 0,206 0,538 0,27 0,422 265 0,330 0,179 0,475 0,23 0,471 260 0,284 0,144 0,400 0,19 0,592 255 0,247 0,117 0,337 0,15 0,845 250 0,226 0,104 0,315
0,13 1,150 245 0,263 0,134 0,402 0,18 -1,45 240 0,432 0,272 0,190 0,37 1,70 230 - - - 1,80
Wie der Tabelle entnommen werden kann, sind die im sauren Milieu und im alkalischen Milieu ermittelten Absorptionsspektren des Protein-Metall-Chelats beträchtlich verschieden von dem bei pH = 7 erhaltenen Absorptionsspektrum.
Bei der Gelscheiben-Elektrophorese auf Polyacrylamid gibt das erfindungsgemls isolierbare Metall-Chelat des Proteins ein typisches Bild mit drei nahe beieinander liegenden Banden sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH Wert von 3,8 (fliessendes Gel) [Diese Arbeitsweise beruht auf den Arbeiten von Ornstein und Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci.
121, 321 und 404 (1964) und von Williams und Reisfeld, Nature 195, 281 (1962)]. Typische Elektrophorogramme des Protein-Metall-Chelats enthilt die untenstehende Tabelle, in welcher simtliche Werte Näherungswerte darstellen.
pH9,4 pH3,8 B Abstand vom Relative Breite Abstand vom Relative in mum Ursprung Intensität in mum Umprung Intensitlt inmml) in % iflmml) in% oberes Band 1,0 11,5 100 1,2 16,5 100 mittleres Band 1,0 14,0 89-93 0,4 20,0 53-56 unteres Band 0,5 18,0 48-52 1,2 22,0 94-96 t) oberer Rand, Gesamtliinge des fliessenden Geles:
56 mm
Es wird angenommen, dass die sich bei der Gelscheiben Elektrophorese zeigenden typischen drei Banden auf eine Aufspaltung einer Bande zuriickzufiihren ist, welche Aufspaltung Pufferwirkungen im elektrischen Feld zugeschrieben werden kann und nicht auf die Anwesenheit dreier verschiedener Proteine im Metall-Chelat hinweist. Ureter Verwendung von Argarose durchgefiihrte Elektrophorogramme können zur angentiherten Bestimmung der Konzentration des erwflnschten Proteins in einem Proteingemisch herangezogen werden. Zu diesem Zwecke kann bei einer Konzentration der Probe von 10-100 mg/ml in 0,05 m [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan]-Glycin-Puffer bei pH 8,45 mit 5 mA und 188 V 30 Minuten gearbeitet werden.
Analytisch besitzt diese Methode gegeniiber der Gelscheiben-Elektrophorese den Vorteil, dass wegen der nahe dem Zentrum der Platte liegenden Probe die wandernden Proteine sowohl kathodisch als auch anodisch sichtbar gemacht werden können.
Das erfindungsgemiiss herstellbare Protein-Metall-Chelat stellt im Hinblick auf das Verhalten bei der Gelscheiben Elektrophorese offensichtlich eine chemisch einheitliche Substanz dar, was auch durch das Verhalten dieses Chelats beim Chromatographieren iiber Ionenaustauschharzen aber auch durch das Verhalten beim Ultrazentrifugieren bestätigt wild, wo das erfindungsgemlss herstellbare Protein-Metall-Chelat in Form eines einheitlichen, scharfen Bandes weiterwandert und der Sedimentationskoeffizient zu etwa 3,32+0,05 Svedberg Einheiten bestimmt wird.
Das erfindungsgemäss herstellbare Protein-Metall-Chelat besitzt in pharmakologischer Hinsicht ein breites Wirkungsspektrum und ist in der Lage, durch Vireninfektionen bewirkte Schädigungen zu lindern und kann in Säugetieren die Folgen von Qberanstrengungen beseitigen bzw. das Immunitätsgleich- gewicht wieder herstellen. Dieses Protein-Metall-Chelat besitzt auch ausgezeichnete antiinflammatorische Wirkung.
Es ist für die Behandlung aller Krankheiten geeignet, an welchen ein inaktiviertes oder aus dem Gleichgewicht geratenes autoimmunes System beteiligt ist und kann allein und zusammen (gleichzeitig oder alternierend) mit für die Behandlung solcher Krankheiten dienenden Medikamenten, beispielsweise Steroiden, wie Cortison, Hydro-cortison, Prednison, Prednisolon, Dexamethason, Fluorcortison, Fluormethalon, Methylprednisolon, Triamoinolon und dessen Acetonid, (3-Methason und deren bekannte Ester und Derivate oder anderen bekannten Stoffen zur Behandlung von Bakterien- und Viren-Infektionen, verwendet werden, wobei diese Medikamente in geringeren Dosen verabreicht werden können und normalerweise vorkommende toxische Wirkungen und sonstige Nebeneffekte verringert werden.
Das erfindungsgemlss herstellbare Protein Metall-Chelat erweist sich auch bei der Behandlung einer grossen Anzahl von Entzündungen geeignet, bei welchen entziindungshemmende Steroide nur beschränkt brauchbar sind, was daraus ersichtlich wird, dass dieses Chelat nach Erzeugung einer durch Antigene induzierten Entzündung nach der Methode von Unger et al., [Arch. Int. Pharmacodynam.
123, 71 (1959)] eine etwa 50%-ige Inhibierung der Entziindung bei Dosen von 0,4 mg/kg bewirkt, wogegen die gleiche Inhibierung erst durch Verabreichung von 25 mg Butazolidin und etwa 15 mg Hydrocortison erreicht werden kann. Sowohl bei der Prüfung als auch bei der Verwendung des erfindungs remiss herstellbaren Protein-Metall-Chelats kann weder eine chronische noch eine akute Toxizität festgestellt werden.
Bei intraperitoneal und/oder intramuskular verabreichten Einzeldosen des Chelats von 60 mg/kg, welche weit iiber der therapeutisch erforderlichen Dosierung liegt, kann in Mäusen, Ratten, Meerschweinchen oder Eseln weder vor der Tötung noch nach augenscheinlicher und mikroskopischer Prüfung der Milz, der Nieren, des Rückenmarks, des Hirns und der Injektionsstellen eine toxische Wirkung festgestellt werden. Die bei Invention körperfremder Proteine auftretende typische Eosinophile bzw. Monocytosis bleibt aus. Bei der Verabreichung von dem Hundertfachen der wirksamen Dosis entsprechenden Dosen an Esel und Meerschweinchen konnten keine chronischen Vergiftungen festgestellt werden.
Das erfindungsgemäss herstellbare Protein-Metall-Chelat ist somit zum grossen Teil frei von den Nachteilen synthetischer Drogen, welche häufig nur sehr spezifisch, stark verzögert und unzureichend wirken.
Das erfindungsgemäss isolierbare Protein-Metall-Chelat wirkt nach Verabreichung stark und rasch. Dies mag darauf zuriick- zufiihren sein, dass es in Anbetracht seiner Chelatstruktur rasch auf die Zellen verteilt wird. Diese Struktur macht dieses Protein-Metall-Chelat hervorragend geeignet zur selektiven Adsorption an und Speicherung in gewissen Zellen, und dies ist unter Umständen ein weiterer Grund für dessen überra- schend hohe Wirkung gegen Viren.
Vorzugsweise hat das erfindungsgemiss erhältliche Protein Metall-Chelat einen Metallgehalt von 0,1-1,0%, wobei zumindest 65% des Metallgehaltes von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu gebildet ist, und ein solches Chelat die gewiinschten pharmakologischen Eigenschaften besitzt.
Dartiber hinaus ist ein ausreichender Metallgehalt des Chelats auch im Hinblick auf dessen Stabilität unbedingt erforderlich.
Die pharmakologisch wirksamsten erfindungsgemlss herstellbaren Protein-Metall-Chelate besitzen einen Metallgehalt von etwa 0,25-0,75 %. Das Ausmass der pharmakologischen Wirkung des Protein-Metall-Chelats scheint zumindest zum Teil von der Anwesenheit eines oder mehrerer physiologisch wesentlicher zweiwertiger Metallionen im Chelat abzuhängen, weshalb in das Chelat vorzugsweise mindestens 75 % insbesondere 85%, der Metalle in Form mindestens eines der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu eingebracht werden.
Bei Herstellung von Protein-Metall-Chelaten höchster Wirksamkeit ist dafür zu sorgen, dass zumindest 40% des Metallgehaltes von einem zweiwertigen Metall mit einem Ionenradius von 0,65-0,79 , beispielsweise Magnesium, gebildet sind. Solche Metalle können beispielsweise dem Buch von Hall, Chemistry and Physics, 44. Auflage, Seiten 3507-3508 (1962) entnom-.
men werden. In den meisten solchen Chelaten ist eines dieser Metalle auch das vorwiegende Metall, also jenes chelatierende Metall, welches im Protein-Metall-Chelat mit dem höchsten Anteil enthalten ist. Obzwar in den die stirkste Wirkung zeigenden Chelaten der grösste Teil des Metallgehaltes auf physiologisch wesentliche zweiwertige Metalle zurückzuführen ist, enthalten typische Metallchelate auch andere Metalle, welche häufig während der Fraktionierschritte vom Protein, insbesondere dann aus Anlagenteilen aufgenommen werden, wenn in den aufzuarbeitenden Ldsungen die Konzentration der erwiinschten physiologisch wesentlichen zweiwertigen Metallionen gering ist.
Falls zumindest im letzten Fraktionierschritt in den aufzuarbeitenden Ldsungen eine ausreichend hohe Konzentration an physiologisch wesentlichen zweiwertigen Metallionen aufrecht erhalten wird, gelingt es Protein-Metall Chelate herzustellen, in welchen von den insgesamt vorliegenden chelatisierenden Elementen nur 10% physiologisch unwesentliche Elemente, beispielsweise Al, Si oder B sind.
Da das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein ziemlich wärmeempfindlich ist, ist es zweckmässig, mit Ausnahme des kurzzeitigen Erhitzens alle Verfahrensschritte bei einer Temperatur unterhalb SOC durch zuführen. Das zwecks Abtrennens der wärmelabilsten Proteine vorzunehmende kurzzeitige Erhitzen einer das erwiinschte Protein enthaltenden Lösung erfolgt zweckmässig auf eine Temperatur von mindestens 500C, vorzugsweise auf eine Temperatur von 50-650C bei einer Erhitzungsdauer von 105 min. Hiebei ist zu beachten, dass die Temperatur und die Dauer der Wärmebehandlung einander umgekehrt proportional sind.
Das in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein ist bei Temperaturen oberhalb 75OC nur kurze Zeit beständig. Sofern es nicht möglich ist, wie beispielsweise beim flash-Pasteurisieren, das Erhitzen und das Abkühlen in kiirze- ster Zeit vorzunehmen, soll das Gemisch nicht tiber 750C erhitzt werden. Blosses Erwirmen auf Temperaturen unterhalb 50OC zeitigt wenig zufriedenstellende Ergebnisse, da einige der unerwiinschten wärmelabilen Proteine bei solchen niedrigen Temperaturen noch ziemlich beständig sind.
Das erwiinschte Protein ist bei 55OC 15-30 min und bei 65OC etwa 3-8 min beständig, womit es möglich ist, bei Zerstörung der wärmelabilen Proteine übliche Heiz- und Kiihleinrichtungen zu verwenden.
Da, wie erwähnt, das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein bei einem pH-Wert unter 1,0 bzw. bei einem pH-Wert oberhalb 11,0 instabil ist und in Nähe des isoelektrischen Punktes (pH-Wert = 5,5) nicht so ldslich ist, ist es zweckmässig, bei allen Fraktionisierschritten bei einem pH-Wert zwischen 1 und 4 oder zwischen 6 und 11, vorzugsweise 7-8, zu arbeiten, sofern es nicht bezweckt ist, aus einer Lösung dieses Proteins dieses Protein auszufällen, in welchem Falle der pH-Wert einer dieses Protein enthaltenden Ldsung auf einen Wert zwischen 4 und 6, insbesondere auf etwa 5,5, zu bringen ist.
Da das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein in Form eines Chelats wesentlich stabiler ist, ist es zweckmässig, sämtliche Fraktionierschritte in Anwesenheit eines Ions eines zweiwertigen Metalls mit einem Ioned radius von 0,60-1,0 A durchzuführen. Es ist hiebei zweckmäs- sig, die Konzentration der Lösungen an Ionen zweiwertiger Metalle auf mindestens 1,10-4 m, vorzugsweise 0,005-0,20 m, insbesondere etwa 0,02 m, einzustellen.
Die Ionen zweiwertiger Metalle können hiebei in Form der Sulfate, Chloride oder Acetate der oben angegebenen Metalle, z.B. in Form von Mg (CH3CO0)2, MgS04, MgCk, CaCk oder MnS04, beigestellt werden. Die Anwesenheit von Ionen zweiwertiger Metalle in Lösungen des erfindungsgemäss in Form eines Chelats zu isolierenden Proteins ist vor allem beim Abtrennen der wirmelabilsten Proteine durch kurzzeitiges Erhitzen einer das erwünschte Protein enthaltenden Ldsung zweckmässig, da, wie erwilhnt, dieses Protein in Form eines Chelats am stabilsten ist und damit während des Erhitzens nur eine geringe Menge des erwiinschten Proteins zerstört wird.
Da der in den einzelnen Fraktionierschritten, beispielsweise selektive Fillungen mittels Salzen oder Lösungsmitteln, erzielbare Trenneffekt stark abhängig ist vom pH-Wert der aufzuarbeitenden Lösungen, ist es zweckmässig, den pH-Wert der aufzuarbeitenden Lösungen durch Zusatz von Puffersubstanzen gegen äussere Einflüsse zu stabilisieren. Zu diesem Zwecke wird am bestend in an Puffersubstanz 0,01- bis 0,20molaren, vorzugsweise mindestens 0,05-molaren, insbesondere 0,1-molaren Lösungen gearbeitet. Als Puffer können hiebei partiell neutralisierte organische oder anorganische Säuren, z.B.
Gemische aus Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (im folgenden kurz als Tris bezeichnet) einerseits und einer Dicar bonsäure, wie Maleinsiiure oder Bernsteinsäure, Phosphor säure oder einer Aminosäure, z.B. Glycin, anderseits, verwendet werden.
Tm erfindungsgemitssen Verfahren wird zweckmässig die natiirliche Eiweissquelle, beispielsweise tierische Organe bzw.
Gewebe, wie Leber, Niere, Hoden, Pankreas, Placenta, Darmschleimhaut, Thymus, Lunge oder Milz von Kaninchen, Schafen, Rindern, Schweinen oder Menschen, bzw. ein daraus in an sich bekannter Weise durch Behandeln mit organischen Lösungsmitteln, wie Toluol oder Aceton, erhaltenes Trockenpulver mit einer einen pH-Wert von 6-8 aufweisenden und zwei ertige Metallionen mit einem Ionenradius von 0,61,0 , vorzugsweise 0,6-0,8 A, enthaltenden Pufferlösung extrahiert, womit eine Lösung erhalten wird, aus welcher, wie bereits erwähnt, bereits durch Gel-Elektrophorese oder mittels Molekularsieben das erwünschte Protein-Metall-Chelat aufgrund seines Wanderungsverhaltens bei der Gel-Elektrophorese abgetrennt werden kann,
wobei jedoch zwecks Erzielung eines ausreichenden Trenneffektes die Gel-Elektrophorese oder das Fraktionieren mittels eines Molekularsiebes mehrmals vorzunehmen ist, um schliesslich die einzelnen Fraktionen weit genug auseinanderziehen zu können.
Um jedoch im Rahmen der Gel-Elektrophorese oder im Rahmen des Fraktionierens mittels Molekularsieben nicht zu grosse Substanzmengen aufarbeiten zu miissen, ist es zweck mässig, vor dem Fraktionieren durch Gel-Elektrophorese oder dem Fraktionieren mittels eines Molekularsiebes eine an erwflnschtem Protein angereicherte Fraktion durch fraktioniertes Fillen mittels Salzen, insbesondere Ammonsulfat, und/ oder mit mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, insbesondere Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Isopropanol und/oder Ethanol,
herzustellen. Naturgemäss ist es im Zuge dieser Fällungen zweckmässig, stets in eine Puffersubstanz und ein Salz eines zweiwertigen Metalls enthaltenden wiisserigen Lösungen zu arbeiten.
Naturgemäss ist aus den hiebei erhaltenen Fraktionen das erwiinschte Protein um so leichter mittels Gel-Elektrophorese oder Molekularsieben abzutrennen, je weitergehender uner wiinschte Begleitstoffe entfernt worden sind, jedoch kann jede der in Frage kommenden Fraktionen im Prinzip durch die Gel Elektrophorese oder mitfels Molekularsieben aufgearbeitet werden.
Eine Mdglichkeit zu einer an erwünschtem Protein angereicherten Fraktion zu kommen, besteht darin, dass die durch Extraktion der Eiweissquelle bzw. des hieraus erhaltenen Trockenpulvers erhaltene wässerige Lösung zwecks Ausfillens von weniger als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein löslichen Stoffen zu 40-45 % mit Ammonsulfat gesättigt oder mit etwa 1,5 Vol.-Teilen Aceton oder Ethanol versetzt wind, wobei zwecks Ausfillens allenfalls vorhandener Pigmente vor oder nach dem Fillen der weniger löslichen Stoffe die jweils vorliegende Lösung mit, vorzugsweise 10% ihres Volumens, eines heterocyclischen Amins, z.B.
Pyridin oder Piperidin, oder mit etwa 15% ihres Volumens eines Gemisches aus ethanol und Chloroform (etwa 2:1) versetzt wird. Hiebei kann zwecks Abtrennens der wirmelabilen Proteine die erhaltene Lösung rasch, z.B. unter kriiftigem Rühren, auf 590C erhitzt, etwa 15 min auf dieser Temperatur gehalten und dann rasch, z.B.
mittels einer Kiltemischung, auf etwa 30C abgekühlt werden, wobei vor oder nach dem Abtrennen der wirmelabilen Proteine ein das erwflnschte Protein enthaltender Niederschlag dadurch hergestellt werden kann, dass die erhaltene Lösung entweder zu 58-76% mit Ammonsulfat gesättigt oder mit der zwei- bis vier-fachen Menge der zum Fallen der weniger löslichen Proteine erforderlichen Menge an Lösungs- mittel (vorzugsweise Aceton oder Athanol) versetzt wird. Der das erwiinschte Protein enthaltende Niederschlag wird zwecks Weiterverarbeitung zweckmässig in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer gelds.
Eine weitere Möglichkeit zu einer an erwunschtem Protein angereicherten Fraktion zu gelangen, besteht darin, dass die durch Extraktion der Eiweissquelle bzw. des hieraus erhaltenen Trockenpulvers erhaltene wiisserige Lösung zwecks Abtrennens von leichter als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein loslichen Stoffen mit dem gleichen Volumen an kaltem Aceton versetzt und der erhaltene Niederschlag in ein zweiwertiges Metallion, vorzugsweise Mn++, enthaltendem Puffer (pH-Wert etwa 7,6) gelöst wird.
Im Anschluss daran kann so vorgegangen werden, dass zwecks Abtrennens der wirmelabilen Proteine die erhaltene Lösung rasch auf 60OC erhitzt, bis etwa 20 min nach Beginn des Erhitzens auf dieser Temperatur gehalten und dann rasch auf 50C abgekühlt wird, worauf aus der erhaltenen Lösung eine das erwiinschte Protein enthaltende Fraktion durch Zusetzen von etwa 0,9 Vol-Teilen Ethanol ausgefüllt wird und sodann der erhaltene Niederschlag in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer gelöst wird.
Schliesslich kann die erhaltene Lösung zwecks Abtrennens der leichter als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein löslichen Stoffe einer fraktionierten Fillung mit Ammoniumsulfat unterworfen werden, wobei die bei einer 60-75 % der Sättigungskonzentration des Ammoniumsulfats betragenden Konzentration am Ammonsulfat anfallenden Niederschläge in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer suspendiert werden und aus der erhaltenen Suspension Unlösliches entfernt wird.
Die so erhaltene Lösung des erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierenden Proteins, insbesondere die von den wirmelabilen Proteinen, den leichter löslichen und den schwerer l5slichen Stoffen befreiten Lösungen, können der Feinreinigung durch Gegenstromextraktion, Gel-Elektrophorese oder Chromatographieren, z.B. Papierchromatographie, Diinnschichtchromatographie oder Chromatographieren in mit Ionenaustauschharzen oder Gelen wie Silikagel oder vernetztes Detran (Molekülsieb) gefiillten Kolonnen, unterworfen werden.
Bei der Feinreinigung geniigt es im allgemeinen, eine Absorptionsbande bei 280 mm zeigenden Fraktionen aufzufangen, da nur solche Fraktionen das erfindungsgemiiss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein enthalten.
Bei dieser Feinreinigung wird das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein von allenfalls vorhandenen Resten an Albuminen oder y-Globulinen abgetrennt; insbesondere das weitgehende Abtrennen der Albu mine vom erfindungsgemlss zu isolierenden Protein ist wesentlich, da die Albumine die pharmakologische Wirksamkeit des erfindungsgemliss in Form eines Metall-Chelats zu isolierenden Proteins wesentlich starker beeintrÅachtigen als y-Globuline.
Da voraussetzungsgemäss ein 0,1-1,0% Metalle aufweisendes Chelat zu isolieren ist, in welchem zumindest 65% des Metallgehalts von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu gebildet ist, ist es zweckmässig, zumindest im letzten Fraktionierschritt in Anwesenheit eines zweiwertigen Metallions mit einem Ionenradius von 0,60-0,79 A insbesondere in Anwesenheit von Magnesiumionen zu arbeiten oder erhaltenes Protein-Metall-Chelat erforderlichenfalls zu einem Chelat zu transchelatieren, in welchem zumindest 40% des Metallgehaltes von einem zweiwertigen Metall mit einem Ionenradius von 0,65-0,79 A, insbesondere Magnesium, gebildet sind.
Da die im letaten Fraktionierschritt anfallenden Losungen des erwflnschten Protein-Metall-Chelats noch ziemliche Mengen an Puffersubstanz und Salzen zweiwertiger Metalle gelds enthalten, ist es zweckmässig, aus diesen LÏsungen die Puffersubstanz und die Salze zweiwertiger Metalle durch Dialyse zu entfernen, wobei zweckmlssig zuerst durch Dialyse gegen eine etwa 0,001 molare Lösung eines Salzes eines zweiwertigen Metalls, insbesondere Mg, in entsalztem Wasser die Konzentration der Lösung an Puffersubstanz auf weniger als 10-6 m gebracht wird und dann durch Dialyse gegen entsalztes Wasser die Konzentration der Lösung an dem Salz eines zweiwertigen Metalls auf weniger als 10-7 gebracht wird.
Da das erfindungsgemlss herstellbare Protein-Metall-Chelat im trockenen Zustand und bei tiefer Temperatur gelagert am bestiindigsten ist, ist es das Protein-Metall-Chelat enthaltende Lösungen, insbesondere erhaltene Lösungen des reinen Chelats, gefrierzutrocknen.
Beispiel 1
1 kg frischer, vom Bindegewebe befreiter Ochsenleber wurde in fiinf oder sechs Stiicke zerteilt, anschliessend mit Leitungswasser gespfflt und zerkleinert. Kleinere Mengen der zerkleinerten Ochsenleber (200 g) wurden in einem Schneidmischer mit 200 ml kalter isoosmotischer KCl-Lösung innerhalb 20 sec homogenisiert, worauf unmittelbar anschliessend im Mischer das Homogenisat innerhalb 20 sec bei -10oC mit 200 ml Aceton vermischt wurde. Das mit Aceton behandelte Homogenisat wurde sodann unter Riihren in ein 2,5 l auf - 10oC gekiihlten Acetons enthaltendes 10 l-Becherglas gegossen.
Sobald der letzte Anteil der zerkleinerten Ochsenleber in der angegebenen Weise behandelt worden war, wurde der Inhalt des Becherglases mit kaltem Aceton auf 10 1 aufgefiillt und durchgemischt. Die Temperatur wurde anschliessend einige Minuten auf 4OC gehalten. Die klare iiberstehende Fliissigkeit wurde nun abdekantiert, worauf der Inhalt des Becherglases mit Aceton auf 10 1 aufgefiillt wurde. Nach dem Abgiessen der klaren iiberstehenden Flüssigkeit wurde die Suspension rasch auf einem Buchner-Trichter filtriert, welcher oben abgedeckt ist, um den Zutritt von Luft so weitgehend als möglich auszuschalten.
Noch bevor der am Trichter befindliche Filterkuchen völlig trocken war, wurde mit 2 1 kaltem Aceton gewaschen. Das Waschen wurde solange fortgesetzt, bis die Teilchen vollständig trocken waren. Der Filterriickstand wurde zerkleinert, auf einem Filterpapier ausgebreitet und unter Stickstoff getrocknet. Das erhaltene Pulver wird noch kalt fein gemahlen und bei 4OC im Vakuum gelagert. Die Ausbeute an pulverförmigem Material betrug etwa 52 g.
100 g des in der oben angegebenen Weise hergestellten trockenen Pulvers wurden einem Liter 1,0 m Tris-Maleat Puffer eingerührt, worauf dem erhaltenen Gemisch nach Ablauf einiger Minuten 6,5 g MgS04.7 H20 in Anteilen zugegeben und der pH-Wert mit NaOH auf 7,4 eingestellt wurde.
Anschliessend wurden weitere 600 ml Tris-Maleat-Puffer und weitere 6,5 g MgS04. 7 H20 zugegeben, worauf der pH-Wert erneut auf 7,4 eingestellt wurde. Nun wurden weitere 400 ml Wasser zugesetzt, worauf in einem kalten Raum weitergerührt wurde bis, gerechnet vom Arbeitsbeginn, 6 Stunden verstrichen waren. Die Mischung wurde sodann absitzen gelassen, worauf filtriert und zentrifugiert wurde. Der pH-Wert des Filtrates wurde auf 7,8 eingestellt, worauf das Filtrat in der Kilte stehengelassen wurde, bis die Abscheidung vollstindig war. Die überstehende Fltissigkeit wurde nach dem Abzentrifugieren filtriert. Zwecks Lagerung wurde das Filtrat gefriergetrocknet.
100 g des durch Extraktion des Trockenpulvers erhaltenen Pulvers wurden unter Rflhren in 400 ml kaltem, 0, im Tris Maleat-Mg++ -Puffer bei pH 7,2 suspendiert, worauf in einem kalten Raum bis zum Absetzen des Niederschlages stehengelassen, bei 1-20C zentrifugiert und schliesslich abdekantiert wurde. Zwecks Abtrennung der Pigmente wurde die abdekantierte Fliissigkeit in 5 gleiche Teile geteilt und jeder Teil unter Riihren langsam mit 8 ml gekühltem Pyridin (chemisch rein) versetzt, worauf noch jedem Teil 40 ml 0,1 m Tris-Maleat Mg++-Puffer zugesetzt wurden. Die erhaltenen Gemische,wur- den sodann bei einer Temperatur von 1-2 C während 15 min bei 13 000 U/min zentrifugiert.
Die überstehenden klaren Fliissigkeiten wurden abdekantiert und miteinander vereinigt, wogegen der Niederschlag verworfen wurde.
Die von Pigmenten befreite kalte Lösung von Proteinen in Tris-Maleat-Mg++-Puffer wurde auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und sodann mit Ammonsulfat zu 40-45 % gesättigt, in dem das Ammoniumsulfat unter Riihren in Anteilen in Form einer gesättigten wiisserigen Lösung zugegeben wurde und die Temperatur des Gemisches auf 0-5 C gehalten wurde.
Das erhaltene Gemisch wurde in der Kälte 30 min stehen gelassen, urn den entstandenen Niederschlag vollständig absetzen zu lassen. Der entstandene Niederschlag, welcher die weniger als das erfindungsgemiiss zu isolierende Protein lös- lichen Stoffe enthlilt, wurde bei 12 000 U/min abzentrifugiert und verworfen.
Um aus der erhaltenen Ldsung die wirmelabilen Proteine auszufällen, wurde die Lösung in einen 1 Liter-Rundkolben iibergefiihrt und darin mittels eines auf 6570OC gehaltenen Wasserbades unter kriiftigem Rflhren auf 59OC erhitzt, 5 min auf dieser Temperatur gehalten und unmittelbar anschliessend durch Eintauchen des Rundkolbens in ein Gemisch aus Trokkeneis und Aceton rasch auf eine Temperatur von 2-30C gekühlt. Der hiebei entstandene flockige Niederschlag wurde in der Kälte abzentrifugiert und sodann verworfen.
Die von den wärmelabilen Proteinen befreite Lösung wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, dann zu 76% mit Ammonsulfat gesättigt und dann bis zur vollstiindigen Ausfiil- lung 2 Stunden kalt gestellt. Der hiebei entstandene, nahezu weisse Niederschlag wurde im 10-15-fachen seines Gewichts an 0,10 m Tris-Maleat-Mg++-Puffer aufgenommen und l/2 Stunde kalt stehengelassen, worauf ein allenfalls verbliebener Rflckstand abzentrifugiert und verworfen wurde.
Die nunmehr vorliegende L5sung des erfindungsgemäss in Form eines Chelats zu isolierenden Proteins (befreit vom Hauptteil der leichter löslichen und der schwerer lichen Stoffe) wurde nun einer Feinreinigung durch Gel-Elektrophorese unter Verwendung von quervernetztem Polyacrylamid als Gel unterworfen.
Hiebei wurde ein fit.r Produktionszwecke entwickeltes Geriit verwendet, in welchem ein 32 cm langer, 10 cm breiter und 1 cm starker Block aus einem 5-7 Gew.-% quervernetztes Polyacrylamid enthaltendem Gel in der Elektrophoresekammer untergebracht war, die ihrerseits mit den Seitenfllchen grösster Abmessungen vertikal angeordnet war und im Bereiche dieser Seitenflächen mittels eines laufend umgewiilzten und gekühlten Gemisches aus Athylenglykol und Wasser gekehlt werden konnte, so dass es möglich war, bei einer Spannung von 600-1000 V und mit einer Stromstärke von 200-500 mA zu arbeiten.
Der Gel-Block wurde in der Elektrophorese-Kammer dieses Gerätes durch Polymerisieren eines im Vakuum entgasten und blasenfrei in die Elektrophorese-Kammer eingebrachten Gemisches aus wässerigen Lösun- gen von Acrylamid, N,N'-Methylenbisacrylamid und Hilfsstoffen hergestellt, wobei folgende Lösungen verwendet wurden: a) lnHCI 480 ml
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 363 g
Tetramethyläthylendiamin 4,6 ml
H20 auf 1000 ml b) Acrylamid 280 g
N,N/-Methylenbisacrylamid 7,36 g
H20 auf 1000 ml c) Ammoniumpersulfat 1,00 g
H20 1000 ml
Das in die Elektrophorese-Kammer eingebrachte Gemisch bestand aus einem Volumteil eines Gemisches aus 1 Vol-tl der Lösung a), 2 Vol.-tln der Lösung b) und 1 Vol.-tl Wasser einerseits und 1 Vol.-tl der Lösung c) anderseits.
Mit diesem Gemisch wurde die Elektrophorese-Kammer bis 16 mm unterhalb ihres oberen Randes gefflllt, worauf das Gel in der Elektrophorese-Kammer mit einer 0,001%igen wässerigen Ldsung von als Markierungsfarbe dienendem Bromphenolblau vorsichtig überschichtet wurde und nach abgeschlossener Polymerisation der Überschuss an wässeriger Lösung des Bromphenolbiaues sorgfältig entfernt wurde. Nun wurde die in der oben angegebenen Weise hergestellte wässerige Lösung des erfin dungsgemäss zu isolierenden Proteins in 0,10 m Tris-Maleat Mg++-Puffer mit einem zu einem Gel polymerisierbaren Gemisch vermischt und das erhaltene Gemisch auf das in der Elektrophorese-Kammer befindliche Gel aufgebracht und dort unter Lichteinwirkung auspolymerisiert.
Das zu einem Gel polymerisierbare Gemisch wurde unter Verwendung folgender Lösungen hergestellt: d) 1n H3PO4 256 ml
Tris-(hydroxymethyl)- aminomethan 57 g H20 auf 100 ml (pH 6,9) e) Acrylamid 100 g N,N/-Methylenbisacrylamid 25 g H20 auf 1000 ml c) Ammoniumpersulfat 1,00 g
H20 1000 ml
Hiebei wurde 1 Vol.-tl eines aus 1 Vol.-tl der Lösung d), 2 Vol.-tln der Ldsung e) und 1 Vol.-tl Wasser hergestelltes Gemisch mit einem Vol.-tl der Lösung c) vermischt.
Nach dem das in die Elektrophorese-Kammer eingebrachte Proben-Gel auspolymerisiert war, wurde die Elektrophorese-Kammer in den Pufferbehilter eingebracht, welcher mit einer aus 60 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 288 g Glycin und der fiir 20 Liter erforderlichen Menge an Wasser hergestellten und auf einen pH-Wert von 8,45 eingestellten Pufferlösung gefdllt war, und unter Kiihlen die Elektrophorese bei 5 C und einer Stromstiirke von 200 mA durchgefflhrt, bis nach 3 Stunden die Markierungsfarbe das Gel nahezu zur Gänze durchquert hatte.
Zu diesem Zeitpunkt befand sich das erfindungs gemäss zu isolierende Protein-Metall-Chelat in einem Bereich, welcher etwa um 30% des von der Markierungsfarbe zurtick- gelegten Wanderungsweges vom Ursprungspurkt entfernt war.
Das erfindungsgemäss zu isolierende Protein-Metall-Chelat war gut getrennt von den beträchtlich rascher wandernden
Albuminen und ebenfalls gut getrennt von den wesentlich langsamer wandernden y-Globulinen. Nach abgeschlossener Elektrophorese wurde das erwünschte Protein-Metall-Chelat aus dem Gel mittels eines Querstromes an 0,1 m Tris-Maleat Puffer, welcher an Mg++ 0,001 molar war, ausgewaschen, wobei das Fortschreiten des Isolierens durch Bestimmung der UV-Absorption bei 280 mm verfolgt wurde. Die Einheitlichkeit des so erhaltenen Protein-Metall-Chelats wurde durch analytisch durchgefiihrte Gelscheiben-Elektrophorese noch überprüft.
Aus dem erhaltenen Eluat wurde das zu isolierende Protein Metall-Chelat dadurch gewonnen, dass dieses Eluat zunächst erschöpfend gegen 0,001 m Tris-Maleat-Mg++-Puffer und dann gegen entsalztes Wasser dialysiert und dann das erhaltene Dialysat gefriergetrocknet wurde Hiebei wurde ein weisses, flaumiges Pulver in einer Menge erhalten, die etwa 16% des durch Ammoniumsulfat ausgefällten Produktes ausmachte.
Die Ausbeute an Protein-Metall-Chelat betrug, bezogen auf Trockengewicht der eingesetzten Ochsenleber, 0,02 %.
Beispiel 2
Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden alle Arbeits grange in einem kalten Raum (2-50C) vorgenommen.
Frische Rinderleber wurde vermahlen und in einen Kunst stoffbehilter eingefullt, worauf kaltes destilliertes Wasser in einer Menge von 2 1 pro kg Leber unter Riihren zugegeben und der pH-Wert des erhaltenen Gemisches mit 0, in-NaOH auf 7,5-7,6 eingestellt wurde. Dem Gemisch wurde nun so viel an 2m-MnSO4-Lösung zugegeben, dass das Gemisch an Mangan 0,05 molar wurde. Der pH-Wert wurde sodann auf 7,6 eingestellt, worauf so viel frisches kaltes Wasser zugegeben wurde, dass auf 1 kg Leber insgesamt 3 1 Wasser kamen. Nun wurden pro kg Leber 50 ml Toluol zugesetzt, worauf die Mischung iiber Nacht im kühlgehaltenen Raum gerührt wurde.
Am darauffolgenden Morgen wurde die Suspension durch Gaze aus Kunststoffäden filtriert, worauf das Filtrat mit dem 1l/2-fachen Volumen an kaltem Aceton (-10oC) unter gelindem Riihren versetzt wurde. Die Zugabe des Acetons erfolgte iiber ein Glasrohr, welches weit genug unter die Oberfläche des Gemisches ragte. Der entstandene Niederschlag wurde numittelbar darauf durch Abzentrifugieren isoliert und sogleich in etwa 25 Vol.-% an 0,05 m Maleat-Mn++-Puffer, bezogen auf das Volumen des Filtrats vor Zugabe des Acetons, suspendiert. Die Mischung wurde in der Kiilte mehrere Stunden gerdhrt, iiber Gaze aus Kunststoffäden filtriert und durch Zentrifugieren gehilirt.
Die erhaltene nberstehende Fliissigkeit wurde in einem Kessel aus rostfreiem Stahl unter Rühren rasch auf 60OC erhitzt und bis 20 min nach Beginn des Erhitzens auf dieser Temperatur gehalten. Die Mischung wurde sodann so rasch als möglich auf 5 C gekühlt, worauf der entstandene volumindse Niederschlag im kalten Raum durch langsames Absaugen tiber eine grosse Filterfläche abfiltriert wurde.
Die Temperatur des klaren Filtrats wurde auf 2-5oC gebracht, worauf 0,9 Vol.-tle denaturiertes ethanol (-10oC) mittels eines Tropftrichters tiber ein sich bis weit unter die Oberfläche des Gemisches erstreckendes Glasrohr unter starkem Riihren und bei einer Temperatur von höchstens 5 C zugegeben wurden. Nach voll stindiger Zugabe des Alkohols wurde das Gemisch gerade so lange in einem kalten Raum verwahrt, bis sich der Niederschlag zusammengeballt und abgesetzt hatte. Der Niederschlag wurde durch Absaugen mit niedrigem Unterdruck isoliert und unmittelbar anschliessend in kaltem 0,001 m Maleat-Mn++ Puffer von pH 7,0 gelöst. Die Menge an verwendetem Puffer betrug etwa 4 ml/g Niederschlag.
Die Ldsung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die iiberstehende Flüssigkeit abgetrennt und der Niederschlag mit kleinen Mengen kalter Pufferlösung mehrmals extrahiert wurde. Die iiberstehenden Fliissigkeiten werden miteinander vereinigt und gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver stellte ein Gemisch aus erwflnschtem Protein, Arginase und anderen Enzymen, Albumin und anderen, unwesentlichen Proteinen dar.
Zwecks weiterer Aufarbeitung wurde das so erhaltene Pulver im 12-fachen seines Schiittvolumens an kaltem 0,2 m Tris Puffer gelöst, welcher an Mg++ 0,001 molar war und einen pH-Wert von 7,8 besass. Die so erhaltene Ldsung wurde mit kalter gesättigter Ammonsulfatlösung behandelt, welche ebenfalls an Mg++ 0,001 molar war. Pro 1000 ml Pufferlösung wurden hievon Anteile zu je 375 ml gegeben, wobei die Puf ferlösung jeweils zu 15, 30, 45, 60 und 75% an Ammonsulfat gesättigt wurde. In jedem Falle erfolgte die Zugabe der Ammonsulfatlösung tropfenweise bei 0-5oC und unter Riih- ren.
Es wurde weitere 10 Minuten gerührt, worauf der entstandene Niederschlag durch Zentrifugieren bei 4500 U/min wäh- rend 30 min bei 0OC abgetrennt wird. Von den 5 erhaltenen Fillungen wurde die erste (A), welche die unerwiinschten Proteine hohen Molekulargewichts enthält, verworfen. Die zweite und die dritte Fillung (B und C) wurden vereinigt und enthalten Arginase und andere Enzyme (welche erwiinschten- falls isoliert werden konnen). Auch die vierte und die fünfte Flung (D und E), welche das mit Albumin und verschiedenen anderen Proteinen niedrigeren und höheren Molekulargewichts verunreinigte erwünschte Protein enthalten, wurden miteinander vereinigt.
Die zuletzt vorliegende iiberstehende Flissigkeit, welche Proteine niedrigen Molekulargewichts und weitere unerwiinschte Verunreinigungen enthilt, wurde verworfen. Die Fillungen D und E wurden in 0,03 m Tris-Mg++ Puffer, welcher an Mg++ 0,001 molar ist und einen pH-Wert von 7,8 besass, in einer Menge gelds, dass eine möglichst genau 10 %ige Lösung erhalten wurde. Die so erhaltene Lösung wurde gegen kalten Puffer dialysiert, bis die Reaktion auf Sulfationen negativ war. Die dialysierte Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die iiberstehende Flüssig- keit durch ein Milliporo -Filter filtriert wurde.
Das erhaltene Filtrat wurde direkt auf den Kopf einer Chromatographier säule (76 x 456 mm) aufgegeben, welche mit Sephadex C-100 (Pharmacia, Schweden) gefüllt war. Das Sephadex wurde nach den Vorschriften des Herstellers gequollen, auf einen definierten Zustand gebracht und gewaschen. Die so vorbereitete Kolonne wurde mit 0,03 m Tris-(0,001 m Mg++)-Puffer von pH 7,8 ins Gleichgewicht gebracht und auf eine Durchflussgeschwindigkeit von etwa 20 ml pro Stunde eingestellt. Nachdem die Probe auf die Kolonne aufgegeben worden war, wurde sie innerhalb 30-45 min mit den ersten 3 cm des Kunstharzbettes ins Gleichgewicht gebracht, worauf mit dem Fraktionieren begonnen wurde. Es wurden Einzelfraktionen zu je 10 ml aufgefangen. Das Auftreten der Scheitel wird durch Bestimmung der Proteinkonzentration mittels der Absorption bei 280 mm erkannt.
Vor dem Auftreten des erwiinschten Proteins ergaben sich zwei Scheitelwerte, die auf Albumin und andere unerwünschte Proteine ähnlichen oder höheren Molekulargewichts zuriickzufiihren sind. Diese Scheitelwerte zeigenden Fraktionen wurden verworfen. Das erwünschte Protein fand sich in jener Fraktion des gesamten Eluats, welche die cm3 von 130-170 umfassen. Diese Fraktionen wurden zwecks weiterer Aufarbeitung vereinigt. Beim weiteren Eluieren der Kolonne, insbesondere beim Erhöhen der Ionenkonzentration des Puffers, flossen aus der Kolonne restliche Proteine niedrigen Molekulargewichts enthaltende Eluate ab. Die Proteine niedrigen Molekulargewichts wurden aus der Kolonne entfernt, um diese für die nächste Charge zu reinigen.
Die das erwflnschte Protein enthaltenden, miteinander vereinigten Fraktionen werden gegen eine 0,001 molare Lösung von Mg++ in entsalztem Wasser dialysiert, bis sie weniger als 10-7 verringert worden war. Die erhaltene Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüssigkeit gefriergetrocknet wurde.
75 kg frische Rinderleber, wetche 70% Wasser enthilt und 22,5 kg Trockensubstanz lieferte, ergab eine Ausbeute von etwa 200 g (1%) des das Mn++-Chelat enthaltenden Zwischenproduktes. 200 g dieses Zwischenproduktes lieferten 17,5 g (0,08 %) Feststoffe in Form der Fraktionen D und E.
Beim Chromatographieren fiber Sephadex wurden aus den Fraktionen D und E 2,9 g des erwünschten Protein-Metall Chelats erhalten, was, bezogen aufs Trockengewicht der Leber, einer Ausbeute von 0,014% entsprach.
Bei intradermaler Verabreichung oder bei Verabreichung auf anderem Wege an versensibilisierte Meerschweinchen erzeugt das erfindungsgemiiss isolierbare Protein-Metall Chelat keine Antigene. Entsprechende Versuche bei Verwendung von Freund's-Adjuvans in Kaninchen konnte die Bildung von Antikörpern nicht festgestellt werden, womit erwiesen erscheint, dass die antigenetische Wirkung des Protein-Metall Chelats höchstens extrem niedriger Grössenordnung ist, so dass dieses Chelat lange Zeitriiume an Siiugetiere verabreicht werden kann, ohne Störungen erwarten zu miissen.
An Kaninchen wurden innerhalb 29 Tagen auf 6 Einzeldosen verteilt insgesamt 30 mg/kg des Protein-Metall-Chelats zusammen mit Freund's Adjuvans und Alaunfiillung verabreicht. Nach Ablauf der Immunisierungsperiode wurde das Serum-(y-Globulin) der Tiere durch Aussalzen konzentriert und anschliessend gefriergetrocknet. Ouchterlony-Platten und Immun-Elektrophorese unter Verwendung dieser konzentrierten y-Globulin-Fraktion gegen das erfindungsgemiss isolierbare Protein lieferten keinerlei Fillungslinien.
Obzwar gesunde Tiere immunologisch nicht ansprechen, sprechen Schwerkranke, deren autoimmunes System praktisch inaktiv ist oder aus dem Gleichgewicht geraten ist, gelegentlich immunologisch an, wodurch sich allerdings die Verwendung des Protein-Metall-Chelats nicht verbietet. Ganz ha Gegenteil ist darin eine begriissenswerte Erscheinung zu sehen, welche darauf hindeutet, dass sich das autoimmune System des Patienten reaktiviert hat, was eine lebenswichtige Vorstufe vor der völligen Genesung des Patienten darstellt.
Das erfindungsgemäss herstellbare Protein-Metall-Chelat wird in der Regel auf dem Injektionswege, beispielsweise intravends oder subkutan, vorzugsweise jedoch intramuskulir verabreicht. Die an Menschen zu verabreichenden Einzeldosen liegen in der Regel zwischen etwa 0,05-1,0 mg. An Pferde werden in der Regel etwa 0,4-5,Omg intramuskulir verabreicht. Die Dosis ist nicht kritisch. Die Anfangsdosen sind in der Regel grosser zu wählen als die fir die anschliessende Therapie. Bei der Bekimpfung von Viruserkrankungen wird das Protein-Metall-Chelat in der Regel in Einzeldosen von 0,2-4,0 mg intramuskulir verabreicht.
Im Gegensatz zur Behandlung chronischer Krankheiten empfiehlt sich bei der Bekiimpfung von Viruserkrankungen die Verabreichung in schneller aufeinanderfolgenden Dosen, beispielsweise in Form von zwei Injektionen pro Tag während mehrerer Tage. Die Behandlungsdauer und die Häufigkeit der Verabreichung hängen von der Reaktion ab, welche hiiufig einer dramatischen Besserung entspricht. In der Regel betriigt die Behandlungsdauer drei bis acht Tage. Im Falle eines Rückfalles sind erneute Injektionen von gleichem Erfolg.
Orale Verabreichung des Protein-Metall-Chelats ist m5g- lich, sofern es vor einer Zerstörung ha sauren Milieu des Verdauungssystems und dessen Enzymen, beispielsweise in Form beschichteter Tabletten, geschützt ist. Bei diesem Verabreichungsweg sind allerdings wesentlich grössere Dosen erforderlich. Qberraschenderweise ist das Protein-Metall-Chelat auch lokal verabreicht wirksam, weshalb es beispielsweise in Form einer Lösung in physiologischer Kochsalzliisung oder einer Pufferlösung und in Form von Cremen, Salben usw. verabreicht werden und zur Behandlung von Erkrankungen der Cornea und von Conjunctiva, der Atmungswege, der Genitalien, des Harnweges und der Haut verwendet werden kann.
Durch lokale Verabreichung ist es beispielsweise möglich, Akne, Irritationen, Abschiirfungen, Brandwunden, Abszesse, Psoriasis usw. zu behandeln. In diesem Falle wird das Protein Metall-Chelat zweckmässig gemeinsam mit einem Netzzittel und/oder einem Penetrationsmittel verabreicht.