CH579147A5 - Antiparasitic streptomyces hygroscopicus metabolite - i.e. septamycine, as antibacterials, antiprotozoals, anthelminthics and coccidiostats - Google Patents

Description

  
 



   Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Metaboliten Septamycin (Formel 1, siehe Formelblatt) in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze.



   Der neue erfindungsgemäss verwendete Stamm von Streptomyces hygroscopicus (Jensen 1931) Waksman and Henrici, 1948 wurde aus einer in Madison, Wisconsin in den USA gefundenen Erdprobe isoliert und eine Probe davon beim United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division) Peoria,   I11.,    USA deponiert und steht der Öffentlichkeit unter der Kulturnummer NRRL 5678 zur Verfügung.



   Der Stamm NRRL 5678 wächst gut auf organischen und synthetischen Medien bei   27     und einem pH-Wert zwischen 6 und 9. Die Sporenträger sind monopodial verzweigt mit engen kompakten Spiralen. Sie bilden oft dichte Büschel, die ein pseudoverticillates Aussehen haben. Die Sporen sind oval, 1,0 bis 1,2 Micron lang und 0,8 bis 1,0 Micron breit.



  Ihre Oberfläche ist warzenartig.



   Auf einigen Medien wurde ein ausgeprägtes hydroskopisches Verhalten beobachtet, indem das Luftmycel feucht wurde und schwarze, glänzende Flecken zeigte. Anhand des Klassifikationssystems von Waksman (Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2 328-334, 1961) konnte der Stamm NRRL 5678 als Stremptomyces hygroscopicus (Jensen, 1931) Waksman and Henrici, 1948, identifiziert werden.



   Die Wachstumseigenschaften des Stammes NRRL 5678 auf normalen biologischen Medien und seine Kohlenstoffassimilation sind in den folgenden Tabellen aufgeführt.



  Wachstumseigenschaften Medium Wachstumseigenschaften Mycelform Malz-Hefe- W: gut, cremefarben bis dichte Spiralen Extrakt leicht braun Agar R: gelb bis braun 2-5 Windungen
LM: weiss bis leicht grau Spira a  (Gy g)*
LP: keine Hafer W: gut, farblos dichte Spiralen Agar R: cremefarben bis gelb 2-5 Windungen oder grüngelb Spira a
LM: weiss bis grau mit etwas gelbem Mycel  (Gy d)
LP: keine Stärke W: gut, farblos dichte Spiralen anorga- R: cremefarben bis gelb- 2-5 Windungen nische grün Spira a Salze LM: weiss bis aschgrau Agar (Gy d)
LP: keine Glycerin W: mittel, farblos bis dichte Spiralen leicht grau 2-5 Windungen Asparagin R: gelb bis leicht braun Agar Spira a
LM: weiss bis leicht grau mit etwas gelbem
Mycel (Gy e)
LP: leicht gelbes Pigment W: Wachstum R: Rückseite LM: Luftmycel   LP:

  Lösliches Pigment * Referenz mit Bezug auf das  Color-wheels-System     Assimilation von Kohlenstoffverbindungen Wachstum Kohlenstoffquelle ++ Glukose, Sucrose, Fructose; Rhamnose   +- Arabinose,    Xylose, Mannit, Raffinose - Inositol, Cellulose ++gute Verwertung +-Verwertung fraglich -keine Verwertung
Der neue Stamm NRRL 5678 besitzt folgende physiologische Eigenschaften:

  : Nitratreduktion negativ Stärkehydrolyse positiv Zellulosezersetzung negativ Tyrosinreaktion schwach positiv Milchkoagulation negativ Milchpeptonbildung stark positiv Gelatineverflüssigung positiv, kein lösliches
Pigment Melaninbildung negativ
Die Züchtung des Stammes NRRL 5678 erfolgt durch Anwendung an sich bekannter Methoden und besteht im wesentlichen darin, den genannten Stamm auf einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und anschliessend den im Laufe der Züchtung gebildeten Metaboliten Septamycin in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze abzutrennen. Die Züchtung des Stammes NRRL 5678 kann nach jeder aeroben Oberflächenzüchtung oder Immersionszüchtung erfolgen.



   Zu Beginn der Züchtung soll der pH-Wert des Fermentationsmediums zwischen 6,8 und 7,0 liegen. Die zur Züchtung optimale Temperatur kann zwischen 25 und   35     liegen. Die
Belüftung der Züchtung kann zwischen weiten Grenzwerten schwanken. Die maximale Ausbeute am Metaboliten Septamycin wird nach 2 bis 7tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.



   Die Fermentationsmedien sollen hauptsächlich eine assi milierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoff quelle und gegebenenfalls Mineralsalze und Wachstumsfakto ren enthalten, wobei alle diese Elemente in Form von gut de finierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können. Medien auf Basis von Glu cose eignen sich besonders gut. Weiterhin eignen sich Suc rose, Fructose und Rhamnose als Kohlenstoffquelle, organi sche und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie
Pepton, Hefe- oder Fleischextrakte, Ammoniumnitrat, Ammo niumsulfat, Aminosäure usw. als Stickstoffquelle in Frage.



   Spurenelemente, die für ein optimales Wachstum des Or ganismus, der zur Produktion von Septamycin verwendet wird, erforderlich sind, sollen ebenfalls in dem Kulturme dium enthalten sein. Solche Spurenelemente kommen ge wöhnlich als Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die für den Wachstumsbedarf des erfindungsgemäss verwendeten Stammes NRRL 5678 ge nügen.



   Sobald bei der Züchtung eine maximale Menge an Meta bolit Septamycin produziert worden ist, wird die Kultur brühe gegebenenfalls mit dem Ultraturrax aufgeschlossen und der Metabolit Septamycin durch extraktive und/oder ad sorptive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise iso liert. Der   Metabolit    Septamycin kann hierauf chromatogra phisch, durch Kristallisation oder mittels Gegenstromvertei lung gereinigt werden.



   Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erwie  sen hat, ist die Extraktion der aufgeschlossenen Kulturbrühe mit Hexan, jedoch können auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Äthylenchlorid, Petroläther, Benzin, Benzol, Chloroform, Butylacetat, Methylenchlorid, Butanol oder Essig ester verwendet werden.



   Anschliessend werden die Extrakte vom Lösungsmittel befreit und der Metabolit Septamycin auf chromatographischem Wege an Sephadex LH 20, Tonerde, Kieselgel, Adsorptionsharze wie Amberlite XAD-12 usw., Magnesiumsilikat, Aluminiumoxyd und der gleichen, Gegenstromverteilung und/oder Kristallisation gereinigt.



   Ebenso kann eine Anreicherung von Septamycin in freier Form oder in Form seiner Salze durch Adsorptionschromatographie an Kieselgel mit unpolaren Lösungsmitteln (Chloroform und 2 bis   5%    Methanol oder Chloroform und   2O0/o    Aceton oder mit Toluol +   1O0/o    Aceton mit   1 /o    Tri äthylaminzusatz und nachfolgender Sephadex-Gelfiltration in Aceton oder Methanol durchgeführt werden.



   Der Metabolit Septamycin in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze ist für humanmedizinische und veterinärmedizinische Zwecke geeignet.



   Der neue Metabolit Septamycin ist wirksam gegenüber grampositiven Bakterien. Im Verdünnungstest wurden die folgenden Mindesthemmkonzentrationen festgestellt: Staphylococcus aureus 0,31 mcg/ml Streptococcus pyogenes 0,1 Bacillus subtilis 0,1 Bacillus stearothermophilus 0,01 Neisseria pharyngis 1 Clostridium pasteurianum 0,1
Septamycin in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze besitzt ferner ein breites antiparasitäres Wirkungsspektrum, das sowohl Helminthen als auch Protozoen umfasst.



  Während sich bei den medizinisch bedeutsamen Helminthen die Wirkung insbesondere gegen Trematoden wie S. mansoni und F. hepatica richtet, ist Septamycin bei Protozoen besonders gegen Kokzidien und Plasmodien wirksam.



   Wie im Malaria-Modell Plasmodium berghei yoelii/Maus mit der Methode von E. Fink (Z. Tropenmed. Parasit 23, 35 bis 47, 1972) nachgewiesen werden kann, ist Septamycin wirksam gegen Plasmodien und führt hier nach ein- bis mehrmaliger oraler Applikation von  >  5   mg/kg/Maus    zur Hemmung bzw. Unterbrechung des Infektionsverlaufes. Die Wirksamkeit ist besonders ausgeprägt, wenn mit der Applikation von Septamycin am Tage der Infektion begonnen wird. Die Substanz erscheint daher zur Prophylaxe und Therapie der verschiedenen Malariaformen des Menschen geeignet.



   Die prophylaktische Dosis kann etwa mit 30 bis 50   mgIx    wöchentlich angenommen werden. Zur Therapie werden täglich 10 bis 20 mg über 10 Tage dosiert, wobei eine Kombination mit Präparaten wie Chloroquin, Chinin oder Pyrimethamin zu empfehlen ist.



   Die Wirksamkeit gegen verschiedene Coccidienarten und -spezies wird unter experimentellen Bedingungen am Beispiel Eimeria tenella, einem wichtigen Coccidiose-Erreger des Geflügels wie folgt aufgezeigt:
Die Untersuchungen erfolgten an Eintagsküken in einem 10 Tage währenden Test. Dabei erhielten die Kükengruppen ein mit Septamycin in verschiedenen Konzentrationen medikiertes Futter und wurden 48 Stunden nach Beginn der Fütterung am 3. Lebenstag mit 200 000 sporulierten Oocysten von E. tenella oral infiziert. Am 7. Tag post infectionem erfolgte der Abbruch des Versuches und die Feststellung der Wirksamkeit unter Berücksichtigung der Kriterien Mortalität, Läsionsgrad des Caecums und Gewichtszunahme im Vergleich zu infizierten-unbehandelten sowie gesunden-unbehandelten Kontrolltieren.



   Es zeigt sich hierbei, dass durch Septamycin in Futterkonzentrationen von mehr als 30 ppm. der Infektionsverlauf von E. tenella im Blinddarm unterbrochen bzw. gehemmt wird, was im Vergleich zu den Kontrolltiergruppen sowohl in der Mortalität und im Läsionsgrad der Blinddarmschleimhaut als auch in einer günstigen Gewichtsentwicklung, die im Bereich von gesunden Küken liegt, zum Ausdruck kommt.



   Septamycin ist gegen Coccidiose-Infektionen wirksam, wenn es dem Futter von Küken zugesetzt wird. Mit Mengen von 5 bis 50 g Septamycin pro Tonne Futter werden Infektionen wirksam bekämpft.



   Ferner zeigte der Metabolit Septamycin und seine Alkalisalze als Futtermittelzusatz, dass er bereits in geringer Konzentration beim Wiederkäuer die Futterverwertung verbessert. Diese Wirkung wurde   fn    vitro mit Hilfe eines künstlichen Pansens nachgewiesen. Mit dieser Methode können Substanzen auf eine Inhibierung der Methanogenese und/oder Verschiebung der Fettsäurebildung zugunsten von Propionat untersucht werden. Aus dem Pansen eines Wiederkäuers wird Pansensaft entnommen und bei 39   "C    unter ständigem Durchleiten von CO2 durch Gaze filtriert. Dieser Pansensaft wird anschliessend gemeinsam mit dem vom Tier benützten Futter, das die zu untersuchende Substanz enthält, inkubiert.



  Nach Beendigung der Inkubationszeit werden aus dem Gasraum 2 Proben entnommen und gaschromatografisch auf Methan und Kohlendioxyd untersucht. Anschliessend wird die flüssige Phase auf ihren Fettsäuregehalt untersucht. Der Vergleich zu einer Probe ohne Substanzzusatz ergibt einen Parameter für die Wirksamkeit. Beispielsweise ergibt ein Zusatz von 0,25 ppm Septamycin (bezogen auf das Flüssigkeitsvolumen) eine Reduktion von etwa   280/0    der Methanproduktion.



  Bei gleichbleibender Fermentationsrate steigt die Produktion von Propionsäure an (siehe Tabelle).



   Tabelle
Kontrolle Futter mit  (ohne Zusatz) 100 ppm
Septamycin   Mol-0/o    der entstandenen Fettsäuren: Essigsäure 70,5 67,3 Propionsäure 17,4 19,9 Buttersäure 12,1 12,8
Der Metabolit Septamycin kann daher als Futtermittelzusatz verwendet werden. Zweckmässigerweise weist das verabreichte Futter einen Gehalt von 1 bis 500 mg Wirkstoff pro kg Futter auf.



   Der einfachste Weg zur Verabreichung von Septamycin in freier Form oder in Form seiner Alkalimetall-, Erdalkalisowie seiner Ammoniumsalze für veterinärmedizinische Zwecke besteht darin, sie dem Futter für die Tiere beizumischen. Septamycin oder seine Salze können aber auch auf anderen Wegen verabreicht werden. Beispielsweise können sie in Tabletten, Tränkmittel, Boluse oder Kapseln eingebracht und so den Tieren dosiert gegeben werden. Die Zubereitung von Septamycin oder seiner Salze in solchen Dosierungsformen kann nach Methoden erfolgen, die auf dem Gebiet der Veterinärpharmazie allgemein bekannt sind.

 

   Septamycin oder seine Alkalisalze können für humanmedizinische Zwecke als Arzneimittel allein, und zwar sowohl in reiner kristalliner Form als auch als Rohkonzentrat oder in den entsprechenden Arzneiformen für topicale, orale, ent erale oder parenterale Verabreichung verwendet werden.



   In dem nachfolgenden Beispiel, welches die Ausführung des Verfahrens erläutert, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturan gaben in Celsiusgraden.  
EMI3.1     




  Beispiel
In Erlenmeyer von 200 ml, welche 50 ml einer Nährlösung (pro 1 30 g Malzextrakt, 5 g Pharmamedia und sterilisiertes Wasser) enthält, werden mit 2 ml einer Vorkultur des Stammes NRRL 5678 angeimpft. Die Nährlösung wurde vorgehend bei einem pH von 6,8 bis 7,0 bei 121   "C    während 20 Minuten in einer Autoklaven sterilisiert. Die Erlenmeyer werden 4 bis 7 Tage bei   27     und einem pH von 6,9 geschüttelt (Schüttelmaschine 200 U/Min.). Hierbei wird gleichzeitig be   lüftet.   



   Anschliessend wird die Kulturbrühe mit Hilfe des Ultraturrax aufgeschlossen und bei einem pH 9 (eingestellt mit Natronlauge) mit Hexan extrahiert. Nach Abtrennung der organischen Phase wird dieselbe im Vakuum eingeengt und über Natriumsulfat getrocknet. Das Konzentrat lässt man langsam über Amberlit XAD-12 durchfliessen und spült mit Hexan nach. Die erhaltene Lösung wird im Vakuum bei maximal   40     Badtemperatur zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Pentan kristallisiert. Durch einmalige Umkristallisation aus Hexan erhält man reines Na-Septamycin.



   Der Metabolit Septamycin-Na Salz der Formel I hat folgende Charakteristika:
Farblose, kristalline Substanz mit dem Smp. 164 bis   166     (Hexan) Spez. Drehung:   ra]D     = +15,3 (c = 0,810 in Chloroform) Molekulargewicht (thermoelektrisch bestimmt) 937 in Methylenchlorid.



   Löslichkeit: gut löslich in Benzol, Chloroform, Aceton, Methanol, unlöslich in   Wasser    Elementaranalyse: Gef.: C 61,7 H 8,8 Na 2,4 Rest 27,1%   Ber.:    C 61,4 H 8,9 Na 2,4 0 27,3%   C48H8lOg6    Na (939,16)    Die    als Ausgangsmaterial verwendete Vorkultur wird wie folgt erhalten:
Eine gut sporierende Agarkultur des Stammes NRRL 5678 wird mit 5 ml einer sterilen 0,85% Kochsalzlösung gewaschen, wobei eine trübe Sporensuspension erhalten wird.

 

  Einen Milliliter der Sporensuspension verwendet man zur Beimpfung von 100 ml eines Vorkulturmediums folgender Zusammensetzung: Pharmamedia 26 g/l Glucose 25 g/l und dest. Wasser ad   11   
Das Vorkulturmedium wird bei einem pH 6,7 in einem Autoklaven bei   121"    während 20 Minuten sterilisiert. Jeweils 100 ml des Vorkulturmediums werden 2 bis 3 Tage bei   27     unter Belüftung geschüttelt (Schüttelmaschine 200 U/Min.). 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Herstellung des neuen Metaboliten Septa mycin EMI3.2 in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze, dadurch gekennzeichnet, dass man einen neuen Stamm der Actinomycetspecies Streptomyces hygroscopicus auf oder in einem Nährmedium züchtet und hierauf den Metaboliten Septamycin in freier Form oder in Form seiner Alkalisalze aus dem Nährmedium isoliert und reinigt UNTERANSPRUCH Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als neuen Stamm der Actinomycetspecies Streptomyces hygroscopicus den Stamm NRRL 5678 verwendet.