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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von D-Fructose, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens ein Acryloylmonomer in einer wässrigen Suspension eines Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsakzelerators polymerisiert, um einen unbeweglich gemachten Glucose Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus herzustellen, und dass man dann den unbeweglich gemachten Glucose Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus einer enzymatischen Reaktion mit D-Glucose unterwirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Acryloylmonomer Acryloylamid, ein N,N' Niederalkylen-bis-acryloylamid, Bis-(acryloylamidomethyl) - äther und/oder N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die enzymatische Reaktion in Gegenwart von Magnesium- und Kobaltionen ausführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein N,N'-Niederalkylen-bis-acryloylamid, Bis (acryloylamidomethyl)-äther oder N,N'-Diacryloyl-äthylenharnstoff zur Polymerisation verwendet oder Acryloylamid mit einem N,N'-Niederalkylen-bis-acryloylamid, Bis-(acryloylamidomethyl)-äther oder N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff zur Copolymerisation verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Polymerisation bei einer Temperatur von 0 bis 500 C und die enzymatische Reaktion bei einer Temperatur von 20 bis 800 C und bei einem pH-Wert von 6 bis 9 ausführt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Polymerisation bei einer Temperatur von 20 bis 400 C und die enzymatische Reaktion bei einer Temperatur von 50 bis 700 C durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Polymerisationsinitiator Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B2 oder Methylenblau verwendet und als Polymerisationsakzelerator ss-(Di-methylamino)propionitril oder N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus Streptomyces griseus IFO 3430, Streptomyces griseus IFO 3356, Streptomyces aureus IFO 3175, Streptomyces olivaceus IFO 3409 oder Bacillus coagulans IFO 12714 verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein N,N'-Niederalkylen-bis-acryloylamid, Bis (acryloylamidomethyl)-äther oder N,N'-Diacryloyl-äthylharnstoff in einer wässrigen Suspension, die 0,25 bis 2,5 g pro g des Acryloylmonomers eines Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus enthält, in Gegenwart von 1 bis 100 mg pro g des Acryloylmonomers eines Polymerisationsinitiators und 1 bis 100 mg pro g des Acryloylmonomers eines Polymerisationsakzelerators bei einer Temperatur von 0 bis 500 C polymerisiert, den so erhaltenen unbeweglich gemachten Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus durch ein Sieb passiert,
um Körnchen des unbeweglich gemachten Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus zu erhalten,und dass man dann die erwähnten Köruchen des unbeweglich gemachten Mikroorganismus einer enzymatischen Reaktion mit D-Glucose bei einer Temperatur von 20 bis 800 C und bei einem pH von 6 bis 9 in Gegenwart von 1 bis 20 mMol Magnesiumionen und 0,1 bis 10 mMol Kobaltionen pro Liter der Reaktionslösung unterwirft.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als Polymerisationsinitiator Kaliumpersulfat, Am moniumpersulfat, Vitamin B2 oder Methylenblau verwendet und als Polymerisationsakzelerator ss-(Di-methylamino)propionitril oder N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Acryloylamid mit 5 bis 160 mg pro g Acryloyl amid eines N,N'-Niederalkylen-bis-acryloylamids, Bis-(acryloylamidomethyl)-äthers oder N,N'-Di-acryloyläthylenharnstoffs in einer wässrigen Suspension, die 0,25 bis 2,5 g pro g Acryloylmonomer eines Glucose-Isomerase hervorbringen den Mikroorganismus enthält, in Gegenwart von 1 bis 100 mg pro g Acryloylmonomer eines Polymerisationsinitiators und
1 bis 100 mg pro g Acryloylmonomer eines Polymerisationsakzelerators bei einer Temperatur von 0 bis 500 C copolymerisiert, den dabei entstandenen unbeweglich gemachten Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus durch ein Sieb passiert, zum Körnchen des unbeweglich gemachten Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus zu erhalten,
und die vorher erwähnten Körnchen des unbeweglich gemachten Mikroorganismus einer enzymatischen Reaktion mit D-Glucose bei einer Temperatur von 20 bis 800 C und bei einem pH von 6 bis 9 in Gegenwart von 1 bis 20 mMol Magnesiumionen und 0,1 bis 10 mMol Kobaltionen pro Liter der Reaktionslösung unterwirft.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als Polymerisationsinitiator Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B2 oder Methylenblau verwendet und als Polymerisationsakzelerator ss-(Di-methylamino)-propionitril oder N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin verwendet.
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung von D-Fructose durch enzymatische Reaktion ei nes unbeweglich gemachten Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus mit D-Glucose.
D-Fructose ist ein nützlicher Süssstoff. Unter Fachleuten ist es bekannt, dass Glucose-Isomerase die Fähigkeit besitzt, D-Glucose in D-Fructose umzuwandeln. Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von D-Fructose aus D-Glucose mittels enzymatischer Reaktion von Glucose-Isomerase bekannt. Man kann D-Fructose z. B. herstellen, indem man einen Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus in einem D-Glucose enthaltenden Nährmedium züchtet. Andererseits kann man D-Fructose durch Extrahieren von Glucose-Isomerase aus einem Mikroorganismus und durch Reaktion des Enzyms mit D-Glucose herstellen. Diese Verfahren sind jedoch zur kommerziellen Herstellung von D Fructose unvorteilhaft. Nach diesem Verfahren hergestellte D-Fructose ist mit dem Enzym, Mikrobenzellen, Nährquellen des Mediums und/oder Protein verunreinigt.
Deshalb muss man, falls man D-Fructose von hohem Reinheitsgrad erhalten will, zusätzliche Schritte zur Entfernung des Enzyms und anderer Verunreinigungen des Produkts ausführen. Des weiteren muss man, wenn die enzymatische Reaktion vollendet ist, die Reaktionslösung kochen und/oder ansäuern, um das Enzym oder den Mikroorganismus zu denaturieren, worauf man dann das ausgefällte Enzym oder den Mikroorganismus abfiltriert. Auf diese Weise kann man Glucose-Isomerase oder den Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus nur einmal benützen und muss ihn darauf entfernen.
Ein Ziel der Erfindung ist es, einen neuen unbeweglich gemachten Mikroorganismus zu beschaffen, der während einer zeitlich langen Periode hohe Aktivität der Glucose Isomere ermöglicht. Ein anderes erfindungsgemässes Ziel ist, einen unbeweglich gemachten Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus zu beschaffen, der es ermöglicht, das Wegwerfen des Mikroorganismus unnötig zu machen und der in einer Anzahl darauffolgender Verfahren wie
der verwendet werden kann. Ein anderes erfindungsgemässes Ziel besteht darin, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von D-Fructose aus D-Glucose unter Verwendung eines Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus zu finden. Weitere erfindungsgemässe Ziele kann man aus der folgenden Beschreibung entnehmen.
Erfindungsgemäss stellt man D-Fructose dadurch her, dass man mindestens ein Acryloylmonomer in einer einen Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus enthaltenden wässrigen Suspension in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsakzelerators polymerisiert, wobei man einen unbeweglich gemachten Glucose Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus erhält, und den unbeweglich gemachten Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus einer enzymatischen Reaktion mit D-Glucose unterwirft.
Bevorzugte erfindungsgemäss verwendete Glucose-Isomerase hervorbringende Mikroorganismen umfassen Streptomyces griseus IFO (Institute for Fermentation, Osaka, Japan) 3430, Streptomyces griseus IFO 3356, Streptomyces aureus IFO 3175, Streptomyces olivaceus IFO 3409 und Bacillus coagulans IFO 12714. Alle diese Mikroorganismen sind öffentlich zugänglich am oben erwähnten Aufbewahrungsort. Diesbezüglich sollte allerdings erwähnt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf diese spezifischen Mikroorganismen limitiert ist, sondern alle Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismen umfasst. Geeignete Mengen von Glucose-Isomerase hervorbringenden erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen betragen 0,25 bis 2,5 g, vorzugsweise 0,5 bis 2 g, pro g des benützten Acryloylmonomers.
Die erfindungsgemässe Polymerisationsreaktion dient dazu, jeden Mikroorganismus ins Gitterwerk des Polymers fest einzuschliessen, wobei man während einer langen zeitlichen Periode hohe enzymatische Aktivität erreicht.
Die erfindungsgemässe Polymerisationsreaktion wird in Gegenwart von Polymerisationsinitiatoren und Polymerisationsakzeleratoren ausgeführt. Als Polymerisationsinitiatoren kann man Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B2 und Methylenblau verwenden. Als Polymerisationsakzeleratoren verwendet man ss-(Dimethylamino)-propionitril und N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin. Geeignete Mengen des Polymerisationsinitiators, den man der wässrigen Suspension des Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus hinzugibt, betragen 1 bis 100 mg, vorzugsweise 5 bis 50 mg, pro g des Acryloylmonomers oder der Monomere. Geeignete Mengen des zufügbaren Polymerisationsakzeleratoren betragen 1 bis 100 mg, vorzugsweise 10 bis 50 mg, pro g des Acryloylmonomers oder der Monomere. Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise bei 0 bis 50, C, insbesondere bei 20 bis 400 C.
Die Umsetzung kann man nach 10 bis 60 Minuten als vollendet betrachten. Die erfindungsgemäss geeigneten Acryloylmonomere umfassen Acryloylamid, N,N'-Niederalkylen-bis-acryloylamid, Bis(acryloylamidomethyl)äther und N,N'-Diacryloyl-äthylenharnstoff (= N,N'-Di-acryloylimidazolidin-2-on). Erfindunsgemäss ist es vorteilhaft, den Glucose Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus mit einem Polymer aus einem oder zwei der oben erwähnten Monomere einzuschliessen, vorzugsweise mit einem Copolymer des Acryloylamids und eines Acryloylmonomers aus der Gruppe bestehend aus N,N'-Niederalkylen-bis-acryloylamid, Bis (acryloylamidomethyl)äther und N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff, oder mit einem Homopolymer von N,N'-Niederalkylen-bis-acryloylamid, Bis(acryloylamidomethyl)äther oder N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff.
N,N'-Methylen-bisacryloylamid und N,N'-Propylen-bis-acryloylamid werden vorzugsweise als N,N'-Niederalkylen-bis-acryloylamid verwendet. Geeignete Mengen des N,N'-Niederalkylen-bisacryloylamids, Bis(acryloylamidomethyl)äthers oder N,N'-Di acryloyl-äthylenharnstoffs, die man zur Copolymerisation mit Acryloylamid verwendet, betragen 5 bis 160 mg, vorzugsweise 25 bis 80 mg, pro g des Acryloylamids. Nach wie oben vollendeter Polymerisationsreaktion wird der so entstandene unbeweglich gemachte Glucose-Isomerase hervorbringende Mikroorganismus durch Sieben gekörnt, wobei man eine Körnchengrösse von 1 bis 10 mm, vorzugsweise von 3 bis 4 mm im Durchmesser erhält. D-Fructose wird aus D-Glucose durch enzymatische Reaktion des unbeweglich gemachten Glucose-Isomerase hervorbringenden Mikroorganismus hergestellt.
Die enzymatische Reaktion wird bei 20 bis 800 C, vorzugsweise bei 40 bis 700 C durchgeführt. Es ist vorteilhaft, die Reaktion bei einem pH von 6 bis 9, vorzugsweise bei einem pH von 7 bis 8,5, durchzuführen. Bei Ausführen der erfindungsgemässen enzymatischen Reaktion kann man die enzymatische Aktivität wirkungsvoll stabilisieren durch Zugabe von Magnesium- und Kobaltionen zu der Reaktionslösung. Geeignete Mengen von zu der Reaktionslösung zufügbaren Magnesiumionen betragen 1 bis 20 mMol, vorzugsweise 3 bis 10 mMol, pro Liter der Reaktionslösung.
Geeignete Mengen von zur Reaktionslösung zufügbaren Kobaltionen betragen 0,1 bis 10 mMol, vorzugsweise 0,5 bis 5 mMol, pro Liter Reaktionslösung. Die Konzentration irgendeines erfindungsgemäss verwendeten Substrats ist nicht kritisch. Z. B. kann man D-Glucose in jeder mengenmässigen Konzentration in Wasser lösen. Der zuvor erwähnte unbeweglich gemachte Mikroorganismus wird in der Lösung der D-Glucose suspendiert, und die Suspension gerührt. Nach vollendeter Reaktion wird das Gemisch filtriert oder zentrifugiert, um den unbeweglich gemachten Mikroorganismus zur späteren Verwendung wieder zu gewinnen. Eine wässrige, D-Fructose enthaltende Lösung wird als Filtrat oder als oben schwimmende Lösung erhalten. D-Fructose wird durch eine bekannte Methode, z. B. durch Zufügen von Borsäure oder eines Borats (z. B.
Natriumtetraborat) zum Filtrat oder zu der oben schwimmenden Lösung, und darauffolgendes Behandeln des Gemisches mit einem stark basischen Anionenaustauschharz wieder gewonnen. Die optimalen Reaktionsbedingungen zur Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose können leicht durch Anpassen der Reaktionszeit erhalten werden.
Andererseits kann man die erfindungsgemässe enzymatische Reaktion durch ein Kolonnenverfahren bewerkstelligen.
Das Kolonnenverfahren ermöglicht es, die Reaktion stufenweise auszuführen. So wird z. B. eine Kolonne mit einem unbeweglich gemachten Mikroorganismus beschickt, worauf man eine wässrige Lösung von D-Glucose mit einer geeigneten Fliessgeschwindigkeit durch die Kolonne fliessen lässt.
heraus fliesst eine D-Fructose enthaltende Lösung. D-Fructose wird aus der herausfliessenden Flüssigkeit durch das gleiche Verfahren, wie es oben für das Filtrat oder die oben schwimmende Lösung verwendet wurde, wieder gewonnen.
Die Umwandlungsgeschwindigkeit von D-Glucose in D-Fructose bei der enzymatischen Reaktion hängt hauptsächlich von der enzymatischen Stärke des unbeweglich gemachten Mikroorganismus, der Temperatur oder der Reaktionszeit ab.
Im Falle des Kolonnenverfahrens kann man die optimalen Reaktionsbedingungen zur Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose leicht durch Anpassen der Fliessgeschwindigkeit der Substratlösung erhalten.
In jedem Falle bewahren die erfindungsgemässen unbeweglich gemachten Mikroorganismen hohe enzymatische Aktivität während der Reaktion, besonders in Gegenwart von Magnesium- und Kobaltionen. Überdies kann man die erfindungsgemässen unbeweglich gemachten Mikroorganismen wegen der genügend hohen Beständigkeit ihrer enzymatischen Aktivität wiederholt für die enzymatische Reaktion verwenden.
Praktisch verwendbare und hier bevorzugte erfindungs gemässe Darstellungen werden in den folgenden Beispielen beschrieben. In dieser Beschreibung bedeuten die Ausdrücke Niederalkylen Alkylengruppen von 1 bis und mit 4 Kohlenstoffatomen. In den folgenden Beispielen wurde die Wirksamkeit eines Mikroorganismus oder eines unbeweglich gemachten Mikroorganismus, die 1 mg D-Fructose bei einer lstündigen Reaktion des Mikroorganismus oder des unbeweglich gemachten Mikroorganismus mit D-Glucose bei einem pH von 8,0 und bei einer Temperatur von 600 C ergibt, als eine Einheit genommen. Die Identifikation von D Fructose in einer Lösung wurde durch Papierchromatographie, bei der ein Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1:1) als Entwicklungslösungsmittel gebraucht wurde, ausgeführt. Der Betrag an D-Fructose in der Lösung wurde übereinstimmend mit dem Verfahren von M. C.
Cadmus al [Analytical Biochemistry, Band 26, Seiten 484 bis 487 (1968)7 geprüft, d. h. 0,4 ml D-Fructoselösung wird einem Gemisch aus 0,1 ml 200/obigem L-Cysteinhydrochloridhydrat und 5 ml 750/obiger Schwefelsäure zugefügt.
Das Gemisch wird gerührt und darauf 1 Stunde stehengelassen. Der Betrag an im Gemisch vorhandener D-Fructose wurde kolorimetrisch bestimmt.
Beispiel 1
1. Es wird ein wässriges Nährmedium (pH 7,0) mit folgenden Ingredientien hergestellt:
Pepton 1 Gew./Vol.- /o
Hefeextrakt 0,25 Gew./Vol.- /o
Fleischextrakt 0,5 Gew./Vol.- /o
D-Glucose 0,3 Gew./Vol.- /o
D-Xylose 0,7 Gew./Vol.- /o
Magnesiumsulfat (7 Hydrat) 0,05 Gew./Vol.- /o
Kobaltchlorid (6 Hydrat) 0,024 Gew./Vol.- /o
Natriumchlorid 0,5 Gew.Vol.- /o
Streptomyces griseus IFO 3430 wird in 200 ml Medium inokuliert. Das Medium wird während 72 Stunden bei einer Temperatur von 300 C und unter Schütteln gezüchtet und darauf zentrifugiert. Die so gesammelten Mikrobenzellen besitzen eine Glucose-Isomeraseaktivität von 30 Einheiten/g.
17 g Mikrobenzellen werden in 68 ml physiologischer Salzlösung suspendiert. 12,75 g Acryloylamid, 680 mg N,N' Methylen-bis-acryloylamid, 7,5 ml 5 0/0 ss-(Dimethylamino)propionitril und 7,5 ml 2,5 o/o Kaliumpersulfat werden der Suspension zugefügt. Dann wird die Suspension während 30 Minuten bei 370 C stehengelassen. Nach vollendeter Reaktion wird das so erhaltene starre Gel durch Sieben gekörnt, wobei man Körnchen von 3 mm Durchmesser erhält. Darauf werden die Körnchen mit 1700 ml physiologischer Salzlösung gewaschen. 170 ml unbeweglich gemachten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 werden so erhalten.
Glucose-Isomeraseaktivität: 25 Einheiten/ml.
2. Eine 4 cm X 13,5 cm Kolonne wird mit 170 ml des unbeweglich gemachten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 beschickt. Darauf lässt man 200 ml einer wässrigen 400/oigen D-Glucoselösung (pH 8,0), die in einer Konzentration von 5 mMol Magnesiumionen und in einer Konzentration von 1 mMol Kobaltionen enthält, bei einer Temperatur von 600 C und bei einer Fliessgeschwindigkeit von 60 ml pro Stunde durch die Kolonne laufen. 200 ml einer wässrigen 0,04 molaren Natriumtetraboratlösung werden zu 200 ml der ausfliessenden Lösung zugegeben. Darauf wird das Gemisch durch eine Kolonne mit Ionenaustauschharz [hergestellt durch Dow Chemical Co., unter dem Handelsnamen Dowex 1 X 2 (H+ type) ], die zuvor mit einer wässrigen 0,02 molaren Natriumtetraboratlösung gewaschen worden ist, durchgelassen.
Die herausfliessende Lösung wird darauf durch eine Kolonne mit einem Ionenaustauschharz [hergestellt durch Dow Chemical Co., unter dem Handelsnamen Dowex 50 X 8 (H+ type) ] durchgelassen. Die herausfliessende Lösung wird konzentriert, worauf man 13,9 g eines D-Fructosesirups erhält. Die Ausbeute an D-Fructose beträgt 90 O/o des Sirups.
Beispiel 2
1. Streptomyces aureus IFO 3175 wird in 200 ml eines wässrigen Nährmediums (pH 7,0), das die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 1 beschrieben besitzt, inokuliert. Das Medium wird während 72 Stunden bei 300 C und unter Schütteln gezüchtet, und dann zentrifugiert. Die so gesammelten Mikrobenzellen zeigen eine Glucose-Isomeraseaktivität von 15 Einheiten pro g. 12 g Mikrobenzellen werden in 48 ml einer physiologischen Salzlösung suspendiert und 9 g Acryloylamid, 480 mg N,N'-Methylen-bis-acryloylamid, 6 ml 5 0/o ss-(Dimethylamino)-propionitril und 6 ml 2,5 0/o Kaliumpersulfat der Suspension zugefügt. Darauf wird die Suspension während 30 Minuten bei einer Temperatur von 370 C stehengelassen.
Nach vollendeter Reaktion wird das so erhaltene starre Gel durch Passieren durch ein Sieb gekörnt, wobei man Körnchen von 3 mm Durchmesser erhält. Darauf werden die Körnchen mit 1200 ml physiologischer Salzlösung gewaschen, worauf man 120 ml eines unbeweglich gemachten Präparats von Streptomyces aureus IFO 3175 erhält. Glucose-Isomeraseaktivität: 10 Einheiten/ml.
2. 120 ml unbeweglich gemachtes Präparat von Streptomyces aureus IFO 3175 werden in 400 ml einer wässrigen 400/eigen D-Glucoselösung (pH 8,0), die eine Konzentration von 5 mMol Magnesiumionen und eine Konzentration von 1 mMol Kobaltionen enthält, suspendiert. Darauf wird die Suspension während einer gewissen Zeit bei 600 C gerührt.
Die in der Suspension enthaltene Menge an D-Fructose wird bestimmt, und die prozentuale Menge an D-Glucose, die sich in D-Fructose umgewandelt hat, daraus errechnet. Die Resultate sind in der Tabelle 1 enthalten.
Tabelle 1
Reaktionszeit Umwandlungsrate in D-Fructose (Std.) (O/o)
3 11
7 20
16 41
20 47
48 46
Nach 48stündigem Rühren wird die Suspension abfiltriert, um das unbeweglich gemachte Präparat zu entfernen.
Das Filtrat wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, worauf man 30,1 g D-Fructosesirup erhält. Der mengenmässige Anteil von D-Fructose im Sirup beträgt 87 /0.
Beispiel 3
1. Streptomyces olibaceus IFO 3409 wird in 100 ml eines wässrigen Nährmediums (pH 7,0), das die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 1 beschrieben besitzt, inokuliert.
Das Medium wird während 72 Stunden bei 300 C gezüchtet und darauf zentrifugiert. Die so gesammelten Mikrobenzellen zeigen eine Glucose-Isomeraseaktivität von 9 Einheiten pro g.
5 g Mikrobenzellen werden in 20 ml physiologischer Salzlösung suspendiert. 3,75 g Acryloylamid, 200 mg Bis(acryloylamidomethyl)äther, 2,5 ml 5 O/o ss-(Dimethylamino)propionitril und 2,5 ml 1 0/0 Ammoniumpersulfat werden der Suspension zugefügt. Darauf lässt man die Suspension während 30 Minuten bei 370 C stehen. Nach vollendeter Reaktion wird das starre Gel durch Passieren durch ein Sieb gekörnt, worauf man Körnchen von 3 mm Durchmesser erhält. Die Körnchen werden mit 500 ml physiologischer Salzlösung gewaschen, wobei man 50 ml unbeweglich gemachtes Präparat von Streptomyces olibaceus IFO 3409 erhält. Glucose-Isomeraseaktivität: 6 Einheiten/ml.
2. Eine 2 cm X 16 cm Kolonne wird mit 50 ml unbeweglich gemachtem Präparat von Streptomyces olibaceus IFO 3409 beschickt. Eine wässrige 400/obige D-Glucoselösung (pH 8,0), die eine Konzentration von 5 mMol Magnesiumionen und 1 mMol Kobaltionen enthält, wird mit einer Fliessgeschwindigkeit, wie sie in Tabelle 2 aufgezeichnet wird, durchgelassen. Die Menge an D-Fructose wird in der herausfliessenden Flüssigkeit bestimmt, woraus man dann den Prozentsatz an aus D-Glucose umgewandelter D-Fructose ausrechnet. Die Resultate werden in der Tabelle 2 aufgezeichnet.
Tabelle 2
Umwandlungsprozentsatz in D-Fructose
Reaktionszeit Fliessgeschwindigkeit (Std.) 12,5 ml/Std. 6,5 ml/Std.
5 28,2 40,2
24 25,2 39,4
48 26,2 40,0
72 26,3 40,3
96 25,8 39,9
112 26,2 40,0
Beispiel 4
1. Es wird ein wässriges Nährmedium (pH 7,0), das folgende Ingredientien enthält, hergestellt:
Hefeextrakt 0,3 Gew./Vol.- /0
D-Glucose 2 Gew./Vol.- /o
Ammoniumchlorid 0,3 Gew./Vol.- /o
Dikaliumphosphat 0,1 Gew./Vol.- /o
Magnesiumsulfat (7 Hydrat) 0,05 Gew./Vol.- /o
Mangansulfat (4 Hydrat) 0,005 Gew./Vol.- /o
Calciumcarbonat 0,2 Gew./Vol.- /o
Bacillus coagulans IFO 12714 wird in 1 Liter Medium inokuliert.
Das Medium wird während 24 Stunden bei 37 C gezüchtet, worauf man 1 Liter wässrige Lösung, die 3 Gew./ Vol.- /0 Pepton und 2 Gew./Vol.-o/o D-Xylose enthält, zugibt.
Das Medium wird nun während 6 Stunden bei 370 C stehengelassen und darauf zentrifugiert. Die so gesammelten Mikrobenzellen zeigen eine Glucose-Isomeraseaktivität von 7 Einheiten pro g. 12 g Mikrobenzellen werden nun in 68 ml physiologischer Salzlösung suspendiert, worauf man 9 g Acryloylamid, 480 mg N,N'-Methylen-bis-acryloylamid, 6 ml 5 0/o ss-(Dimethylamino)-propionitril und 6 ml 2,5 0/0 Kaliumpersulfat zugibt, und die Suspension während 30 Minuten bei 370 C stehenlässt. Nach beendeter Reaktion wird das so erhaltene steife Gel durch Passieren durch ein Sieb gekörnt, worauf man Körnchen von 3 mm Durchmesser erhält. Diese Körnchen wäscht man nun mit 1200 ml physiologischer Salzlösung, worauf man 120 ml unbeweglich gemachtes Präparat von Bacillus coagulans IFO 12714 erhält.
Glucose-Isomeraseaktivität: 5 Einheiten/ml.
2. 120 ml des unbeweglich gemachten Präparats von Bacillus coagulans IFO 12714 werden in 400 ml einer wässrigen 400/oigen D-Glucoselösung (pH 8,0), die eine Konzentration von 5 mMol Magnesiumionen und 1 mMol Kobaltionen enthält, suspendiert. Die Suspension wird während 96 Stunden bei 450 C gerührt und darauf abfiltriert, um das unbeweglich gemachte Präparat zu entfernen. Darauf behandelt man das Filtrat in derselben Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist, so erhält man 22,6 g eines D-Fructosesirups. Die D-Fructosemenge im Sirup beträgt 81 0/o.
Beispiel 5
1. 12 g Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO 3430 werden in 48 ml physiologischer Salzlösung suspendiert, worauf man 9 g Acryloylamid, 480 mg N,N'-Diacryloyläthylenharnstoff, 6 ml 5 0/0 ss-(Dimethylamino)- propionitril und 6 ml 2,5 0/0 Ammoniumpersulfat zugibt.
Darauf wird die Suspension während 30 Minuten bei 370 C stehengelassen, worauf man das so erhaltene starre Gel durch Passieren durch ein Sieb körnt, wobei man Körnchen von 3 mm Durchmesser erhält. Die Körnchen werden nun mit 1200 ml physiologischer Salzlösung gewaschen, worauf man 120 ml unbeweglich gemachtes Präparat von Streptomyces griseus IFO 3430 erhält. Glucose-Isomeraseaktivität: 15 Einheiten/ml.
2. 120 ml des unbeweglich gemachten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 werden in 400 ml einer wässrigen 400/obigen D-Glucoselösung (pH 8,0), die eine Konzentration von 5 mMol Magnesiumionen und 1 mMol Kobaltionen enthält, suspendiert. Die Suspension wird nun während 48 Stunden bei 600 C gerührt und filtriert, um das unbeweglich gemachte Präparat zu entfernen. Das Filtrat wird in der gleichen Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist, behandelt. So erhält man 27,8 g eines D-Fructosesirups.
Die D-Fructosemenge im Sirup beträgt 90 /o.
Beispiel 6
1. 24 g Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO 3430 werden in 240 ml physiologischer Salzlösung suspendiert, worauf man 600 mg Bis(acryloylamidomethyl)äther, 18 ml 0,112 o/o N,N,N',N'-Tetramethyl-äthylendiamin und 2 ml 2,5 o/o Ammoniumpersulfat zugibt. Darauf wird die Suspension während 60 Minuten bei 370 C stehengelassen.
Das so erhaltene starre Gel wird durch Passieren durch ein Sieb gekörnt, worauf man Körnchen von 3 mm Durchmesser erhält. Diese Körnchen werden nun mit 4200 ml physiologischer Salzlösung gewaschen, worauf man 420 ml unbeweglich gemachtes Präparat von Streptomyces griseus IFO 3430 erhält. Glucose-Isomeraseaktivität: 4 Einheiten/ml.
2. 420 ml des unbeweglich gemachten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 werden in 400 ml einer wässrigen 400/obigen D-Glucoselösung (pH 8,0), die eine Konzentration von 5 mMol Magnesiumionen und 1 mMol Kobaltionen enthält, suspendiert. Die Suspension wird nun während 72 Stunden bei 600 C gerührt und dann filtriert, um das unbeweglich gemachte Präparat zu entfernen. Das Filtrat wird in der gleichen Weise behandelt, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist. So erhält man 27,8 g eines D-Fructosesirups. Die D-Fructosemenge im Surup beträgt 90 0/o.
Beispiel 7
1. 24 g Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO 3430 werden in 240 ml physiologischer Salzlösung suspendiert, worauf man 600 mg N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff, 18 ml 0,112 o/o N,N,N',N'-Tetramethyl-äthylendi- amin und 2 ml 2,5 o/o Kaliumpersulfat zugibt. Darauf wird die Suspension während 30 Minuten bei 300 C stehengelassen, worauf man das so erhaltene starre Gel durch Passieren durch ein Sieb körnt, um Körnchen von 3 mm Durchmesser zu erhalten. Die Körnchen werden nun mit 4200 ml physiologischer Salzlösung gewaschen, worauf man 420 ml unbeweglich gemachtes Präparat von Streptomyces griseus IFO 3430 erhält. Glucose-Isomeraseaktivität: 3 Einheiten/ml.
2. 420 ml unbeweglich gemachtes Präparat von Streptomyces griseus IFO 3430 werden in 400 ml einer wässrigen 400/oigen D-Glucoselösung (pH 8,0), die eine Konzentration von 5 mMol Magnesiumionen und 1 mMol Kobaltionen enthält, suspendiert. Die Suspension wird nun während 72 Stunden bei 600 C gerührt und dann filtriert, um das unbeweglich gemachte Präparat zu entfernen. Das Filtrat wird nun in der gleichen Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist, behandelt. 27,8 g eines D-Fructosesirups werden erhalten. Die Menge an D-Fructose im Sirup beträgt 90 /0.
Beispiel 8
1. 24 g Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO 3430 werden in 240 ml einer physiologischen Salzlösung suspendiert, worauf man 600 mg N,N'-Methylen-bis-acryloylamid, 18 ml 0,112 o/o N,N,N',N'-Tetramethyl-äthylendiamin und 2 ml 2,5 o/o Kaliumpersulfat zugibt. Die Suspension wird nun während 60 Minuten bei 370 C stehengelassen, worauf man das so erhaltene starre Gel durch Passieren durch ein Sieb körnt, um Körnchen von 3 mm Durchmesser zu erhalten. Darauf wäscht man die Körnchen mit 4200 ml einer physiologischen Salzlösung, worauf man 420 ml eines unbeweglich gemachten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 erhält. Glucose-Isomeraseaktivität: 5 Einheiten/ml.
2. 420 ml des unbeweglich gemachten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 werden in 400 ml einer wässrigen 400/obigen D-Glucoselösung (pH 8,0), die eine Konzentration von 5 mMol Magnesiumionen und 1 mMol Kobaltionen enthält, suspendiert. Die Suspension wird nun während 72 Stunden bei 600 C gerührt und darauf filtriert, um das unbeweglich gemachte Präparat zu entfernen. Das Filtrat wird nun in der gleichen Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist, behandelt. So erhält man 27,8 g eines D Fructosesirups. Die Menge an D-Fructose in dem Sirpu beträgt 90 /0.
Beispiel 9
60 ml des unbeweglich gemachten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430, das in der gleichen Weise wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist, hergestellt worden ist, werden in 200 ml einer wässrigen 400/oigen D-Glucoselösung (pH 8,0), die eine Konzentration von 5 mMol Magnesiumionen und 1 mMol Kobaltionen enthält, oder in 200 ml einer wässrigen 400/eigen D-Glucoselösung (pH 8,0) suspendiert. Die Suspension wird während einer gewissen Zeit bei 600 C gerührt, worauf man die D-Fructosemenge in der Suspension bestimmt und daraus die prozentuale Umwandlungsrate von D-Glucose in D-Fructose berechnet. Die Resultate kann man aus der Tabelle 3 ablesen.
Tabelle 3
Reaktionszeit Umwandlungsrate in D-Fructose (0/o) (Std.) Mit Zugabe von Ohne
Metallionen Zugabe
3 22 4
5 31 6
16 46 14
24 45 22
48 47 31
72 46 39