CH615221A5 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur 55 Weise erhält man das reine Antibiotikum TA in Form eines

Herstellung eines Antibiotikums. Dieses ist erfindungsgemäss weissen, festen Stoffes, der in Chloroform und Methanol lösbar dadurch gekennzeichnet, dass ein geeigneter Stamm Mikroor- ist. Das Antibiotikum TA ist in Wasser ebenfalls so weit lösbar,

ganismen der Art Myxococcus xanthus unter aeroben Bedin- dass antibiotisch wirksame Lösungen hergestellt werden kön-

gungen gezüchtet wird, bis er eine Menge Antibiotikum nen. Das reine Antibiotikum TA ist sowohl in saurer als auch in erzeugt hat, und dass dieses anschliessend gereinigt wird. 60 basischer Umgebung stabil und ebenfalls relativ hitzebeständig.

Es wurde eine Anzahl von Stämmen der Art Myxococcus Es kann zudem ohne weiteres mit sehr grossem Reinheitsgrad xanthus untersucht, die, abgesehen von einigen degenerierten hergestellt werden. Beispielsweise wurde eine Reinigung mit

Mutanten, alle zur Gewinnung eines Antibiotikums, das im fol- einem Reinigungsfaktor von etwa 1000 vorgenommen.

genden als Antibiotikum TA bezeichnet wird, verwendet wer- Im übrigen wurde das Antibiotikum TA durch einige seiner den konnten. Ein Stamm, der im folgenden als Myxococcus 65 Eigenschaften, wie etwa sein Infrarot- und Ultraviolett-Spek-

xanthus TA bezeichnet wird, wurde mit dem Standard-Verfah- trum, durch sein Massenspektrum und sein chromatographi-

ren der Peterson-Methode (Microbiology, 3B, 1969, Academic sches Verhalten in sechs Lösungssystemen charakterisiert.

Press, N. Y., USA, p. 85-210) aus der Rinde eines Olivenbaums Als nächstes soll nun die Zucht des Myxococcus xanthus

TA näher beschrieben werden. Die Mikroorganismen Myxococcus xanthus TA wurden im Laboratorium mit einem Standard-Verfahren von der Rinde eines Olivenbaumes isoliert. Die Lagerung der Mikroorganismen erfolgte dann entweder als Fruchtkörper auf toten E.Coli-Agarplatten oder auf 0,1% CT-Agar, das 0,1% Casiton (Difco) und 0,1% Magnesiumsulfat enthält und mit 1,5% Agar verfestigt ist. Falls nicht anderes angegeben ist, wurde der verwendete Myxococcus xanthus als flüssige Kultur bei 32 °C durch eine periodische Übertragung in 1% CT-Medium mit 1% Casiton (Difco) und 0,1% Magnesiumsulfat erhalten. Die Belüftung erfolgte durch Schütteln mit einem Rotationsschüttler mit einer Drehzahl von 300 Umdrehungen pro Minute.

Bei den Laborversuchen wurde das Antibiotikum beispielsweise durch das folgende Verfahren gewonnen: Ein 250 ml-Kol-ben mit 50 ml 0,5% CT-Medium wurde mit einer 1 ml-Teilmenge einer am Abend zuvor zubereiteten Kultur von Myxococcus xanthus TA geimpft. Die Kolben werden dann bei einer Temperatur von 32 °C und während einer starken Rotations-Schüttel-bewegung (300 U/min.) bebrütet. Der Hauptanteil des Antibiotikums wurde in 3 bis 4 Tagen produziert. Da die Zellen einen an der Wand des Kolbens haftenden Ring bildeten, konnte die Flüssigkeit in einfachster Weise durch Ausgiessen abgetrennt werden. Wenn dies nötig war, wurde das Entwicklungs-Medium durch eine 15 Minuten dauernde, bei einer Temperatur von 4 °C stattfindende Zentrifugierung mit einer Zentrifugalbeschleunigung von 105 m/s2 geklärt. Anschliessend wurde der antibiotische Wirkstoff von der oben aufschwimmenden Phase mit 0,8 Volumenteilen Chloroform extrahiert. Die Chloroformphase wurde ein Mal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann im Vakuum oder in einem Strom von filtriertem Stickstoff getrocknet und konzentriert.

Für die nachstehend beschriebene Papierscheiben-Testmethode wurde direkt die Chloroformlösung des Antibiotikums verwendet. Für bestimmte Versuche wurde das Antibiotikum in einen 0,1 M Tri-(Hydroxymethyl>Aniinomethanpuffer mit einem pH von 7,2 übertragen, wobei der Puffer direkt einer hochkonzentrierten Chloroformlösung des Antibiotikums beigefügt wurde. Das verbleibende Chloroform wurde dann dadurch entfernt, dass die Flüssigkeit mit Stickstoff durchblasen wurde.

Zur Herstellung von grösseren Mengen des Antibiotikums wurde ein 20-1-Säureballon mit 41 Entwicklungs-Medium verwendet und bei einer Temperatur von 32 °C mit einer Hin- und Herbewegung geschüttelt.

Die Prüfung der antibiotischen Wirksamkeit erfolgte nach dem Papierscheiben-Prüfverfahren von Loo et al. (J. Bacteriol., 50, p. 701-709), wobei als Testorganismen E.Coli-Bakterien verwendet wurden. Verschiedene Mengen einer Chloroformlösung des direkt extrahierten oder zusätzlich gereinigten Antibiotikums wurden auf eine Scheibe mit 5,5 mm Durchmesser des Whatman Nr. 3 mm Filterpapiers aufgebracht und während mindestens einer Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Dann wurden die Scheiben auf eine Nährstoff-Agar-Platte aufgesetzt, die vorgängig mit einer milden, Agar enthaltenden Nährstoffbrühe und 10® E.Coli-Bakterien belegt worden war. Nach einem bei einer Temperatur von 37 °C stattfindenden, 18 Stunden dauernden Test wurde der Durchmesser der Hemmungszone gemessen. Aus dem letzteren wurde dann mit Hilfe einer Standard-Kurve die antibiotische Aktivität in Funktion der auf die Scheibe aufgebrachten Antibiotikumsmenge bestimmt. Eine Einheit der antibiotischen Aktivität entspricht einem Durchmesser der Hemmungszone von ungefähr 3 mm.

Des weitern wurde ein antibakterielles Wirkungs-Spektrum des Antibiotikums TA bestimmt. Die Bestimmung erfolgte in der vorstehend beschriebenen Weise mit dem Papierscheiben-Prüfverfahren, wobei jedoch anstelle der E.Coli-Bakterien 106 andere Testorganismen auf die Agarplatte aufgebracht wur-

3 615 221

den.

Ferner wurden verschiedene chromatographische Analysen und Trennverfahren durchgeführt. Die Abtrennung wurde beispielsweise papierchromatographisch unter Verwendung 5 eines Whatman Nr. 1-Papiers mit absteigendem Lösungsmittel durchgeführt. Als Lösungssystem wurde 1-ButanoI-Essigsäure-Wasser mit einem Volumenmischungsverhältnis von 4:1:1 verwendet. Des weitern wurde eine Analyse unter Verwendung der Dünnschicht-Chromatographie mit Aluminiumoxid I0 und DC-Karten AL F (Riedel-De Haen) durchgeführt. Preparative Dünnschichtchromatographie wurde auf Aluminiumoxidplatten (P 254, Typ T; Merck) mit 1,5 mm Dicke und einer Oberfläche von 200x200 mm durchgeführt. Die Platten wurden mit Methanol gewaschen, über Nacht bei Raumtemperatur i5 getrocknet, bei einer Temperatur von 120 °C während 15 Minuten aktiviert, gekühlt und sofort verwendet. Bei der 2-dimensio-nalen Dünnschichtchromatographie liess man die Platten nach der Entwicklung mit dem ersten Lösungsmittel über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Säulenchromatographie wurde mit 2o von der Firma Fluka AG in Buchs SG bezogenen Kieselsäure mit einer der Maschenweite 100 entsprechenden Korngrösse durchgeführt. Die Kieselsäure wurde vor dem Zusatz der Antibiotikum-Probe während einer Stunde bei einer Temperatur von 120 °C aktiviert, 15 Minuten abgekühlt, mit Chloroform 25 verrührt, zu einem Brei gepresst und dann mit zwei Säulenvolumen Chloroform gewaschen.

Mit dem Antibiotikum wurden verschiedene weitere Analysen durchgeführt. Zur Bestimmung des Trocken-Gewichtes des Antibiotikums wurde das Chloroform verdampft. Dazu wurde 30 zuerst filtrierter Stickstoff durchgeblasen und die Proben dann in einen Raumtemperatur aufweisenden Vakuum-Trockenapparat gebracht und mit der Tarier-Methode gewogen. Des weitern wurde das ultraviolett-Spektrum des gereinigten Antibiotikums aufgenommen. Dazu wurde ein Gilford Spektrophotome-35 ter Modell 240 mit einem Lichtweg von 1 cm und als Lösungsmittel Methanol der optischen Qualität (Merck) verwendet. Ferner wurde mit einem Perkin-Elmer-Spektrophotometer (Modell 337) das Infrarot-Spektrum bestimmt. Des weitern wurde mit einem Hitachi-Perkin-Elmer-Spektrometer (Modell 4o BNV-6E) das Massenspektrum bestimmt.

Die Versuche erwiesen, dass der zeitliche Verlauf und die Ausbeute der Antibiotikum-Produktion mit den Mikroorganismen Myxococcus xanthus TA auf einem Kultur-Medium, das 0,2%, 0,5%, 0,75% oder 1% Casiton enthält, im wesentlichen 45 gleich bleibt. Dagegen wird die Antibiotikum-Produktion bei Verwendung von Kultur-Medien mit mehr als 1% Casiton deutlich reduziert.

Der während des Wachstums beobachtete Anstieg des pH-Wertes scheint nicht mit der Antibiotikum-Produktion verso knüpft zu sein, da sich auch bei Verwendung von gepufferten Medien ähnliche Resultate ergaben (pH-Werte am Ende 7,4 bis 7,6).

Zur Festlegung der optimalen Produktionsbedingungen wurden verschiedene Parameter variiert. Beispielsweise wurde 55 die Temperatur im Bereich von 23 bis 37 °C, der pH-Wert im Bereich von 6,8 bis 8,5 und die Drehzahl des Rotations-Schüttel-iapparates von 100 bis 500 U/min. verändert. Des weitern wurde der MgS04-Anteil des Mediums von 0,01 bis 2 M variiert und der Einfluss einer K2HP04-Beigabe bis zu einem Gehalt 60 von 0,1 M und eine Hefe-Extrakt-Zugabe von 0,05% untersucht. Die Ergebnisse erwiesen jedoch, dass die Antibiotikum-Produktion durch keine der vorgenannten Massnahmen wesentlich erhöht werden konnte.

Im folgenden soll nun noch die Reinigung und Aufbereitung 65 des Antibiotikums TA näher beschrieben werden. Vor der Durchführung einer Reinigung wurden die Stabilität des Antibiotikums untersucht. Einige der erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt.

615221

4

Tabelle 1

Stabilität des mit den Mikroorganismen Myxococcus xanthus TA gewonnenen Antibiotikums

Test-Behandlung a)

Verbleibende Aktivität in % b)

pH 1,2; 25 °C; 30 min.

95-100

pH 3,2; 25 °C;30min.

95-100

pH 9,8; 25 °C; 30 min.

95-100

pH 12,5; 25 °C;30min.

80- 85

pH 7,4; 100 °C; 30 min.

75- 80

a) Die Einstellung des pH-Wertes erfolgte mit HCl (pH 1,2), Essigsäure (pH 3,2), NH4OH (pH 9,8), NaOH (12,4) und Tri-(hydroxymethyl)-Aminomethanpuffer (pH 7,4).

b) Die Aktivität wurde mit dem Papierscheiben-Prüfverfahren bestimmt, wie es in «Materials and Methods» beschrieben ist.

Die Versuche ergaben, dass das aus den Mikroorganismen Myxococcus xanthus TA gewonnene Antibiotikum eine für die Durchführung der üblichen Reinigungsverfahren ausreichende Säure-, Basen- und Hitzebeständigkeit aufweist.

Die Extraktion und Reinigung des Antibiotikums erfolgte dann nach dem folgenden Schema:

Zucht der Kultur während 3 bis 4 Tagen auf 0,5% CT-Medium

Zentrifugierung oder Abgiessen der Flüssigkeit; Entfernung der Zellen

Obenaufschwimmende Flüssigkeit

I

Extraktion mit 0,8 Vol. CHCh; Entfernen der wässerigen Phase i

5 CHCh-Phase (Fraktion I)

;

Anreicherung durch Absorption mit Kieselsäure und Eluierung mit 5% Methanol in CHCb; verdampfen, trocknen und

I

10 lösen in CHCI3 (Fraktion II)

I

Säulenchromatographie mit Kieselsäure; Entwicklung mit 5% Methanol in CHCI3

I

15 Aktiven Anteil trocknen und lösen in CHCb (Fraktion III)

I

Auftragen auf präparativen Dünnschichtchromatographie-Trä-ger; entwickeln mit 5% Methanol in CHCb

I

20 Aktive Zone eludieren, trocknen und lösen in CHCb (Fraktion IV)

I

Fleckenbildung für 2-dimensionale Dünnschichtchromatographie;

251.10% Methanol in CHCb 2. Ethylacetat, Isopropanol, H2O

I

Aktive Flecken eludieren; trocknen und lösen in CHCb (Fraktion V)

30 Die sich bei einem gemäss vorstehendem Schema durchgeführten Reinigungsverfahren für die verschiedenen Fraktionen ergebenden Mengenverhältnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt.

Fraktion

Tabelle 2

Antibiotikum-Mengen der aus 341 Kultur-Flüssigkeit erhaltenen Reinigungsfraktionen

Volumen mg

Trocken-Gewicht mg/ml

Antibiotische Aktivität

Spezifische

Ausbeute

Total Gew.

Total

Aktivität

mg

Einheiten/ml

Einheiten

Einheiten/mg

%

1819

0,5

13 600

7,0

100

1630

120

10200

6,2

75

337

2000

10000

30,0

74

3,3

317

8200

2500

60

0,39

217

3 250

8300

24

I. CHCh-Phase 27 150

II. Konzentrat 85 IILKieselsäuren-Chromato- 5,0

graphie

IV.Dünnschicht-Chromato- 26,0 graphie

V. 2-dim-Chromatographie 15,0

0,067 19,1 67,5

Durch Abtrennung der obenauf schwimmenden Flüssigkeit 1. Das angereicherte Antibiotikum wird als Strichkultur auf wird das Antibiotikum von einer wässerigen in eine Chloro- eine Platte aufgetragen und mit 5% Methanol-Chloroform ent-form-Phase übertragen (Fraktion I). Kein Antibiotikum konnte wickelt, wobei der RxRrWert des aktiven Materials 0,17 betrug, aus den Zellen extrahiert werden. Kieselsäure wurde sowohl 55 2. Aus der Fraktion IV wird ein Einzel-Flecken für die zweifür die 40fache Anreicherung des Antibiotikums (Fraktion I) als dimensionale Chromatographie gebildet. Für die Durchfüh-auch für die 4bis 5fache Reinigung der Aktivität (Fraktion III) rung des Trennvorganges in der ersten Richtung wird Metha-verwendet. Beim Anreicherungs-Schritt waren 300 g Kiesel- nol-Chloroform mit einem Volumenmischverhältnis von 10 zu säure erforderlich, um das Antibiotikum aus 271 Chloroform zu 90 verwendet. Die Durchführung der Trennung in der zweiten absorbieren. Die Eluierung der Aktivität aus der Kieselsäure 60 Richtung erfolgt mit im Verhältnis von 65 zu 23,5 zu 11,5 Volu-erfolgte dann schubweise mit etwa 31 von 5% Methanol-Chlo- menteilen gemischten Ethylacetat, Isopropanol und Wasser, roform. Bei der nach der Entwicklung in der zweiten Richtung durchge-Das Eluierungs-Profil des Kieselsäure-Chromatographie- führten Untersuchung der Dünnschichtplatten mit Ultraviolett-Schrittes ist in der Fig. 1 dargestellt. Das Antibiotikum wurde Licht wurde ein isolierter Ultraviolett-Absorptionsflecken festunmittelbar nach einem braunen Verunreinigungsband und vor 65 gestellt, der genau der Lage der antibiotischen Aktivität ent-einem gelben Pigment aus der Säule eludiert. sprach. Die RrWerte des Antibiotikums in den zwei Lösungssy-

Präparative Dünnschicht-Chromatographie wurde mit den stemen betrugen 0,62 beziehungsweise 0,65.

nachstehenden, aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt: Durch das ganze Reinigungsverfahren konnte eine mehr als

5 615 221

lOOOfache Erhöhung der Reinheit erzielt werden, wobei die Im folgenden sollen nun noch verschiedene Eigenschaften

Ausbeute des ganzen Verfahrens etwa 24% betrug (vgl. Tabelle des Antibiotikums TA beschrieben werden. Bei der Aluminium-

2). Das Endprodukt (Fraktion V) wies eine spezifische Aktivität oxyd-Dünnschicht-Chromatographie, die mit sechs verschie-

von 8,3 Einheiten pro Mikrogramm auf. denen Lösungs-Systemen durchgeführt wurde, erschien das

Das Reinigungsverfahren wurde ebenfalls mit einer Menge 5 Antibiotikum TA bei der Ultraviolett-Untersuchung als wan-

von 701 Kulturflüssigkeit mit einer Anfangs-Aktivität von 1 Ein- dernder Einzel-Absorptions-Flecken. Die Dünnschicht-Chro-

heit/ml durchgeführt. Dabei konnte bei einer totalen Ausbeute matographie wurde gemäss der Beschreibung in «Materials von 45% 3,2 mg gereinigtes Antibiotikum TA gewonnen wer- and Methods» durchgeführt. Die Parameter sind in der Tabelle den. Dieses gereinigte Antibiotikum wurde dann für weitere 3 zusammengestellt.

chemische und biologische Untersuchungen verwendet. |0

Tabelle 3

Chromatographie des aus dem Mikroorganismus Myxococcus xanthus TA gewonnenen Antibiotikums auf Aluminiumoxyd.

Lösungs-System Anteile in VoIumen-% Rf

Methanol; Chloroform 5:95 0,17

Methanol; Chloroform 10:90 0,62

Methanol; Chloroform 15:85 0,83

Essigsäure; Methanol; Chloroform 1:10:89 0,70

Ammoniak; Methanol; Chloroform 1:10:89 0,66

Essigsäure; Isopropanol; Wasser 65 :23,5 :11,5 0,65

In jedem Fall entsprach der Ultraviolett-Absorptions-Flecken genau der Lage der antibioti sehen 30

Aktivität. Der Aktivitäts-Flecken reagierte positiv auf Jod und schnelles Blau B und negativ auf Bromokresol-Grün, Dichlorfluoreszein, Dimethylaminobenzoldehyd, Ninhydrin und Dragendorff-Reagenzien. Die Tatsache, dass die Mobilität des Antibiotikums TA in neutralen, sauren und basischen 35

Lösungs-Systemen ähnlich ist, deutet darauf hin, dass das Molekül keine leicht ionisierbare Gruppe enthält.

Das Ultraviolett-Absorptions-Spektrum des in Methanol gelösten Antibiotikums TA ist in der Fig. 2 dargestellt. Es weist ein einziges Absorptions-Maximum bei einer Wellenlänge von 40 242 nm auf, dem ein Extinktionskoeffizient von E = 108%/cm entspricht. Unter der Annahme eines auf der massenspektro-metrischen Untersuchung basierenden Molekulargewichtes von etwa 650 ergibt sich für den molaren Extinktionskoeffizienten ein Wert in der Grösse von 7000. 45

Im Bereich des sichtbaren Lichtes konnte sogar bei der Untersuchung einer Lösung mit einem Gehalt von 0,1% gereinigtem Antibiotikum keine Absorption festgestellt werden.

Das Infrarot-Durchlass-Spektrum des Antibiotikums TA ist in der Fig. 3 dargestellt.

Die Massenspektrometrische Untersuchung deutet auf ein Molekül-Ion mit einem Molekulargewicht von 650 hin. Die für aromatische Verbindungen charakteristischen Ionen mit Mas-sen-zu-Ladungs-Verhältnissen von 39,50,51,52 und 65 wurden nicht festgestellt.

Anschliessend wird nun noch die antibakteriologische Wirksamkeit des Antibiotikums TA beschrieben. Das rohe Antibiotikum, das heisst die Fraktion I, war sowohl gegen Gram-positive (Staphylococcus albus und Bacillus subtilis) als auch gegen Gram-negative (E. coli und Shigella dysenteria) Bakterien wirksam. Da beim Reinigungsverfahren als Testorganismen nur E.Coli-Bakterien verwendet wurden, war es von Interesse, zu prüfen, ob die Wirksamkeit gegen andere Bakterien beim gereinigten Material erhalten bleibt oder nicht. Die Untersuchung zeigte, dass das rohe und das gereinigte Antibiotikum innerhalb der experimentellen Fehlergrenzen das gleiche Aktivitäts-Spektrum aufweisen. Einige Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 4

Antibakterielle Wirksamkeit des aus Myxococcus xanthus TA gewonnenen Antibiotikums TA.

Testorganismus

Chloroform-Extrakt

Gereinigtes

Antibiotikum

Fraktion I

Fraktion V

2 Einheiten

10 Einheiten

2 Einheiten

10 Einheiten

Staphylococcus albus

2,5

5,5

2

3

Bacillus subtilis

168

1

3

0

3

E. Coli B.

6

12

6

12,5

Shigella dysenteriae

2,5

10,5

1

10,5

615 221

6

Die angegebenen Werte bezeichnen den Durchmesser des Hemmungskreises in mm.

Die antibiotische Wirksamkeit gegen E.Coli-Bakterien wurde entweder mit einem Dilutions-Reihen-Prüfverfahren oder nach der Papierscheiben-Methode von Loo et al. (J. Bac., 50,701) durchgeführt. Beim Dilutions-Reihen-Prüfverfahren wurde eine über Nacht in Nährbrühe angesetzte Kultur von E.Coli-Bakterien im Verhältnis von 1:100 mit frischer vorgewärmter Nährbrühe verdünnt und anschliessend unter Luftzufuhr während einer Stunde bei 37 °C bebrütet. Bei diesem Verfahren ergab sich in der exponentiellen Wachstumsphase ein Zellengehalt von etwa 108 Zellen pro Milliliter. Der exponen-tiell wachsenden Kultur wurde dann bei fortwährender Bebrütung in verschiedenen Konzentrationen in 0,02 M Tripuffer mit einem pH von 7,2 gelöstes Antibiotikum zugegeben. Nachdem die Kultur zwei Stunden dem Antibiotikum ausgesetzt worden war, wurde eine geeignete Dilution gebildet und auf Nährstoff-Agar verteilt und dadurch die Anzahl entwicklungsfähiger Zellen bestimmt. Eine Einheit des Antibiotikums wird als diejenige Antibiotikum-Menge definiert, die bei diesem Standard-Prüfverfahren eine hundertfache Reduktion der in einem Milliliter enthaltenen, entwicklungsfähigen Zellen bewirkt.

Bei der Papierscheiben-Methode wurden verschiedene

Mengen einer Chloroformlösung des Antibiotikums auf einen Durchmesser von 5,5 mm aufweisende Scheiben des Whatman Nr. 1,3 mm Filterpapiers aufgebracht und während mindestens einer Stunde bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die 5 Scheiben wurden dann auf Nährstoff-Agar-Platten angesetzt, die vorgängig mit müdem Agar enthaltender Nährstoffbrühe und 108 E.Coli-Bakterien belegt worden waren. Nach einem bei einer Temperatur von 37 °C erfolgenden, 18 Stunden dauernden Test wurde der Durchmesser der Hemmungszone gemes-io sen. Die Anzahl der antibiotischen Aktivitäts-Einheiten wurde dann mit Hilfe einer Standard-Hemmungs-Kurve bestimmt. Eine Einheit des Antibiotikums entspricht, abzüglich des 5,5 mm Scheibendurchmessers, einem Durchmesser der Hemmungszone von etwa 3 mm.

15 Ein antibafâerielles Wirkungs-Spektrum wurde gemäss der vorstehend beschriebenen Papierscheiben-Methode bestimmt, Wobei jedoch anstelle der E.Coli-Bakterien verschiedene andere Mikroorganismen verwendet wurden. Bei jedem Test wurde der milde Agar mit 10® Testorganismen besät. Penicillin-20 G-Scheiben mit einer Aktivität von 10 Einheiten wurden als Vergleichselemente verwendet.

Die Ergebnisse der Tests sind in der Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5

Antibakterielle Wirksamkeit des Antibiotikums TA in Millimetern des Hemmungszo-nen-Durchmessers

Test-Organismus Antibiotikum TA a) Penicillin

2 Einheiten 10 100 10 Einheiten

Einheiten Einheiten

Gram-negative Bakterien:

E. coli B

6,6 b)

12,13 b)

-

12

E. coli K12

4

7,4 b)

15

2

E. coli CW 3747

3

5

10

5

E. coli (Arzneimittel

resistent)

0

2

9

0

E. coli 428 (LAC)

1

2

-

0

Klebsiella pneumoniae

9,8 b)

17,15 b)

-

0

Proteus morgani

0

0

7,5

8

Pseudomonas fluorescens

0

0

0

-

Salmonella typhimurium

0

0

2,5

21

Serratia marcescens

0

0

-

0

Shigella dysenteriae

3,1b)

11,11b)

-

12

Shigella flexneri 2a

3

8

16

3

Vibrie cholerae

0

0

0

14

Gram-positive Bakterien:

Bacillus pumilus

3

5

-

26

Bacillus subtilis 168

1,0 b)

3,3 b)

-

26

Bacillus subtilis W 23

2,5 b)

4,8 b)

8

26

Corynebacteria diphteriae

0,5 b)

7,11b)

-

34

Corynebacteria xerosis

0

2,1 b)

9

22

Staphylococcus albus

0

2,3 b)

5

24

Staphylococcus aureus

0,0 b)

3,2 b)

8

42

Streptococcus faecalis

0

1

3

44

a) Falls nichts anderes angegeben ist, wurde das mit Chloroform extrahierte und aus der Kieselsäure eludierte Antibiotikum verwendet.

b) Gereinigtes Antibiotikum; 10 Einheiten = 1,2.

Das gereinigte und das rohe, mit Chloroform extrahierte Antibiotikum weisen das gleiche Wirkungs-Spektrum auf. Das Antibiotikum ist sowohl gegen Gram-positive als auch gegen Gram-negative Bakterien wirksam. Mit der Ausnahme von Pseudomonas fluorescens, Vibrie cholerae und Serratia mar-cescens waren alle getesteten Bakterien empfindlich auf die Einwirkung des Antibiotikums. Von besonderem Interesse ist die Feststellung, dass E.Coli-Bakterien, die die Arzneimittel-Resistenz-Markierung tragen, ebenfalls auf das Antibiotikum 60 TA reagierten. E.Coli-Bakterien wiesen sowohl auf Nährstoff-Agar als auch im Minimal-Medium und auf Blut-Agar-Platten die gleiche Empfindlichkeit gegen das Antibiotikum TA auf. Die zwei Pilze Sacharomyces cerevisiae und Schizophyllum commune wurden durch 10 Einheiten des Antibiotikums TA 65 nicht beeinträchtigt.

Das erfindungsgemässe Antibiotikum hat also eine breite antibakterielle Wirksamkeit und lässt sich in verschiedener Form als pharmazeutisches Präparat verwenden.

G

1 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

1. 615221 2

   PATENTANSPRÜCHE isoliert. Eine Kultur dieses Mikroorganismus wurde der Ameri-

   1. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums, dadurch can Type Culture Collection in Rockeville, Maryland, USA, gekennzeichnet, dass ein geeigneter Stamm Mikroorganismen zugestellt, ist dort am 10. Juni 1974 eingegangen und ist dort auf der Art Myxococcus xanthus unter aeroben Bedingungen Verlangen unter der Nummer 31046 erhältlich.

   gezüchtet wird, bis er eine Menge Antibiotikum erzeugt hat, 5 Ein anderer untersuchter, an sich bereits bekannter Stamm,

   und dass dieses anschliessend gereinigt wird. der bei der American Type Culture Collection unter der Num-
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, mer 25232 hinterlegt ist, wird im folgenden als Myxococcus dass der Mikroorganismus Myxococcus xanthus TA ATCC Nr. xanthus FB bezeichnet. Myxococcus xanthus TA und TB kön-31046 gezüchtet wird. nen etwa auf einem Kultur-Medium wachsen, das eine
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, io Mischung von Aminosäuren enthält. Als Kultur-Medium kön-dass der Mikroorganismus Myxococcus xanthus FB ATCC Nr. nen jedoch auch gewisse Proteine, wie etwa Kasein verwendet 25232 gezüchtet wird. werden. Als besonders vorteilhaftes und preisgünstiges Kultur-
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Medium hat sich ein enzymatischer Aufschluss von Kasein dass die Mikroorganismen unter Luftzufuhr in einem flüssigen erwiesen, der unter dem Namen Casiton bekannt ist. Dabei han-Nährmittel gezüchtet werden, bis die Kultur eine späte Phase is delt es sich um einen pankreatischen Aufschluss von Kasein, des exponentiellen Wachstums oder einen stationären Zustand Andere pankreatische Aufschlüsse von Kasein, wie etwa NZ-erreicht. Kase sind ebenfalls sehr gut geeignet.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Für viele Versuche wurde ein im folgenden als CT 1 %

   dass die Mikroorganismen in einem Kultur-Medium gezüchtet bezeichnetes Kultur-Medium mit folgender Zusammensetzung werden, das bis zu 1 % eines enzymatischen Aufschlusses von 20 verwendet: Casiton-1 % (Difco), Magnesiumsulfat-0,1 Gew.-%.

   Kasein und Magnesiumsulfat enthält. Die Zucht wurde im allgemeinen bei einer Temperatur von

   32 °C unter Luftzufuhr durchgeführt

   Wie schon erwähnt, wurde das Antibiotikum TA aus Kultu-ren von verschiedenen Stämmen Myxococcus xanthus gewon-25 nen. Im folgenden soll nun jedoch zur Erläuterung der Erfindung die Gewinnung des Antibiotikums aus Myxococcus xant-

   Die Myxokokken sind gram-negative, nicht-photosyntheti- hus TA und Myxococcus xanthus FB näher beschrieben Wersche, procaryotische Mikroorganismen, die sich durch Gleiten den.

   auf festen Oberflächen frei fortbewegen können. Unter Das erfindungsgemässe Verfahren und die Eigenschaften bestimmten Ernährungsbedingungen erleiden sie einen kom- 30 des erzeugten Antibiotikums werden zusätzlich anhand der plexen Lebens-Zyklus, der aus Aggregation, Fruchtkörper- und Zeichnung illustriert. In dieser zeigen

   Myxosporenbildung besteht. die Fig. 1 ein Eluierungs-Profil des Kieselsäure-Chromato-

   Über die mögliche Erzeugung von Antibiotika mit Myxo- graphie-Schrittes,

   bakterien bestanden bisher gegensätzliche Ansichten. Es die Fig. 2 ein Ultraviolett-Absorptions-Spektrum des Anti-

   wurde berichtet, dass der Myxococcus virescens während des 35 biotikums TA und

   Endes der exponentiellen Wachstumsphase ein Antibiotikum in die Fig. 3 ein Infrarot-Spektrum des letzteren,

   das Kultur-Medium aussondere. Dieses Antibiotikum wurde Der Myxococcus xanthus wird unter aeroben Bedingungen jedoch wegen seiner offensichtlichen Unstabilität nicht gerei- gezüchtet, die etwa dadurch erreicht werden können, dass die nigt und weiter verarbeitet. Andere Autoren kamen zu andern Kultur zur Belüftung konstant geschüttelt wird, oder dass Luft

   Ergebnissen und berichten, dass Myxococcus virescens ein 40 durch die das Kultur-Medium enthaltende Flüssigkeit geblasen

   Antibiotikum erzeuge, das gegen Aerobactar aerogenes wirk- wird. Das Antibiotikum TA wird dann während eines späten sam sei. Dagegen konnten Kletter und Henis (Can. J. of Micro- Stadiums der exponentiellen Wachstumsphase und während biology 9,577) bei zellenfreien Filtraten von Myxococcus fui- der stationären Wachstumsphase der Kultur erzeugt. Durch vus oder Myxococcus virescens weder gegen gram-positive Testen der Mikroorganismen mit Glycerin kann die Bildung noch gegen gram-negative Bakterien eine antibiotische Wirk- 45 von Myxosporen ausgelöst werden. Auch die Sporen erzeugen samkeit feststellen. das gleiche Antibiotikum. Die Mikroorganismen können auch

   Der einzige klare und direkte, vorbekannte Nachweis der auf einem festen Stoff gezüchtet werden und erzeugen auch in

   Erzeugung eines Antibiotikums durch Myxobakterien wurde diesem Fall das gleiche Antibiotikum.

   von Petersen et al. (Can. J. Mikrobiol. 12,221 ) erbracht. Diese Wie noch erläutert wird, nimmt die Produktion des Antibio-Autoren stellten fest, dass eine bestimmte Art von Sorangium 50 tikums nach einer gewissen Zeit ab, so dass die Antibiotikumein Breit-Spektrum-Antibiotikum, nämlich l-hydroxy-6-metho- Menge dann ungefähr konstant bleibt. In diesem Zeitpunkt xyphenazin-5,10 dioxyd (Myxin) erzeugt. Neuere Untersuchun- wird die Zucht vorteilhafterweise abgebrochen und das Antigen deuten darauf hin, dass Myxin eine schnelle Degradation biotikum mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel aus der DNS in E.coli-Bakterien bewirkt. der wässerigen Lösung extrahiert und gereinigt. Auf diese