CH616706A5 - - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1) Verfahren zur Herstellung von D-Ribose, dadurch gekennzeichnet, dass man einen zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismus, der keine Transketolase und/oder keine D-Ribulosephosphat-3-epimerase aufweist und bei dem der Quotient aus der Sporenzahl und der gesamten Lebensfähigkeit der Population, d.h. die «Sporenbildungshäufigkeit», nicht mehr als 10~4 beträgt und/oder der eine hohe 2-Dsoxy-D-glucoseoxydationsaktivität hat, züchtet, so dass der Stamm D-Ribose bildet und anreichert, und die so angereicherte D-Ribose aus der resultierenden Kulturbrühe gewinnt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass bei Verwendung eines Mikroorganismus mit hoher 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität die 2-Desoxy-D-gluco-seoxydationsaktivität grösser als 0,05 (xMol pro Minute und pro mg Protein, aber nicht grösser als 1,00 jxMol pro Minute und pro mg Protein ist.

3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Transketolaseaktivität und/oder D-Ribulose-phosphat-3-epimeraseaktivität des Mikroorganismus nicht gros- : ser als 0,01 |xMol pro Minute und pro mg Protein sind.

4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus in einem Nährboden züchtet, der Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff und für das Wachstum des Mikroorganismus erforderliche Nährstoffe, vorzugsweise verschiedene Metalle, Vitamine und Aminosäuren, enthält.

5) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus in einem Nährboden mit einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von : 20 bis 45° C unter aeroben Bedingungen züchtet.

6) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus eine Mutante von Bacillus pumilus, vorzugsweise Bacillus pumilus Nr, 911, Bacillus pumilus Nr. 1027 oder Bacillus pumilus Nr. 1083, verwendet.

7) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus eine Mutante von Bacillus subtilis, vorzugsweise Bacillus subtilis Nr. 957, Bacillus subtilis Nr. 941, Bacillus subtilis Nr. 1054, Bacillus subtilis Nr. 1067 oder Bacillus subtilis Nr. 1097, verwendet.

den gezüchtet wird, derL-Tyrosin,L-Tryptophan undL-Phenyl-alanin in Mengen von je mehr als ca. 100 y/ml enthält, bzw. die als Shi 5 und Shi 7 bezeichneten, keine Transketolase aufweisenden Stämme der Gattung Bacillus oder der mit Gluc 34 ; bezeichnete, keine D-Ribulosephosphat-3-epimerase aufweisende Stamm der Gattung Bacillus verwendet werden.

Das erstgenannte Verfahren ist in der britischen Patentschrift Nr. 1 255 254 und das zuletzt genannte Verfahren in Agricultural and Biological Chemistry, Band 35, Seite 509 1 (1971) beschrieben.

Die Häufigkeit der Sporenbildung, die Stärke der 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität, der Transketolaseaktivität und der D-RibuIosephosphat-3-epimeraseaktivität der in den vorbekannten Verfahren verwendeten Stämme wurde aber ; nicht erwähnt; im folgenden wird D-Ribulosephosphat-3-epi-merase einfach als Epimerase bezeichnet.

Dass diese Stämme Sporen zu bilden vermögen, ist mindestens aus der Tatsache ersichtlich, dass die Sporenbildung eines der hervorstechendsten Merkmale von Mikroorganismen der 1 Gattung Bacillus ist, und folgt auch aus dem Axiom, dass im allgemeinen das Fehlen eines besonderen Hinweises auf die Sporenbildung in einer Aussage über einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus bedeutet, dass der spezielle Mikroorganismus Sporen zu bilden vermag [Bergey's Manual of Determina-: tive Bacteriology, 7. Aufl., S. 613 (1957)].

Überdies haben diese bekannten Stämme eine sehr geringe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität, bestimmt mittels des im folgenden beschriebenen Verfahrens zum Testen der 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität; diese enzymatische Wir-1 kung der genannten Stämme beträgt 0,01 bis 0,02 (xMol pro Minute und pro mg Protein.

Wie in den oben beschriebenen Veröffentlichungen selbst zugegeben wird, werden nach diesen Verfahren bestenfalls nur ca. 35,3 mg D-Ribose pro ml erhalten.

Die 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität der genannten Stämme, erhalten nach dem erwähnten Bestimmungsverfahren, und die in den oben erwähnten Veröffentlichungen angegebenen höchsten in der Flüssigkeit angereicherten D-Ribosemen-gen sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Mikroorganismus

2-Desoxy-D- Ange-glucoseoxy- reicherte

Als Bestandteil von Nucleinsäuren kommt D-Ribose in allen Organismen vor; Ribit, ein Reduktionsprodukt von D-Ribose, ist in Vitamin B2 und Ribit enthaltender Teichonsäure, einem Bestandteil der Zellwandungen, vorhanden. Somit ist Ribose eine physiologisch sehr wichtige Substanz. Ferner haben D-Ribose und ihre Derivate bisher als Ausgangsmaterialien für die Synthese von Vitamin B2 und den sogenannten Nuclein-säure-Würzmitteln eine grosse Beachtung gefunden ; demzufolge war die Entwicklung eines technischen Verfahrens zur Herstellung von D-Ribose sehr erwünscht.

Die herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von D-Ribose umfassen Verfahren zum Extrahieren von D-Ribose aus natürlichen Produkten und Syntheseverfahren unter Verwendung von Furan, D-Glucose usw. als Ausgangsmaterialien. Es gibt auch Berichte über die fermentative Herstellung von D-Ribose, aber die Ausbeute der Fermentierung ist ausserordentlich gering. Somit sind diese Verfahren für die technische Herstellung von D-Ribose nicht ganz befriedigend.

Im Zusammenhang mit den Verfahren zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Organismen aus der Gattung Bacillus haben Sasajima and Yoneda bereits zwei Verfahren veröffentlicht, bei denen ein D-Ribose erzeugender Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der für sein Wachstum L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin benötigt, in einem Nährbo-

dationsak-tivität ([x-Mol/ min/mg Protein)

D-Ribose (mg/ml)

Britisches Patent 1 255 254

Bacillus pumilus

0,01

28,5

Nr. 503

Bacillus pumilus

0,02

30,5

Nr. 537

Bacillus pumilus

0,01

29,3

Nr. 558

Bacillus subtilis

0,01

26,5

Nr. 429

Bacillus subtilis

0,01

29,5

Nr. 483

Agricultural Bacillus-Art 0,01 28,4 and Biological Shi 5

fi5 Chemistry Bacillus-Art 0,02 35,3 35,509(1971) Shi 7

Bacillus-Art 0,01 24,8 Gluc 34

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Bei Versuchen zur Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Bakterien der Gattung Bacillus, die D-Ribose bei hohen Fermentierungsaus-beuten erzeugen, wurden intensive Untersuchungen ausgeführt, die schliesslich zu der Feststellung führten, dass diejenigen Mikroorganismen der Gattung Bacillus, die einerseits keine Transketolase und/oder keine D-Ribulosephosphat-3-epime-rase aufweisen und bei denen andererseits der Quotient aus der Sporenzahl und der gesamten Lebensfähigkeit der Population, d.h. die «Sporenbildungshäufigkeit», nicht mehr als 10~4 beträgt und/oder die eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydations-aktivität haben, ein ungewöhnlich hohes Vermögen zur Anreicherung von D-Ribose haben. Daraus ergaben sich weitere Untersuchungen, die zum Verfahren gemäss vorliegender Erfindung führten, nach dem D-Ribose in einer Menge von ca. 65 bis 70 mg pro ml erzeugt und angereichert werden kann.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist somit dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der oben beschriebenen Art züchtet, so dass der Stamm D-Ribose bildet und anreichert, und die so angereicherte D-Ribose aus der resultierenden Kulturbrühe gewinnt.

Im Zusammenhang mit Verfahren zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Mikroorganismen wurden bisher noch keinerlei Untersuchungen über die Beziehung zwischen dem Sporenbildungsvermögen und der Ausbeute an D-Ribose ausgeführt; die Erfindung beruht auf der ersten Untersuchung dieser Art. Abgesehen davon, dass somit durch die Ausführung der Erfindung eine erhöhte Ausbeute an D-Ribose erzielt werden kann, hat die Erfindung auch den zusätzlichen Vorteil, der die natürliche Folge der oben erwähnten geringen Sporenbildungshäufigkeit ist, dass das lästige Verfahren zur Entfernung der Sporen nicht erforderlich ist und das gewünschte Produkt sehr leicht gewonnen werden kann.

Das im folgenden beschriebene Verfahren zur Bestimmung der Sporenbildungshäufigkeit ist analog dem in Journal of General and Applied Microbiology, Band 16, S. 430, letzte Zeile bis S. 431, Zeile 5 (1970) beschriebenen Verfahren.

Verfahren zur Bestimmung der Sporenbildungshäufigkeit

Eine Öse voll einer Schrägkultur des Stammes, dessen Sporenbildungshäufigkeit bestimmt werden soll, wird in 5 ml eines modifizierten Schaeffer-Nährbodens [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Band 54, Seite 704 (1965)], der 1,0% D-Glucose, 0,8% Difco-Nährbouillon, 0,01 % Shikimisäure, 0,025 % MgS04 • 7HzO und 0,1 % KCl enthielt und 10_6-molar an FeCl3 • 6H20,10"3-molar an CaCl2 • 2H20 und 10_5-molar an MnCl2 • 4H20 war, wobei CaCl2 ■ 2H20 und MnCl2 ■ 4H20 getrennt sterilisiert wurden, übergeführt. Der Nährboden wurde vor der Sterilisierung auf pH = 7,0 eingestellt. Nach dreitägiger Bebrütung bei 37° C wurde die Kultur in 2 Portionen von 2,5 ml geteilt, von denen eine 30 Minuten lang auf 80° C erhitzt wurde. Sowohl die nicht erhitzte Kulter (gesamte Lebensfähigkeit) als auch die erhitzte Kulter (Sporenzahl) wurden entsprechend verdünnt und auf einen modifizierten Schaeffer-Agarnährboden gestrichen, der durch Zusatz von 2% Agar zu dem oben beschriebenen modifizierten Schaeffer-Nährboden hergestellt wurde. Die lebensfähigen Zellen wurden nach zweitägiger Bebrütung bei 37° C gezählt. Die Sporenbildungshäufigkeit des Teststammes ist der Wert des Quotienten aus der Sporenzahl und der totalen Lebensfähigkeit der Population.

Wenn nach dem in Journal of Biological Chemistry 223, 1009 (1956), Archives of Biochemistry and Biophysics 74,306 (1958) und 74,315 (1958) beschriebenen Verfahren das Aus-mass der Oxydation der reduzierten Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid (die im folgenden als NADH bezeichnet wird) bestimmt und die spezielle enzymatische Aktivität für den Zellenextrakt (A), der nach dem im folgenden beschriebenen

Verfahren hergestellt wird, berechnet wird und dieser Wert nicht grösser als 0,01 |xMol pro Minute und pro mg Protein ist, kann man annehmen, dass der Mikroorganismus keine Transketolase und/oder keine D-RibuIosephosphat-3-epimerase auf-5 weist.

(I) Verfahren zur Herstellung eines Zellenextraktes (A)

Eine Schrägkultur eines Stammes, dessen Transketolaseak-tivität oder Epimeraseaktivität bestimmt werden soll, wird in einen Nährboden vom pH = 7,0 geimpft, der 2,0% Sorbit, 10 0,1% Natrium-L-glutamat, 0,1% KH2S04,0,3% K2HP04, 0,5% (NH4)2S04,0,1 % MgS04 • 7H20,0,001% FeS04 • 7H20, 0,001 % ZnS04 • 7H20,0,001 % MnS04 • 4-6H20,100-4000 [ig/Liter Biotin, 100-3000 (ig/Liter Thiamin-hydrochlorid und 100 (ig/ml Shikimisäure enthält, worauf der geimpfte Nährbo-15 den unter Schütteln 24 Stunden lang bei 32 bis 37° C bebrütet wird. Die resultierende Kulturbrühe wird zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, die ihrerseits zweimal mit einer Pufferlösung vom pH = 7,5 aus 0,01-molarem Tris-(hydroxymethyl)-amino-methan und Salzsäure, der 0,001-molar an Mercaptoäthanol ist, gewaschen und wieder in dem obigen Puffer suspendiert werden, um eine Zellensuspension herzustellen, deren Absorptionsvermögen bei 650 nm 10 beträgt. Dann wird Eiweiss-Lysozym zu der Suspension gegeben, so dass sich eine Konzentration von 50 [ig pro ml ergibt ; man lässt die Reaktion 30 bis 90 Minuten lang bei 37° C vor sich gehen und zentrifugiert das Gemisch dann. Die resultierende überstehende Flüssigkeit wird als obiger Zellenextrakt (A) verwendet.

(II)-l Lösungen für die Bestimmung der Transketolaseaktivität Reaktionslösung A (1,11 ml):

20 (xMol D-Ribose-5-phosphat, 0,5 (xMol NADH, eine genügende Menge D-Ribose-5-phosphatketolisomerase und Epimerase, 0,66 Einheiten a-Glycerophosphatdehydrogenase, die genügend Triosephosphatisomerase enthält, 0,43 (xMol Thiaminpyrophosphat und 40 (iMol Tris-(hydroxymethyl)-ami-nomethan-Salzsäure-Pufferlösung vom pH = 7,5.

35

Reaktionslösung B (0,89 ml):

20 |xMol MgCl2,0,43 (xMol Thiaminpyrophosphat, 40 (xMol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Pufferlösung vom pH 7,5 und 10 |J.l der Enzymlösung.

(H)-2 Lösungen für die Bestimmung der Epimeraseaktivität 45 Reaktionslösung A (0,9 ml):

20 (iMoI D-Ribose-5-phosphat, 20 [xMol MgCl2,0,43 jxMol Thiaminpyrophosphat, genügend Transketolase und 40 jiMol Tris- (hydroxymethyl) -aminomethan-Salzsäure-Puff erlösung vom pH 7,5.

50

Reaktionslösung B (1,09 ml):

0,5 (xMol NADH, 0,66 Einheiten a-Glycerophosphatdehydrogenase, die genügend Triosephosphat/isomerase, genügend D-Ribose-5-phosphatketoIisomerase und Transketolase ent-55 hält, und 60 [iMol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salz-säure-Pufferlösung vom pH 7,5.

(III)-l Verfahren zur Bestimmung der Transketolaseaktivität Jede Reaktionslösung wird 10 Minuten lang bei 30° C h0 bebrütet, worauf die Reaktionslösungen gemischt werden (das Gesamtvolumen beträgt 2 ml). Die Änderungen des Absorptionsvermögens bei 340 nm wurde bei 30° C mit einem Gilford Multiple Sample Absorbance Recorder 2000 (Gilford Instrument Laboratories Inc., USA) bestimmt.

(>5

(Hl)-2 Verfahren zur Bestimmung der Epimeraseaktivität

Die Reaktionslösung A wird bei 30° C 30 Minuten lang bebrütet, und die Reaktionslösung B wird bei 30° C10 Minuten

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lang bebrütet. Die Reaktionslösungen werden gemischt. Dann werden 10 jxl der Enzymlösung zu dem Gemisch gegeben (das Gesamtvolumen beträgt 2 ml). Die Veränderung des Absorptionsvermögens bei 340 nm wurde in gleicher Weise wie bei der Bestimmung der Transketolaseaktivität gemessen.

(IV) Berechnung der Enzymaktivität

Die Enzymaktivität (|aMo1 pro Minute und pro mg Protein) in der Enzymlösung entspricht der folgenden Formel:

\T

—AE^n/min. x -

SxdxExp worin -AE340/min. die Geschwindigkeit der Abnahme des Nettoabsorptionsvermögens der gemischten Reaktionslösung bei 340 nm innerhalb 1 Minute bedeutet, V das Gesamtvolumen der gemischten Reaktionslösung (2 ml) darstellt, 2 der molekulare Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm (6,22 cm2/ (xMol) ist, d den Lichtweg (1 cm) bedeutet, E das Volumen der Enzymlösung (0,01 ml) darstellt und p die Konzentration des Proteins in der Enzymlösung (mg pro ml) ist.

Wenn bei einem Zellenextrakt (B), der nach den im folgenden zu beschreibenden Verfahren zur Herstellung von Zellenextrakt (B) hergestellt ist, das Ausmass der Reduktion von Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+) unter Verwendung der Reaktionslösung für die Bestimmung der 2-Desoxy-D-glu-coseoxydationsaktivität, die ebenfalls im folgenden beschrieben werden soll, bestimmt wird und auf Grund dieses Ausmasses die enzymatische Aktivität des Extraktes nach der Formel berechnet wird, die vorstehend als Ausdruck für die Transketolase-oder Epimeraseaktivität angegeben ist, und ein Wert gefunden wird, der nicht kleiner als 0,05 [iMol pro Minute und pro mg Protein, aber nicht grösser als 1,00 (xMol pro Minute pro mg Protein ist, so kann man annehmen, dass der Mikroorganismus eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität hat.

(I) Verfahren zur Herstellung von Zellenextrakt (B)

Ein Nährboden, der 0,5% Sorbit, 0,65% Natrium-L-gluta-mat, 0,1 % KH2P04,0,3 % K2HP04,0,1 % Na2S04,0,01 % MgS04 • 7H20,0,004% Biotin, 0,0003 % Thiaminhydrochlorid und 0,01 % Shikimsäure enthält, wird aus einer Schrägkultur mit 4 einem Stamm, dessen 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität bestimmt werden soll, geimpft und unter Schütteln 20 Stunden lang bei 37° C bebrütet. Aus der Brühe werden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet, zweimal mit einer Pufferlösung vom pH = 7,5 aus 0,01-molarem Tris-(hydroxymethyl)-aminome- 4 than und Salzsäure, die an Mercaptoäthanol 0,001-molar ist, gewaschen und wieder in dem obigen Puffer suspendiert, um eine Zellensuspension herzustellen, deren Absorptionsvermögen bei 650 nm 100 beträgt. Die Suspension wird bei 160 W10 Minuten lang mit einem Ultraschallzerkleinerer (Insonater der . Kubota Iron Works, Ltd. Japan) behandelt, wodurch die Zellen zerrissen werden. Das Sediment wird durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Fraktion ist der Zellenextrakt (B).

(II) Reaktionslösung für die Bestimmung der 2-Desoxy-D-glu- < coseoxydationsaktivität

1,2 ml einer Pufferlösung vom pH = 8,0 aus 1-molarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und Salzsäure, 0,2 ml einer 0,1-millimolaren Lösung von MnS04 • 6H20,0,2 ml einer 20-millimolaren NAD+-Lösung, 0,2 ml einer 1-molaren 2-Desoxy- , D-glucoselösung und 0,2 ml des Zellenextrakts (B) (Reaktionstemperatur 30°C).

Erfindungsgemäss wird ein Stamm der Gattung Bacillus verwendet, der einerseits keine Transketolase und/oder Epime-rase aufweist und andererseits eine hohe 2-Desoxy-D-glucose- , oxydationsaktivität und/oder kein Sporenbildungsvermögen hat. Derartige Stämme können aus Mikroorganismen, die zur Gattung Bacillus gehören, wie beispielsweise Bacillus brevis,

Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis usw., nach verschiedenen Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch Bestrahlen der ; Ausgangsstämme mit ultraviolettem Licht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder dergl., oder durch Einwirkenlassen von chemischen Mutagenen, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin, Stickstofflost, Dimethylsulfoxyd, Äthylmethansulfonat usw., auf die Ausgangsstämme. Es ist natürlich möglich, zuerst i einen Stamm zu erhalten, der keine Transketolase und/oder Epimerase aufweist, und den Stamm einer weiteren Mutation zu unterwerfen, um einen Stamm herzustellen, der kein Sporenbildungsvermögen und/oder eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxy-dationsaktivität hat, oder diese beiden Stufen des Verfahrens ; zur Herstellung der gewünschten Mutante zu vertauschen. Beispiele von erfindungsgemäss verwendbaren Stämmen sind Bacillus pumilus No. 911 (IFO13566), hinterlegt am 28.

August 1973, No. 1027 (IFO 13585), hinterlegt am 28. Dezember 1973, und No. 1083 (IFO 13620), hinterlegt am 1. Novem-) ber 1974, sowie Bacillus subtilis No. 957 (IFO 13565), hinterlegt am 28. August 1973, No. 941 (IFO 13573), hinterlegt am 6. November 1973, No. 1054 (IFO 13586), hinterlegt am 28. Dezember 1973, No. 1067 (IFO 13588), hinterlegt am 2. Februar 1974, und No. 1097 (IFO 13621), hinterlegt am 1. ; November 1974, usw.

Die Zahlen nach dem Wort IFO bedeuten die Ordnungsnummern der Hinterlegung bei der Culture Collection of the Institute for Fermentation, 4—54 Juso-nishino-cho, Higashiyo-dogawaku, Osaka, Japan.

]

Was die Nährstoffe angeht, die als Bestandteile eines Nährbodens für die Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden können, so gehören zu den Kohlenstoffquellen u.a. D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Sorbit, D-Mannit, Saccha-; rose, Melasse, Stärkehydrolysate, Stärke, Essigsäure und Äthanol. Zu den Stickstoffquellen gehören organische Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Baumwollsamenabfälle, Hefeextrakt, Trockenhefe, Fischmehl, Fleischextrakt, Pepton, das als «casamino acid» bezeichnete Caseinhydrolysat usw., anorgani-, sehe Stickstoffverbindungen, wie wässriges Ammoniak, Ammoniakgas, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat usw., und organische Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff, Aminosäuren usw. Abgesehen von den genannten Kohlenstoff -; und Stickstoffquellen können dem Nährboden verschiedene Metalle, Vitamine, Aminosäuren und andere Substanzen zugesetzt werden, die für das Wachstum des speziellen Mikroorganismus unbedingt erforderlich sein mögen und deren Mengen beliebig sind.

, Die Züchtung wird in der Regel aerob ausgeführt, z.B.

durch Schüttelkultur oder submerse Kultur unter Durchblasen von Luft und Rühren. Die Bebrütungstemperatur wird gewöhnlich je nach der Temperatur, die sich für das Wachstum des speziellen Organismus und die Anreicherung von D-Ribose s eignet, im Bereich von 20 bis 45° C gewählt. Der pH-Wert des Nährbodens liegt vorzugsweise irgendwo zwischen ca. 5 und ca. 9.

Um den pH-Wert während der ganzen Züchtungsdauer in dem optimalen Bereich zu halten, kann man von Zeit zu Zeit i eine neutralisierend wirkende Substanz, wie Salzsäure, Schwefelsäure, wässriges Ammoniak, Ammoniakgas, eine wässrige Natriumhydroxydlösung, Calciumcarbonat, Calciumhydroxyd usw., zusetzen. Gewöhnlich reichert sich in dem Nährboden in ca. 2 bis 5 Tagen eine wesentliche Menge D-Ribose an.

s Die so angereicherte D-Ribose kann beispielsweise nach dem folgenden Verfahren leicht gewonnen werden. Die Kulturbrühe kann nämlich zuerst filtriert oder zentrifugiert werden, wodurch die Zellen mit grosser Leichtigkeit entfernt werden

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können. Dann dann das Filtrat durch Behandlung mit Aktivkohle und Ionenaustauscherharz entsalzt und entfärbt und danach eingeengt werden.

Das Konzentrat kann mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthanol, versetzt werden, worauf sich D-Ribosekristalle abscheiden. Die D-Ribose kann leicht gewonnen werden, gleichgültig ob das obige Verfahren oder ein anderes Verfahren angewandt wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Prozente beziehen sich auf das Verhältnis Gew./Vol., wenn nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Die keine Transketolase aufweisende, keine Sporen bildende Mutante Nr. 911 von Bacillus pumilus (IFO 13566), die durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht aus Bacillus pumilus IFO 12113 erhalten worden war und eine Transketolaseaktivität von nicht mehr als 0,01 [iMol pro Minute und mg Protein und eine Sporenbildungshäufigkeit von 2 X 10-8 hatte, wurde verwendet, um 10 Liter eines Nährbodens zu impfen, der 2,0% Sorbit, 2,0% Maisquellwasser, 0,3% Dikaliumhydrogenphos-phat, 0,1 % Kaliumdihydrogenphosphat, 100 {xg pro ml Tyrosin und 100 mg pro ml Phenylalanin enthielt, worauf der geimpfte Nährboden 24 Stunden lang bei 36° C bebrütet wurde. Die Gesamtmenge der resultierenden Kultur wurde in 100 Liter eines Nährbodens übergeführt, der 15,0% D-Glucose, 1,0% Trockenhefe, 0,5% Ammoniumsulfat, 2,0% Calciumcarbonat, 50 |ig pro ml Tryptophan, 50 |xg pro ml Tyrosin und 50 [ig pro ml Phenylalanin enthielt; darin wurde die Kultur 60 Stunden lang bei 36° C gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in einer Menge von 64 mg pro ml anreicherte. Aus dieser D-Ribosefer-mentierungsbrühe wurden die Zellen durch Filtration entfernt, worauf das Filtrat auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt wurde. Dann wurde das Konzentrat mit ca. '/< seines Volumens an Äthanol versetzt und der Niederschlag verworfen. Der Rückstand wurde mit Kationen- und Anionenaustauscher-harzen entsalzt und dann auf einer Säule mit Aktivkohle entfärbt.

Die entfärbte Lösung wurde eingeengt und mit ca. dem vierfachen Volumen Äthanol versetzt, wodurch 5,0 kg kristalline D-Ribose erhalten wurden.

Beispiel 4

Die Mutante Nr. 1027 von Bacillus pumilus (IFO 13585), die durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht aus Bacillus pumilus IFO 12092 erhalten worden war und die keine Trans-5 ketolase aufwies und eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxyda-tionsaktivität hatte (Transketolaseaktivität nicht mehr als 0,01 [iMol pro Minute und mg Protein; 2-Desoxy-D-glucoseoxyda-tionsaktivität 0,28 [iMol pro Minute und mg Protein), wurde nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben m gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in der Brühe in einer Menge von 63,2 mg pro ml anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 14,8 kg D-Ribosekristalle erhalten.

15 Beispiel5

Die Mutante Nr. 1054 von Bacillus subtilis (IFO 13586), die durch Behandlung mitN-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin aus Bacillus subtilis IFO 3026 erhalten worden war und keine Epimerase aufwies und eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxyda-tionsaktivität hatte (Epimeraseaktivität nicht mehr als 0,01 |i,Mol pro Minute und mg Protein; 2-Desoxy-D-glucoseoxyda-tionsaktivität 0,31 (iMol pro Minute und mg Protein), wurde nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in der Brühe in einer Menge 25 von 65,7 mg pro ml anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 5,1 kg D-Ribosekristalle erhalten.

10 Beispiel 6

Die Mutante Nr. 1067 von Bacillus subtilis (IFO 13588), die durch Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin aus Bacillus subtilis IFO 3026 erhalten worden war und keine Transketolase aufwies und eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxy-35 dationsaktivität hatte (Transketolaseaktivität nicht mehr als 0,01 [iMol pro Minute und mg Protein ; 2-Desoxy-D-glucose-oxydationsaktivität 0,33 (iMol pro Minute und mg Protein), wurde nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, wobei die D-Ribose sich in der Brühe in 40 einer Menge von 66,5 mg pro ml anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 5,3 kg D-Ribosekristalle erhalten.

Beispiel 2

Die keine Transketolase aufweisende, keine Sporenbildende Mutante Nr. 957 von Bacillus subtilis (IFO 13565), die durch Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) aus Bacillus subtilis IFO 3026 erhalten worden war und eine Transketolaseaktivität von nicht mehr als 0,01 [iMol pro Minute und pro mg Protein sowie eine Sporenbildungshäufigkeit von 8 X 10-5 hatte, wurde nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, wodurch sich die D-Ribose in einer Menge von 62 mg pro ml in der Brühe anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 14,6 kg kristalline D-Ribose erhalten.

Beispiel 3

Die keine Epimerase aufweisende, keine Sporen bildende Mutante Nr. 941 von Bacillus subtilis (IFO 13573), die durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht aus Bacillus subtilis IFO 3026 erhalten worden war und eine Epimeraseaktivität von nicht mehr als 0,01 (iMol pro Minute und mg Protein sowie eine Sporenbildungshäufigkeit von 7 X 10~6 hatte, wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in einer Menge von 65 mg pro ml anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 14,3 kg D-Ribosekristalle erhalten.

Beispiel 7

Die keine Transketolase aufweisende, keine Sporen bildende und eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität besitzende Mutante Nr. 1083 von Bacillus pumilus (IFO 13620) ■ mit einer Transketolaseaktivität von nicht mehr als 0,01 [iMol 50 pro Minute und mg Protein, einer Sporenbildungshäufigkeit von 4 X 10"6 und einer 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität von 0,34 (iMol pro Minute und mg Protein, die durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen aus Bacillus pumilus S—1, der aus der Erde isoliert und gemäss der Beschreibung in Bargey's 55 Manual of Determinative Bacteriology, Seiten 620-622 (1957) als Bacillus pumilus identifiziert worden war, erhalten worden war, wurde nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in der Brühe in einer Menge von 72,3 mg pro ml anreicherte. Aus dieser Brühe 60 wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 5,6 kg kristalline D-Ribose erhalten.

Beispiel 8

65 Die keine Transketolase aufweisende, keine Sporen bildende, eine hohe 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität aufweisende Mutante Nr. 1097 von Bacillus subtilis (IFO 13621) mit einer Transketolaseaktivität von nicht mehr als 0,01 [iMol

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pro Minute und mg Protein, einer Sporenbildungshäufigkeit von 3 X 10~7 und einer 2-Desoxy-D-glucoseoxydationsaktivität von 0,29 [iMol pro Minute und mg Protein, die durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen aus Bacillus usbtilis IFO 3026 erhalten worden war, wurde nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, wobei sich die D-Ribose in der Brühe in einer Menge von 70,5 mg pro ml anreicherte. Aus dieser Brühe wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 5,4 kg kristalline D-Ribose erhalten.

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