CH617013A5

CH617013A5 -

Info

Publication number: CH617013A5
Application number: CH975575A
Authority: CH
Inventors: Hermann Erich Dr Karges; Norbert Dr Heimburger; Eckart Dr Jacobi
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1974-07-26
Filing date: 1975-07-25
Publication date: 1980-04-30
Also published as: NL7508671A; DK340375A; IE41277L; DE2435988B2; LU73056A1; ATA577175A; US4033824A; GB1516355A; FR2280086A1; IT1041783B; BE831796A; IE41277B1; AT349152B; FR2280086B1; DE2435988A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur analytischen Bestimmimg von Humanplasminogen durch Messung der Gerinnungszeit in einer Probe.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Bestimmung von Plasminogen in menschlichen Blut- und Körperflüssigkeiten. Die Kenntnis des Plasminogengehaltes ist besonders wichtig bei Patienten, die unter einer fibrinolyti-schen oder antifibrinolytischen Therapie stehen, ferner bei thrombo-embolisch Erkrankten oder bei Patienten mit globaler Gerinnungsstörung.

Zur Bestimmung des Plasminogengehalts einer Plasmaoder Serumprobe steht eine Reihe von Methoden zur Verfügung, die auf unterschiedlichen Prinzipien beruhen, unterschiedlich empfindlich oder störanfällig sind und für die

Bestimmung mehr oder weniger Zeitaufwand erfordern. Die biologischen Tests unterscheiden sich prinzipiell darin,

dass in einem Falle das Plasminogen der Probe in Plasmin umgewandelt und beispielsweise in der Fibrinplatten-Tech-nik nach Astrup bestimmt wird. Im anderen Falle wird das Plasminogen mit Hilfe eines Katalysators, der Plasminogen in einen Plasminogen-Aktivator umwandelt, z. B. Streptokinase als Aktivator, bestimmt, beispielsweise in der Clot-Lysis-Methode nach Christensen, mit der der gebildete Aktivator über die Piasminbildung gemessen werden kann.

In einer älteren Patentanmeldung wurde ein Verfahren zur Messung des Plasminogengehaltes vorgeschlagen, in dem die Fibrinbildung in einem antiplasminfreien Probenplasma nach Aktivierung des Plasminogens unter Beifügung von Thrombin verzögert und der Plasminogengehalt durch die Bestimmung der Verzögerung der Gerinnungszeit festgelegt wird. Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch in der Notwendigkeit, die Antiplasmin-Aktivität des Patientenplasmas mit Isoamylalkohol entfernen zu müssen. Dadurch ist seine Anwendung für die routinemässige Plasminogenbestimmung in klinischen Laboratorien relativ aufwendig und auch nicht schneller als beispielsweise die Clot-Lysis-Methode.

Es bestand daher ein Interesse, das vorgeschlagene Verfahren zu verbessern.

Es wurde nun gefunden, dass die Plasminogenbestimmung wesentlich vereinfacht werden kann, wenn das Plasminogen in einer Probe, z. B. in verdünntem Plasma oder Serum, mit Hilfe eines Katalysators in einen Plasminogen-Aktivator umgewandelt wird und die Menge des Aktivators in einem Testsystem bestimmt wird, das ein Plasminogen im Überschuss enthält, welches durch den Katalysator nicht aktiviert wird. Die Gerinnungszeit des Testansatzes mit Thrombin wird dabei zur Messgrösse für den unbekannten Plasminogengehalt.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur analytischen Bestimmung von Humanplasminogen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Humanplasminogen enthaltende Flüssigkeit mit a) einem Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogenaktivator umwandelt;

b) Fibrinogen; und c) einem durch den Katalysator nicht aktivierbaren Plasminogen versetzt und anschliessend Thrombin zugibt und die Gerinnungszeit des Ansatzes bestimmt.

Das Verfahren eignet sich insbesondere für die Bestimmung von Plasminogen im Plasma, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten von menschlichen Probanden.

Dem Verfahren liegt die Überlegung zugrunde, dass Humanplasminogen mit einigen biologischen Katalysatoren, beispielsweise dem Stoffwechselprodukt /»-hämolysierender Streptokokken, der Streptokinase, einen Komplex zu bilden vermag, der eine ähnliche enzymatische Wirkung wie die körpereigenen Aktivatoren des Plasminogens hat. Demgegenüber wird tierisches Plasminogen, insbesondere Plasminogen von Wiederkäuern, z. B. Rinderplasminogen, durch Streptokinase nicht aktiviert. Der Human-Plasminogen-Strepto-kinase-Komplex katalysiert die Umwandlung von menschlichem und tierischem Plasminogen zu Plasmin.

Unter diesen Gesichtspunkten ist das Wesen des vorliegenden Verfahrens darin zu sehen, dass einerseits ein Katalysator verwendet wird, der Humanplasminogen in Human-plasminogen-Aktivator umzuwandeln vermag, z. B. die Streptokinase, dass dieser Katalysator jedoch andererseits ein zugesetztes, phylogenetisch, dem menschlichen nicht verwandtes Plasminogen meist nicht direkt, sondern nur über eine aktivierte Zwischenstufe in Plasmin überführt. Vom Pirmin

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ist bekannt, dass es eine sehr wirksame Proteinase darstellt, die u. a. Fibrinogen abzubauen vermag. In einem Gerinnungsansatz erweist sich die Gerinnungszeit um so stärker verzögert, je stärker das Fibrinogen durch vorhandenes Plasmin degradiert wurde. 5

Nach dem Vorhergesagten kann in dem Verfahren statt Streptokinase auch jede andere katalytisch wirksame Substanz Anwendung finden, die in der Lage ist, die gesamte vorhandene Plasminogenmenge in Aktivator zu überführen.

Es konnte deshalb mit dem vorliegenden Verfahren ge- 10 zeigt werden, dass eine Beziehung zwischen der vorhandenen Plasminogenmenge und der in einem Gerinnungsansatz gemessenen Gerinnungszeit herzustellen ist. Dabei hat es sich als zweckmässig erwiesen, die zu testenden Körperflüssigkeiten 1:5 bis 1:500 mit einem wässrigen Medium, vorteilhaft 15 mit einer isotonischen Salzlösung, die ggf. gepuffert sein kann, zu verdünnen. Die Menge an Katalysator soll gegenüber der Plasminogenmenge im Überschuss vorliegen. Im Falle von Streptokinase als Katalysator bedeutet das ein Molverhältnis Streptokinase:Plasminogen > 1:1. In normalerweise20 vorkommenden Messbereichen ist es ausreichend, pro ml der verdünnten Körperflüssigkeit 250—5000 Einheiten Streptokinase (nach Christensen) zuzusetzen oder ein entsprechendes Äquivalent einer anderen katalytisch wirksamen Substanz,

die in der Lage ist, die gesamte vorhandene Plasminogen- 251 menge in Aktivator zu überführen.

Ferner soll der Ansatz pro ml zweckmässig 1—20 mg Fibrinogen, an nicht durch den Katalysator aktivierbarem Plasminogen entsprechend einer Menge von 1—80 Einheiten (eine Einheit Plasminogen entspricht einem Plasminogengehalt von einem ml normalen Rinderplasma) und schliesslich 0,1—1,0 Einheiten Thrombin enthalten. Dabei ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass eine höhere Fibrino-genmenge eine geringere Thrombinmenge zur Gerinnung in der gleichen Zeiteinheit benötigt bzw. dass die Gerinnungszeit von der Fibrinogenmenge in umgekehrt proportionalem Verhältnis steht. Die Gerinnungszeit, die in dem Verfahren gemäss der Erfindung mit der Plasminogenmenge in Korrelation steht, kann zweckmässigerweise mit Hilfe von dafür zur Verfügung stehenden Messgeräten, sogenannten Koagulo- 40 metern, bestimmt werden, beispielsweise in einem Kugel-koagulometer.

Zudem können Änderungen im Puffermilieu zu Änderungen in den Gerinnungszeiten führen. So ergibt ein stärker alkalischer Puffer verlängerte Gerinnungszeiten in einem sonst unveränderten Testansatz. Solche Änderungen, sind jedoch ohne Einfluss auf das Endergebnis der Bestimmung des Plasminogengehaltes, da der Plasminogengehalt der Probe von einer jeweils parallel zu erstellenden Eichkurve abgelesen wird. 50

Es hat sich als zweckmässig erwiesen, die praktische Durchführung in der Weise vorzunehmen, dass man zu einer verdünnten, menschlichen Plasminogen enthaltenden Körperflüssigkeit einen Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogen-Aktivator umwandelt, zusetzt, das Gemisch zu einer Lösung, die Fibrinogen und ein: durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen enthält, zufügt, den Ansatz schliesslich mit Thrombin zur Gerinnung bringt, die Gerinnungszeit bestimmt und diese mit der Plasminogenmenge in Beziehung setzt, oder dass man eine verdünnte, 60 menschliches Plasminogen enthaltende Körperflüssigkeit zu einem Gemisch aus a) einem Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogenaktivator umwandelt,

b) Fibrinogen und c) einem durch den Katalysator nicht aktivierbaren Plasminogen zufügt, den Ansatz schliesslich mit Thrombin zur

Gerinnung bringt, die Gerinnungszeit bestimmt und diese mit der Plasminogenmenge in Beziehung setzt.

Ein besonders vorteilhaftes Reagens für die Plasminogenbestimmung enthält z. B. eine Mischung von Rinderplas-minogen-haltigem Rinderfibrinogen mit Streptokinase. Die Zusammensetzung der Mischung liegt vorzugsweise bei 2—8 mg Rinderplasminogen-haltigem Rinderfibrinogen und 250 bis 5000 Einheiten Streptokinase in fester Form oder aufgelöst in 1 ml der geeigneten Pufferlösung.

Im klinischen Laboratorium werden Reagensansätze bevorzugt, mit deren Hilfe die durchzuführenden Bestimmungsmethoden vereinfacht werden können. Ein Reagens zur Bestimmung von Plasminogen könnte beispielsweise folgende Zusammensetzung haben, wobei spezielle Erfordernisse zu Anteilen oder mehrfachen der angegebenen Menge der jeweiligen Substanzen Anlass geben könnten:

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1. Rinderfibrinogen

2. Streptokinase

3. Thrombin

Reagens 60 mg

75 000 I. E. (nach Christensen)

60 NIH-Einheiten

[National Inst, of Health (NIH)]

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Dieser Testansatz kann gewünschtenfalls noch ergänzt werden durch:

4. schwach alkalische Pufferlösung,

beispielsweise Diäthylbarbiturat-Na-Acetat-HCl pH 7,6 0,06 M

5. Standard-Humanplasma ca. 1 ml

Die Komponenten 1 und 2 können gewünschtenfalls gemeinsam gelöst und lyophilisiert werden und in dieser Form in einem Testbesteck als eine einzige Komponente eingesetzt werden.

Mit Hilfe des vorgeschlagenen Testbesteckes kann nun sowohl die Eichkurve für die Beziehung der Plasminogenmenge und der Gerinnungszeit erstellt als auch die Bestimmung des Plasminogens von etwa 25 unbekannten Humanplasminogen enthaltenden Lösungen durchgeführt werden. Dies wird in der folgenden Versuchsbeschreibung wiedergegeben:

Erstellung der Eichkurve

In 10 Teströhrchen aus Polystyrol mit den Abmessungen 14,5 X 84 mm wird je eine Glaskugel (0 2 mm) gegeben. In 5 der Röhrchen soll die Gerinnungszeit des Standardplasmas ohne Aktivierung durch Streptokinase durchgeführt werden. In den restlichen. 5 Röhrchen wird die Gerinnungszeit nach Aktivierung mit Streptokinase bestimmt. Die Gerinnungszeiten werden jeweils in 5 verschiedenen Verdünnungen gemessen, wobei jeweils eine Kontrolle ohne Plasmaverdünnung vorgenommen, wird. Das Plasma wird 1:20 mit 0,06 M Diäthylbarbiturat-Na-Acetat-HCl vorverdünnt und die weitere Verdünnung mit der gleichen Lösung in der Weise vorgenommen, dass in den zu testenden Röhrchen 100 %, 50 o/o, 25 %, 12,5 % und 0 % der Plasmaverdünnung vorliegt. In den Proben, die mit Streptokinase aktiviert werden, werden pro 2 ml Plasma-Vorverdünnung 0,1 ml einer Streptokinaselösung von 20 000 I. E. pro ml zugegeben und 30 Sekunden bei Raumtemperatur belassen.

Für die nachstehend beschriebenen Gerinnungsansätze werden folgende Lösungen benötigt:

1. Rinderfibrinogenlösung mit 4 mg/ml Rinderfibrinogen,

2. Thrombinlösung mit 2 NIH Einheiten/ml Thrombin.

Im folgenden Testansatz ergeben sich die angeführten

Gerinnungszeiten. Die in einer Doppelbestimmung erhaltenen Mittelwerte der Gerinnungszeiten werden auf einem Doppel-Logarithmenpapier aufgetragen, die als Eichkurve für die weiteren Bestimmungen verwendet werden kann.

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Testansatz 0,4 ml Rinderfibrinogenlösung + 0,2 ml Plasmaverdünnungen, nicht aktiviert oder aktiviert

2 Min. inkubieren (37° C)

+ 0,1 ml Thrombin

Je nach der verwendeten Piasminverdünnung liefert ein solcher Ansatz folgende Gerinnungszeiten in Sekunden:

Plasma unaktiviert

100 o/o —

26,3/26,3 =

26,3'

50 o/o —

24,6/25,1 =

24,9'

25o/o _

24,3/24,0 =

24,2'

12,5 o/o _

23,4/23,2 =

23,3'

0 % —

23,2/23,1 =

23,2'

Plasma aktiviert

100 o/o —

40,5/39,0 =

39,8'

50 o/o —

34,8/34,0 =

34,4'

25 0/0 —

29,5/29,3 =

29,4'

12,5o/o —

26,6/26,5 =

26,6'

Oo/o —

23,1/23,2 =

23,2'

Testung unbekannter Seren oder Plasmen Die zu testenden Seren- oder Plasmenproben werden wie das Standard-Humanplasma 1:20 vorverdünnt. 2 ml dieser Serum- oder Plasmaverdünnung werden mit 0,1 ml Strepto-5 kinase (20 000 E/ml) versetzt und 30 Sek. bei Raumtemperatur belassen. Danach wird die inkubierte Probe 1 + 1 verdünnt in den Testansatz zur Bestimmung der Gerinnungszeit eingesetzt. Aus der resultierenden Gerinnungszeit von 37 Sek. kann mit Hilfe der Eichkurve (vgl. Abbildung 1) und einer io primär getroffenen Annahme, dass Standard-Humanplasma 5000 E/ml Plasminogen enthält, die Menge des Plasminogens in der getesteten Probe z. B. mit 70 % dieses Wertes entsprechend 3500 Einheiten Plasminogen/ml entnommen werden. ;. Unter Berücksichtigung der eingangs vorgenommenen Verls dünnung von 1:2 beträgt der Plasminogen-Gehalt der Probe 7000 E/ml. Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man die vorverdünnte Humanplasminogen enthaltende Körperflüssigkeit zu einer Mischung aus plasminogenhaltigem Rinderfibrinogen mit 500 E/ml Streptokinase zusetzt, den Ansatz 2 Min. bei 37° C inkubiert und anschliessend mit der angegebenen Thrombinlösung zur Gerinnung bringt.

Zeigt es sich beispielsweise, dass eine zu prüfende Körperflüssigkeit in dem Testsystem einen nicht bestimmbar hohen Plasminogenwert erbringen würde, wird sinnvoller-25 weise die Probe entsprechend vorverdünnt und diese Verdünnung in der Bestimmung in Rechnung gesetzt.

Entsprechendes gilt bei zu niedrigem Plasminogengehalt.

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1 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur analytischen Bestimmung von Humanplasminogen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Human-plasminogen enthaltende Flüssigkeit mit a) einem Katalysator, der Humanplasminogen in Human-plasminogenaktivator umwandelt;

b) Fibrinogen; und c) einem durch den Katalysator nicht aktivierbaren Plasminogen versetzt und anschliessend Thrombin zugibt und die Gerinnungszeit des Ansatzes bestimmt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zu einer verdünnten, menschliches Plasminogen enthaltenden Körperflüssigkeit einen Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogenaktivator umwandelt, zusetzt, das Gemisch zu einer Lösung, die Fibrinogen und durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen enthält, zufügt, den Ansatz schliesslich mit Thrombin zur Gerinnung bringt und die Gerinnungszeit bestimmt.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine verdünnte, menschliches Plasminogen enthaltende Körperflüssigkeit zu einem Gemisch aus a) einem Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogenaktivator umwandelt;

b) Fibrinogen; und c) einem durch den Katalysator nicht aktivierbaren Plasminogen zufügt, den Ansatz schliesslich mit Thrombin zur Gerinnung bringt und die Gerinnungszeit bestimmt.
4. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Katalysator Streptokinase ist.
5. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass einer 1:5 bis 1:500 mit einer wässrigen Lösung vorverdünnten Körperflüssigkeit pro ml 250 bis 5000 Einheiten Streptokinase nach Christensen zugesetzt werden.
6. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen ein Plasminogen von Wiederkäuern verwendet wird.
7. Reagens zur Durchführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es a) einen Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogenaktivator umwandelt;

b) Fibrinogen; und c) ein durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen enthält.
8. Reagens nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es Streptokinase, Rinderfibrinogen und Rinder-plasminogen enthält.