CH617268A5

CH617268A5 - Coloured reference standard for diagnostic determinations, and process for its preparation

Info

Publication number: CH617268A5
Application number: CH1285975A
Authority: CH
Inventors: Paul Kimberly Adolf; James Joseph Carroll
Original assignee: Warner Lambert Co
Priority date: 1974-10-04
Filing date: 1975-10-03
Publication date: 1980-05-14
Also published as: GB1468494A; CA1043677A; JPS557239B2; DE2537499A1; DK442775A; FR2287036B1; NO753268L; IT1043092B; SE408232B; FR2287036A1; SE7511133L; JPS5162091A

Description

**WARNUNG** Anfang DESC Feld konnte Ende CLMS uberlappen **.

PATENTANSPRÜCHE
1. Gefärbtes Bezugs-Standard für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1-(pjod- phenylf54p-nitrophenylf3-phenylformazan gebildet wird, aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wässrige Lösung von a) 0,001 bis 0,020 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)3-phenylformazan; b) 0,01 bis 0,10 Gew.-0/o Serumalbumin; c) 2 bis 10 Gew.-0!o der Lösungsmittel N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxyd; und d) 2 bis 10 Gew.-0!o Isopropylalkohol enthält, wobei die Mengenangaben sich auf das Gewicht der Gesamtlösung beziehen, und ein Extinktionsmaximum bei 500 nm aufweist.

2. Gefärbtes Bezugs-Standard nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es 5 bis 20 Gew.-% eines inerten Quellmittels in wässriger Lösung enthält.

3. Gefärbtes Bezugs-Standard nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Lösung von a) 0,005 bis 0,015 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)- 3-phenylformazan; b) 0,02 bis 0,075 Gew.- /0 Serumalbumin; c) 2 bis 10 Gew.-0/c N,N'-Dimethylformamid; d) 2 bis 10 Gew.-O/o Isopropylalkohol; und e) 8 bis 14 Gew.-0!o Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10 000 enthält.

4. Gefärbtes Bezugs-Standard nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wässrige Lösung von a) etwa 0,0123 Gew.-O/o 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3- phenylformazan; b) etwa 0,0563 Gew.-0!o Rinderserumalbumin; c) etwa 2,5 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid; d) etwa 7,5 Gew.-0/o Isopropylalkohol; und e) etwa 9 Gew.-% Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10000 enthält und diese Lösung eine Extinktion bei 500 nm, was einem Äquivalent von ungefähr 1,34 entspricht, aufweist.

5. Verfahren zur Herstellung eines gefärbten Bezugs-Standards für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phe- nylformazan gebildet wird, aufweisen, nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man a) 0,001 bis 0,020 Gew.-0/c I-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenylt 3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2 bis 10 Gew.-O/o der Lösungsmittel N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxyd enthält, vollständig löst; b) 2 bis 10 Gew.-0/o Isopropylalkohol langsam zu der Lösung a) gibt und sorgfältig mischt; c) 0,01 bis 0,10 Gew.- /0 Serumalbumin in 80 bis 95 Gew.-0/o Wasser löst;

und d) die Lösung b) zu der Lösung c) langsam unter Rühren hinzufügt, wobei sich die Mengenangaben auf die Gesamtlösung beziehen.

6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Stufe c) 5 bis 20 Gew.-% eines inerten Quellmittels in dem Wasser zusätzlich mit dem Serumalbumin löst, und man in der Stufe d) die Lösung b) langsam unter Rühren zu der Lösung c), welche das Quellmittel und das Serumalbumin enthält, hinzufügt.

7. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Verfahrensstufe a) 0,005 bis 0,015 Gew.-0/o lAp-Jodphenylp5Ap-nitrophenyl)-3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2 bis 10 Gew.-0/o N,N'-Dimethylformamid enthält, löst; und man in der Stufe c) 0,02 bis 0,075 Gew.-0/c Serumalbumin zusätzlich zu 8 bis 14 Gew.-% eines Dextran-Quellmittels mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10 000, hinzufügt.

8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Verfahrensstufe a) etwa 0,0123 Gew.-% 1Xp-JodphenylS5Ap-nitrophenyl)-3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2,5 Gew.-0/o N,N'-Dimethylformamid enthält, löst, in Stufe b) etwa 7,5 Gew.-0/o Isopropylalkohol zusetzt und in Stufe c) 9 Gew.-0/o Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 und 0,0563 Gew.-% Rinderserumalbumin in 90 Gew.-% Wasser löst.

9. Verwendung des gefärbten Bezugs-Standards nach den Patentansprüchen 1 und 2 zur Herstellung eines stabilen Produktes, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung lyophilisiert.

10. Verwendung nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Bezugs-Standard gemäss Patentanspruch 3 verwendet.

11. Verwendung nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Bezugs-Standard gemäss Patentanspruch 4 verwendet.

Die Erfindung betrifft ein gefärbtes Bezugs-Standard für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1Ap-Jodphenyl)-5Ap-nitrophenyl)-3-phenylforma- zan gebildet wird, aufweisen, sowie das Verfahren zu seiner Herstellung, sowie seine Verwendung zur Herstellung eines lyophilisierten Produktes.

Methoden zur quantitativen Bestimmung gewisser Enzyme basieren auf der Produktion von reduziertem Nikotinamid Adenindinucleotid (NADH) oder reduziertem Nikotinamid Adenindinucleotidphosphat (NADPH) als Ergebnis der enzymatischen Reaktion auf einem Substrat. Das NADH oder im Wechsel NADPH reduziert farbloses 2-(p-Jodphenyl)-3 < p- nitrophenyl > 5-phenyltetrazoliumchlorid (im allgemeinen unter der Bezeichnung INT bekannt) in Gegenwart eines Elektronenträgers, beispielsweise Phenazin-methosulfat, zu 1(pJodphe- nyl)-5-(p-nitrophenylS phenylformazan für gewöhnlich unter der Bezeichnung INT-Formazan bekannt), welches hellrot ist und spektrofotometrisch gemessen werden kann.

Die Konzentrationen des Enzyms werden derart bestimmt, dass man gleichzeitig neben der Testreaktion einen Versuch mit einer Bezugsprobe durchführt, wobei letztere bekannte Enzymmengen besitzt und man die spektrofotometrischen Werte der zu bestimmenden Probe mit denen der Bezugsprobe vergleicht.

Repräsentative enzymatische Bestimmungen, bei denen die oben beschriebene Methode im allgemeinen beschrieben ist, finden sich in folgenden Schriften: Babson, A. L. and Phillips, G. E., A Rapid Colorimetric Assay for Serum Lactic Dehydrogenase , Clin. Chim. Acta 12,210-215(1965); Van Der Veen et al., Isoenzymes of Creatine Phosphokinase in Tissue Extracts and in Normal and Pathological Sera , Clin. Chim. Acta 13, 312-316 (1966); and Nachlas, M. M., et al., The Determination of Lactic Dehydrogenase with a Tetrasodium Salt , Anal. Bio chem.,1,317-326 (1960).

Die Genauigkeit der Ergebnisse bei der Anwendung der oben genannten Methoden zur Bestimmung enzymatischer Aktivitäten hängt in einem weiten Mass von der Herstellung und der Stabilität der Bezugsprobe ab, welche eine bekannte Enzymmenge enthält, mit der die Ergebnisse der Testprobe verglichen werden. Darüber hinaus bedeuten diese enzymatischen Testmethoden eine doppelte Arbeit, da in jedem Falle der Test selber ebenso auf der Bezugsprobe wie auf der unbekannten Probe laufen muss. Solch ein Doppelversuch erfordert eine sehr umfangreiche Kontrolle, um sicherzugehen, dass

keine Ungenauigkeiten vorliegen.

Es liegt deshalb auf der Hand, dass ein Bedürfnis nach einem stabilen Bezugsstandard für die enzymatischen Bestimmungen vorliegt, bei dem kein gleichzeitiger Kontrolltest vorgenommen werden muss. Bis jetzt ist ein solches Produkt noch nicht im Handel erhältlich.

Demgemäss ist Gegenstand der Erfindung:
1. ein gefärbtes Bezugs-Standard für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen l-(p-Jod- phenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan gebildet wird, aufweisen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine wässrige Lösung von a) 0,001 bis 0,020 Gew.-0/c 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl > 3-phenylformazan; b) 0,01 bis 0,10 Gew.- /O Serumalbumin; c) 2 bis 10 Gew;O/o der Lösungsmittel N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxyd; und d) 2 bis 10 Gew.-0/c Isopropylalkohol enthält, wobei sich die Mengenangaben auf die Gesamtlösung beziehen, und ein Extinktionsmaximum bei 500 nm aufweist;

sowie
2. ein Verfahren zur Herstellung des gefärbten Bezugs-Standards für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phe- nylformazan gebildet wird, aufweisen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) 0,001 bis 0,020 Gew.-0/o 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)- 3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2 bis 10 Gew.-0/o Lösungsmittel N,N'-Dimethylformamid und/oder
Dimethylsulfoxyd enthält, vollständig löst; b) 2 bis 10 Gew.-O/o Isopropylalkohol langsam zu der Lösung a) gibt und sorgfältig mischt; c) 0,01 bis 0,10 Gew.-0/c Serumalbumin in 80 bis 95 Gew.-0/o Wasser löst;

Dem wässrigen gefärbten Bezugs-Standard können auch 5 bis 20 Gew.-0/o eines inerten Quellmittels zugesetzt und sodann lyophilisiert werden. Das lyophilisierte Produkt kann leicht mit Wasser wiederhergestellt werden. Die wässrige gefärbte
Bezugs-Standardlösung weist ein Extinktionsmaximum bei 500 nm auf und eignet sich für die Bestimmung gewisser Enzym aktivitäten, wie beispielsweise der Aktivität der Serumlactat
Dehydrogenase, der Creatinphosphokinase, der Glucose-6.

phosphatdehydrogenase und ähnlicher Enzyme.

Es hat sich herausgestellt, dass ein gefärbtes Bezugs-Stan dard zur Bestimmung gewisser Enzymaktivitäten enthaltend in wässriger Lösung 0,001 bis 0,020 Gew.-0/c lXp-JodphenylS5Xp- nitrophenyl > 3-phenylformazan, 0,01 bis 0,10 Gew.- /0 Serumal bumin, 2 bis 10 Gew.-% eines Lösungsmittels N,N'-Dimethylfor mamid und/oder Dimethylsulfoxyd und 2 bis 10 Gew.-% Isopro pylalkohol ein Extinktionsmaximum bei 500 nm aufweist.

Durch die Zugabe von 5 bis 20 Gew;O/o eines inerten Quellmit tels kann eine Lösung, welche lyophilisiert werden kann, herge stellt werden. DieNlyophilisierte Form des gefärbten Bezugs
Standards ist mindestens sechs Monate lang bei 4 "C und bei
24 "C stabil. darüber hinaus kann die lyophilisierte Form des vorliegenden Bezugs-Standards mit Wasser wiederhergestellt werden und ergibt eine klare Lösung, welche ohne Schwierig keit als Bezugs-Standard für die enzymatischen Bestimmungen verwendet werden kann.

Das 14p-Jodphenyl)4-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan in dem gefärbten Bezugs-Standard (allgemein als INT-Formazan bekannt) ist im Handel von National Biochemicals Cor., Cleve land, Ohio erhältlich und weist folgende Formel auf:
EMI2.1

Das INlU-Formazan wird häufig bei mikrobiologischen Identifikations-Bestimmungen verwendet, insbesondere bei der Prüfung von Nahrungsmitteln und pathologischen Präparaten, bei denen Bakterien, falls vorhanden, das farblose 2-(p-Jodphe nyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid (allgemein als INT bekannt), welches die Formel
EMI2.2
besitzt, zu dem hellgefärbten INT-Formazan reduziert.

Darüber hinaus bewirken einige enzymatische Reaktionen die Reduktion des INT in das INT-Formazan, und dies wiederum ist genau die Verwendungsmöglichkeit des vorliegenden gefärbten Bezugs-Standards bei der Bestimmung dieser Enzyme.

Es hat sich herausgestellt, dass die Lösungsmittel N,N' Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd besonders gut die Löslichkeit des INT-Formazans verbessern und die leichte Wiederherstellung mit Wasser nach der Lyophilisierung erlauben. Die Zugabe von Isopropylalkohol unterstützt ebenfalls diesen Lösungsvorgang. Von besonderer Wichtigkeit ist es, dass diese Lösungsmittel nicht das Extinktionsmancimum der wässrigen gefärbten Bezugs-Standardlösung stören oder beeinträchtigen.

Das vorliegende stabile gefärbte Bezugs-Standard enthält auch Serumalbumin. Dabei ist das Rinderserumalbumin bevor zugt Es wird vermutet, dass dieses Material bei der Stabilisierung sowohl der lyophilisierten als auch der wässrigen Form des Bezugs-Standards hilft.

Geeignete inerte Quellmittel zur Verwendung in dem vorliegenden Bezugs-Standard sind u. a. natürliche und synthetische Kautschukarten, wie z. B. Gummi arabicum, Natriumalgi nat, Irish-Moos-Extrakt, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon und ähnliche Arten; ferner Zucker, wie beispielsweise Sorbit, Mannit, Saccharose und ähnliche Zucker; ferner ECohle- hydrate, wie z. B. Stärke, Dextran und andere Kohlehydrate.

Das bevorzugte Quellmittel ist ein Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10000.

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel eines gefärbten Bezugs-Standards kann derart hergestellt werden, indem man eine wässrige Lösung, welche sich zur Lyophilisierung eignet, herstellt, welche 0,005 bis 0,015 Gew.-0/o von 1-(pJodphenyW5- (p-nitrophenyl3-phenyllormazan, 0,02 bis 0,075 Gew.-0/o Rin derserumalbumin, 8 bis 14 Gew.-0/o Dextran, mit einem Molekulargewicht von etwa 10000,2 bis 10 Gew.-0/c N,N'-Dimethylfor- mamid und 2 bis 10 Gew.-0/o Isopropylalkohol zubereitet.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines gefärbten Bezugs-Standards enthält in wässriger Lösung 0,0123 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan, 0,563 Gew.-0/o Rinderserumalbumin, 9 Gew.-0/c Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10000,2,5 Ges % N,N' Dimethylformamid und 7,5 Gew.- /O Isopropylalkohol. Die Extinktion der wässrigen gefärbten Bezugs-Standardlösung bei 500 nm ist ungefähr 1,34.

Die lyophilisierte Form des vorliegenden gefärbten Bezugs Standards hat sich bei Temperaturen von 4 "C und 24 "C mindestens sechs Monate lang als stabil erwiesen. Das mit Wasser oder mit 0,1 n Salzsäure wiederhergestellte lyophilisierte Standard kann leicht zu Verdünnungen verwendet werden, welche zur Aufstellung von Standardkurven für kolorimetrische Fixpunkt (fixed-point > Enzymproben erforderlich sein können.

Wiederhergestellte gefärbte Bezugs-Standardlösungen sind 8 Stunden lang bei Zimmertemperatur und mindestens 48 Stunden lang bei 4 "C stabil.

Um ein stabiles gefärbtes Bezugs-Standard herzustellen, müssen die verschiedenen oben genannten Bestandteile auf besondere Weise zueinander gegeben werden, um ein Produkt zu erhalten, welches die notwendige Stabilität und Löslichkeit aufweist, um nach der Lyophilisierung wiederhergestellt werden zu können. Diese Eigenschaften werden durch erstes vollständiges Lösen des INT-Formazans in einem ausgewählten Lösungsmittel und Zugabe des Isopropylalkohols unter gründli chem Mischen erreicht. Das Serumalbumin wird in Wasser gelöst und zu dieser Lösung wird langsam unter Rühren die INT-Formazanlösung zugesetzt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des vorliegenden Bezugs-Standards, bei dem Lyo philisierung erwünscht ist, wird das inerte Quellmittel in Wasser zusammen mit dem Serumalbumin gelöst.

Die erhaltene Endlösung wird in gleiche Teile aufgeteilt und dem üblichen Lyophilisierungsverfahren unterworfen.

Zur Verwendung für enzymatische Bestimmungen wird die oben beschriebene lyophilisierte Form des gefärbten Bezugs Standards mit Wasser oder 0,1 n-Salzsäure wiederhergestellt.

Die gefärbte Bezugs-Standardlösung dient als Standard bekannter Aktivität, gegen das unbekannte Testproben vergli chen werden können, um die Enzymaktivität in der unbekannten Probe zu bestimmen. Die vorliegende gefärbte Bezugs Standardlösung kann bei Bedarf verdünnt werden, um zur Auf stellung von Kurven für colorimetrische Fixpunkt (fix pointS
Enzymproben zu dienen.

Das vorliegende gefärbte Bezugs-Standard weist eine ausgezeichnete Stabilität in lyophilisiertem Zustand auf und kann nach der Wiederherstellung leicht für die laufend vorgenom menen enzymatischen Bestimmungen verwendet werden. Aus führungsbeispiele des vorliegenden gefärbten Bezugs-Stan dards sowie dessen Herstellungsverfahren sind nachfolgend in den Beispielen beschrieben.

Beispiel
Herstellung der stabilen gefärbten Bezugs-Standardlösung a) 12,13 mg INT-Formazan wird in 2,5 ml N,N'-Dimethylfor- mamid gelöst. Zu dieser Lösung werden 7,5 ml Isopropanol als
Reagens hinzugefügt und sorgfältig vermischt.

b) 9,0 g Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr
10 000 und 56,3 mg Rinderserumalbumin werden in 90 ml gerei nigtem Wasser gelöst.

c) Die Lösung a) wird langsam zu der Lösung b) unter Rühren zugesetzt. Von der erhaltenen vereinigten Lösung werden gleiche Mengen von jeweils 4,0 ml in Ampullen von 10 ml Inhalt gegeben, gefroren und 36 Stunden lang bei einem Einstellpunkt von 30 "C lyophilisiert. Sodann werden die Ampullen in trockener Stickstoffatmosphäre verschlossen. Jede Ampulle wird mit 10 ml einer 0,1 n-Salzsäure wiederhergestellt, wobei die Extinktion bei 500 nm 1,34010,010 beträgt, was 540 Internationale Einheiten Lactat-Dehydrogenase-Aktivität bei 37 "C oder aber 420 Internationalen Einheiten Creatin-Phosphokinase-Aktivität bei 30 "C entspricht.

Colorimetrischer Versuch für Serumlactat-Dehydrogenase Die Reagentien für den Versuch werden wie folgt hergestellt:
Farbreagens: 50 mg INT werden in ungefähr 15 ml Wasser unter längerem Schütteln gelöst, bis die Lösung vollständig eingetreten ist. Sodann werden 125 mg Nikotinamid-Adenindinucleotid hinzugefügt und gelöst gefolgt von der Zugabe von 12,5 mg Phenazin-Methosulfat. Die Lösung wird mit den Waschwässern sofort in eine 25 ml volumetrische Flasche mit geringer actinischer Wirkung eingebracht und mit Wasser bis zur Marke verdünnt.

Pufferlösung: 1,0 g äthoxylierter Oleylalkohol (Lipal 10-OA, Drew Chemical Co., Boonton, N. J.) wird in 10 ml Wasser durch Erhitzen auf ungefähr 95 "C gelöst. Die Lösung wird mit Wasser auf 50 ml verdünnt und sodann werden 12,1 g Tris dazugegeben. Der pH-Wert wird auf 8,2 mittels 3 n-Salzsäure eingestellt und das Ganze sodann auf 100 ml aufgefüllt.

Substratreagens: (0,1 m-L(+)lactat) 5,0 ml einer 200/obigen L(+SMilchsäurelösung werden zu ungefähr 50 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wird auf 5,5 mittels 1 n-Natronlauge eingestellt und das Ganze mit Wasser auf 120 ml aufgefüllt. Die Lösung wird mit einigen Tropfen Chloroform gesättigt.

Kontrollregeans: 0,2 g Kaliumoxalat und 0,2 Äthylendiamintetraessigsäure-Dinatriumdihydrat werden in 100 ml Wasser gelöst. Die oben genannten Zubereitungen sind in Babson et al. Clin. Chim. Acta 12: Seite 210 bis 215(1965) beschrieben.

Verfahren: 0,1 ml Serum und 0,2 ml Pufferreagens werden in jeweils 2 Reagensgläser pipetiert.0,5 ml Substrat werden in das eine Reagensglas gegeben und 0,5 ml der Kontroll-Rea genslösung in das andere Reagensglas. Beide Reagensgläser werden gemischt und auf 37 "C erwärmt. In genau gemessenen Abständen werden in beide Reagensgläser jeweils 0,2 ml Farbreagens zugesetzt und der Inhalt der Reagensgläser wiederum gemischt und das Ganze sofort wieder in das Wasserbad gestellt. Genau 5 Minuten nach Zugabe des Farbreagens werden in beide Reagensgläserjeweils 5 ml 0,1 n-Salzsäure gegeben und erneut gemischt. Die Differenz bei der Extinktion zwischen dem Kontrollreagensglas und dem Reagensglas mit der Serumprobe, bestimmt bei 500 nm innerhalb 20 Minuten, beträgt 0,67.

Diese Extinktion wird mit dem gefärbten Bezugs Standard aus Beispiel 1 verglichen, welches eine Extinktion von 1,34010,010, was 540 Internationalen Einheiten Lactat-Dehydrogenase-Aktivität entspricht, aufweist. Die Lactat-Dehydrogenase-Aktivität in dem Serum wird bestimmt und ergibt 270 Internationale Einheiten bei 37 "C.

Claims

PATENTANSPRÜCHE 1. Gefärbtes Bezugs-Standard für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1-(pjod- phenylf54p-nitrophenylf3-phenylformazan gebildet wird, aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wässrige Lösung von a) 0,001 bis 0,020 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)3-phenylformazan; b) 0,01 bis 0,10 Gew.-0/o Serumalbumin; c) 2 bis 10 Gew.-0!o der Lösungsmittel N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxyd; und d) 2 bis 10 Gew.-0!o Isopropylalkohol enthält, wobei die Mengenangaben sich auf das Gewicht der Gesamtlösung beziehen, und ein Extinktionsmaximum bei 500 nm aufweist.
2. Gefärbtes Bezugs-Standard nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es 5 bis 20 Gew.-% eines inerten Quellmittels in wässriger Lösung enthält.
3. Gefärbtes Bezugs-Standard nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Lösung von a) 0,005 bis 0,015 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)- 3-phenylformazan; b) 0,02 bis 0,075 Gew.- /0 Serumalbumin; c) 2 bis 10 Gew.-0/c N,N'-Dimethylformamid; d) 2 bis 10 Gew.-O/o Isopropylalkohol; und e) 8 bis 14 Gew.-0!o Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10 000 enthält.
4. Gefärbtes Bezugs-Standard nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wässrige Lösung von a) etwa 0,0123 Gew.-O/o 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3- phenylformazan; b) etwa 0,0563 Gew.-0!o Rinderserumalbumin; c) etwa 2,5 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid; d) etwa 7,5 Gew.-0/o Isopropylalkohol; und e) etwa 9 Gew.-% Dextran mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10000 enthält und diese Lösung eine Extinktion bei 500 nm, was einem Äquivalent von ungefähr 1,34 entspricht, aufweist.
5. Verfahren zur Herstellung eines gefärbten Bezugs-Standards für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phe- nylformazan gebildet wird, aufweisen, nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man a) 0,001 bis 0,020 Gew.-0/c I-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenylt 3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2 bis 10 Gew.-O/o der Lösungsmittel N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxyd enthält, vollständig löst; b) 2 bis 10 Gew.-0/o Isopropylalkohol langsam zu der Lösung a) gibt und sorgfältig mischt; c) 0,01 bis 0,10 Gew.- /0 Serumalbumin in 80 bis 95 Gew.-0/o Wasser löst;

und d) die Lösung b) zu der Lösung c) langsam unter Rühren hinzufügt, wobei sich die Mengenangaben auf die Gesamtlösung beziehen.
6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Stufe c) 5 bis 20 Gew.-% eines inerten Quellmittels in dem Wasser zusätzlich mit dem Serumalbumin löst, und man in der Stufe d) die Lösung b) langsam unter Rühren zu der Lösung c), welche das Quellmittel und das Serumalbumin enthält, hinzufügt.
7. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Verfahrensstufe a) 0,005 bis 0,015 Gew.-0/o lAp-Jodphenylp5Ap-nitrophenyl)-3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2 bis 10 Gew.-0/o N,N'-Dimethylformamid enthält, löst; und man in der Stufe c) 0,02 bis 0,075 Gew.-0/c Serumalbumin zusätzlich zu 8 bis 14 Gew.-% eines Dextran-Quellmittels mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10 000, hinzufügt.
8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Verfahrensstufe a) etwa 0,0123 Gew.-% 1Xp-JodphenylS5Ap-nitrophenyl)-3-phenylformazan in einer wässrigen Lösung, welche 2,5 Gew.-0/o N,N'-Dimethylformamid enthält, löst, in Stufe b) etwa 7,5 Gew.-0/o Isopropylalkohol zusetzt und in Stufe c) 9 Gew.-0/o Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 und 0,0563 Gew.-% Rinderserumalbumin in 90 Gew.-% Wasser löst.
9. Verwendung des gefärbten Bezugs-Standards nach den Patentansprüchen 1 und 2 zur Herstellung eines stabilen Produktes, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung lyophilisiert.
10. Verwendung nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Bezugs-Standard gemäss Patentanspruch 3 verwendet.
11. Verwendung nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Bezugs-Standard gemäss Patentanspruch 4 verwendet.

Die Erfindung betrifft ein gefärbtes Bezugs-Standard für diagnostische Bestimmungen, welche enzymatische Reaktionen, bei denen 1Ap-Jodphenyl)-5Ap-nitrophenyl)-3-phenylforma- zan gebildet wird, aufweisen, sowie das Verfahren zu seiner Herstellung, sowie seine Verwendung zur Herstellung eines lyophilisierten Produktes.

Methoden zur quantitativen Bestimmung gewisser Enzyme basieren auf der Produktion von reduziertem Nikotinamid Adenindinucleotid (NADH) oder reduziertem Nikotinamid Adenindinucleotidphosphat (NADPH) als Ergebnis der enzymatischen Reaktion auf einem Substrat. Das NADH oder im Wechsel NADPH reduziert farbloses 2-(p-Jodphenyl)-3 < p- nitrophenyl > 5-phenyltetrazoliumchlorid (im allgemeinen unter der Bezeichnung INT bekannt) in Gegenwart eines Elektronenträgers, beispielsweise Phenazin-methosulfat, zu 1(pJodphe- nyl)-5-(p-nitrophenylS phenylformazan für gewöhnlich unter der Bezeichnung INT-Formazan bekannt), welches hellrot ist und spektrofotometrisch gemessen werden kann.

Die Konzentrationen des Enzyms werden derart bestimmt, dass man gleichzeitig neben der Testreaktion einen Versuch mit einer Bezugsprobe durchführt, wobei letztere bekannte Enzymmengen besitzt und man die spektrofotometrischen Werte der zu bestimmenden Probe mit denen der Bezugsprobe vergleicht.

Repräsentative enzymatische Bestimmungen, bei denen die oben beschriebene Methode im allgemeinen beschrieben ist, finden sich in folgenden Schriften: Babson, A. L. and Phillips, G. E., A Rapid Colorimetric Assay for Serum Lactic Dehydrogenase , Clin. Chim. Acta 12,210-215(1965); Van Der Veen et al., Isoenzymes of Creatine Phosphokinase in Tissue Extracts and in Normal and Pathological Sera , Clin. Chim. Acta 13, 312-316 (1966); and Nachlas, M. M., et al., The Determination of Lactic Dehydrogenase with a Tetrasodium Salt , Anal. Bio chem.,1,317-326 (1960).

Die Genauigkeit der Ergebnisse bei der Anwendung der oben genannten Methoden zur Bestimmung enzymatischer Aktivitäten hängt in einem weiten Mass von der Herstellung und der Stabilität der Bezugsprobe ab, welche eine bekannte Enzymmenge enthält, mit der die Ergebnisse der Testprobe verglichen werden. Darüber hinaus bedeuten diese enzymatischen Testmethoden eine doppelte Arbeit, da in jedem Falle der Test selber ebenso auf der Bezugsprobe wie auf der unbekannten Probe laufen muss. Solch ein Doppelversuch erfordert eine sehr umfangreiche Kontrolle, um sicherzugehen, dass **WARNUNG** Ende CLMS Feld konnte Anfang DESC uberlappen**.