CH618421A5 - Process for the preparation of a polypeptide. - Google Patents

Description

  
 

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   PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptides der Formel
EMI1.1     
  -Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu    -His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-     -Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2 (I) wobei alle Aminosäuren in L-Form vorliegen, oder dessen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man Aminosäuren und/oder Peptide durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I umsetzt und die Disulfidbrücke durch Oxidation der Mercaptogruppe in einer beliebigen Stufe des Aufbaues der Peptideinheit bildet,
2.

  Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminosäure und ein Peptid mit zwei bis vier Aminosäuren durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I umsetzt und die Disulfidbrücke durch Oxidation der Mercaptogruppe in der Stufe des Aufbaues der Peptideinheit, welche zwei L-Cysteinyl-Einheiten enthält, bildet.



   3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminosäure und ein Peptid mit zwei bis vier Aminosäuren durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I umsetzt und die Disul   fidbrücke    durch Oxidation der Mercaptogruppe in der Stufe des Aufbaues der Peptideinheit, welche zwei L-Cysteinyl-Einheiten enthält, bildet und anschliessend in der obigen Formel I die Schutzgruppen von der Verbindung entfernt, in welcher mindestens eine Aminogruppe oder Carboxylgruppe durch eine mittels Säure entfernbare Schutzgruppe geschützt ist.



   4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminosäure und ein Peptid mit zwei bis vier Aminosäuren durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I umsetzt und die Disulfidbrücke durch Oxidation der Mercaptogruppe in der Stufe des Aufbaues der Peptideinheit der Formel
EMI1.2     
 bildet und anschliessend in der obigen Formel I die Schutzgruppe von der Verbindung, in welcher mindestens eine Aminogruppe oder Carboxylgruppe durch eine mit Säure entfernbare Schutzgruppe geschützt ist, entfernt.



   5. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktionsfähigen Gruppen, die nicht an der Umsetzung teilnehmen, vorübergehend geschützt werden.



   Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptides der Formel
EMI1.3     

9 10 11 12 13 14 15   1o       -Leu-ly-Lp-Leu-Ser-ln-lu-Leu-   
17 18 19   2n      2t    22   23    24   -Eis-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-   
25 26 27 28 29 30 31 32   -Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Oly-Thr-Pr-o-  -NH2 (1)    wobei alle Aminosäurereste in L-Form vorliegen oder deren Säureadditionssalze.



   Das Polypeptid der Formel I weist eine, den Calciumgehalt des Serums herabsetzende Wirksamkeit auf, und aufgrund von Versuchen an Ratten wurde festgestellt, dass es eine Wirksamkeit von 3700 bis 6000 MRC-Einheiten an dieser Wirksamkeit aufweist. Es weist eine Wirksamkeit von 15mal höher als diejenigen von menschlichem Calcitonin und Schafs-Calcitonin und 20mal höher als diejenige von Schweine- oder Rinder-Calcitonin auf. Diese Wirksamkeit ist mindestens so hoch als diejenige des am wirksamsten bekannten Salm-Calcitonins.



   Diese neue Verbindung ist dank ihrer Wirksamkeit ein wertvolles therapeutisches Mittel. Die neue Verbindung ist nützlich für die Herabsetzung des Calciumgehaltes im Serum bei Krankheiten wie Hypercalcaemie, endogenem Calcitonin Mangel hervorgerufen durch Dysthroidismus oder Hyperpa   rathyroidismus.   



   Die neue Verbindung kann ferner für eine calciumerfordernde Osteopathie verwendet werden, z.B. bei Osteoporose, Osteomalazie, Knochenbrüchen, fibröser Dysplasie der   Kno-    chen oder Rachitis, hervorgerufen durch Corticosteron-Therapie oder Inaktivierung nach Menopause oder äusserer Verletzung, insbesondere zur kombinierten Therapie mit Calcium oder Phosphor. Die neue Verbindung kann ferner für die Theraphie der Paget-Krankheit eingesetzt werden. Ausserdem kann sie für die Therapie oder die Verhütung von Peptin-Geschwüren verwendet werden. Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung ist stabiler in Serum, Leber oder Nieren als die bekannten Calcitonine.



   Die Synthese kann nach üblichen Peptid-Synthesemethoden erfolgen, d.h., dass Aminosäuren und/oder Peptide durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I miteinander umgesetzt werden und die Disulfidbrükke durch Oxidation von Mercaptogruppen beim Aufbau der Peptideinheit gebildet werden. Falls erwünscht, kann das erhaltene Produkt in ein Säureadditionssalz oder einen Komplex umgewandelt werden.



   Die Schutzgruppen bei der Herstellung von Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukten sind die üblichen Schutzgruppen für die Peptid-Synthese und sie sollten durch Hydrolyse, Säurezersetzung, Reduktion, Aminolyse, oder Hydrazinolyse leicht abspaltbar sein.



   So wird z.B. die Aminogruppe üblicherweise durch eine Acylgruppe, wie die Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl- oder 2,4-Dinitrophenylsulfenylgruppe, eine Aralkylgruppe, wie die Benzyl-, Diphenylmethyl- oder Triphenylmethylgruppe (diese Gruppen können durch niedere Alkoxygruppen, z.B.

   o-Methoxy oder p-Methoxy substituiert sein), eine Benzyloxycarbonylgruppe, wie die   B enzyloxycarbonyl-,    o-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, o-Chlorbenzyloxycarbonyl-,   p-Nitrobenzyloxycarbonyl-,    p-Methoxybenzyloxycarbonyl-,   p-Phenylazo-benzyloxyzarbonyl-    oder p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, eine aliphatische Oxycarbonylgruppe, wie die Cyclopentoxycarbonyl-, Trichlor äthyloxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyloder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe, oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe, wie die 2-Phenylisopropoxycarbonyl-, 2-Tosyl-isopropoxycarbonyl-   oder 2-pDiphenyl-isopropoxy-    carbonylgruppe aufgespalten. Diese Aminogruppe kann geschützt werden durch Umsetzung mit einem 1,3-Diketon, wie z.B.

  Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, unter Bildung eines Enamins.



   Die Carboxylgruppe kann geschützt werden durch Bildung eines Amides, eines Hydrazides oder eines Esters. Die Amidgruppe kann z.B. eine   3,4-Dimethoxybenzyl-    oder Bis-(p -methoxyphenyl)-methylgruppe sein. Die Hydrazidgruppe kann z.B. eine Benzyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, Trifluoracetyl-, t-Butoxycarbonyl-, Trityl- oder 2-p-Diphe  



  nyl-isopropoxycarbonylgruppe sein. Die Estergruppe kann erhalten werden durch Umsetzung mit einem Alkanol, wie Methanol, Äthanol, t-Butanol oder Cyanomethylalkohol, einem Aralkanol, wie Benzylalkohol, p-Brombenzylalkohol,   p    Chlorbenzylalkohol,   p-Methoxybenzylalkohol,    p-Nitrobenzylalkohol, 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, Benzhydrylalkohol, Benzoylmethylalkohol,   p-Brombenzoylmethylalkohol    oder p-Chlorbenzoylmethylalkohol, einem Phenol, wie 2,4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol oder p-Methansulfonylphenol, oder einem Thiophenol, wie Thiophenol, Thiocresol oder o-Nitrothiophenol. Die Hydroxygruppe in Serin, Threonin oder Tyrosin kann durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden.

  Eine durch Veresterung geschützte Gruppe ist z.B. eine niedere Alkanoylgruppe, wie die Acetylgruppe, eine Aroylgruppe, wie die Benzoylgruppe, oder eine Gruppe abgeleitet von einem Carbonyl, wie z.B. die Benzyloxycarbonyl- oder Äthoxycarbonylgruppe. Eine durch Verätherung geschützte Gruppe ist z.B. die Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder t-Butylgruppe. Der Schutz der Hydroxygruppe kann durch die 2,2,2   -Trifluor-l-t-butyloxycarbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Tri-      fluor- 1 -benzyloxycarbonylaminoäthylgruppe    erfolgen. Diese Hydroxygruppen brauchen jedoch nicht immer geschützt zu werden.



   Die Mercaptogruppe in Cystein kann z.B. mittels Acylierung oder Alkylierung geschützt werden. Eine durch Acylierung geschützte Gruppe ist z.B. die Acetyl-, Äthoxycarbonyl-, Benzoyl-, Äthylcarbamoyl-, Benzyloxycaronyl- oder substituierte Benzyloxycarbonylgruppe. Eine durch Alkylierung geschützte Gruppe ist   z.B.    die t-Butyl-, Acetoamidmethyl-, Benzylthiomethyl- oder Benzylgruppe, oder eine Arylmethylgruppe, wie die 3,4-Dimethylbenzyl-,   p- Methoxybenzyl-,    Diphenylmethyl-, Dimethoxybenzylhydryl- oder Tritylgruppe, eine Phenylcyclohexyl- oder Thienyl-2-cyclohexylgruppe. Die Aminogruppe oder Guanidinogruppe in Arginin kann durch die Nitro-, Tosyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützt werden, jedoch braucht die Guanidinogruppe nicht unbedingt geschützt zu werden.

  Die Iminogruppe in Histidin kann geschützt werden durch die Benzyl-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, Admantyloxycarbonyl-,   2,2,2-Tnfluor-1      -t-butyloxycar-      b onylaminoäthyl    oder   2,2,2-Trifluor- 1    -benzyloxycarbonylaminoäthylgruppe, jedoch braucht diese Iminogruppe nicht immer geschützt zu werden.



   Die als Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte dienenden Peptide werden durch Kondensation von Aminosäuren oder Peptiden von zwei bis vier Aminosäuren in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz von Formel I hergestellt, und das Peptid, welches   l-Cysteinylgruppen    enthält, wird hergestellt durch Bildung der Disulfidbindung während der Peptidherstellung. Beispielsweise wird eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter   o-Aminogruppe    und aktivierter endständiger Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid, welches eine freie   el-Aminogruppe    und eine geschützte endständige Carboxylgruppe aufweist umgesetzt.

  Andererseits wird eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter   z-Ami-    nogruppe und geschützter endständiger Carboxylgruppe umgesetzt mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier endständiger Carboxylgruppe und geschützter   (X-Aminogrup-    pe.



   Die obgenannte Carboxylgruppe kann aktiviert werden, z.B. durch ein Säureazid, ein   Säureanhydrid,    ein Säureimidazolid oder einen aktiven Ester, z.B. durch Umwandlung in einen Cyanomethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, p-Methansulfonylphenylester, Thiodylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester,   2,4,6-Tdchlorphenylester,    Pentachlorphenylester, N-Hydroxyphthalimidester,   8-Hydroxypipeddinester    oder N-Hydroxypiperidinester, oder ein Carbodiimid,   N,N'-Carbonyl-diimid-    azol oder ein Isoxazoliumsalz, wie Woodward-Reagens.



   Die obgenannte Carboxylgruppe kann auf übliche Weise aktiviert werden, z.B. mit Säureazid, Säureanhydrid, aktivem Ester oder Carbodiimid.



   Bei der Kondensation sollte eine Razemisierung sorgfältig vermieden werden. Die gebildete Disulfidbindung kann in verschiedenen Stufen des Herstellungsverfahrens die Tendenz aufweisen, aufgespalten zu werden. Daher sollte sie vorzugsweise so spät wie möglich im Laufe der Synthese gebildet werden. Die Disulfidbindung kann vorzugsweise bei der Reaktionsstufe des Peptides, welches keine Cysteingruppe enthält, z.B. geschütztes Tricosa-Peptit-Amid (No. 10-32) oder geschütztes Decosa-Peptid-Amid (No. 11-32) mit einem anderen Peptid, welches eine Cysteingruppe enthält, z.B. geschütztes Nonapeptid (No. 1-9) oder geschütztes Deca-Peptid (No.



  1-10) gebildet werden. Die Bildung der Disulfidbindung wird vorzugsweise durch Oxidieren des geschützten Peptides, welches freie Mercaptogruppen enthält, mit Jod in Eisessig, Dijodäthan in einem organischen Lösungsmittel oder Sauerstoff in Wasser vom pH 6,5 oder Wasserstoffperoxid durchgeführt.



  Eine geschützte Mercaptogruppe, die z.B. durch Trityl- oder eine Acetamidgruppe geschützt ist, kann gebunden werden, indem gleichzeitig die Schutzgruppe durch Behandlung mit Jod in Methanol entfernt wird.



   Wenn die Synthese des neuen Polypeptides nach der Festphasenpeptid-Synthese von Meryfield erfolgt, kann die Hydroxygruppe in Serin, Threonin und Tyrosin durch die Benzylgruppe geschützt werden; die Mercaptogruppe in Cystein kann durch die Acetamidmethyl-, Benzyl-, 3,4-Dimethylbenzyloder p-Methoxybenzylgruppe geschützt werden; die Iminogruppe in Histidin kann z.B. durch die l-Benzyloxycarbonyl   amino-2,2,2-tnfluoräthylgruppe    geschützt werden; die Guanidingruppe in Arginin kann durch die Nitrogruppe geschützt werden und die Seitenkette in Glutaminsäure kann durch die Benzylestergruppe geschützt werden. Eine Schutzgruppe für die    < x-Aminogruppe    ist z.B. die t-Butyloxycarbonyl-, o-Chlorbenzyloxycarbonyl- oder o-Brombenzyloxycarbonylgruppe.



   Das geschützte Peptid kann vom Trägerharz entfernt und die Schutzgruppe mit wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt werden.



   Die einstufige Entfernung aller Schutzgruppen durch Hydrolyse unter Verwendung von Trifluoressigsäure kann durchgeführt werden, wenn die t-Butoxycarbonylgruppe zum Schutz der Aminogruppe, der t-Butylester für den Schutz der Carboxylgruppe in der Seitenkette, der t-Butyläther für den Schutz der Hydroxylgruppe in Serin, Threonin und Tyrosin und 2,2,2   -Trifluor-l-t-butoxycarbonylaminoäthylgruppe    für den Schutz der Iminogruppe in Histidin verwendet werden. Wenn das geschützte Dotriacontapeptid hergestellt wird unter Verwendung der Schutzgruppen, welche mittels Trifluoressigsäure entfernt werden können, wird die Mercaptogruppe vorzugsweise durch die Acetamidmethyl-, Benzyl-, 3,4-Dimethylbenzyl-,   p-Meth-    oxybenzyl- oder Tritylgruppe geschützt. 

  Die Acetamidmethyloder Tritylgruppe kann mit Quecksilberacetat und Schwefelwasserstoff in einem organischen Lösungsmittel vom geschützten Peptid abgespalten werden, und die Benzyl-, 3,4-Dimethylbenzyl- oder   p-Methoxybenzylgruppe    kann selektiv mit Natrium oder Wasserstoffluorid in flüssigem Ammoniak entfernt werden.



   Vorzugsweise wird das Fragment, bestehend aus der 1. bis zur 7-12. Aminosäuresequenz mit endständigem Stickstoff mit dem restlichen Peptid, bestehend aus der 8-32., bzw. 9-32., 10-32., 11-32., 12-32. oder 13-32. Aminosäuresequenz kondensiert. Das genannte Fragment bestehend aus 1. bis 7-12. Aminosäuresequenz mit endständigem Stickstoff kann auch mit dem Fragment bis zu der 23. Aminosäuresequenz kondensiert, und das derart gebildete Tetracosapeptid kann mit dem Nona  peptid, bestehend aus der 24-32. Aminosäuresequenz kondensiert werden.



   Diese Kondensationsreaktion kann nach der Azid-Methode durchgeführt werden, ausgehend von dem Peptid, welches eine endständige Azid- oder Hydrazidgruppe aufweist. Vorzugsweise kann sie auch durchgeführt werden nach der Methode ausgehend von dem Peptid mit freier endständiger Carboxylgruppe, der sogenannten Wünsch-Methode oder analogen Methoden.



   Ein Fragment mit endständigem Stickstoff wie das Decapeptid, bestehend aus der 1. bis 10. Aminosäuresequenz, das Heptapeptid 1-7, das Octapeptid 1-8, das Nonapeptid 1-9, das Undecapeptid 1-11 oder das Dodecapeptid 1-12 können nach demselben Verfahren hergestellt werden.



   Die Decapeptidsequenz kann hergestellt werden durch Verbindung der Aminosäuresequenz von 1-5 mit 6-10, Sequenz 1-6 mit 7-10 oder Sequenz 1-4 mit 5-10. Die anderen Fragmente, bestehend aus verschiedenen Aminosäuresequenzen können selbstverständlich für diese Synthese verwendet werden. Zum Beispiel kann das genannte Peptid hergestellt werden durch Kondensation von der 1. Aminosäureeinheit mit der 2-10. Aminosäuresequenz. Die Fragmente können hergestellt werden durch Verbindung der Aminosäuren und/ oder niederen Peptideinheiten über das endständige C. Eine Schutzgruppe für die Alpha-Aminogruppe in Cystein ist vorzugsweise eine Gruppe, welche abgespalten werden kann durch Säurezersetzung, z.B. eine t-Butoxycarbonylgruppe.



  Gleichzeitig wird vorzugsweise eine Schutzgruppe an der Mercaptogruppe abgespalten. Beispiele einer solchen   Schutzgrup    pe ist die Acetamidmethyl-, Benzyl-, 3,4-Dimethylbenzyl-, p-Methoxybenzyl- oder Tritylgruppe. Bei der Kondensation nach der Azid-, aktiver Ester- oder Säureanhydrid-Methode braucht die endständige Carboxylgruppe im Decapeptid nicht unbedingt geschützt zu werden. Die Carboxylgruppe kann auch durch Veresterung, z.B. mit Methanol, Benzylalkohol oder einem anderen Alkohol geschützt werden. Die Estergruppe, z.B. die Methylestergruppe, kann mit verdünnter Natriumhydroxidlösung oder durch Umwandlung in die Hydrazidgruppe entfernt werden, und die Benzylestergruppe kann durch katalytische Hydrierung entfernt werden.

  Die Aminogruppe des Zwischenproduktes wird durch übliche Schutzgruppen, wie die Benzyloxycarbonyl-, Trityl-, t-Butoxycarbonyl- oder 2-p-Diphenylisopropoxycarbonylgruppe geschützt.



  Die Carbonylgruppe kann, falls erforderlich, durch übliche Veresterung geschützt werden. Die Hydroxylgruppe in Serin und Threonin kann, falls notwendig, durch Verätherung unter Verwendung von t-Butanol, Benzylalkohol oder einem anderen Alkohol geschützt werden.



   Die genannten Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzylesterund Benzylestergruppen können durch katalytische Hydrierung in Gegenwart von Palladium/Kohle abgespalten werden.



  Die N-Tritylgruppe wird im allgemeinen mit wässriger Essigsäure abgespalten, und die t-Butoxycarbonylgruppe kann mit Trifluoressigsäure zersetzt werden. Die   o-Nitrophenylsulfenyl-    gruppe kann mit Chlorwasserstoff, Cyanwasserstoff oder schwefeliger Säure in einem organischen Lösungsmittel abgespalten werden. Die Diphenylisopropoxycarbonylgruppe kann mit einem Gemisch von Essigsäure-Ameisensäure-Wasser   (7:1:    2) abgespalten werden. Der Methylester, Äthylester oder p-Nitrobenzylester kann unter Verwendung von Hydrazinhydrat in das entsprechende Hydrazin umgewandelt werden. Die Methylestergruppe kann mit verdünnter Natriumhydroxidlösung entfernt werden, und die t-Butylestergruppe kann mit Trifluoressigsäure abgespalten werden. Die   S-Trityl-    gruppe kann mit Quecksilberacetat und Schwefelwasserstoff entfernt werden.

  Die S-Benzylgruppe kann mit Natrium in flüssigem Ammoniak entfernt werden und gleichzeitig kann die p-Nitrobenzylestergruppe, falls vorhanden, abgespalten werden. Die Bildung der Disulfidbrücke kann wie oben beschrieben erzielt werden.



   Ein Peptid mit C-Endung bestehend aus der Aminsäuresequenz No. 8 bis 13-32., welches mit dem oben genannten Nendständigen Peptid kondensiert wird, wird vorzugsweise hergestellt durch Verbindung der C-endständigen 17-32. Aminosäuresequenz mit der 8. bis 13-16. Aminosäuresequenz, z.B.



  mit der 8-16., 9-16., 10-16., 11-16., 12-16. oder 13-16. Aminosäuresequenz. Dieses Peptid kann auch hergestellt werden durch Verbindung der Aminosäure mit endständigem C (Aminosäure   No. 32),    oder dem C-endständigem Fragment,   zB.   



  dem Peptid der Aminosäuresequenz 31-32., 29-32., 27-32., 26-32., 25-32. oder 24-32. mit einer Aminosäure oder einem niederen Peptid bestehend aus 2 bis 4 Aminosäuren in der Reihenfolge der restlichen Aminosäuresequenz. Zum Beispiel kann das C-endständige Fragment 11-32. hergestellt werden durch Kondensation von Aminosäuren, wie Prolinamid, Threonin, Aspartinsäure, Arginin, Glutamin oder Glutaminsäure und einen niederen Peptid, z.B. das Dipeptid 29-30, das Dipeptid 27-28, das Tripepdid 21-23., das Tetrapeptid 16-19.



  und das   Tripeptid    11-13. in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz von der C-endständigen Seite, durch die aktive Ester
Methode oder die Geiger-Methode. Bevorzugte Schutzgruppen für jede Gruppe sind:   a-Aminogruppe    durch t-Butoxycarbonylgruppe; Carboxylgruppe in der Seitenkette durch Benzylestergruppe; E-Aminogruppe durch o-Chlorbenzyloxycarbonyl- oder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe; Hydroxylgruppe in Serin, Threonin und Tyrosin durch die Benzylgruppe; und die Aminogruppe in der Guanidingruppe von Arginin sowie die Iminogruppe von Histidin durch die Tosylgruppe.



   Das obgenannte C-endständige Fragment von der 8. bis
13-16. Aminosäuresequenz kann durch Kondensation der Aminosäuresequenz von 8-13., 9-13. oder 10-13. mit   dejeni-    gen von 14-16. erhalten werden, oder durch Kondensation der Aminosäuresequenz von 8-12., 9-12. oder 10-12. mit derAminosäuresequenz von 13-16. hergestellt werden. Dieses Fragment wird verwendet für die Kondensation mit dem Fragment der weiteren Aminosäuresequenz, z.B. das Hexadecapeptid oder ein Fragment davon, wie weiter unten erklärt. Die Gamma-Carboxylgruppe in Glutaminsäure kann durch die t-Butylestergruppe geschützt werden. Die a-Aminogruppe in Lysin kann vorzugsweise durch die t-Butoxycarbonylgruppe geschützt werden. Die Hydroxylgruppe in Serin kann durch die t-Butyläthergruppe geschützt werden, doch braucht sie nicht unbedingt geschützt zu werden.



   Die Aminosäuresequenz des 17-32. Fragmentes kann auf verschiedene Weise hergestellt werden. Dieses Fragment wird vorzugsweise durch Kondensation des Nonapeptidamides bestehend aus der 24-32. Aminosäuresequenz mit dem vorstehenden Heptapeptid bestehend aus der 17-23. Aminosäuresequenz oder durch Kondensation dieses Nonapeptides mit dem Fragment von 20-23. oder 21-23. Aminosäuresequenz gefolgt durch die Kondensation der restlichen vorstehenden Aminosäuresequenz hergestellt. Dieses Heptapeptin kann vorzugsweise durch Kondensation des Tripeptid 17-17. oder Tetrapepdid 17-20. Aminosäuresequenz mit dem restlichen Aminosäurefragment bis zur 23. Aminosäure nach der Azid-Methode gebildet werden. Die   o-Aminogruppe    in diesen Aminosäuren kann mit der Benzyloxycarbonylgruppe geschützt werden, und die e-Aminogruppe wird mit der t-Butoxycarbonylgruppe geschützt. 

  Die Hydroxylgruppe in Threonin und Tyrosin brauchen nicht unbedingt geschützt zu werden, werden aber vorzugsweise mit der t-Butyläthergruppe geschützt. Die Hydroxylgruppe in Tyrosin wird gleichzeitig mit der   c-Aminogruppe    durch Benzyloxycarbonylgruppen geschützt, und diese Schutzgruppen können durch Hydrierung entfernt werden.



   Das obgenannte Nonapeptid der 24-32. Aminosäuresequenz wird vorzugsweise hergestellt durch Kondensation des   Tripeptidamins 30-32., Tetrapeptidamins 29-32., Pentapeptidamides 28-32. und Heptapeptidamides 26-32. -Sequenz mit dem Fragment bestehend aus der obgenannten Aminosäuresequenz. Diese Kondensation kann vorzugsweise nach der Wünsch-Methode durchgeführt werden. Die y-Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch die t-Butylestergruppe geschützt.



   Die geschützte   Tricosapeptid-l0-32.-Sequenz    kann erhalten werden durch Kondensation der Aminosäuresequenz 17-32. mit dem Heptapeptidhydrazid 10-16. nach der Azid Methode.



   Eine andere bevorzugte Methode zur Herstellung der Aminosäuresequenz 10-32. geschützten Tricosapeptidamid ist die Kondensation des C-endständigen Fragmentes von 24-32. mit dem Fragment der 10-23. Aminosäuresequenz.



   Die Aminosäuresequenz vom 10-23. Fragment kann auf verschiedene Weise hergestellt werden. Die bevorzugte Herstellungsmethode ist die Kondensation des Fragmentes mit der 10-13. Aminosäuresequenz mit dem Decapeptid der
14-23. Sequenz oder die Kondensation des Fragmentes vom    10-13.    Sequenz mit dem Fragment der 14-16., 14-19. oder
14-20. Sequenz in Decapeptid, gefolgt von der Kondensation des restlichen Fragmentes bis zur 23. Aminosäuresequenz.



   Die Schutzgruppe des C-endständigen Fragmentes mit geschützten   el-Aminogruppen,    wie oben erwähnt, beispielsweise das   Tricosapeptidamid    der 10-32. Sequenz oder das Docosa peptidamid der 11-32. Sequenz, kann durch eine geeignete Methode entfernt werden. Beispielsweise wird die Tritylgruppe mit wässriger Essigsäure abgespalten. Die Diphenylisopro poxycarbonylgruppe, Benzyloxycarbonylgruppe und die t-Bu toxycarbonylgruppe können mit einem Gemisch von Eisessig, Ameisensäure und Wasser, bzw. durch Hydrierung bzw. mit Trifluoressigsäure entfernt werden.



   Die Azid-Methode oder Wünsch-Methode wird bevorzugt für die Kondensation von N-endständigen Aminosäurese quenzen mit Disulfidbrücken und mindestens einer geschützten a-Aminogruppe, z.B. das Nonapeptid der 1-9. Sequenz od. das Decapeptid der 1-10. Sequenz, mit dem obengenannten
C-endständigen Fragment, welches eine freie Aminogruppe aufweist.



   Auf diese Weise wird das Dotriacontapeptidamid mit geschützter a-Aminogruppe, geschützter   e-Aminogruppe,    gegebenenfalls geschützter Carboxylgruppe in der Seitenkette und/oder Hydroxylgruppe erhalten. Diese Schutzgruppen können auf die oben beschriebene Art abgespalten werden, so dass schliesslich das Produkt I erhalten werden kann.



   Das Dotriacontapeptidamid mit freier Mercaptogruppe kann auf dieselbe Art wie das geschützte Dotriacontapeptidamid hergestellt werden. Die Schutzgruppe für die Mercapto gruppe sollte in der letzten Stufe der Herstellung entfernt werden, und die Disulfidbrücke wird auf die oben beschriebene Weise gebildet werden, worauf das Produkt I hergestellt werden kann.



   Das neue erfindungsgemäss hergestellte Polypeptid I kann in Form der freien Base oder deren Salze erhalten werden.



  Die freie Base kann auf einfache Weise aus dem Salz erhalten werden. Die freie Base kann in ein pharmakologisch annehmbares Salz umgewandelt werden durch Umsetzung mit einer organischen Säure,   zB.Salzsäure,    Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder einer organischen Säure, wie z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Benzoesäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure.



   Das neue Polypeptid kann auch in komplexer Form erhalten werden durch Zusatz einer anorganischen oder organischen Substanz. Diese komplexe Form wird erhalten durch Zusatz einer anorganischen oder organischen Substanz zu einem langkettigen Polypeptid und ist eine unbekannte Konstitution der Verbindung mit einer langanhaltenden Wirksamkeit nach Verabreichung. Beispiele derartiger komplexbildender Substanzen sind anorganische Verbindungen abgeleitet von Metallen, wie Calcium, Magnesium oder Zink, insbesondere die Phosphate, Pyrophosphate oder Polyphosphate dieser Metalle. Weitere Beispiele derartiger komplexbildender organischer Substanzen sind nicht antigene Gelatine, Carboxymethylzellulose, Polyglutaminsäure und dergleichen.



   Die hier verwendeten Abkürzungen weisen folgende Bedeutung auf:
BOC: t-Butoxycarbonyl
AOC: t-Amyloxycarbonyl
DIP: Diisopropylmethoxycarbonyl
Cbz: Benzyloxycarbonyl
ClCbz: o-Chlorbenzyloxycarbonyl
Bzl: Benzyl
Mbzl: p-Methoxybenzyl
Tos: Tosyl
OEt: Äthylester
OBzl: Benzylester
ONP: p-Nitrophenylester
OSU: N-Hydroxysuccinylimidester
Cys: L-Cystein    Ser:    L-Serin
Asn: L-Asparagin
Leu: L-Leucin
Thr: L-Threonin
Val: L-Valin
Pro: L-Prolin
Arg: L-Arginin
Asp: L-Asparaginsäure
Ala: L-Alanin
Gly: Glycin
Lys: L-Lysin
Gln: L-Glutamin
Glu: L-Glutaminsäure
His: L-Histidin
Tyr: L-Tyrosin
TFA: Trifluoressigsäure
TosOH: p-Toluolsulfonsäure
CHA: Cyclohexylamin
DCHA: Dicyclohexylamin
THF: Tetrahydrofuran
DMF: Dimethylformamid
AcOEt: Äthylacetat  
DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
WSC: N-Äthyl-N'-dimethylaminpropyl-carbodiimid
HOBT:   1 -Hydroxybenzotriazol   
MeOH:

  Methanol
EtOH: Äthanol
AcOH: Essigsäure.



   Die folgenden Beispiele dienen der Illustrierung der vorliegenden Erfindung.



   Die Bestimmungsmethode für die das Serumcalcium herabsetzende Wirksamkeit, der Träger und das Entwicklungssystem für Dünnschichtchromatographie und die Bedingungen für die Aminosäureanalyse sind die folgenden:
Bestimmungsmethode
Die Probe wird mit 0,1 N Natriumacetat- 0,1% Eiweisslösung adäquat verdünnt. Männliche Ratten wurden einzeln einer intramuskulären Injektion mit je 0,2 ml der zweifachen Verdünnungen unterzogen. Nach 1 Stunde wurden alle Ratten getötet, um ihr Blut zu gewinnen und der Serumcalciumwert von jeder Blutprobe wurde durch   Atomabsorptionsspektrofo    tometrie bestimmt. Andererseits wurde ein Forschungsstandard B, ein aus der Schilddrüse von Schweinen erhaltener Extrakt, derart verdünnt, dass Konzentrationen von 2,5, 5, 10 und 20 MCR   mm/0,2    ml erhalten wurden.

  Männliche Ratten wurden einer intramuskulären Injektion mit je 0,2 ml der Verdünnungen unterworfen. Nach demselben Verfahren wie oben wurde der Serumcalciumwert bei diesen Ratten 1 Stunde nach dieser Injektion bestimmt. Aus der Potenz des entsprechenden Forschungsstandards wurde die Potenz des Calcitonins in der Probe bestimmt.



   Dünnschichtchromatographie (TLC)
Träger: Silicagel G
Zellulose
Lösungsmittelsystem für das Entwickeln:
1. CHCI3-MeOH-AcOH   95:5:3   
2. CHCI3-MeOH-AcOH   85:10:5   
3. CHCI3-MeOH-AcOH   80:25:2   
4.   CHCl3-EtOH-AcOEt    5:2:5
5.   CHCl3-MeOH-AcOH-H2O 10:10: 1: 1     (untere Schicht)
6. Benzol-AcOEt   2:1   
7. n-BuOH-Pyridin-AcOH-H2O 15: 10: 3: 12
8. Methanol
9. CHCI3-MeOH-AcOH   80:15:5   
A minosäureanalyse
Eine Probe (20 Gamma) wird mit 6 N   HC1    (0,25 ml) bei   105"C    während 24 Stunden hydrolisiert und anschliessend unter vermindertem Druck getrocknet.

  Der Rückstand wird in 0,2 N Citratpufferlösung (pH 3,25, 1,2 ml) gelöst und 1 ml der erhaltenen Lösung wird der Aminosäureanalyse unterworfen.



   Beispiel 1 Herstellung von
EMI5.1     
  -Leu-Cly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu  -His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg    -Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2   
720 mg   BOC-Lys(DIP)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-      -His-Lys(DIP)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)- -Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2    wurden in 5 ml TFA   bei-5 C    gelöst. Nach 35 Minuten langem Rühren bei Zimmertemperatur wurde die Lösung im Vakuum eingeengt und mit Äthyläther versetzt, wobei ein   Nie-    derschlag entstand. Der Niederschlag wurde über Natriumhydroxid getrocknet Der getrocknete Niederschlag wurde sodann in 1 ml DMF gelöst.

  Zu dieser Lösung wurden 30 ml HOBT, 45 mg DCC und 220 mg
EMI5.2     

EMI5.3     
 -50C zugesetzt und während 2 Stunden bei   OOC    und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Zu dem erhaltenen Reaktionsgemisch wurde Wasser zugesetzt. Der derart gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, und mit Wasser und Acetylacetat gewaschen und anschliessend im Vakuum getrocknet, wobei 740 mg rohes Produkt erhalten wurden. Dieses rohe Material wurde sodann mit Fluorwasserstoff bei   20"C    während 1 Stunde in Gegenwart von 3 g Phenol und 2,5 g Anisol behandelt. Nach der Destillation von Fluorwasserstoff wurde der Rückstand in 200 ml 0,5 Mol Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde mit 150 ml Äthylacetat gewaschen und über eine Säule (2 x 20 cm) von  Dowex 1 x 2  (Acetatform) geleitet und das Eluat gefriergetrocknet, wobei 590 mg des Pulvers erhalten wurden.



   500 mg dieses Pulvers wurden in 50 ml Wasser gelöst, welches mit   HC1    auf pH 4,37 eingestellt worden war, und die Lösung wurde über eine Säule (2,5 x 63 cm), welche mittels 0,01 Mol Ammoniumacetat (pH 4,37) mit Carboxymethylzellulose gefüllt worden war, dann mit 4 Liter 0,01 Mol Acetatpuffer (pH 4,37) und 8 Liter 0,01 Mol Ammoniumformiat (pH 4,37) gewaschen. Anschliessend wurde die Säule nach und nach eluiert mit 12 Liter Ammoniumformiat [0,01 Mol (pH 4,37) bis 0,07 Mol (pH   6,0)1.    Das Eluat wurde in Fraktionen von je 100 ml gesammelt und aktiven Fraktionen, welche durch biologische Versuche geprüft wurden, gesammelt und gefriergetrocknet, um das aktive Pulver zu erhalten.



     5Q    mg dieses aktiven Pulvers wurden in 5 ml 0,1 N Ameisensäure gelöst, über eine Säule (1,2 x 250 cm) aus  Sephadex   G-509    geleitet und mit 0,1 N Ameisensäure bei einer Fliessgeschwindigkeit von 10 ml pro Stunde eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet, um das Produkt zu erhalten.

 

   Schmelzpunkt:   2200C (Zersetzung).   



     [a:]D20      = -750    (c = 1, 0,1 N-HCOOH).



   Wirksamkeit = 4000 MRC   p/mg.   



   Aminosäurezusammensetzung:
Cys/2 2,13 (2), Ser 2,86 (3),   Leu5,10    (5),
Thr 3,48 (4), Val 2,20 (2), Gly 3,00 (3),
Lys 1,98 (2), Glu 3,27 (3), His 0,95 (1),    Tyr0,90    (1), Pro 1,96 (2), Arg 1,03 (1),
Asp 2,07 (2), Ala 0,94 (1)
Rf-Wert = 0,65 bis 0,71,
Träger : Zellulose
Entwickler: n-BuOH - Pyridin - AcOH     - Wasser (15: 10: 3: 12)   
Ein Ausgangsmaterial wurde wie unten beschrieben hergestellt: Herstellung der Aminosäuresequenz 11-32: BOC-Lys     (DIP)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(DIP)-Leu- -Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzt)-Asp(OBzl)- -Val-Gly-Ala-Thr(Bzl)-Pro-NH2.   



   (1) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2:
BOC-Thr(Bzl)-OH (67,7 g), H-Pro-NH2-HCl (33,0 g) und HOBT (29,6 g) wurden zu THF (220 ml) zugesetzt. Zu diesem Gemisch wurde WSC (40,0 ml) unter Kühlung bei   -5"C    zugesetzt, während 1 Stunde bei dieser Temperatur gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und anschliessend Äthylacetat (800 ml) zum Rückstand zugesetzt, dann zweimal mit 1 N HCI (400 ml), zweimal mit   5%Der    Natriumbicarbonatlösung (300 ml) und mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde die organische Schicht im Vakuum eingeengt. Das erhaltene ölige Material wurde über eine Silicagelsäule (450 g) chromatographiert.

  Das Entwickeln erfolgte mit einem Gemisch von Benzol-Äthylacetat   (1:1),    Äthylacetat und Methanol in der genannten Reihenfolge und die eluierten Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie auf Silicagel geprüft.



  Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und in Äthylacetat (500 ml) gelöst und anschliessend zweimal mit   5%Der    wässriger Natriumbicarbonatlösung (300 ml) und mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit n-Hexan behandelt, um BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2 als weisses Pulver (54,5 G; Ausbeute 61,4%) zu erhalten. Rfi = 0,48,   [a]u2s      = -14,00    (c = 1, DMF).



   Elementaranalyse:   (C2lH3lNO3)    gef.: C 62,04 H 8,01 N 9,90 ber.: C 62,20 H 7,71 N 10,30  (2) Herstellung von BOC-Ala-Gly-OBZI:
BOC-Ala-OH (94,5 g), H-Gly-OBzl-TosOH (168,8 g) und HOBT (67,6 g) werden in THF (450 ml) gelöst und mit WSC (91,5 ml) versetzt. worauf das Gemisch während 1 Stunde bei   OOC    und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt wird. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Äthylacetat (800 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wird 1 N HCI (500 ml) zugesetzt, der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert und die Äthylacetatschicht mit 1 N HCI (400 ml), zweimal mit   5 XOiger    Natriumbicarbonatlösung und schliesslich mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Magnesiumsulfat wird die Lösung im Vakuum eingeengt.

  Der Rückstand wird mit n-Hexan behandelt, um ein rohes Material (152,5 g) zu erhalten. Die   Umkristallisierung    erfolgt zweimal aus Äthylacetat-n-Hexan, um BOC-Ala-Gly-OBzl (144 g, Ausbeute   85,737o)    zu erhalten. Schmelzpunkt 87 bis 88,50C, TLC: ein Fleck,   Rfi    = 0,59.



   (3) Herstellung von BOC-Ala-Gly-OH:
BOC-Ala-Gly-OBzl (101 g) wird in THF (500 ml) gelöst und in Gegenwart von 5% Palladium auf Kohle (7 g) hydriert.



  Nach 6 Stunden wird der Katalysator entfernt, die Lösung eingeengt, in THF (800 ml) gelöst, dann wiederum mit 5% Palladium auf Kohle hydriert. Nach 4 Stunden wird der Katalysator entfernt und die Lösung im Vakuum konzentriert, worauf der Rückstand durch Behandlung mit n-Hexan verfestigt wird.



  Die Umkristallisation erfolgt mit Äthylacetat-THF-n-Hexan, wobei BOC-Ala-Gly-OH (72 g, Ausbeute   97,4in)    mit einem Schmelzpunkt von 129 bis   132"C    erhalten wird. TLC: ein Fleck (Lösungsmittelsystem 2).



     [a]D28      = -8,870    (c = 1, DMF).



      Elementaranalyse: (C10H18N2O5)    gef.: C 48,80 H 7,41 N 11,29 ber.: C 48,77 H 7,37 N 11,38  (4) Herstellung von   BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2:       BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2    (10,0 g) wird zu TFA (30 ml) bei -50C zugesetzt, während 30 Minuten gerührt und anschliessend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther behandelt, filtriert und über Natrium getrocknet, um H-Thr (Bzl)-Pro-NH2 TFA zu erhalten.



   Das im obigen Abschnitt (3) erhaltene BOC-Ala-Gly-OH (6,08 g) und HOBT (3,34 g) werden in THF (100 ml) zugesetzt und diesem Gemisch WSC (4,5 ml)   bei-SOC    (pH 4,0) zugesetzt. Nach einstündigem Rühren bei   -5 C    und siebenstündigem Rühren bei Zimmertemperatur wird das Gemisch auf   -5"C    gekühlt, 0,8 ml WSC zugesetzt und der pH auf 4,0 eingestellt, worauf während 1 Stunde bei   -5 C    und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt wird und anschliessend im Vakuum eingeengt wird. Der Rückstand wird in Äthylacetat (400 ml) gelöst, mit gesättigter Natriumchloridlösung, anschliessend zweimal mit   5%Der    wässriger Natriumbicarbonatlösung (100 ml), dann mit 1 N HCI, gesättigt mit NaCI (100 ml) und schliesslich mit Wasser (50 ml) gewaschen.

  Die Äthylacetatschicht wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und die wässrige Schicht wird mit Chloroform extrahiert, zweimal mit Wasser gewaschen, um mit der Äthylacetatschicht vereinigt zu werden. Die organische Schicht wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand über Silicagel (150 g) chromatographiert. Die Säule wird mit Äthylacetat und mit Methanol behandelt. Das Methanoleluat wird im Vakuum kondensiert. n-Hexan wird zum Rückstand zugesetzt, wobei das BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 kristallisiert. Schmelzpunkt 106 bis   116"C.    Es wurden 11,5 g (Ausbeute 87,3%) erhalten. TLC: ein Fleck, Rf4 = 0,29,   Rf5    = 0,52.



   (5) BOC-Val-Gly-OEt:
BOC-Val-OH DCHa (219,2 g) wurde zu Äthylacetat (1 Liter) zugesetzt. Die Lösung wurde zweimal mit 1 N   HC1    (600 ml) und anschliessend mit Wasser (500 ml) gewaschen.



  Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde die Lösung im Vakuum eingeengt. THF (100 ml) und Dichlormethan (400 ml) wurden zum Rückstand zugesetzt, und diesem Gemisch H-Gly-OEt   HCl    (69,8 g) und Triäthylamin (70 ml) zugesetzt. DCC (103,2 g) wurde bei   -5 C    zugesetzt und das Gemisch bei   -5 C    während 1 Stunde und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Dem Reaktionsgemisch wurde sodann Essigsäure (10 ml) zugesetzt, während 1 Stunde gerührt und anschliessend filtriert. Das Filtrat wurde zweimal mit 1 N   HC1    (500 ml) sodann zweimal mit   5%Der    Natriumbicarbonat lösung (500 ml) und schliesslich mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde im Vakuum konzentriert.

  Der Rückstand wurde dreimal aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, um BOC-Val-Gly-OEt (105,4 g), Schmelzpunkt 95 bis   96"C    in einer Ausbeute von 69,7% zu erhalten.



   (6) Herstellung von BOC-Val-Gly-OH:
BOC-Val-Gly-OEt (96,8 g) wurde in Methanol (150 ml) gelöst und 1 N NaOH-Lösung (368 ml) bei   -5 C    zugesetzt. Nach einstündigem Rühren wurde der pH auf 8,0 mittels 1 N HCI eingestellt. Das Methanol wurde im Vakuum entfernt und die wässrige Schicht mit Äthyläther (100 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde sodann mit 1 N   HC1    auf pH 2,0 eingestellt und viermal mit Äthylacetat (200 ml) extrahiert. Dieser Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschliessend im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit n-Hexan behandelt und aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, um BOC-Val-Gly-OH (85,5 g, Ausbeute   97,4So),    Schmelzpunkt 112 bis 1 170C (unter Zersetzung) zu erhalten.

 

  TLC: ein Fleck, Rfi = 0,35.



   (7) Herstellung von BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl) -Pro-NH2:
BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (10,5 g) wurden zu TFA (35 ml) bei   -5 C    zugesetzt. Nach 30 Minuten langem Rühren wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äthyläther aufgenommen, das ausgeschiedene Material filtriert und im Vakuum über Natriumhydroxid getrocknet, um H-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 TFA zu erhalten. Hierzu wur  den 100 ml THF sowie   bei -5 C    Triäthylamin, um den pH auf 5,0 einzustellen.



   BOC-Val-Gly-OH (5,49 g) und HOBT (2,66 g) wurden sodann zum Gemisch zugesetzt. Zu diesem Gemisch wurde WSC (3,61 ml) tropfenweise bei   -5 C    zugesetzt und bei   -5 OC    während 1 Stunde und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand in Chloroform (300 ml) gelöst. Die Lösung wurde zweimal mit 1 N HCI, gesättigt mit NaCI (200 ml), das zweimal mit   5%Der    NaCI gesättigter Natriumbicarbonatlösung (200 ml) und schliesslich mit gesättigter   NaC1-Lösung    (75 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde die organische Schicht im Vakuum eingeengt.

  Die Umkristallisierung aus Methanol-Äthyl äther ergab   BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2    (12,0 g, Ausbeute   88,3%),    Schmelzpunkt 121 bis 1350C (Zersetzung). TLC: ein Fleck (Lösungsmittelsystem 5).



      ta]u25 = 10,300 (c = I,DMF).   



   Elementaranalyse:   (C33H51N7O9      ¸H2O)    gef.: C 56,67 H 7,43 N 13,90 ber.: C 56,72 H 7,50 N 14,03  (8) Herstellung von BOC-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly -Thr(Bzl)-Pro-NH2:
TFA (100 ml) wurde zu BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl) -Pro-NH2 (33,1 g) bei   -5 C    zugesetzt, während 30 Minuten gerührt und im Vakuum konzentriert. Dem Rückstand wurde Äther zugesetzt und das ausgeschiedene Material im Vakuum über NaOH getrocknet. Sodann wurde DMF (80 ml) zugesetzt und das Gemisch mit Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt.



  Nach dem Zusatz von HOBT (950 mg) und BOC-Asp(OBzl) -OSU (30,2 g) wurde der pH durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf pH 7,5 eingestellt und das Gemisch während 2 Tagen gerührt. Der pH wurde während dieser Zeit durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf 7,5 gehalten. Dann wurde wiederum BOC-Asp(OBzl)-OSU (2,0 g) zugesetzt, der pH mit N Methylmorpholin auf 7 eingestellt und über Nacht gerührt.



  Eine grosse Menge Wasser wurde sodann zum Reaktionsgemisch zugesetzt und die ausgeschiedene, klebrige Substanz durch Dekantieren abgetrennt, worauf sie durch Behandlung mit Äthyläther kristallisiert wurde. Die wässrige Schicht wurde mit Chloroform extrahiert und der Extrakt im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit Wasser behandelt, um eine klebrige Substanz auszuscheiden. Die ausgeschiedene klebrige Substanz wurde mit Äthyläther behandelt, um zu kristallisieren. Die Feststoffe wurden vereint und aus Methanol Äthyläther viermal umkristallisiert, mit heissem Äthylacetat Äthyläther gewaschen und schliesslich getrocknet, um BOC   -Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2    (34,2 g, Ausbeute 79,6%), Schmelzpunkt 195 bis   199"C    zu erhalten. TLC: ein Fleck. Rf5 = 0,46.



     [a]nls    =   -18,27     (c = 1, DMF).



   Elementaranalyse:   (C44H62N6O12H2O)    gef.: C 58,08 H 6,90 N 12,47 ber.: C 57,88 H 7,07 N 12,27  (9)   BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-      -Pro-NH2:   
TFA (30 ml) wurde zu BOC-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly -Thr(Bzl)-Pro-NH2 (7,2 g) bei   -5 C    zugesetzt, während 30 Minuten gerührt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit Äthyläther behandelt und das ausgeschiedene Material im Vakuum über NaOH getrocknet. DMF (15 ml) wurde sodann zugesetzt und der pH durch Zusatz von Triäthylamin auf 7,5 eingestellt. Nach dem Zusatz von HOBT (100 mg) und BOC-Thr(Bzl)-OSU (4,0 g) wurde der pH erneut mit N-Methylmorpholin eingestellt und anschliessend während 2 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt.

  Der pH wird sodann mit DMF (3 ml) und N-Methylmorpholin auf 7,5 eingestellt und über Nacht gerührt.



   Nach beendigter Reaktion wurden grosse Mengen Wasser zugesetzt und das ausgeschiedene Material abfiltriert und aus Methanol-Äthyläther dreimal umkristallisiert, um BOC-Thr   (Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2    (6,7 g, Ausbeute 77,1%) zu erhalten. Schmelzpunkt 172 bis 1880C.



  TLC: ein Fleck (Lösungsmittelsystem 2 und 5).



     [u2s    =   -13,650    (c = 1, DMF).



   Elementaranalyse:   (C55H?5NgOl4       'hH2O)    gef.: C 60,31 H 6,92 N 11,58 ber.: C 60,31 H 7,00 N 11,51  (10) Herstellung von AOC-Arg(TOS)-Thr(Bzl)-Asp   (OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2:   
TFA (20 ml) wird bei -50C zu BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)   -Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2    (6,52 g) zugesetzt, während 30 Minuten gerührt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Zusatz von Äthyläther behandelt, und die ausgefallene Substanz im Vakuum über NaOH getrocknet.



  GMF (25 ml) wurde zugesetzt und der pH durch Zusatz von Triäthylamin bei   -5 C    auf 5,0 eingestellt. Daraufhin wurde HOBT (972 mg) zugesetzt sowie AOC-Arg(Tos)-OH (3,2 g) und WSC (1,3 ml) tropfenweise zugesetzt unter Kühlung auf   -5 C,    und das Gemisch sodann während 1 Stunde   bei-5 C    und über Nacht bei Zimmertemperatur   gerührt.   



   Dem Reaktionsgemisch wurde sodann Äthylacetat zugesetzt und der entstandene Niederschlag mit heissem Methanol (400 ml) -Äthyläther (50 ml) behandelt, anschliessend mit heissem Methanol (300 ml) -Äthyläther (100 ml) behandelt, um AOC-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly -Thr(Bzl)-Pro-NH2 (7,0 g, Ausbeute 82,7%) zu erhalten.



  Schmelzpunkt 187 bis   193"C    (Zersetzung). TLC: ein Fleck (Lösungsmittelsystem 2 und 5). Rf2 = 0,42.



   Elementaranalyse:   (C69Hg5Nl3OlTS    H2O) gef.: C 57,97 H 6,88 N 12,76 S 2,26 ber.: C 58,01 H 6,84 N 12,75 S 2,24
Aminosäurezusammensetzung: NH3 1,28, Arg 0,95 (1), Asp
1,04 (1), Thr 1,50 (2), Pro 0,98 (1), Gly 1,84 (2), Ala 1,00 (1), Val 1,01(1).



   (11) Herstellung von BOC-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl:
BOC-Tyr(Bzl) OH CHA (37,6 g) wurde mit Äthylacetat (300 ml) und 1 N   HC1    (120 ml) gemischt, die Schichten sodann getrennt und die Äthylacetatschicht dreimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wurde die organische Schicht im Vakuum eingeengt und der erhaltene ölige Rückstand in Dichlormethan (80 ml) gelöst.



  Dieser Lösung wurde H-Pro-OBzl   HCI    (19,3 g) zugesetzt und anschliessend WSC (14,6 ml)   bei-5 C    zugemischt und das Gemisch während 1 Stunde bei -50C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt.



   Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand mit Äthylacetat (800 ml) und 1 N   HC1    (400 ml) geschüttelt, worauf die Äthylacetatschicht abgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde zweimal mit 1 N   HC1    (300 ml), anschliessend zweimal mit Wasser (300 ml) dann dreimal mit 5%iger wässriger Natriumbicarbonatlösung (300 ml) und schliesslich zweimal mit Wasser (300 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde sodann über Natriumcarbonat   (Natriumsulfat7.)    getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das rohe Produkt wurde über eine Silicagelsäule (400 g) chromatographiert. 

  Ein Gemisch von Chloroform und Äthylacetat (4: 1) wurde zur Eluierung verwendet, und die Eluate durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung des Lösungsmittelsystems 1 geprüft, um ein öliges BOC-Tyr(Bzl) -Pro-OBzl (43 g) zu erhalten. Rfi = 0,88.



   (12) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl:
TFA (50 ml) wurde unter Kühlung   auf -5 C    zu BOC-Tyr (Bzl)-Pro-OBzl (20 g) zugesetzt, während 10 Minuten   bei -50C    und während 50 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und die Lösung sodann im Vakuum eingeengt. Der ölige Rück  stand wurde über NaOH während einer Nacht getrocknet, anschliessend mit DMF (30 ml) versetzt und der pH durch Zusatz von Triäthylamin bei   -5 C    auf 7,5 eingestellt. HOBT (470 mg) und BOC-Thr(Bzl)-OSU   (14,2    g) wurden sodann zugesetzt und das Gemisch   bei-5 C    während 1 Stunde und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Während des Rührens wurde das Reaktionsgemisch durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf pH 7 gehalten.

  Nach 2 Tagen wurde Dimethylaminopropylamin (1 ml) zugesetzt und das Gemisch während 2 Stunden gerührt und anschliessend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Wasser (500 ml) und Äthylacetat (500 ml) geschüttelt und die Äthylacetatschicht sodann abgetrennt. Die wässrige Schicht wurde wiederum mit Äthylacetat (200 ml) extrahiert. Die Äthylacetatschichten wurden vereint, je dreimal mit 1 N   HC1,    Wasser sowie 5%iger Natriumbicarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde die organische Schicht im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde aus Äthyläther-n-Hexan kristallisiert, wobei das rohe Material   (19,6    g) erhalten wurde.

  Dieses rohe Material wurde aus demselben Lösungsmittelgemisch umkristallisiert und ergab BOC -Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl   (14,4    g, Ausbeute   54,9.      Rf3    = 0,67.



   (13) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH:
BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl   (14,2    g) wurde in THF (30 ml) gelöst und tropfenweise 1 N NaOH-Lösung (23 ml) im Laufe von 15 Minuten bei   -5 C    zugesetzt. Nach vierstündigem Rühren bei Zimmertemperatur wurde der pH mit 1 N HCI auf 7 eingestellt und das Reaktionsgemisch anschliessend im Vakuum konzentriert, um das THF zu entfernen. Die restliche Lösung wurde (Satz im englischen Text unvollständig, wird später ergänzt).



   Wasser wurde zur wässrigen Schicht zugesetzt und nach dem Waschen mit Äthyläther wurde der pH der Wasserschicht mit 1 N   HC1    auf pH 2 eingestellt und die Schicht anschliessend zweimal mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat schicht wurde mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und anschliessend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde aus Äthyläther-n-Hexan kristallisiert, um rohes Material (12 g) zu erhalten. Dieses rohe Material wurde in Äthylacetat gelöst, Äthyläther zugesetzt und die Lösung zum Kristallisieren beiseite gestellt, wobei nach und nach n-Hexan zugesetzt wurde. Es wurden 10,5 g (84% Ausbeute) BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH vom Schmelzpunkt 134 bis   136"C    erhalten. TLC: ein Fleck. Rf1 = 0,68, Rf4 = 0,63.



   Elementaranalyse:   (C37H45N3O5)    gef.: C 66,85 H 6,80 N 6,68 ber.: C 67,35 H 6,88 N 6,37  (14) Herstellung von   BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg-      (Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-    -NH2:
AOC-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly -Thr(Bzl)-Pro-NH2 (6,0 g) wurden zu TFA (20 ml) bei -50C zugesetzt, während 30 Minuten gerührt und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äthyläther behandelt und im Vakuum über NaOH getrocknet. DMF (20 ml) wurde sodann zugesetzt und nach Einstellung des pH auf 4,5 durch Zusatz von Triäthylamin bei   -5 C    wurde HOBT (851 mg) und BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH (4,2 g) zugesetzt und   WSC (1,2    ml) tropfenweise bei   -5 C    zugefügt.

  Das Rühren wurde während 1 Stunde bei   -5 C    und über Nacht bei Zimmertemperatur fortgesetzt. Methanol (300 ml) und Äthyl   äther (100    ml) wurden sodann zum Reaktionsgemisch zugesetzt und das ausgeschiedene Material abfiltriert und zuerst aus Methanol-Äthyläther, dann aus DMF-Äthyläther und schliesslich aus Methanoläthyläther umkristallisiert, um BOC   -Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-    -Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (5,8 g, Ausbeute   71,3%)    zu erhalten. Schmelzpunkt 186,5 bis   190"C    (Zersetzung). TLC: ein Fleck (Lösungsmittelsystem 2 und 5).



       [cw],zs = -15,86" (c = 1, DMF).



   Elementaranalyse: (C100H135N16O22S tH,O)    gef.: C 61,44 H 6,63 N 11,55 S 1,73 ber.: C 61,68 H 6,68 N 11,51 S 1,65
Aminosäureanalyse: NH3 1,60, Arg 0,92 (1), Asp   1,04(1),      Thr 2,1 (3), Pro 2,08 (2), 2 > 08(2) >  Gly 1,86 (2), Val 1,00 (1), Typ 0,91 (1).   



   (15) Herstellung von BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro   -Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)- -Pro-NH2:
BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl) Asp(OBzl)    -Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (5,4 g) wurde zu TFA (20 ml) bei   -5 C    zugesetzt, während 30 Minuten gerührt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit Äthyl äther behandelt und über NaOH im Vakuum getrocknet.



  DMF (18 ml) wurde sodann zugesetzt, Triäthylamin bis zum pH 7,5 beigefügt und HOBT (100 mg) sowie BOC-Gln-ONP   (1,54    g) zugesetzt und das Gemisch während 2 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt. Während des Rührens wurde der pH durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf 7,5 gehalten. Sodann wurde dem Gemisch BOC-Gln-ONP (0,2 g) zugesetzt und der pH auf 7,0 eingestellt und über Nacht gerührt. Nach beendigter Reaktion wurde eine grosse Menge Wasser zum Reaktionsgemisch zugesetzt, um das Produkt auszufällen. Das erhaltene Produkt wurde dreimal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert, um BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro   -Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-    -Pro-NH2 (4,8 g, Ausbeute   82,9in)    zu erhalten. Schmelzpunkt
178 bis   182"C.      Rf3    = 0,67.



     [ai25      = 15,190    (c =   I,DMF).   



   Elementaranalyse;   (C105H136N18O24S      2H2O)    gef.: C 59,92 H 6,56 N 12,05 S 1,47 ber.: C 59,98 H 6,71 N 11,99 S 1,53  (16) Herstellung von BOC-Lys(DIP)-Leu-OBzl:
BOC-Lys(DIP)-OH (38,9 g) und H-Leu-OBzl TosOH (43,3 g) wurden in Dichlormethan (200 ml) gelöst. WSC (20 ml) wurde   bei-5 C    zur erhaltenen Lösung zugesetzt und das Gemisch sodann bei   -5 C    während 1 Stunde und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert, sodann mit 1 N   HCI,5%iger    Natriumbicarbonatlösung und schliesslich Wasser gewaschen.

  Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde der Extrakt im Vakuum eingeengt und die ausgeschiedenen Kristalle aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, um BOC-Lys(DIP) -Leu-OBzl (52 g, Ausbeute   88,1in)    zu erhalten. Schmelzpunkt 100 bis   102"C.    TLC: ein Fleck.   Rf1    = 0,53.



   (17) Herstellung von BOC-His-Lys(DIP)-Leu-OBzl:
BOC-Lys(DIP)-Leu-OBzl   (17,8    g) wurden   bei-5 C    zu TFA (110 ml) zugesetzt. Nach 40 Minuten langem Rühren wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde über NaOH im Vakuum getrocknet. THF (150 ml) wurde sodann zugesetzt und ferner Triäthylamin und HOBT (4,9 g) bei -50C zugegeben, gefolgt von BOC-His (Tos)-OH (14,8 g) und WSC (6,6 ml). Der pH wurde schliesslich auf 4,0 eingestellt und das Gemisch während 1 Stunde bei   -5 C    und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Nach beendigter Reaktion wurde das Gemisch im Vakuum konzentriert, sodann Äthylacetat zugesetzt und zunächst mit 1 N HCI, 1 N Natriumbicarbonatlösung und schliesslich mit Wasser gewaschen. 

  Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und anschliessend im Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wurde chromatographiert unter Verwendung von Silicagel mit einem Entwickler aus Chloroform Äthanol-Äthylacetat (5 : 2 : 5). Die eluierten Fraktionen wurden durch Silicagel-Dünnschichtchromatographie geprüft un     terAnwendung    desselben Lösungsmittelsystems und die aktiven Fraktionen gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden im Vakuum konzentriert und aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, um BOC-His-Lys(DIP)-Leu-OBzl (19,7 g) zu ergeben. Schmelzpunkt 214 bis   216,5"C    (Zersetzung). TLC: ein Fleck. Rf4 = 0,16.



     [a]D28      = -26,3"    (c = 1, DMF).



   (18) Herstellung von BOC-Leu-His-Lys(DIP)-Leu-OBzl:
TFA (30 ml) wurde zu BOC-His-Lys(DIP)-Leu-OBzl (8,7 g)   bei-S"C    zugesetzt und das Gemisch während 30 Minuten gerührt und anschliessend im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wurde über NaOH im Vakuum getrocknet. Anschliessend wurde DMF (10 ml) zugesetzt, der pH durch Zusatz von Triäthylamin bei -50C auf 7,5 eingestellt, anschliessend HOBT (1 g) und BOC-Leu-OSU (4,7 g) zugesetzt und das Gemisch während 30 Minuten bei derselben Temperatur und während 3 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt. Eine grosse Menge Wasser wurde sodann zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das ausgeschiedene Material filtriert, Äthylacetat gelöst,   N,N-Dimethylamino-1,3-propandiamin    (1 ml) zu der Lösung zugesetzt und während 30 Minuten gerührt.

  Die Äthylacetatschicht wurde mit 1 N   HC1,    dann mit 1 N Natriumbicarbonatlösung und schliesslich mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde die organische Schicht im Vakuum eingeengt. Die derart erhaltene pulverförmige Substanz wurde während der Verwendung einer Silicagelsäule chromatographiert. Nach dem Entwickeln mit Chloroform-Äthanol-Äthylacetat (5 : 2 : 5) wurde das Eluat mit Silicagel-TLC geprüft. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, wurden gesammelt und im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei BOC-Leu-His-Lys(DIP)-Leu-OBzl (7,3 g, Ausbeute 72,7%) erhalten wurde. Schmelzpunkt 94 bis   98,5"C.    Rf2 = 0,37, Rf4 = 0,59.



     [ ]D20    = -28,50C (c = 2, DMF).



   (19) Herstellung von BOC-Leu-His-Lys(DIP)-Leu-OH:    BOC-Leu-His-Lys(DIP)-Leu-OBzl    (16,2 g) wurden in Methanol (300 ml) gelöst und in Gegenwart von 5% Palladium auf Kohle während 10 Stunden hydriert. Nach der Reaktion wurde der Katalysator entfernt und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst und die ausgeschiedene, gelartige Substanz filtriert. Diese Substanz wurde aus Methanol-Äthyläther, welcher kleine Mengen von Chloroform enthielt, umkristallisiert, um BOC-Leu-His(DIP) -Leu-OH (12,5 g, Ausbeute   86,8So)    zu erhalten. Rf2 = 0,18.



   (20)   Herstellung von BOC-Leu-His-Lys(DIP)-Leu-Gln-    -Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val   -Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2:   
TFA (30 ml) wurde bei   -5 C    zu BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr   (Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-    -Thr(Bzl)-Pro-NH2 (4,5 g) zugesetzt, das Gemisch während 45 Minuten gerührt und anschliessend mit Vakuum eingeengt.



  Der Rückstand wurde mit Äthyläther behandelt und anschliessend über NaOH im Vakuum getrocknet. Zu dieser Lösung wurde DMF (16 ml) zugesetzt und der pH durch Zusatz von Triäthylamin bei   -5 C    auf 6,0 eingestellt, anschliessend BOC -Leu-His-Lys(DIP)-Leu-OH (2,2 g), HOBT (386 mg) und WSC (0,52 ml) zugesetzt. Der pH wurde weiter durch Zusatz von HOBT auf 5,5 bis 6,0 gehalten und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt.



   Äthylacetat und Äthyläther wurde zum Reaktionsgemisch zugesetzt und der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert.



  Dieser wurde je zweimal mit DMF, Äthylacetat, Methanol und Äthyläther behandelt, um   BOC-Leu-His-Lys(DIP)-Leu-Gln-      -Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-    -Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (6,0 g) zu erhalten. Schmelzpunkt 162 bis   166"C    (Zersetzung). TLC; ein Fleck. Rf3 = 0,38,   Rfs    = 0,20.



     [oc]D28    =   -18,20"    (c =   1,DMF).   



   Elementaranalyse:   (C137H191N25O30S      512H2O)    gef.: C 59,83 H 7,22 N 12,76 S 1,22 ber.: C 59,94 H 7,20 N 12,76 S 1,17
Aminosäureanalyse: Lys 0,97 (1), His 0,96 (1), NH3 2,34, Arg 1,00 (1), Asp 1,02 (1), Thr 2,43 (3), Glu 1,09 (1), Pro 1,96 (2), Gly 2,00 (2), Ala 0,93 (1), Val 1,10 (1), Leu 1,94(2), Tyr   0,90(1).   



   (21)   BOC-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(DIP)-Leu-Gln-Thr-    (Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly -Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH   2   
Das im obigen Absatz (20) erhaltene Heptadecapeptidamid [16 bis 32] wurde zu TFA (25 ml) bei -50C zugesetzt, während 40 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äthyläther behandelt und im Vakuum über NaOH getrocknet. Zu dieser Lösung wurde sodann DMF (13 ml) zugesetzt und der pH durch Zusatz von Triäthylamin   bei -50C    auf 6,5 eingestellt. HOBT (270 ml) und BOC-Glu (OBzl)-OSU (1,74 g) zur Lösung zugesetzt, der pH durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt und das Gemisch während 2 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt.

  Weiteres BOC-Glu(OBzl)-OSU (870 mg) wurden sodann zugesetzt und gleichzeitig der pH auf 7,0 eingestellt und das Gemisch während 2 Tagen gerührt.



   Äthylacetat, Methanol und Äthyläther wurden zum Reaktionsgemisch zugesetzt, wodurch ein gelbes Produkt ausgeschieden wurde, welches filtriert wurde. DMF, Äthyläther und Äthylacetat wurden zugesetzt, um den Niederschlag zu erhalten. Dieser wurde mit Aktivkohle in heissem Methanol behandelt und mit Äthyläther versetzt, um das gewünschte Produkt auszufällen. Die Umkristallisation aus Methanol-Äthyläther ergab das Produkt (5,13 g, Ausbeute   87,8in).    Schmelzpunkt 184 bis   1920C.    Rf4 = 0,56.



   (22) Herstellung von BOC-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys (DIP)-Leu-Gln-Thr(Bz1)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl) -Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2:
Das im obigen Abschnitt (21) erhaltene Octadecapeptidamid [15 bis 32] (4,96 g) wurde zu TFA (35 ml)   bei -5 0C    zugesetzt und das Gemisch während 40 Minuten gerührt und anschliessend im Vakuum eingeengt Der Rückstand wurde mit Äthyläther behandelt und anschliessend im Vakuum über NaOH getrocknet. Zu dieser Lösung wurde DMF (15 ml) zugesetzt und der pH durch Zusatz von Triäthylamin bei -50C auf 7,0 eingestellt. Nach Zusatz von HOBT (70 mg) und BOC -Gln-ONP (940 mg) wurde der pH durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf 7,0 eingestellt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Weiteres BOC-Gln-ONP (320 mg) wurde sodann zugesetzt und wiederum während einer Nacht gerührt.



   Zu dem derart erhaltenen Reaktionsgemisch wurde eine grosse Menge Wasser gegeben. Der Rückstand wurde abfiltriert, und anschliessend zweimal mit Methanol-Äthyläther und einmal mit DMF-Methanol-Äthyläther und heissem Methanol umkristallisiert, um das Produkt (4,03 g, Ausbeute 77,8%) zu erhalten. Schmelzpunkt 217 bis 2270C (Zersetzung).

 

  TLC: ein Fleck (Lösungsmittelsystem 3).



     [o]D28      = 18,06C    (c =   1,DMF).   



   Elementaranalyse:   (C154H212N28O35S      3H2O)    gef.: C 59,49 H 7,01 N 12,57 ber.: C 59,63 H 7,08 N 12,65
Aminosäureanalyse: Lys 0,93 (1), His 0,92 (1), Arg 0,85 (1), Asp 1,04 (1), Thr 2,43 (3), Glu 3,15 (3), Pro 1,92 (2), Gly 2,0 (2), Ala 0,84 (1), Val 1,10 (1), Leu 2,00 (2), Tyr 0,74 (1).



   (23) Herstellung von BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH:
H-Ser(Bzl)-OH (11,7 g) wurde in einem Gemisch von Na   triumcarbonat    (6,4 g), Wasser (50 ml) und Dioxan (10 ml) ge   löst. BOC-Leu-OSU (16,4 g) gelöst in Dioxan-Wasser (3: 1)    (20 ml) wurde zu dieser Lösung zugesetzt und das Gemisch  während einer Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Einstellung des pH auf7 durch Zusatz von 6 N   HC1    wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äthylacetat und 1 N   HCl    gemischt die abgetrennte Äthylacetatschicht 1 N HCI und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit Magnesiumsulfat wurde die Lösung im Vakuum konzentriert und aus Äthylacetat-n-Hexan kristallisiert.

  Die Umkristallisation aus Äthylacetat-n-Hexan ergab BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH (18,5 g, Ausbeute   92,5So).    Schmelzpunkt 82 bis   85,5"C.    TLC: ein Fleck. Rf1 = 0,44.



     [a]D20    = + 6,90 (c = 2, DMF).



   (24) Herstellung von BOC-Lys(DIP)-Leu-Ser(Bzl)-OH:
TFA (90 ml) wurde zu BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH (18,0 g) bei   -5   C    zugesetzt, während 40 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äthyläther behandelt, um das Produkt auszufällen, welches über NaOH im Vakuum getrocknet wurde. Dieses Produkt wurde in Pyridin (40 ml) gelöst und HOBT (1 g) und BOC-Lys)DIP)-OSU (21,0 g) bei   -5 C    zugesetzt und das Gemisch während 5 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt.



   Eine grosse Menge Wasser wurde sodann zum Reaktionsgemisch zugesetzt und der ausgeschiedene Niderschlag   abfiltriert,    getrocknet und in Chloroform gelöst, sodann mit 1 N Natriumcarbonatlösung, 1 N HCI und schliesslich Wasser gewaschen.



  Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde das Gemisch eingeengt und die derart erhaltene gelartige Substanz der Säulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel unterworfen. Es wurde sodann mit Chloroform-Ätha   nol.Äthylacetat (5 :    2: 5) entwickelt und die eluierten Fraktionen mit Silicagel-TLC unter Anwendung desselben Entwicklers geprüft. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde aus Chloroform-Äthyläther umkristallisiert und ergab BOC-Lys(DIP) -Leu-Ser(Bzl)-OH (12 g, Ausbeute 40,3%). Schmelzpunkt 178,5 bis   183,0 C    (Zersetzung). Rf4 = 0,53.



     [a]D28    =   -7,10    (c = 1, DMF).



   Eine weitere Chromatographie wurde durchgeführt unter Verwendung von Methanol auf derselben Säule wie oben, um die Substanz (9 g, Ausbeute   30,2So)    zu erhalten.



   (25) Herstellung von   BOC-Lys(DIP)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-    -Glu(OBzl)-   Leu-His-Lys(DIP)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-    -Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr   (Bzl)-Pro-NH2:   
TFA (35 ml) wurde bei   -5 C    zu dem im obigen Abschnitt (22) erhaltenen Nonadecapeptidamid [14 bis 32] (3,81 g) zugesetzt, das Gemisch während 40 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äthyläther behandelt und über NaOH im Vakuum getrocknet. DMF (15 ml) wurde zugesetzt, der pH der Lösung durch Zusatz von Tri äthylamin auf 5 eingestellt, sodann HOBT (220 mg), BOC -Lys(DIP)-Leu-Ser(Bzl)-OH (1,10 g) und WSC (0,3 ml) bei   -5 C    zugesetzt und während 1 Stunde gerührt.

  Das Gemisch wurde weiter über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt, sodann wurde HOBT (34 mg), BOC-Lys(DIP)-Leu-Ser(Bzl) -OH (185 mg) und WSC (0,046 ml) zu dem Gemisch zugesetzt und während 7 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dieselbe Menge an HOBT,   BOC-Lys(DIP)-Leu-Ser(Bzl)-OH    und WSC wurden sodann zugesetzt und über Nacht gerührt.



   Nach beendigter Reaktion wird eine grosse Menge Wasser dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das ausgefällte Produkt zweimal mit Methanol-Äthyläther behandelt, dann fünfmal mit heissem Äthanol behandelt und zentrifugiert, um das gewünschte Produkt zu erhalten (2,26 g, Ausbeute   50, so).   



  Schmelzpunkt über 2280C (Zersetzung). Rf3 = 0,54.



   Elementaranalyse:   (C184H260N32O41S    . 2H2O) gef.: C 60,53 H 7,47 N 11,98 ber.: C 60,64 H 7,30 N 12,30 Aminosäuresequenz No. 1 bis 10: (26) Herstellung von
EMI10.1     

Eine Lösung von WSC (34 g) in Dichlormethan (500 ml) wurde tropfenweise zu einer Suspension von BOC-Leu-OH (46,2 g),   HOBT (1    g) und   H-Gly-OBzl    TosOH (74 g) in DMF (100 ml) und Dichlormethan (200 ml) unter Rühren bei   -5 C    während 1 Stunde zugesetzt. Nach 1 Stunde wurde die Lösung über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt, um Dichlormethan zu entfernen. Zu der DMF-Schicht wurde Wasser zugesetzt und mit Äthylacetat (1 Liter) extrahiert, und nochmals mit demselben Lösungsmittel (500 ml).

  Die Äthylacetatschicht wurde mit 1 N HCI, dann mit Wasser, dann mit   5%ges    Natriumbicarbonatlösung und schliesslich nochmals mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschliessend im Vakuum eingeengt, um öliges BOC-Leu-Gly-OBzl (82 g) zu ergeben.   Rf1    = 0,68.



   (27) Herstellung von BOC-Val-Leu-Gly-OBzl:
TFA (70 ml) wurde zu BOC-Leu-Gly-OBzl (76 g)   bei -5"C    zugesetzt, das Gemisch während 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde über NaOH im Vakuum getrocknet. DMF (200 ml) wurde sodann zugesetzt, der pH durch Zusatz von Triäthylamin (etwa 50 ml) bei   -5 C    auf 6,5 eingestellt. Dem Gemisch wurde sodann BOC-Val-OSU (19 g) und HOBT (2 g) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf pH 6 eingestellt und während 4 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt. Während des Rührens wurde der pH des Gemisches durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf pH 6 gehalten.

  Eine grosse Menge Wasser wurde sodann zum Gemisch zugesetzt und mit Äthylacetat extrahiert,   N,N-Dimethylamino- 1 ,3-propandi-    amin (1 ml) zum Extrakt zugesetzt und während 30 Minuten gerührt. Der Extrakt wurde mit Wasser, 1 N   HC1,    5% Natriumbicarbonat und schliesslich mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wurde entfernt und das Produkt aus n-Hexan kristallisiert, wobei BOC-Val-Leu-Gly-OBzl (90 g, Ausbeute   94    erhalten wurde. Schmelzpunkt 119 bis   1210C.   



   Elementaranalyse:   (C2sH3sN3  6)    gef.: C 62,73 H 8,34 N 8,85 ber.: C 62,86 H 8,25 N 8,80  (28) Herstellung von BOC-Cys(Mbzl)-Val-Leu-Gly-OBzl:
TFA (150 ml) wurde bei   -5 C    zu BOC-Val-Leu-Gly-OBzl (47,8 g) zugesetzt, das Gemisch während 20 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Benzol wurde zum Rückstand zugesetzt und azeotropisch entfernt und über NaOH im Vakuum getrocknet. Das Material wurde in DMF (200 ml) gelöst, der pH durch Zusatz von Triäthylamin auf7 eingestellt und BOC -Cys(Mbzl)-OSU (57 g) und HOBT (3 g) zugesetzt und das Gemisch während 2 Tagen gerührt. Nach der Reaktion wurde   N,N-Dimethylamino-1,3-propandiamin    (0,5 ml) zugesetzt und das Gemisch während 1 Stunde gerührt. Eine grosse Menge Wasser wurde sodann zugesetzt und mit Äthylacetat extrahiert. 

  Die Äthylacetatschicht wurde mit 1 N HCI, Wasser,   5%Der    Natriumbicarbonatlösung,   5iOiger    Natriumcarbonatlösung und schliesslich mit Wasser gewaschen, dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und schliesslich im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde aus Äthylacetat-Benzol -n-Hexan kristallisiert, wobei BOC-Cys(Mbzl)-Val-Leu-Gly -OBzl (53 g, Ausbeute   75,7    erhalten wurde. Rf6 = 0,36.



  Schmelzpunkt 141 bis 1430C.



     [a]D21 =      M3,80    (c = 1,7, EtOH).



   Elementaranalyse:   (C36H52N4O5S)    gef.: C 61,56 H 7,60 N 8,19 ber.: C 61,68 H 7,49 N 7,99    (29) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Cys(Mbzl)-Val-Leu -Gly-OBzl:
TFA (150 ml) wurde zu BOC-Cys(Mbzl)-Val-Leu-Lys -OBzl (52 g) bei -50C zugesetzt, das Gemisch während 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äthyläther, welcher n-Hexan zwecks Bildung eines Pulvers enthielt, und über NaOH im Vakuum getrocknet. DMF (200 ml) wurde sodann zugesetzt, der pH durch Zusatz von Triäthylamin auf 6,5 eingestellt, dann HOBT (2 g) und BOC -Thr(Bzl)-OSU (39 g) zugesetzt und die Lösung durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf pH 6 eingestellt und während 2 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt.



   Zu dem Reaktionsgemisch wurde 0,5 N HCI zugesetzt und das ausgefällte Material abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus   90Woigem    Äthanol-Äthylacetat umkristallisiert, um BOC -Thr(Bzl)-Cys(Mbzl)-Val-Leu-Gly-OBzl (55 g, Ausbeute   83,4%)    zu ergeben. Schmelzpunkt 190 bis   194 C    (Zersetzung).



     Rfl =    0,46.



     [(y]D21.5    = -1450 (c = 1,5, DMF).



   Elementaranalyse:   (C47H60N5O10S)    gef.: C 62,98 H 7,47 N 7,92 ber.: C 63,26 H 7,36 N 7,85  (30) Herstellung von BOC-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Cys(Mbzl) -Val-Leu-Gly-OBzl:
TFA (250 ml) wurde zu BOC-Thr(Bzl)-Cys(Mbzl)-Val -Leu-Gly-OBzl (53,5 g) bei   -5 C    zugesetzt, das Gemisch während 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äthyläther-n-Hexan   (1:1)    behandelt, um das Produkt auszufällen und über NaOH im Vakuum getrocknet. DMF (200 ml) wurde zugesetzt und auf pH 6,5 eingestellt. HOBT (2 g) und BOC-Ser(Bzl)-OSU (28,2 g) wurden zugesetzt, der pH mit N-Methylmorpholin auf 6 eingestellt und das Gemisch während 2 Tagen gerührt.



   0,5 N HCI (700 ml) wurde sodann zum Reaktionsgemisch zugesetzt und das Gemisch   abfiltriert.    Der Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und wiederum ausgefällt durch Zusatz von Äthanol (800 ml), dann mit Äthyläther gewaschen und getrocknet, wobei rohes   Material (58    g) erhalten wurde, welches aus Äthanol-Äthylacetat umkristallisiert wurde. BOC-Ser   (Bzl)-Thr(Bzl)-Cys(Mbzl)-Val- Leu-Gly-OBzl    (49,0 g, Ausbeute   76,5So).    Schmelzpunkt 234 bis   236"C    (Zersetzung).   Rfi    = 0.54.



      [0l]D28 = -12.70 (c = 1, DMF).   



   (31) Herstellung von Cbz-Asn-Leu-OBzl:
Cbz-Asn-OH (26,6 g) und H-Leu-OBzl    TosOH    (43,3 g) wurden in DMF (150 ml) gelöst. HOBT (2 g) wurde zugesetzt und WSC (16,3 g) tropfenweise   bei-10 C    im Laufe von 30 Minuten zugegeben und das Gemisch sodann über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Wasser wurde zum Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Produkt wurde ausgefällt und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit 1 N HCI, Wasser, 5% Natriumcarbonat und wiederum Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die Umkristallisation aus Äthylacetat-n-Hexan ergab Cbz-Asn-Leu-OBzl (40 g, Ausbeute   80in).    Schmelzpunkt 154 bis   155,5"C.   



   Elementaranalyse:   (C25H31N3O6)    gef.: C 63,98 H 6,72 N 8,99 ber.: C 63,94 H 6,67 N 8,95  (32) Herstellung von BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-OH:
Cbz-Asn-Leu-OBzl (30 g) wurde in einem Gemisch von Methanol (400 ml), DMF (50 ml), Essigsäure (50 ml) und Wasser (100 ml) in der Wärme gelöst und in Gegenwart von 5% Palladium auf Kohle hydriert. Nach der Reaktion wurde der Katalysator entfernt und das Filtrat im Vakuum auf 150 ml eingeengt. Die Lösung wurde durch Zusatz von Triäthylamin auf pH 7 eingestellt und HOBT (1 g) und BOC-Ser(Bzl)-OSU (30 g) zugesetzt und anschliessend während 2 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt. Wasser wurde zum Reaktionsgemisch zugesetzt, um das Produkt auszufällen, und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit 1 N HCI und Wasser gewaschen, dann mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt.

  Der Rückstand wurde aus Äthylacetat -n-Hexan kristallisiert, wobei BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-OH (30,8 g, Ausbeute   9270)    erhalten wurde. Schmelzpunkt 176 bis   178"C.   



     [arjD28      = -7,3"    (c = 0,9, DMF).



   (33) Herstellung von BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl) -Thr(Bzl)-Cys(Mbzl)-Val-Leu-Gly-OBzl:
TFA (50 ml) wurde zu   BOC-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Cys(Mbzl)-    -Val-Leu-Gly-OBzl (10 g)   bei -5"C    zugesetzt, das Gemisch während 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt.



  Äthyläther wurde zum Rückstand zugesetzt, um das Produkt auszufällen, und über NaOH im Vakuum getrocknet. DMF (30 ml) wurde zugesetzt und der pH durch Zusatz von Tri äthylamin auf 5,5 eingestellt. HOBT (1,3 g) und BOC-Ser (Bzl)-Asn-Leu-OH (5,5 g) wurde zugesetzt, sowie WSC (1,92 ml) bei -50C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde während 1 Stunde gerührt und über Nacht bei   Zimmertenipe-    ratur stehen gelassen. DMF (20 ml) wurde zu der erhaltenen gelartigen Substanz zugesetzt und die gebildete Suspension zu 0,5 N   HC1    (200 ml) zugesetzt. Die ausgefällte weisse Substanz wurde filtriert, mit Wasser, Äthanol und schliesslich Äthyl äther gewaschen und getrocknet. Die rohe Substanz wurde durch Zusatz von Äthanol (100 ml) unter Erwärmen behandelt.

  Nach dem Abkühlen wurde die Substanz getrocknet, um   BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Cys(Mbzl)-Val-    -Leu-Gly-OBzl (12,5 g, Ausbeute 85%) zu erhalten. Schmelzpunkt 246 bis   252"C    (Zersetzung).   Rfl    = 0,68.



     [Ol1D28      = -18,960    (c = 0,62, DMF).



   (34) Herstellung von   BOC-Cys(Mbzl)-Ser(Bzl)-Asn-Leu-    -Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Cys(Mbzl)-Val-Leu-Gly-OBzl:
TFA (50 ml) wurde zu BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl) -Thr(Bzl)-Cys(Mbzl)-Val-Leu-Gly-OBzl (10,0 g) bei   -5 C    zugesetzt, das Gemisch während 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Äthyläther wurde zum Rückstand zugesetzt, um das Material auszufällen und über NaOH im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde zu DMF (30 ml) zugesetzt und Hexamethylphosphorsäuretriamid (15 ml) zugegeben und der pH durch Zusatz von Triäthylamin   bei-5 C    auf 6,5 eingestellt.   HOBT (1    g) und BOC-Cys(Mbzl)-OSU (4,5 g) wurden zugesetzt und bei Zimmertemperatur während 2 Tagen reagieren gelassen. Während der Reaktion wurde der pH des Reaktionsgemisches mit N-Methylmorpholin auf 6 gehalten.



   Nach Zusatz von Äthylacetat wurde der Niederschlag filtriert und in Gegenwart von Äthanol erhitzt, um BOC-Cys   (Mbzl)-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Cys(Mbzl)-Val-    -Leu-Gly-OBzl (10,7 g, Ausbeute 93%) zu ergeben. Schmelzpunkt 247 bis   253"C    (Zersetzung). Rf2 =   0,55.   

 

     [ x]D28      = -17,010    (c = 0,53, DMF).



   (35) Herstellung von
EMI11.1     
    BOC-Cys(Mbzl)-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Cys-    (Mbzl)-Val-Leu-Gly-OBzl (1,10 g) wurde in einem 300 ml-Erlenmeyer-Kolben eingefüllt und unter Kühlung mit Trockeneis-Methanol flüssiger Ammoniak zugesetzt. Das Trockeneisbad wurde sodann entfernt und metallisches Natrium zugesetzt bis die blaue Farbe verschwunden war (etwa 20 Sekunden), wobei Stickstoff durchgeleitet wurde. Das überschüssige Natrium wurde durch Zusatz einiger Tropfen Essigsäure zersetzt und der flüssige Ammoniak im Lauf von 2 Stunden abgesaugt. Anschliessend wurde das Produkt über konzentrierter Schwefelsäure im Vakuum getrocknet und in DMF (200 ml) und   0,5%Der    Essigsäure (400 ml) gelöst.

  Das Gemisch wurde  mit wässrigem Ammoniak auf pH 6,8 eingestellt und carbonatfreie Luft hindurchgeleitet, bis die Reaktion von Natriumnitroprusidreagens negativ war. Nach Einstellung des pH des Reaktionsgemisches auf 4,2 durch Zusatz von Essigsäure wurde das Gemisch im Vakuum auf etwa 150 ml eingeengt. Äthylacetat (500 ml) wurde sodann zugesetzt und die Kristallisation durch Kratzen der Glaswand angeregt. Weiteres Äthylacetat (500 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch im Kühlschrank stehen gelassen. Das organische Lösungsmittel wurde sodann abdekantiert und mit Äthylacetat behandelt, um das Pulver auszufällen, welches anorganisches Salz enthielt (3,76 g).

  Das Pulver wurde in einer kleinen Menge Methanol-Wasser (1: 1)    gelöst, über eine Säule aus CM- Sephadex  (4,4  >  <  X 60 60 cm) ge-    leitet und chromatographiert unter Verwendung von Metha   nol-Wasser (1    : 1). Das Eluat wurde in Fraktionen von je 10 ml unterteilt und die Fraktionen No. 36 bis 46, welche eine Absorptionsspitze bei 230   m,a    aufwiesen, wurden gesammelt.



  Das Methanol wurde im Vakuum entfernt und das Produkt gefriergetrocknet, wobei ein Pulver (210 mg) erhalten wurde.



  TCL: ein Fleck (Lösungsmittelsystem 2 und 8 aus Silicagel).



   Aminosäurezusammensetzung: Asp 1,02 (1), Thr 0,90 (1), Ser 1,72 (2), Gly 1,00 (1), Cys/2 1,52 (2), Val 1,09 (1), Leu 2,00 (2).



   Beispiel 2
Herstellung von    H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val     -Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu     -His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-  -Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-ProNH2   
732 mg   BOC-Lys(CICbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-      -Leu-His-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg (Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NHE    wurden in 3 ml TFA und 1 ml   4N-HC1/Dioxan    bei   -5 C    gelöst. Nach 35 Minuten langem Rühren bei Zimmertemperatur wurde die Lösung im Vakuum eingeengt und Äthyläther als Fällungsmittel zugesetzt. Der Niederschlag wurde über Na   triuinhydroxid    getrocknet.

  Der trockene Niederschlag wurde in 3 ml DMF gelöst und der pH durch Zusatz von N-Methylmorpholin bei   -5 C    auf 5,5 bis 6 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 3 mg HOBT, 100 mg DCC und 500 mg BOC-Cys-Ser -Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-OH, erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben, zugesetzt und das Gemisch während 2 Stunden bei   0 C    und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurde Wasser zugesetzt, um das Produkt auszufällen, und der gebildete Niederschlag abfiltriert, gut mit Wasser und mit Äthylacetat gewaschen, dann im Vakuum getrocknet, wobei 700 mg rohes Produkt erhalten wurde. Das rohe Material wurde mit Fluorwasserstoff (35 ml) bei   OOC    während 1 Stunde in Gegenwart von 1,5 g Phenol und 4,0 ml Anisol behandelt.

  Nach Destillation des Fluorwasserstoffes wurde der Rückstand dreimal mit Äthylacetat (30 ml) gewaschen und getrocknet und anschliessend in 200 ml 0,5 Mol Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule aus  Dowex 1 x 2  (Acetatform)   (2    x 20 cm) geleitet und das Eluat gefriergetrocknet, wobei ein Pulver (451 mg) erhalten wurde. 393 mg dieses Pulvers gelöst in 1 ml 0,1 N Essigsäure wurden über eine Säule  Sephadex G-50  in 0,1 N Essigsäure (3,0 x 107 cm) geleitet und mit 0,1 N Essigsäure mit einer Eluierungsgeschwindigkeit von 10 ml pro Stunde eluiert. Die durch biologischen Versuch ermittelten aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet, um das aktive Pulver (267 mg) zu erhalten.



   Das aktive Pulver gelöst in 0,1 N Essigsäure (1 ml) wurde durch eine Säule aus Carboxymethylzellulose in 0,01 Mol Am   moniumacetat (2,0  >  <  x 20 20 cm) geleitet und nach und nach mit    500 ml 0,01 Mol Ammoniumacetat (pH 4,5) bis zu 500 ml 0,15 Mol Ammoniumacetat (pH 4,5) eluiert. Je 6,7 ml Eluat wurden gesammelt und die aktiven Fraktionen No. 109 bis 126, welche durch biologischen Versuch ermittelt waren, wurden gefriergetrocknet, um das Produkt als weisses Pulver zu ergeben.



  Dieses Pulver (18 mg) gelöst in einer kleinen Menge   0,1    Mol Essigsäure, wurde über eine Säule aus    < (Sephadex    LH-20  (2 x 75 cm) geleitet, mit 0,1 Mol Essigsäure eluiert, in Fraktionen von 5 ml Eluat geteilt und die aktiven Fraktionen No. 13 bis 17 gesammelt und gefriergetrocknet, um das aktive Pulver zu ergeben. Rf = 0,65 bis 0,71.



     [a]D90    =   -75"    (c = 1, 0,1 N Ameisensäure).



   Wirksamkeit: 4200 MRC-Einheiten pro Milligramm.



   Aminosäurezusammensetzung: Cys/2 2,07 (2), Ser 2,84 (3), Leu 5,15 (5), Thr 3,50 (4), Val 2,18 (2), Gly 3,00 (3), Lys 1,95 (2), Glu 3,30 (3), His 0,96 (1),   Tyr0,91    (1), Pro 1,97 (2), Arg 1,04 (1), Asp 2,05 (2), Ala 0,98 (1).



   Ein Ausgangsmaterial wurde wie unten beschrieben hergestellt.



   Erzeugung der Teil-Aminosäuresequenz 11 bis 32:   
BOC-Lys(CICbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His- -Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr- (Bzl)-Asp(TOBzl)-Val-Gly-Ala-G1y-Th BzD-Pro-NH3.   



   (1) Herstellung von BOC-Lys(CICbz)-Leu-OEt:    BOC-Lys(C1Cbz)-OH    t-Butylaminsalz (7,32 g) suspendiert in Äthylacetat, wurde dreimal mit   1N      HCl (100    ml) und Wasser (100 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde das Äthylacetat abdestilliert.



  Der Rückstand wurde mit Dichlormethan (60 ml), H-Leu -OEt   HCI    (2,93 g) und HOBT (2,0 g) versetzt und ausserdem WSC (2,75 ml) bei   -5 C    zugegeben und das Gemisch während 1 Stunde gerührt. Das Rühren wurde sodann über Nacht bei Zimmertemperatur fortgesetzt. Nach der Reaktion wurde das Dichlormethan im Vakuum entfernt und der Rückstand in Äthylacetat (150 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit 1 N   HCI,    dann mit   5%Der    Natriumbicarbonatlösung und schliesslich mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Magnesiumsulfat, gefolgt von Einengung im Vakuum wurde der Rückstand auf Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, um 6,4 g   BOC-Lys(C1Cbz)-Leu-OEt    (Ausbeute 76,6%) vom Schmelzpunkt 76 bis   79"C    zu ergeben.



   (2) Herstellung von BOC-Lys(CICbz)-Leu-OH:
Zu einer Lösung von   BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OEt    (6,13 g) in Äthylacetat (20 ml) wurde 1 N NaOH (12,1 ml) bei   0 C    zugesetzt und das Gemisch während 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde 1 N NaOH (1,1 ml) zugesetzt und nach einstündigem Rühren der pH auf 7 eingestellt und das Gemisch im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äthyläther gewaschen, die wässrige Schicht auf pH 3 eingestellt und dreimal mit Äthylacetat (100 ml) gewaschen. Nach dem Waschen der Äthylacetatschicht mit Wasser (100 ml) und Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde die Lösung im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Äthyläther (50 ml) gelöst, unter vermindertem Druck eingeengt und getrocknet, wobei   BOC-Lys(C1Cbz)-Leu-OH    als Pulver (5,85 g) erhalten wurde. 

  Schmelzpunkt  >  46 bis   60"C.   



   [a]D19 =   -10,680    (c = 1, DMF).



   Elementaranalyse:   (C25H35N3 O7Cl      V3H2O)    gef.: C 56,25 H 7,35 N 8,00 ber.: C 56,21 H 7,31 N 7,87  (3) Herstellung von BOC-Leu-His-OH:
H-His-OH   HCI    (3,83 g) wurde unter Erhitzen in Wasser (25 ml) gelöst. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde Natriumbicarbonat (1,84 g) zugesetzt und ferner HOBT (270 mg), BOC-Leu-OSU (8,53 g) und THF (25 ml) zugefügt.



  10 ml Wasser wurden zu dem Gemisch zugesetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Der pH des Reaktionsgemisches wurde durch Zusatz von wässrigem Natriumbicarbonat auf 7 eingestellt und BOC-Leu-OSU (1,3 g) wiederum  zugesetzt und gerührt. Nach 6 Stunden wurden weitere 1,3 g dieser Verbindung zugesetzt und das Rühren über Nacht fortgesetzt. Nach beendeter Reaktion, was mit Hilfe von TLC überprüft wurde, wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingeengt, um das organische Lösungsmittel zu entfernen, und die restliche wässrige Schicht mit Äthylacetat gewaschen. Die wässrige Schicht wurde auf pH 5 eingestellt und über eine Säule aus HP-20 (2,3 x 18 cm) geleitet, gefolgt vom Waschen mit Wasser, bis das Wascheluat keine Ninhydrinreaktion mehr aufwies, worauf mit Methanol eluiert wurde.

  Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Äthyläther versetzt Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und zweimal mit Methanol-Äthyläther umkristallisiert, wobei ein trokkenes Pulver (3,94 g, Ausbeute   53,5in)    erhalten wurde.



  Schmelzpunkt 178 bis   180"C.   



     [o]D19    =   -0,190    (c = 1, DMF).



   Elementaranalyse:   (C17H28N4O5      2AH3O)    gef.: C 53,39 H 7,65 N 14,71 ber. C 53,65 H 7,79 N 14,73  (4) Herstellung von BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH:
H-Ser(Bzl)-OH (11,7 g) wurde in Wasser (50 ml) gelöst und dieser Lösung Natriumbicarbonat (10,1 g) und Dioxan (10 ml) zugesetzt. Sodann wurde BOC-Leu-OSU (16,4 g) in Dioxan (15 ml) und DMF (5 ml) zugesetzt. Nach Rühren während einer Nacht wurde der pH des Reaktionsgemisches auf pH 7 eingestellt und das Gemisch im Vakuum eingeengt, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die wässrige Schicht wurde mit Äthylacetat (100 ml) geschüttelt und die organische Schicht zweimal mit 1 N   HC1    und Wasser gewaschen.



  Die organische Schicht wurde sodann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, im Vakuum eingeengt und der Rückstand zweimal aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, um BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH   (16,lg, Ausbeute      78,857o)    zu erhalten. Schmelzpunkt 82 bis   86"C.   



   (5) Herstellung von   BOC-Lys(C1Cbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH:   
BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH (4,1 g), (10 Millimol), erhalten gemäss Absatz (4), wurde zu gekühltem (auf -5   OC)    TFA (25 ml) zugesetzt, während 25 Minuten gerührt und anschliessend im Vakuum eingeengt. Äthyläther wurde zum Rückstand zugesetzt, um das Material auszufällen, welches über NaOH im Vakuum getrocknet wurde.



   Die Kristalle wurden in DMF (8 ml) gelöst und BOC-Lys (ClCbz)-ONP (8 g) und HOBT (270 mg) zugesetzt, der pH mit N-Methylmorpholin auf 8 eingestellt und das Gemisch sodann über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. 1 N   HC1    wurde zugesetzt und der Niederschlag in Chloroform gelöst, die Lösung dreimal mit 1 N HCI, dreimal mit   5%Der    Natriumbicarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde die Chloroformschicht im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde dreimal aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert und ferner dreimal aus Äthyläther-n-Hexan umkristallisiert, sodann über eine Kolonne aus Silicagel (180 g) geleitet, welche mit Äthylacetat-Benzol (2: 1) gewaschen und mit Methanol eluiert wurde. Das Methanoleluat wurde im Vakuum konzentriert.

  Der Rückstand wurde aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert und ergab BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH (5,25 g, Ausbeute   74,5%)    Schmelzpunkt 84 bis   100"C    (Zersetzung).



  TLC: ein Fleck.



   Aminosäurezusammensetzung: Lys 0,98 (1), Leu   1,00 (1),      Ser0,82    (1).



   (6) Herstellung von   BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-      -Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala- -Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2:
BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp-       (OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2    (7,65 g) erhalten nach demselben Verfahren wie in Beispiel   1(15)    beschrieben, wurde in TFA (35 ml) bei   -5 C    gelöst, das Gemisch während 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Diäthyläther behandelt und das ausgefällte Material über NaOH im Vakuum getrocknet.

  Dieses Material wurde sodann in DMF (25 ml) gelöst, mit HOBT (600 mg), BOC -Lys(ClCbz)-Leu-OH (2,35 g) erhalten nach (2) oben, und WSC (0,69 ml)   bei -5"C    versetzt, und das Gemisch während 1 Stunde bei   -5 0C    und anschliessend über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. 1 N HCI wurde zum Reaktionsgemisch zugesetzt, um das Material auszufällen, welches zweimal mit Methanol-Äthyläther wieder gefällt wurde und getrocknet wurde, um das Produkt (8,0 g, Ausbeute   87,3in)    zu ergeben.



  Schmelzpunkt    >       1640C    (Zersetzung).



     [a]D15    =   -18,65      (c = 1, DMF).



   Elementaranalyse:   (Cl25H164N2l028Scl      HC1):    gef.: C 59,63 H 6,67 N 11,78 ber.: C 59,75 H 6,62 N 11,71  (7) Herstellung von   BOC-Leu-His-Lys(C1Cbz)-Leu-Gln-      Thr(Bzi)-Tyr(Bzl)-ProArg(Tos)-Th Bzi)-Asp(OBzl)-Vai -Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2:   
BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg   (Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-      -NH2    (7,68 g) erhalten gemäss Absatz (6) wurde in TFA (35 ml) bei   -5"C    gelöst, die Lösung während 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt.

  Der Rückstand wurde in DMF (20 ml) gelöst, durch Zusatz von Triäthylamin auf pH 5 eingestellt, HOSU (430 mg), BOC-Leu-His-OH (1,37 g) und WSCO (58 ml) bei   -5 C    zugesetzt und anschliessend bei dieser Temperatur während 1 Stunde gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur weitergerührt. 1 N HC1 wurde sodann zum Reaktionsgemisch zugesetzt, um das Material auszufällen, welches weiter aus Methanol-Äthyläther umgefällt wurde und mehrmals aus DMF-Äthyläther umgefällt wurde.



  Das Produkt wurde durch Trocknen erhalten. (8,30 g, Ausbeute 98,2%). Schmelzpunkt 167 bis   175"C.   



     [o]Dl5      = 17,45C    (c = 1, DMF).



   Elementaranalyse:   (C137Hl82N25030Scl      HC1    4H2O) gef.: C 58,19 H 6,71 N 12,42 ber.: C 58,04 H 6,79 N 12,35  (8) Herstellung von BOC-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys   (ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)- -Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-   
Das im Abschnitt (7) erhaltene Heptadecapeptidamid (Amonosäuresequenz No. 16 bis 32) (7,64 g) wurde in TFA (35 ml) bei   -5 C    gelöst, während 40 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in DMF (30 ml) gelöst, der pH durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, dann HOBT (70 mg) und BOC-Glu(OBzl)-OSU (1,82 g) zur Lösung zugesetzt.

  Der pH wurde wiederum mit N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt und das Gemisch während 2 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt. 1 N HC1 wurde sodann zum Reaktionsgemisch zugesetzt und der Niederschlag zweimal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert, um das Produkt nach dem Trocknen zu erhalten. (7,55 g, Ausbeute   92,5So).    Schmelzpunkt 161 bis 1690C (Zersetzung).

 

   Aminosäurezusammensetzung: His 0,83 (1), Arg 1,05 (1), Asp 1,08 (1), Thr2,52 (3), Glu2,06 (2), Pro 2,16 (2), Gly2,00 (2), Ala 1,06 (1), Val 1,10 (1), Leu 1,82 (2), Tyr 0,73 (1).



   (9) Herstellung von BOC-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys (ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl) -Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2:
Das im obigen Absatz (8) erhaltene Octadecapeptidamid (15 bis 32) (7,29 g) wurde in TFA (30 ml)   bei-50C    gelöst, während 45 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in DMF (15 ml) gelöst, der pH mit N-Methylmorpholin auf7 eingestellt, HOBT (100 mg) und BOC   -Gln-ONP    (1,4 g) zugesetzt und das Gemisch sodann über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. 1 N   HC1 wurde    sodann zum Reaktionsgemisch zugesetzt und der Niederschlag gesam  melt und mit Wasser gewaschen. Die Umfällung wurde dreimal wiederholt, um das getrocknete Produkt (7,00 g, Ausbeute 91,5%) zu erhalten. Schmelzpunkt 171 bis 1750C (Zersetzung).



   (10) Herstellung von   BOC.Lys(ClCbz).Leu-Ser(Bzl).Gln      -Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-    -Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr (Bzl)-Pro-NH2:
Das im obigen Absatz (9) erhaltene Nonadecaptid (14 bis 32) (6,70 g) wurde in TFA (30 ml) bei   -5 C    gelöst, mit 4 N   HC1/Dioxan    (2,2 ml) versetzt und während 45 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und mit Äthyläther versetzt, um das Material auszufällen, welches gut mit Äthyläther gewaschen und über NaOH im Vakuum getrocknet wurde.



   Die erhaltene   Substanz wurde    in DMF (15 ml) gelöst, der pH durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf 5,5 bis 6 eingestellt, HOBT (360 mg),   BOC-Lys(C1Cbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH    (1,86 g) und DCC (540 mg) gelöst in DMF (5 ml) zugesetzt, das Gemisch sodann während 1 Stunde bei   -5 C    und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. 1 N HCl wurde sodann zugesetzt und der gebildete Niederschlag abfiltriert. Der in Äthanol unlösliche Teil des Niederschlages und das durch Zusatz von Äthyläther zum Filtrat erhaltene ausgefällte Material wurden vereint. Zu diesem Material wurde Methanol-Diäthyl äther zugesetzt und der Niederschlag mehrmals aus Methanol Äthyläther umkristallisiert, um das Produkt (7,0 g, Ausbeute   87,6So)    zu erhalten. Schmelzpunkt 171 bis 177 C (Zersetzung).

 

     [ < Y]D15      = -18,450    (c = 1, DMF).



   Elementaranalyse:   (C84H242N3204lSc12      HCl    11/2H2O) gef.: C 58,43 H 6,65 N 11,83   C1    2,64 ber.: C 58,21 H 6,74 N 11,81   C1    2,80
Aminosäurezusammensetzung: Lys 1,86 (2), His 0,74 (1), Arg   (1),    Asp 1,04(1), Thr2,55 (3),   Ser0,53    (1), Glu2,85 (3), Pro 2,08 (2), Gly 2,00 (2), Ala   1,04(1),    Val   1,04(1),    Leu 2,67 (3), Tyr 0,67 (1). 

Claims (5)

1. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptides der Formel EMI1.1 -Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu -His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg- -Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2 (I) wobei alle Aminosäuren in L-Form vorliegen, oder dessen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man Aminosäuren und/oder Peptide durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I umsetzt und die Disulfidbrücke durch Oxidation der Mercaptogruppe in einer beliebigen Stufe des Aufbaues der Peptideinheit bildet,
2. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminosäure und ein Peptid mit zwei bis vier Aminosäuren durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I umsetzt und die Disulfidbrücke durch Oxidation der Mercaptogruppe in der Stufe des Aufbaues der Peptideinheit, welche zwei L-Cysteinyl-Einheiten enthält, bildet.
3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminosäure und ein Peptid mit zwei bis vier Aminosäuren durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I umsetzt und die Disul fidbrücke durch Oxidation der Mercaptogruppe in der Stufe des Aufbaues der Peptideinheit, welche zwei L-Cysteinyl-Einheiten enthält, bildet und anschliessend in der obigen Formel I die Schutzgruppen von der Verbindung entfernt, in welcher mindestens eine Aminogruppe oder Carboxylgruppe durch eine mittels Säure entfernbare Schutzgruppe geschützt ist.
4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminosäure und ein Peptid mit zwei bis vier Aminosäuren durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I umsetzt und die Disulfidbrücke durch Oxidation der Mercaptogruppe in der Stufe des Aufbaues der Peptideinheit der Formel EMI1.2 bildet und anschliessend in der obigen Formel I die Schutzgruppe von der Verbindung, in welcher mindestens eine Aminogruppe oder Carboxylgruppe durch eine mit Säure entfernbare Schutzgruppe geschützt ist, entfernt.
5. 5. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktionsfähigen Gruppen, die nicht an der Umsetzung teilnehmen, vorübergehend geschützt werden.

   Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptides der Formel EMI1.3 9 10 11 12 13 14 15 1o -Leu-ly-Lp-Leu-Ser-ln-lu-Leu- 17 18 19 2n 2t 22 23 24 -Eis-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg- 25 26 27 28 29 30 31 32 -Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Oly-Thr-Pr-o- -NH2 (1) wobei alle Aminosäurereste in L-Form vorliegen oder deren Säureadditionssalze.

   Das Polypeptid der Formel I weist eine, den Calciumgehalt des Serums herabsetzende Wirksamkeit auf, und aufgrund von Versuchen an Ratten wurde festgestellt, dass es eine Wirksamkeit von 3700 bis 6000 MRC-Einheiten an dieser Wirksamkeit aufweist. Es weist eine Wirksamkeit von 15mal höher als diejenigen von menschlichem Calcitonin und Schafs-Calcitonin und 20mal höher als diejenige von Schweine- oder Rinder-Calcitonin auf. Diese Wirksamkeit ist mindestens so hoch als diejenige des am wirksamsten bekannten Salm-Calcitonins.

   Diese neue Verbindung ist dank ihrer Wirksamkeit ein wertvolles therapeutisches Mittel. Die neue Verbindung ist nützlich für die Herabsetzung des Calciumgehaltes im Serum bei Krankheiten wie Hypercalcaemie, endogenem Calcitonin Mangel hervorgerufen durch Dysthroidismus oder Hyperpa rathyroidismus.

   Die neue Verbindung kann ferner für eine calciumerfordernde Osteopathie verwendet werden, z.B. bei Osteoporose, Osteomalazie, Knochenbrüchen, fibröser Dysplasie der Kno- chen oder Rachitis, hervorgerufen durch Corticosteron-Therapie oder Inaktivierung nach Menopause oder äusserer Verletzung, insbesondere zur kombinierten Therapie mit Calcium oder Phosphor. Die neue Verbindung kann ferner für die Theraphie der Paget-Krankheit eingesetzt werden. Ausserdem kann sie für die Therapie oder die Verhütung von Peptin-Geschwüren verwendet werden. Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung ist stabiler in Serum, Leber oder Nieren als die bekannten Calcitonine.

   Die Synthese kann nach üblichen Peptid-Synthesemethoden erfolgen, d.h., dass Aminosäuren und/oder Peptide durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I miteinander umgesetzt werden und die Disulfidbrükke durch Oxidation von Mercaptogruppen beim Aufbau der Peptideinheit gebildet werden. Falls erwünscht, kann das erhaltene Produkt in ein Säureadditionssalz oder einen Komplex umgewandelt werden.

   Die Schutzgruppen bei der Herstellung von Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukten sind die üblichen Schutzgruppen für die Peptid-Synthese und sie sollten durch Hydrolyse, Säurezersetzung, Reduktion, Aminolyse, oder Hydrazinolyse leicht abspaltbar sein.

   So wird z.B. die Aminogruppe üblicherweise durch eine Acylgruppe, wie die Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl- oder 2,4-Dinitrophenylsulfenylgruppe, eine Aralkylgruppe, wie die Benzyl-, Diphenylmethyl- oder Triphenylmethylgruppe (diese Gruppen können durch niedere Alkoxygruppen, z.B.

   o-Methoxy oder p-Methoxy substituiert sein), eine Benzyloxycarbonylgruppe, wie die B enzyloxycarbonyl-, o-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, o-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, p-Phenylazo-benzyloxyzarbonyl- oder p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, eine aliphatische Oxycarbonylgruppe, wie die Cyclopentoxycarbonyl-, Trichlor äthyloxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyloder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe, oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe, wie die 2-Phenylisopropoxycarbonyl-, 2-Tosyl-isopropoxycarbonyl- oder 2-pDiphenyl-isopropoxy- carbonylgruppe aufgespalten. Diese Aminogruppe kann geschützt werden durch Umsetzung mit einem 1,3-Diketon, wie z.B.

   Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, unter Bildung eines Enamins.

   Die Carboxylgruppe kann geschützt werden durch Bildung eines Amides, eines Hydrazides oder eines Esters. Die Amidgruppe kann z.B. eine 3,4-Dimethoxybenzyl- oder Bis-(p -methoxyphenyl)-methylgruppe sein. Die Hydrazidgruppe kann z.B. eine Benzyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, Trifluoracetyl-, t-Butoxycarbonyl-, Trityl- oder 2-p-Diphe **WARNUNG** Ende CLMS Feld konnte Anfang DESC uberlappen**.