CH618736A5

CH618736A5 - Continuous process for the cultivation of microorganisms and apparatus for carrying it out.

Info

Publication number: CH618736A5
Application number: CH1550875A
Authority: CH
Inventors: Karl Klemm
Original assignee: Sick Peter
Priority date: 1974-12-03
Filing date: 1975-11-28
Publication date: 1980-08-15
Also published as: ZA757515B; IT1051027B; ES443149A1; FR2293488A1; FR2293488B1

Description

Die Erfindung betrifft ein kontinuierliches Verfahren zur Kultur von Mikroorganismen, bei dem Messungen in bezug auf das Stoffwechselgeschehen durchgeführt werden, sowie eine Vorrichtung zur Durchfuhrung des Verfahrens.

Bei der Kultur von Mikroorganismen in sog. «geschlossenen Systemen» oder «Batch-Verfahren», ändern sich die Kulturbedingungen mit zunehmender Organismenzahl und abnehmendem Nährstoffangebot ständig.

Zur Kultur von Mikroorganismen unter gleichbleibenden Bedingungen über längere Zeit wurden bisher zwei kontinuierliche Verfahren eingesetzt. Im «Chemostaten» wird einer Kultur mit konstanter Zuflussrate frisches Substrat zugeführt und in gleichem Masse Organismensuspension entnommen, wobei sich ein Fliessgleichgewicht einstellt, das abhängig ist von den Aussenbedingungen und der vorgegebenen Zuflussrate. Im «Turbidostaten» wird die vorhandene Anzahl von Organismen pro Volumeneinheit als optische Dichte der Kultur überwacht und bei ihrer Zunahme durch Zugabe frischen Substrates eine vorgegebene Organismendichte aufrechterhalten. Während bei dem erstgenannten Verfahren ein Regeleingriff nicht möglich ist, wird bei der optischen Dichtemessung nicht zwischen lebenden und toten Organismen und/

oder anderen Trübungen unterschieden, was besonders in Grenzbereichen der Kulturbedingungen, die durch erhöhte Absterberaten gekennzeichnet sind, eine exakte derartige Dichteregelung unmöglich macht. Ein Verfahren, bei dem der Prozessablauf durch gasanalytische Messdaten geregelt werden soll, hat sich in der Praxis der kontinuierlichen Kulturen offenbar nicht eingebürgert.

Keines der vorgenannten Verfahren weist spezifische Vorrichtungen zur gezielten, selektiven Züchtung von Mikroorganismen oder der direkten Überwachung und Registrierung der Stoffwechselleistung für eine Langzeitkultur auf.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu dessen Durchführung zu schaffen, mit dem überwachbare und steuerbare Langzeitkulturen auch in Grenzbereichen von Kulturbedingungen durchgeführt werden können, die einerseits eine selektive Anreicherung von Mikroorganismen, andererseits eine Analyse von deren Stoffwechseleigenschaften unter sich verändernden Bedingungen ermöglichen. Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zumindest ein Parameter aus den Kulturbedingungen und/oder Fremdstoffzugaben und/oder Organismeneigenschaften einem Gradienten in Änderungsrichtung auf einen vorgegebenen Wert unterworfen und die Stoffwechselleistung der Kultur fortlaufend ermittelt wird. Dadurch können gradientengesteuerte Langzeitkulturen durchgeführt werden, die neue Aspekte bezüglich einer selektiven Züchtung und der Untersuchungsmöglichkeiten für Mikroorganismen eröffnen.

Zur gezielten Selektion und/oder Anreicherung von den interessierenden Bedingungen besser angepassten Organismen oder auch Mutanten wird zweckmässigerweise so vorgegan2

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gen, dass der Parameter, auf den sich die Selektion bzw. Adaption beziehen soll, asymptotisch einem Grenzwert der Stoffwechselleistung angenähert wird. Dabei wird der Anstieg des Parametergradienten der laufend gemessenen Stoffwechselleistung der Kultur stetig angeglichen. Die dadurch gegebene graduelle Veränderung einer Bedingung in Anstiegsabhängigkeit zur jeweiligen Stoffwechselleistung der Kultur ermöglicht die gezielte Anreicherung besser angepasster Organismen in der Kultur.

Zur Analyse des Stoffwechselverhaltens von Kulturen bei z.B. der Einwirkung von Substanzen, kann unter ständiger Registrierung der Stoffwechselleistung der Kultur bei Konstanthalten aller anderen Parameter, die interessierende Grösse verändert werden. Beispielsweise wird eine Substanzmenge einmalig zugegeben. Damit ist es bei längeren Kulturzeiten auch möglich, bei z.B. Giftstoffen die Erholungsphase, bei fördernden Substanzen die Abklingphase nach erfolgter Einwirkung zu erfassen. Durch Kontrolle des Verlaufes der Stoffwechselleistung bei Ablauf eines vorgegebenen Gradienten, - der also jm Gegensatz zur Selektion nicht rückführend gesteuert wird -, etwa bezüglich der Temperatur oder der Konzentration einzelner Substratkomponenten, können Aussagen über z.B. optimale Konzentrationen oder Werte in bezug auf eine interessierende Optimierung des Stoffwechselablaufes erhalten werden.

Nach Möglichkeit erfolgt die Messung der Stoffwechselleistung vorzugsweise über manometrische oder gasvolume-trische Daten. Die Messung in der Gasphase erbringt besonders Vorteile bezüglich des einfacheren Messwertabgriffes. Die Auftragung der Messwerte über die Zeit ergibt die Stoffwechselleistung der Kultur. Ebenso können andere Messwerte wie z.B. der pH-Wert oder Daten von schnellen Analysengeräten unter Bezug auf stoffwechselcharakteristische Substanzen zur Ermittlung der Stoffwechselleistung eingesetzt werden.

Dabei wird vorzugsweise so vorgegangen, dass die Mess-grösse digital als Signale erfasst und über einer analogen, vorzugsweise Zeitskala, fortlaufend registriert wird, worauf immer wieder eine Rückstellung auf den Anfangswert erfolgt. Dabei werden die registrierten Signale oder ihr zeitlicher Abstand zur Auslösung von die Parameter beeinflussenden Vorgängen benutzt. Werden die Kulturvolumina entsprechend erhöht, kann die Messung auch analog - z.B. über Strömungsmesser, IR-Messung oder ähnliches, bei Messwertaufnahme in der Gasphase - erfolgen.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beschreibung und in Verbindung mit der Zeichnung näher erläutert.

Die Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine Skizze einer Anordnung der grundsätzlichen Teile, mit deren Hilfe das erfindungsgemässe Verfahren durchgeführt werden kann, und

Fig. 2 eine Skizze eines Registriergerätes zur Aufzeichnung der Stoffwechselleistung in der Koppelung mit einem automatischen Gradienten-Anstiegsregler.

Die in Fig. 1 dargestellte Anordnung besteht aus einem Kulturgefäss 10 in Form eines gasdichten Behälters mit Temperiermantel 11, der über einen Umwälzthermostaten 12 temperiert wird. Frisches Medium wird mittels der Zulaufpumpe 14 durch die Leitung 13 aus dem Vorratsbehälter 15 in das Kulturgefäss 10 gepumpt, Überschuss-Kulturmedium und gebildetes Gas werden mittels der Ablaufpumpe 16 entnommen. Eine unten offene Trennwand im Kulturgefäss 10 zwischen Zu- und Ablaufstutzen gewährleistet den Durchlauf zugegebenen frischen Mediums durch das ganze Kulturgefäss. Ein verschliessbarer Stutzen 17 dient der Startbeimpfung und Probenahme. Ein weiterer Zugabeteil dient wechselweise oder in Parallelschaltung gemeinsam der Zugabe 18 von Fremdstoffen, dem Anschluss einer Zugabepumpe 19 für den Gra3 618 736

dienten einer gelösten Untersuchungssubstanz oder/und einer Rückstellpumpe 20 zur z.B. Zugabe des Elektrolyten bei einer pH-Steuerung. Die notwendige Homogenität der Kultur wird durch einen Magnetrührer 21 erreicht. Der Messwertaufneh-5 mer 22 gibt Messsignale direkt oder über einen Gradienten-Anstiegsregler 23 zum Steuergerät 24. Dieser gibt die Messsignale weiter an das Registriergerät 25, das mit Hilfe des/der Berührungsschalter 26 entweder direkt oder über den Gradienten-Anstiegsregler 23 Einfluss auf das Steuergerät 24 neh-10 men kann. Das Steuergerät 24 hält die eingestellte Rührerkonstanz aufrecht, betätigt aufgrund der Messsignale die Zu-und Ablaufpumpen 14 bzw. 16 und der Rückstellpumpe 20 und aufgrund der Signale des Gradienten-Anstiegreglers 23 der Zugabepumpe 19 oder den Thermostaten 12.

15 Je nach Aufgabenstellung und Kulturvolumen kann das Kulturgefäss 10 mit Einrichtung für den Durchlaufzwang aus Glas oder anderen Werkstoffen bestehen und je nach Messwertaufnehmer gasdicht, druckdicht oder nur mit einem einfachen Sterilabschluss ausgeführt sein. Vorzugsweise sollte das 20 Kulturgefäss 10, besonders bei kleinen Kulturvolumina, für Konstanz des Kulturvolumens so eingerichtet sein, dass die Höhe des Ablaufstutzens über dem Boden dieses Volumens bestimmt. Temperierung 11 und 12 ist frei variabel. Die Zulaufpumpe 14, Gradientenzulaufpumpe 19 und je nach Auf-25 gabenstellung Rückstellpumpe 20 müssen eindeutige Dosierungen zulassen, 19 und 20 dazu eine Gradientendosierung. Bei Messung in der Gasphase übernimmt die Ablaufpumpe 16 zweckmässigerweise die Funktion der Rückstellpumpe 20. Ebenso kann es zweckmässig sein, besonders bei kleinen Vo-30 lumina den Gradientenparameter (gelöste Substanz) dem Medium zuzugeben und durch die Zulaufpumpe 14 zugeben zu lassen. Je nach Konstruktion des Kulturgefässes, Kulturvolu-men und Messwertaufnehmer kann auf die Ablaufpumpe 16 verzichtet oder die Zulaufpumpe 14 und gegebenenfalls Ab-35 laufpumpe 16 durch je ein Stellventil ersetzt werden, dies besonders bei grossen Kulturvolumina und z.B. Strömungsmessern oder dergleichen als Messwertaufnehmer. Die Rückstellpumpe 20 kann bei kleinen Kulturvolumina bei z.B. der Zugabe des Elektrolyten bei pH-Regelung durch ein Magnet-40 ventil ersetzt werden. Die notwendige Homogenisierung der Kultur ist frei variabel und den Kulturvolumina anzupassen. Der Messwertaufnehmer 22 ist je nach Aufgabenstellung, Gegebenheiten und Möglichkeiten bezüglich des Stoffwechselablaufes auszubilden als z.B. Kontaktmanometer, Gasvolu-45 menmesser, pH-Meter, ionenselektive Elektroden, schnelle Analysengeräte, spektroskopische Verfahren, bei grossen Volumina auch Strömungsmesser und dergleichen. Der Gradienten-Anstiegsregler 23 ermittelt aus dem Vergleich der Messsignale und/ oder deren zeitlichem Abstand die Stoffwech-50 selleistung der Kultur und gibt diese umgeformt als Signale für den Gradientenanstieg an das Steuergerät 24 weiter. Dieser Gradienten-Anstiegsregler kann alleine oder in Zusammenfassung mit dem Registriergerät 25 und dessen Berührungsschalter 26 ausgeführt sein. Seine Funktion und mögliche 55 technische Ausgestaltung wird eingehend zusammen mit dem Registriergerät 25 in Zusammenhang mit Fig. 2 besprochen. Das Steuergerät 24 beinhaltet die Gradientensteuerungen für die Zugabepumpe 19 und den Thermostaten 12, hält die eingestellte Rührkonstanz aufrecht und wird bei anderen Auf-60 gabenstellungen und Anordnungen je nach Notwendigkeit auch die Einheiten für z.B. eine Belüftung, Antischaumregu-lierung und andere, bereits bekannte, Kontroll- und Regeleinrichtungen beinhalten.

Durch Regelung unter Bezug auf Messwerte, die repräsen-65 tativ für die Stoffwechselleistung der Kultur sind, weist diese bei gleichbleibenden Aussenbedingungen pro Volumeneinheit stets gleiche Stoffwechselleistung auf. Damit kann einer derart geregelten Kulturanlage über lange Zeit stets gleichbleibend

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stoffwechselaktives Material zur Beimpfung von Folgekulturen entnommen werden.

Verändert man eine Kulturbedingung in der Zeit langsam genug, so werden sich solche Organismen in der Kultur anreichern, die sich unter den jeweiligen gegebenen Bedingun- 5 gen im Selektionsvorteil befinden. Es tritt also eine Selektion besser angepasster Organismen oder Mutanten in der Kultur auf. Wird der Anstieg des Änderungsgradienten der Stoffwechselleistung angepasst, so wird im äussersten Fall der Gradient = 0, die Kultur kann aber nicht durch Überschreiten 10 eines Grenzwertes abgetötet werden. Änderungsgradienten sind interessant z.B. bezüglich der Temperatur, des pH-Wertes oder besonders für Konzentrationen von Substanzen für Selektionen wie: Resistenz gegen, erhöhte Abbaufähigkeit für, Anhäufung bestimmter Stoffwechselprodukte, Veränderung 15 bisher inert erscheinender Substanzen (Umweltschutz) und dergleichen. Besonders gute Resultate sind zu erwarten, wenn die Möglichkeit gegeben ist, die betreffende Bezugssubstanz oder Folgeprodukte direkt mit einem Messwertaufnehmer oder durch eine schnelle automatische Analysenmethode zu 20 bestimmen und für die Regelung des Gradientenanstieges zu verwenden. Bestrahlungen im Reaktionsgefäss durch z.B. punktförmige Quellen oder Zusatz mutationsauslösender Chemikalien können gegebenenfalls dem Gradienten zur Selektion eine Erhöhung der Mutationsrate parallel gehenlassen. 25 Dies gilt selbstverständlich sinngemäss auch für Selektionen aus Mischpopulationen. Bei Konstanthalten der Kulturbedingungen resultiert eine gleichbleibende Stoffwechselleistung der Kultur, ein sog. «Steady State», in bezug auf den Messwert für die Regelung, z.B. die C02-Bildung pro Zeiteinheit. Da- 30 durch können Einwirkungen von Aussenbedingungen wie Temperatur, pH-Wert oder auch von Substanzen auf den «Steady State» einer Kultur untersucht werden. Dabei wird unter ständiger Registrierung der Stoffwechselleistung der Kultur unter Konstanz aller anderen Parameter die interes- 35 sierende Grösse z.B. mit einem steilen Gradienten verändert (im Gegensatz zur Selektion, bei der mit möglichst flachen Gradienten gearbeitet wird). Durch Auswaschung bei weiterer Stoffwechseltätigkeit wird dann diese Substanzkonzentration einem der Stoffwechselleistung proportionalen Gradienten 40 unterworfen. Damit ist es möglich, bei längerer Kulturzeit bei z.B. Giftstoffen die Erholungsphase, bei fördernden Substanzen die Abklingphase zu erfassen. Gemessen wird dabei der Einfluss der Substanz auf die je nach Messwertaufnehmer definierte Stoffwechselleistung. Durch Kontrolle des Verlaufes 45 der Stoffwechselleistung bei Ablauf eines vorgegebenen Gradienten (im Gegensatz zur Selektion ohne Steuerung des Gradientenanstieges), etwa bezüglich der Temperatur oder der Konzentration einzelner Substratkomponenten können Aussagen über z.B. optimale Konzentrationen oder Werte in 50 bezug auf eine interessierende Optimierung des Stoffwechselablaufes erhalten werden.

Als Beispiel sei die Selektion gärender Hefen in bezug auf eine höhere Verträglichkeit gegenüber einer Substanz X bei manometrischer Messung der C02-Bildung pro Zeiteinheit 55 angegeben: Druckanstieg am Manometer 22 durch die C02-Bildung bis zu einem vorgewählten Maximum, Weitergabe des Maximum-Signals über die Steuereinheit 24 an die Abgabepumpe 16, die in diesem Fall gleichzeitig als Rückstellpumpe arbeitet und dem Kulturgefäss 10 etwas Kulturmedium und 60 C02 entnimmt, bis der eingestellte Minimalwert am Manometer 22 erreicht ist und dieses Minimumsignal die Abgangspumpe 16 stillsetzt. Der Gradientenanstiegsregler 23 hat inzwischen aus der geltenden Stoffwechselaktivität, die aus den Abständen vorausgegangener Maximumsignale ermittelt wur- es de, den darauf bezüglichen Gradientenanstieg ermittelt und an die Steuereinheit 24 weitergegeben. Diese gibt das Signal zur Zugabe einer bestimmten Menge von X an die Zugabepumpe 19, denn der Gradient insgesamt bedeutet die Zunahme von X im Kulturmedium pro Zeiteinheit durch eine jeweils gleiche Zugabemenge von X pro Maximumsignal, sein Anstieg wird durch eine jeweils geringere (oder höhere) Zugabemenge bei einem Maximumsignal, das eine verringerte (oder erhöhte) Stoffwechselleistung anzeigt, verändert (wie später im einzelnen bei der Beschreibung des Registriergeräts und das Gradientenanstiegsreglers anhand von Fig. 2 beschrieben wird). Damit steigt die Konzentration von X in der Kultur in Abhängigkeit von der Stoffwechselleistung - und der Selektion und Vermehrung besser angepasster Organismen langsam im Kulturverlauf bis zu einer Grenze, die in den Organismen zu suchen ist. Es kann also mit einem solchen Verfahren auch die obere Grenze für die Anpassungsfähigkeit in einem gegebenen Zeitraum (Kulturdauer) für die Organismen ermittelt werden.

Bei der Analyse der Wirkung steigender Konzentrationen der Substanz X auf gärende Hefen bei manometrischer Messung der C02-Bildung pro Zeiteinheit wird bei fortlaufender Messung und Registrierung der Stoffwechselleistung der Gradientenanstiegsregler 23 ausgeschaltet und die Konzentration von X durch die Steuereinheit 24 pro Maximumsignal gleichbleibend oder um ein durch eine Kurve gegebenes Mass erhöht. Bei einem vorgegebenen Grenzwert der Stoffwechselaktivität wird die Zugabe von X endgültig abgeschaltet und der weitere Verlauf der Stoffwechselleistung bis zum Erreichen der ursprünglichen Stoffwechselleistung als Erholungszeit verfolgt. Der Gradient wird dabei zumeist steiler gewählt werden als bei einem Selektionsverfahren.

Wird dagegen z.B. eine Säurebildung als Messwert erfasst, so sollte das Kulturgefäss 10 zwar steril, nicht aber gasdicht ausgeführt sein. Die Massspanne ist durch die Differenz der pH-Werte zwischen dem des sterilen Substrates und dem festgesetzten pH-Abweichwert durch Einstellung am pH-Meter 22 bestimmt. Die Rückstellung erfolgt als Rücktitration und wird je nach Kulturvolumen über eine Rückstellpumpe oder ein Magnetventil 20 erfolgen. Dabei ist eine Ablaufpumpe in diesem Falle einer pH-Steuerung bei Verwendung eines Kultur-gefässes mit Volumenkonstanz aufgrund der Ablaufstutzen-höhe nicht notwendig, was sinngemäss für alle Messwertaufnehmer gilt, die keine Gas- oder Druckdichtigkeit des Kultur-gefässes voraussetzen.

Generell ist es zweckmässig, bei allen genannten Verfahrensmöglichkeiten so vorzugehen, dass die jeweiligen Zugabemengen möglichst klein im Verhältnis zum Gesamtkulturvo-lumen sind (Medium, rückstellende Grösse wie etwa Elektrolyt, und Substanzparameter), was durch erhöhte Konzentrationen besonders von rückstellenden Grössen und Parametersubstanzen erreicht werden kann. Bei kleinen Kulturvolumina und hohen Temperaturschwankungen kann sich die Verwendung von Differenzdruckmanometern in Messung gegen ein steriles Vergleichsgefass in Grösse des Kulturgefässes empfehlen. Dabei sind für Zu- und Abgabe nur Pumpen zweckmässig, die das Kulturgefäss - wie etwa Schlauchpumpen -immer gegen den barometrischen Aussendruck voll abschlies-sen.

Die Ermittlung und Registrierung der für die Durchführung des Verfahrens erforderlichen jeweiligen Stoffwechselleistung oder Aktivität der Kultur in bezug auf den jeweils ermittelten Messwert erfolgt — bis aus die Möglichkeiten bei grossen Kulturvolumina-vorzugsweise dadurch, dass zur Regelung die jeweilige Produktionsmenge eines Stoffwechselproduktes oder Veränderung einer Messgrösse zwischen zwei Schaltzuständen an einem Kontakt-Messwertaufnehmer oder dergleichen fortlaufend gemessen und die jeweiligen Veränderungsraten bzw. die «oberen» Schaltzustände vor der Rückstellung über einer analogen Zeitskala aufgetragen werden.

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Mit dieser Produktion oder Veränderung in bezug auf die Messwerte in der Zeit ist die Stoffwechselleistung definiert.

Nach Fig. 2 kann zu diesem Zweck ein Registrierstift 30 mit gleichbleibender Geschwindigkeit aus einer Ausgangslage 31 quer zur Fortbewegungsrichtung (Pfeil) eines sich gleich-mässig vorschiebenden Registrierpapierstreifens 32 bewegt werden, ohne diesen zu berühren. Bei Eintreffen eines Signals druckt er einen Punkt, springt in die Ausgangslage zurück und läuft sofort wieder an, bereit beim Eintreffen eines weiteren Signals zu drucken, zurückzuspringen usf. Man erhält dabei eine für die Stoffwechselleistung charakteristische Punktfolge in einem Abstand von der Ausgangslage, die einerseits dem Zeitmass, andererseits den jeweils gleichbleibenden Abläufen bei Eintreffen eines Signals entspricht (Produktbildungsmenge, damit Substratverbrauch, Zugabe- und Abgabemenge von Substrat bzw. Kulturmedium, Rückstellgrösse, Veränderungsparameter usw.). Dadurch kann der Registrierstreifen entweder im Zeitmass oder dem Mass für eine der gleichbleibenden Grössen beim Eintreffen eines Signals geeicht werden.

Da bei dem erfindungsgemässen Verfahren die Stoffwechselleistung, also die Zeit für eine messbare, vorgegebene Produktionsrate eines Stoffwechselproduktes oder die Veränderungsrate einer Messgrösse erfasst werden muss, ist es aus Gründen der Anpassung an verschiedene Aufgaben zweckmässig, für den gleichmässigen Lauf des Registrierstiftes 30 über die Gesamtbreite des Registrierpapierstreifens 32 verschieden einstellbare Durchlaufzeiten am Registriervorschub 36 vorzusehen. Ein Endschalter 33 bewirkt dabei, dass bei grossen Signalabständen, z.B. einer Anlaufphase, der Stift bei Erreichen dieses Endschalters 33 ohne auszudrucken in die Ausgangslage 31 zurückspringt und sofort wieder anläuft, so dass in einem solchen Fall die tatsächlichen Signalabstände auch aus dem Punktabstand in der Fortbewegungsrichtung des Registrierstreifens abgelesen werden können. Auch der Papiervorschub 34 sollte verschiedene Vorschubgeschwindigkeiten zulassen. Zusätzlich ist zur Erhöhung der Empfindlichkeit eine Unterdrückung des Anlaufbeginnes nach erfolgter Rückstellung des Registrierstiftes durch eine-Verzögerungsschaltuhr 35 vorzusehen. Sind z.B. Signalfolgen von 150 sec zu erwarten, sind bei einer Durchlaufzeit von 180 sec und einer Schreibbreite von 60 mm 0,3 mm/sec ablesbar, bei einer Unterdrückungszeit von 120 sec könnte dagegen eine Durchlaufzeit von 60 sec gewählt und eine Ablesung von 1 mm/sec erreicht werden.

Bereits auf dem Markt befindliche, sogenannte «Plotter» weisen ähnliche Merkmale auf. Allerdings werden diese in beiden Koordinaten so angesteuert, dass die Signale aus Rechenmaschinen zu Kurven bzw. Zeichnungen verarbeiten, d.h. also in beiden Koordinaten in + und - Richtung. Zudem verarbeiten diese Geräte sehr hohe Signalfolgen pro Zeiteinheit und sind damit wesentlich höher spezifiziert ausgelegt, dabei wird auf einer ruhenden Unterlage aufgezeichnet. Im Unterschied dazu werden bei dem hier beschriebenen Gerät sehr langsame Signalfolgen (max. 2/min) in nur einer Richtung der Ordinate gegen eine analoge - zumeist Zeitskala - bei einem bewegten Registrierpapierstreifen erfasst.

Auch das in der erfindungsgemässen Vorrichtung angebrachte Registriergerät kann zur Ansteuerung durch Signale in beiden Richtungen bei ruhender Unterlage ausgebaut werden, was die Registrierung zweier vergleichsweise langsamer Vorgänge in bezug aufeinander erlaubt. Periodische Vorgänge oder auch Langzeit-Abläufe sind gut zu überwachen, wenn die analoge Zeitskala kreisförmig, also in der Art von Fahrtenschreibern, ausgebaut wird. Dies gilt besonders für z.B. Wachstumskurven von «Batch»-Kulturen, wobei die maximal theoretisch mögliche C02-Menge als äusserste Anschlaggrenze angenommen und die Schrittlänge des Registrierstiftes ohne Rücklauf nach jedem Maximum-Signal diesem theoretischen Ma-ximal-Anschlag angepasst wird.

Das erfindungsgemäss verwendbare Registriergerät ist neben der beschriebenen spezifischen Aufgabe, der Überwachung von Langzeitkulturen, sehr vielseitig einsetzbar, da es alle zeitlichen Überwachungen bei der Kontrolle der' Gleichmässigkeit jeglicher Art von Stückzahlproduktionen übernehmen kann. Die Vielseitigkeit dieses Registriergerätes resultiert vor allem daraus, dass keine Messwerte, sondern Schaltzustände erfasst werden, was eine spezielle diesbezügliche Anpassung an die zu überwachenden Systeme überflüssig macht.

Durch Anordnung von verstellbaren Berührungsschaltern 37 im Wege des Registrierstiftes 30 kann das Gerät auch für die Gradientenanstiegsregelung eingesetzt werden. Da mit der Stoffwechselleistung immer die Bildung einer Stoffwechselproduktrate oder Veränderungsrate einer Messgrösse erfasst werden, gibt der Abstand der Punktfolge von der Ausgangslage 31 des Registrierstiftes 30 gleichzeitig den zeitlichen Abstand für die Änderungsraten an. Setzt man unter gleichbleibenden Normalbedingungen für die Kultur diesen Punktabstand im Zeitmass also 100% der Stoffwechselleistung, so entspricht der halbe Abstand 200%, der doppelte Abstand 50% dieser Stoffwechselleistung, da für die gleiche Änderungsrate die halbe bzw. die doppelte Zeitspanne benötigt wurde.

Die Gradientensteuerung kann im einfachsten Falle so erfolgen, dass z.B. das Volumen einer Verdrängungspumpe über eine Kurvenscheibe verändert, oder die Drehzahl eines Pumpenmotors durch Verstellung eines Potentiometers variiert wird. Der Servomotor zum Antrieb der Kurvenscheibe oder eines Potentiometers wird über eine Schaltuhr 38 so reguliert, dass das Programm von 0 bis 100% in einer vorgebbaren Zeit abläuft.

Ist ein Signalabstand von 150 sec bei 100% der Stoffwechselleistung nach obiger Definition gegeben und lässt man zur Sicherheit der Kultur einen Rückgang dieser Leistung auf 50% zu, entspricht dies einer möglichen Signalabstandszeit von 225 sec. Bei 60 mm Schreibbreite und einer Unterdrückungszeit von 120 sec ist dann eine Durchlaufzeit von 120 sec, entsprechend 0,5 mm/sec, möglich. Für eine Zugabe von 100 bis 0% einer Substanz, die im Gradienten zugegeben werden soll, stehen also 225 - 150 = 75 sec zur Verfügung, die an der Schaltuhr 38 eingestellt werden. Trifft ein Maximumsignal nach 150 sec ein, werden 100% der entsprechenden Substanzmenge zugegeben. Trifft das Signal infolge gesunkener Stoffwechselleistung erst nach 225 sec ein, erfolgt keine Zugabe, während bei 187,5 sec 50% der entsprechenden Substanzmenge zugegeben werden. Die Gradientenanstiegsregulierung wird in diesem Falle also von den Berührungsschaltern 37 des Registriergerätes aus vorgenommen. Was die Form der Gradienten betrifft, können z.B. verwendete Potentiometer ebenso linear wie logarithmisch gewickelt sein, Kurvenscheiben jeder gewünschten Form verwendet, wie auch der Gradient proportional, umgekehrt proportional oder in anderer Form abhängig von der Stoffwechselleistung geartet sein.

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618 736 PATENTANSPRÜCHE

1. Kontinuierliches Verfahren zur Kultur von Mikroorganismen, bei dem Messungen in bezug auf das Stoffwechselgeschehen durchgeführt werden, dadurch gekennzeichnet,

dass zumindest einer der Parameter, die sich aus Kulturbedingungen und/oder Fremdstoffzugaben und/oder Organismeneigenschaften ergeben, fortlaufend einem Gradienten in Änderungsrichtung auf einen vorgegebenen Wert unterworfen und die Stoffwechselleistung der Kultur fortlaufend ermittelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur gezielten Selektion und/oder Anreicherung von den interessierenden Bedingungen besser angepassten Organismen bzw. Mutanten der auf die Selektion bzw. Anreicherung bezogene Parameter asymptotisch einem Grenzwert der Stoffwechselleistung angenähert und der jeweilige Messwert der Stoffwechselleistung zur Steuerung des Anstieges des Parametergradienten herangezogen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Analyse des Langzeit-Verhaltens von Organismen, insbesondere nach kürzer oder länger andauernder Veränderung einer der Kulturbedingungen und/oder Zugabe von Fremdstoffen, der interessierende Parameter unter Konstanthalten aller anderen Parameter einem Gradienten unterworfen wird und eine fortlaufende automatische Registrierung der Stoffwechselleistung erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Stoffwechselleistung manometrisch oder gasvolumetrisch erfolgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Messwerte zur Ermittlung der Stoffwechselleistung digital als Signale erfasst und die Signale über einer analogen Skala, vorzugsweise einer Zeitskala, fortlaufend registriert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale gezählt und gegebenenfalls zu einer Zeitzählung als Quotient in Beziehung gebracht werden.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die registrierten Signale oder deren zeitlicher Abstand zur Auslösung von die Parameter beeinflussenden Schaltvorgängen oder zur Steuerung des Anstieges von Gradienten herangezogen werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zum Registrieren der Signale der Registrierstift aus einer Endlage mit einstellbarer konstanter Geschwindigkeit quer zur Fortbewegungsrichtung des Registrierpapiers geführt und bei Ankunft eines Signals einen Punkt druckt und schlagartig in seine Endlage zurückgebracht wird, von wo aus er sofort wieder anläuft.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Registrierstift aus der Endlage erst nach einer wählbaren Unterdrückungszeit wieder anläuft.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Weg des Registrierstiftes durch variabel einstellbare Endschalter begrenzt oder an einstellbare Berührungsschalter, von denen Schaltsignale abgenommen werden können, herangeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass von den Endschaltern oder Berührungsschaltern Steuersignale für die Anstiegsregelung von Parameter-Gradienten oder andere Parameter-Beeinflussungen ausgelöst werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitskala auf eine runde Scheibe aufgebracht wird.

13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Kulturgefäss (10), das eine Einrichtung zum Zwangsdurchlauf frischen Mediums durch das ganze Kulturvolumen aufweist und dessen Ablaufstutzen eine solche Höhe über dem Gefassboden besitzt, dass das Kulturvolumen konstant ist, durch eine Steuereinheit (24) zur stetig graduellen Veränderung der Zugabe von Fremdstoffen und/oder Mediumsbestandteilen sowie der Temperatur im Kulturgefäss und durch ein Registriergerät, das aus einem einstellbaren Papiervorschub (34) einem Registrierstift (30) mit einer einstellbaren konstanten Durchlaufzeit für die Registrierpapierbreite aus einstellbaren Endschaltern (33) und/oder Berührungsschaltern (37) und aus einem Zählwerk (38) in Koppelung mit einem Zeitzählwerk zum Ermitteln der Stoffwechselleistung und zum darauf bezogenen Regeln des Gradientenanstieges besteht.