CH618985A5 - Process for the purification of protein conjugates. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Protein-Konjugaten, die sich gegenüber den zur Konjugation eingesetzten organischen Verbindungen in ihren elektrophoretischen Eigenschaften unterscheiden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Rohkonjugat zur Abtrennung von unerwünschten Nebenprodukten und nicht umgesetzten Konjugationspartnern einer präparativen Elektrophorese unterwirft.

Auf diese Weise können Protein-Konjugate, d.h. mit organischen Verbindungen kovalent verbundene Proteine oder Proteingemische, in reiner Form aus den bei der Konjugationsreaktion anfallenden Rohkonjugaten, die allgemein sowohl unerwünschte Konjugationsprodukte als auch nicht umgesetzte Konjugationspartner enthalten, gewonnen werden. Die Abtrennung kann nach Durchführung der Elektrophorese in einfacher Weise geschehen, indem man die Zone, welche die gewünschten Protein-Konjugate enthält, von den Zonen, welche die unerwünschten Konjugate bzw. die nicht umgesetzten Konjugationspartner enthalten, abtrennt.

Voraussetzung für die Durchführbarkeit des erfindungsge-mässen Verfahrens ist es, dass sich die unerwünschten Protein-Konjugate vom nicht umgesetzten Protein und dem zur Konjugation verwendeten organischen Molekül in ihren elektrophoretischen Eigenschaften, d.h. ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit, unterscheiden.

Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich insbesondere zur Reinigung von Protein-Farbstoff-Konjugaten, vorzugsweise von antikörperhaltigen Immunsera bzw. Proteinfraktionen, nach erfolgter Konjugationsreaktion mit Farbstoffen, insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen, beispielsweise mit Fluo-resceinisothiocyanat.

Die Erfindung betrifft weiterhin nach dem beschriebenen Verfahren gereinigte Protein-Konjugate und deren Verwendung in der immunologischen Diagnostik.

Protein-Farbstoff-Konjugate, insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierte antikörperhaltige Immunsera haben, wie nachstellend gezeigt wird, ihre besondere Bedeutung in der sogenannten Immunfluoreszenztechnik.

Die von A.H. Coons 1942 eingeführte Technik der Immunfluoreszenz gestattet die kombinierte Untersuchung der serologisch-immunologischen Spezifität und der morphologischen Charakteristik des zu analysierenden Materials. Grundlage dieser Methode ist die sogenannte Antigen-Antikörper-Reak-tion, bei der einer der beiden immunologischen Partner - in der Regel der Antikörper - mit einem fluoreszierenden Farbstoffkonjugiert ist. Die Sichtbarmachung der Antigen-Antikörper-Reaktionsverbindung im mikroskopischen Präparat erfolgt durch Anregung der sichtbaren Fluoreszenz mittels Strahlung im ultravioletten Bereich.

Die Immunfluoreszenz hat zur Identifizierung von gebundenen wie freien Antigenen und Antikörpern grosse diagnostische Beachtung gefunden.

Hierzu wird beispielsweise auf die folgenden Publikationen verwiesen: P.K. Nakane und G.B. Pierce, J. Histochem. Cytochem. 14 (1966) 929; M. Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York (1968); und Standardiza-tion in Immunofluorescence, herausgegeben von E. J. Hol-borow, Blackwell Scientific Pubblications, Oxford and Edinburgh (1970).

Gemäss diesem Stand der Technik werden antikörperreiche Fraktionen als sogenannte Immunsera mit Fluoreszenzfarbstoff - vorzugsweise mit Fluoresceinisothiocyanat — umgesetzt. Die weitere Reinigung des Umsatzproduktes erfolgt vorwiegend mittels Gelfiltration und mittels Ionenaustau-scher-Chromatographie an Diäthyl-Aminoäthyl-Cellulose. Dabei werden die fluoresceinkonjugierten Immunglobuline isoliert.

Diese Verfahren haben den Nachteil, dass man beim Versuch der Entfernung des nicht kovalent gebundenen Farbstoffes aus der fluoresceinkonjugierten Proteinpräparation mittels Gelfiltration oder Dialyse eine unvollständige Abtrennung des Farbstoffes beobachtet, insbesondere wird der adsorptiv an das Protein gebundene oder der hydrolytisch relativ leicht abspaltbare, schwach kovalent gebundene Farbstoff nicht entfernt. Ausserdem wird Farbstoff, der infolge Eigenpolymerisation bzw. Eigenkondensation höhere Molekulargewichte erreicht, ebenfalls nur unvollständig eliminiert.

Die Anwendung solcher, freien Farbstoff enthaltender, Präparate führt zu unspezifischen Fluoreszenzfärbungen am mikroskopischen Präparat und damit zu falschen Aussagen.

Bei dem gemäss dem Stand der Technik vorwiegend angewandten Verfahren zur Gewinnung der antikörperhaltigen konjugierten Proteinfraktion mittels Ionenaustauscher-Chromatographie an DEAE-Cellulose wird im wesentlichen nur der Antikörperanteil, der zur IgG-Klasse gehört, gewonnen. Unter den dabei angewandten Elutions- und Trennbedingungen werden Antikörper der IgM- und IgA-Klassen nur unvollständig bzw. überhaupt nicht abgelöst, so dass das gewonnene Präparat zum Teil einen erheblichen Verlust an gewünschten spezifischen Antikörpern aufweist. Bei Änderung der Elu-tionsbedingung zur Gewinnimg fluoresceinkonjugierter IgM-ünd IgA-Antikörper werden sogenannte «übermarkierte» Y-Globuline wie auch basophile Proteine miteluiert. Aufgrund ihres stark sauren Charakters führen diese sogenannten «übermarkierten» Proteinanteile bei immunologischen Reaktionen zur unspezifischen Bindung mit einer Reihe basischer Proteine im Untersuchungsmaterial und damit ebenfalls zu Fehlinterpretationen der erhaltenen Fluoreszenz.

Das erfindungsgemässe Verfahren weist die angegebenen Nachteile nicht auf. Die nach der Konjugationsreaktion, vorzugsweise imter Verwendung inerter Träger, durchgeführte elektrophoretische Reinigung farbstoffkonjugierter Proteinpräparationen, vorzugsweise fluoresceinkonjugierter Proteinpräparationen, bietet folgende Vorteile:

1. Das Verfahren ermöglicht eine optimale «massgerechte» antikörperhaltige Zonengewinnung. Unerwünschte, beispielsweise antikörperfreie Ballast-Protein-Fraktionen können bei der Eliminierung der gewünschten Fraktion ohne Schwierig2

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keiten verworfen werden. Die Ausbeute der antikörperhaltigen farbstoffkonjugierten Proteinpräparationen ist optimal. Im herangezogenen Beispiel der fluoresceinmarkierten 7-GI0-bulin-Fraktion werden 70 bis 90% der eingesetzten Menge wiedergewonnen.

2. Infolge der Konjugation von Proteinen mit sauren organischen Molekülen ändert sich der isoelektrische Punkt bei allen mit den organischen Molekülen in Reaktion getretenen Proteinen zu niedrigen Werten mit der Folge, dass sie unter den Bedingungen der Elektrophorese stärker anodisch wandern als nicht konjugierte Proteine. Die Entfernung zu sauer gewordener Proteine infolge starker Reaktion mit dem zur Konjugation eingesetzten Molekül bereitet keine Schwierigkeiten, da diese stärker anodenwärts wandern. Besonderes Gewicht hat dieses Ergebnis bei den mit dem sauren Fluoreszenzfarbstoff Fluoresceinisothiocyanat (chinoides System mit freier Carboxylgruppe) konjugierten Proteinen.

3. Die optimale Entfernung des nicht (oder adsorptiv) gebundenen sauren organischen Moleküls, dessen Präsenz in fluoresceinkorijugierten Präparaten zu unerwünschten, unspe-zifisChen Fluoreszenzfärbungen führt, ist bei dem erfindungs-gemässen Verfahren gewährleistet. Der Grund für die leichte Entfernung dieses Farbstoffanteils liegt darin, dass das saure Molekül selbst stark anodenwärts wandert. Die Belastung durch die elektrische Spannung bei den Bedingungen der präparativen Zonenelektrophorese führt zu einer Abspaltung von relativ schwach an Protein gebundenen Molekülen und verursacht eine gute Qualität der elektrophoretisch gewonnenen Protein-Konjugate. Im Falle der mit Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Proteine wird eine Stabilitätssteigerung solcher Präparate bei Aufbewahrung in wässriger Lösung gegenüber denen, die nach dem Stand der Technik gewonnen wurden, beobachtet.

4. Werden für die Konjugation als Proteine Antikörper eingesetzt, so gestattet das erfindungsgemässe Verfahren die Gewinnung aller farbstoffkonjugierter Antikörperklassen, z.B. IgG, IgA, IgM. Dies ist insbesondere bei der Verwendung von Antikörpern aus Seren, beispielsweise von Mensch, Ziege, Schaf oder Pferd, bei denen ausser den Antikörpern der IgG-Klasse auch die Antikörper anderer Immunglobulinklassen einen relativ hohen Anteil an der gesamten Antikörpermenge ausmachen, von Bedeutung. Dieser Faktor hat auch ein erhebliches wirtschaftliches Interesse, da antikörperhaltige Seren nicht in unbeschränkter Menge zur Verfügung stehen.

Wird das erfindungsgemässe Verfahren auf die Reinigung von mit Fluoresceinfarbstoffen konjugierten Antikörpern übertragen, so führt dies zu einer Erhöhung der Relation von spezifischen Antikörpern (Ab) zu Gesamteiweiss (P), des sogenannten Ab/P-Quotienten, was eine Steigerung der gewünschten spezifischen Fluoreszenz bewirkt.

5. Das erfindungsgemässe Verfahren, bei dem auf den Einsatz teurer chromatographischer Hilfsmittel verzichtet werden kann, beinhaltet eine wesentliche Verbilligung bei der Herstellung reiner Protein-Konjugate. Das vorzugsweise verwendete inerte Trägermaterial kann wiederholt eingesetzt werden.

Für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens empfiehlt sich insbesondere die Träger-Elektrophorese, wobei man sich bevorzugt einer Elektrophorese-Anordnung bedient, bei der der inerte Träger in einer horizontalen Wanne angeordnet ist.

Wird beispielsweise Polyvinylchloridgranulat als Trägermaterial verwendet, so lässt sich nach Auftrennung der antikörperhaltigen fluorescein-konjugierten Proteinfraktionen die gewünschte Präparation entsprechend den sichtbaren Banden herausschneiden und danach aus dem Träger mit einfachen Lösungsmitteln eluieren.

Ist das Konjugat ungefärbt, kann die Position von Protein,

Reaktionspartner und Protein-Konjugat indirekt, beispielsweise über einen Papierabklatsch, der anschliessend nach bekannten Methoden eingefärbt wird, nachgewiesen werden.

Häufig verwendete elektrophoretische Trägermaterialien neben Polyvinylchlorid sind um einige Beispiele zu nennen Polyacrylamid, Cellulose, Stärke, Glasperlen und Sand. Die Aufzählung dieser Beispiele ist nicht abschliessend aufzufassen, sie könnte vielmehr beliebig fortgesetzt werden.

Für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens lassen sich jedoch auch Elektrophorese-Anordnungen in vertikaler Bauart mit und ohne Trägermaterial verwenden. Sehr gute Reinigungseffekte werden auch mit kontinuierlich arbeitenden Elektrophoresegeräten erhalten.

Nach dem vorliegenden Verfahren können Antikörper-Präparationen jeden Usprungs, die mit Farbstoffen sauren Charakters kovalent gebunden worden sind, aufgetrennt werden. Ein besonders geeigneter Farbstoff ist dabei Fluoresceinisothiocyanat.

Es können jedoch auch nicht fluoreszierende Farbstoffe mit Proteinen umgesetzt werden und die infolge der Konjugationsreaktion gefärbten Proteine nach dem vorliegenden Verfahren abgetrennt werden, sofern die benutzten Farbstoffe ein unterschiedliches elektrophoretisches Wanderungs verhalten aufweisen.

Anstelle von Antikörpern können auch andere Proteine tierischen, pflanzlichen und mikrobiellen Ursprungs eingesetzt werden, wenn sie als Konjugate vom Ausgangsprotein und dem zur Konjugation verwendeten organischen Molekül abweichende elektrophoretische Eigenschaften aufweisen. Vorzugsweise werden als organische Moleküle für die Konjugation solche Verbindungen eingesetzt, bei denen der jeweilige isoelektrische Punkt im sauren pH-Bereich liegt.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens ist darin zu sehen, dass es mit seiner Hilfe gelingt, reine Protein-Konjugate, insbesondere von mit Fluoreszenz-Farb-stoffen umgesetzten Gammaglobulin-Fraktionen zu gewinnen.

Bei der Umsetzung von Gammaglobulin-Fraktionen mit den üblichen Fluoreszenz-Farbstoffen ist kein elektrophoretisch einheitliches Produkt zu erwarten, da die Struktur der für die Umsetzung in Frage kommenden Immunglobulinklassen bekanntlich verschieden ist und sehr viel eher eine unterschiedliche Anzahl von für die Umsetzung zugänglichen Ami-nogruppen besitzt. Obwohl eine relativ einheitlich wandernde Zone von nicht umgesetzten Gammaglobulinen bei elektrophoretischen Verfahren bekannt ist, muss die einheitliche Wanderung der mit Farbstoff umgesetzten Immunglobuline der verschiedenen Klassen als überraschend angesehen werden. Es war zudem nicht zu erwarten, dass die adsorptiv an .. Eiweissmolekülen gebundenen Farbstoffe im elektrischen Spannungsfeld vom Eiweiss abgetrennt werden. Schliesslich konnte aus der bekannten intensiven Bindung der Fluoreszenz-Farbstoffe an Ionenaustauschermaterial, welches gemäss dem Stand der Technik Verwendung findet, nicht erwartet werden, dass der freie Farbstoff bei elektrophoretischen Verfahren, insbesondere unter Verwendung des Trägers Polyvinylchlorid, eine besonders grosse Wanderungsstrecke im Vergleich zu den Protein-Konjugaten zeigt.

Durch die Anwendung der präparativen Elektrophorese wird ein Produkt erhalten, welches eine wesentlich höhere Reinheit aufweist, als das durch Chromatographie erhältliche Produkt. Das mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens erhaltene Produkt weist als überraschenden technischen Effekt eine höhere Spezifität bei seiner Verwendung als immunologisches Reagens auf als das Produkt nach dem Stand der Technik.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand der Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

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Beispiel 1

Eine 3%ige antikörperhaltige Serumeiweisslösung von der Ziege wird mit Fluoresceinisothiocyanat auf bekannte Weise im alkalischen Milieu umgesetzt. Das konjugierte Antiserum wird in einer mit 3,61 PVC-Pulver (Geon X 427 der Firma s Serva, Heidelberg) fassenden horizontalen Elektrophorese-Apparatur (Masse: 1 = 65,0 cm, b = 76,0 cm, h = 1,2 cm) bei pH-Wert 8,1, einer Feldstärke von 6 V pro cm, bei einer Stromstärke von 0,6 A während einer Laufzeit von 15 Stunden aufgetrennt. Die antikörperhaltige y-Globulin-Fraktion, die io ohne Konjugation an Fluoresceinisothiocyanat in der Regel in der Auftragsrille liegenbleibt bzw. sogar kathodisch wandert, ist deutlich in Richtung Anode gewandert. Die hellgelbe bis grünliche Färbung der antikörperhaltigen y-Globulin-Frak-tion zeichnet sich deutlich ab von den übrigen Protein-Frak- 15 tionen und von den freien Farbstoffanteilen, die dunkelgelb bis rötlich-braun gefärbt sind. Die gewünschte antikörperhaltige y-Globulin-Fraktion mit optimalem F/P-Quotienten, der übrigens unmittelbar nach der Auftrennung bandenweise bestimmt werden kann, wird als PVC-Zone herausgeschnitten zo und mittels 0,9%iger Kochsalzlösung aus dem Träger ausgewaschen. Das Eluat wird durch Ultrafiltration auf etwa 1 g % Ei-weiss eingeengt.

Danach kann die Endeinstellung und Qualitätskontrolle erfolgen. 25

Beim Einsatz von 3,6 g einer fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen Eiweisslösung (120 ml Antiserum) werden 0,5 g einer fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen y-Globulin-Fraktion gewonnen.

Werden antikörperhaltige Serumproteine vom Kaninchen 30 eingesetzt, so erhält man beim Einsatz von 8 g eines fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen Antiserums (120 ml)

1,0 g einer fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen y-Globulin-Fraktion.

Ähnliche Ausbeuten erhält man auch bei der Gewinnung von Antikörpern aus Humanseren. Unter Berücksichtigung, dass der Anteil der y-Globulin-Fraktion in einem Antiserum ca. 15 bis 18% ausmacht, sind die Ausbeuten, bezogen auf diese y-Globulin-Fraktion, als optimal zu bezeichnen.

Beispiel 2

Eine 3%ige Human-Transferrin-Lösung wird mit Fluoresceinisothiocyanat auf bekannte Weise im alkalischen Milieu umgesetzt. Das konjugierte Protein wird in einer mit 3,61 PVC-Pulver (Geon X 427 der Firma Serva, Heidelberg) fassenden horizontalen Elektrophorese-Apparatur (Masse: 1 = 65,0 cm, b = 76,0 cm, h = 1,2 cm) bei pH-Wert 8,1, einer Feldstärke von 6 V pro cm, bei einer Stromstärke von 0,6 A während einer Laufzeit von 15 Stunden aufgetrennt. Das Transferrin-Konjugat ist deutlich in Richtung Anode gewandert. Die gelb-braune Färbung der Transferrin-haltigen Zone zeichnet sich deutlich ab von den freien Farbstoffanteilen, die unterschiedlich gefärbt und noch weiter anodenwärts gewandert sind. Das Transferrin-Konjugat mit optimalem F/P-Quotienten, der übrigens unmittelbar nach der Auftrennung bandenweise bestimmt werden kann, wird als PVC-Zone herausgeschnitten und mittels 0,9%iger Kochsalzlösung aus dem Träger ausgewaschen. Das Eluat wird durch Ultrafiltration auf etwa 1 g % Eiweiss eingeengt.

Danach kann die Endeinstellung und Qualitätskontrolle erfolgen.

Beim Einsatz von 3,6 g Human-Transferrin werden ca. 3,0 g des entsprechenden fluoresceinkonjugierten Proteins gewonnen.

Claims (8)

618985 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Reinigung von Protein-Konjugaten, die sich gegenüber den zur Konjugation eingesetzten organischen Verbindungen in ihren elektrophoretischen Eigenschaften unterscheiden, dadurch gekennzeichnet, dass man das Rohkonju-gat zur Abtrennung von unerwünschten Nebenprodukten und nicht umgesetzten Konjugationspartnern einer präparativen Elektrophorese unterwirft.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man mit Farbstoffen konjugierte antikörperhal-tige Gammaglobulin-Fraktionen reinigt.

3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierte antikörperhaltige Gammaglobulin-Fraktionen reinigt.

4. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das elektrophoretische Verfahren unter Verwendung eines inerten Trägers durchführt.

5. Nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 gereinigte Protein-Konjugate.

6. Protein-Konjugate gemäss Patentanspruch 5, gereinigt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 2.

7. Verwendung der Protein-Konjugate nach Patentanspruch 5 in der immunologischen Diagnostik.

8. Verwendung nach Patentanspruch 7 der Protein-Konjugate nach Patentanspruch 6.