CH619614A5 - - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Dimeren von antigenbindenden Fragmenten, die auch als Fab'-Dimere bezeichnet werden und durch enzymati-sche Spaltung, wie Pepsinspaltung, aus Antitumor-Antikörper enthaltenden Immunglobulinen gebildet werden, als kovalente Träger für Antitumormittel, wie z. B. Daunomycin.
Erfindungsgemäss werden kovalent an Dimere von antigenbindenden Fragmenten gebundene Antitumorverbindun-gen hergestellt, indem man die Antitumorverbindung mit Natriumperjodat oxydiert, die oxydierte Antitumorverbindung unter Bildung einer Schiffschen Base an freie Äminogruppen des Proteins bindet und die gebildete Bindung durch Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert.
Beispielsweise werden kovalente Verbindungen von Daunomycin mit Fab'-Dimeren hergestellt, welch letztere sich von Immunglobulin ableiten, das aus einem Antilymphom-Antiserum isoliert worden ist. Diese Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer cytotoxischen Wirkung in vitro untersucht.
Die Erfindung sei anhand der folgenden Beschreibung näher erläutert, wobei überdies auf die beiliegende Zeichnung verwiesen wird.
Es wurde festgestellt, dass Verbindungen aus Antitumor-verbindungen und Antikörper erhalten werden können, die dazu bestimmt sind, die Target-Zellen möglichst spezifisch zu erreichen. Für die praktische Anwendung der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, dass alles, was nicht an das zelluläre Antigen gebunden ist, möglichst rasch aus dem Blutkreislauf entfernt wird.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird das Dimere von antigenbindenden Fragmenten, das wie gesagt als (Fab')2 bezeichnet wird und sich von einem Antikörper ableitet, gegenüber einem intakten Antikörpermolekül bevorzugt, welches noch das «kristallisierbare Fragment», das auch als das Fc-Fragment bezeichnet wird, enthält, da die Halbwertszeit des (Fab')2 im Blutkreislauf wesentlich kürzer ist als diejenige des intakten Immunglobulins. Die Verwendung von Antikörpern für eine lokale Abgabe von Antitumorverbindungen für therapeutische Zwecke kann heterologe Antikörper erzeugen, welche, da sie immunogen sind, unerwünschte Reaktionen hervorrufen können. Das Fe stellt den am stärksten immuno-potenten Teil eines Immunglobulins dar, und seine Entfernung führt zu einem Molekül, nämlich dem Fab'-Dimeren, welches weniger immunogen ist, obwohl es höchstwahrscheinlich noch Antikörper hervorzubringen vermag, welche mit determinan-ten Gruppen am Fab' zu reagieren vermögen.
Wie weiter oben bereits erwähnt worden ist, kann man erfindungsgemäss kovalente Verbindungen von Arzneimitteln mit Fab'-Dimeren, die sich von Immunglobulinen ableiten, erhalten. Als Antitumorverbindungen werden Cytotoxika, An-timetabolite, Antibiotika, Alkaloide besonders bevorzugt. Beispiele von Antitumorverbindungen aus diesen Klassen sind Daunomycin, Adriamycin, Methotrexat, Mithramycin, Cytosin-arabinosid und 6-Azauridin. Diese Verbindungen sind in The Pharmacological Basis of Therapeutics, herausgegeben durch Goodman et al., 5. Auflage, Abschnitt XV, Seiten 1248 bis 1308, 1975 erschienen bei Macmillan Co., New York, beschrieben. In der Praxis werden die kovalenten Verbindungen in einer Menge verwendet, die so viel Antitumorverbindung enthält, dass die gewünschte pharmakologische Reaktion hervorgerufen wird. Im allgemeinen entspricht diese Menge der Menge, wie sie in der Beschreibung für die entsprechende Antitumorverbindung geoffenbart ist. Die zu verabreichende Dosis hängt selbstverständlich von der verwendeten Verbindung, von deren Wirksamkeit, von der Art der Verabreichung, von der Grösse des Patienten und von der Natur der zu behandelnden Krankheit ab. Eine brauchbare Dosierung liegt beispielsweise bei Mäusen bei 2,5 ßg bis 5 mg pro kg Körpergewicht. Der Fachmann kann selbstverständlich grössere oder kleinere Mengen zur Anwendung bringen, um zum erwünschten, günstigen Resultat zu gelangen.
Die für die erfindungsgemässen Zwecke verwendeten antigenbindenden Dimeren werden durch Spaltung eines Immun-
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globulins, welches einen Antikörper enthält, der für ein Gewebe oder ein Zellen-Antigen spezifisch ist, mit einem proteolytischen Enzym erhalten. Im vorliegenden Falle wird ein An-titumor-Antikörper, welcher für ein Tumor-Antigen spezifisch ist, bevorzugt. Im allgemeinen können die Dimeren aus Im-munglobulinpräparaten hergestellt werden, die aus Blutzellen, Gewebezellen und Knochenmarkzellen isoliert worden sind. Dimere können beispielsweise aus Immunglobulinpräparaten gewonnen werden, welche für verschiedene Tumoren, einschliesslich Tumoren, die mit akuter lymphatischer Leukämie, akuter myelotischer Leukämie, Lymphom, Tumoren der Brust, der Blase und der Hoden, osteogenen Sarkomen, Weichgewebesarkomen und ähnlichen malignen Wachstumsarten zu tun haben, spezifisch sind. Das im vorliegenden Falle bevorzugte, proteolytische Enzym, das zum Abbau des Immunglobulins verwendet wird, ist Pepsin.
Die folgende Beschreibung erläutert ausführlicher die Art und Weise der Durchführung der vorliegenden Erfindung.
Erfindungsgemäss wurden kovalente Verbindungen aus Daunomycin und Fab'-Dimeren hergestellt, wobei sich die Dimeren von Immunglobulinen ableiten, die aus einem Anti-lymphom-Antiserum isoliert worden sind. Die kovalenten Verbindungen wurden in an sich bekannter Weise auf ihre cy-totoxische Wirkung in vitro getestet, wie weiter unten beschrieben. Ähnliche Resultate können auch bei anderen Warmblütern, wie Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen u. dgl., erwartet werden, und zwar aufgrund von bekannten Versuchen, die zeigen, dass verschiedene Makromoleküle sich in Tumorzellen lokalisieren und daher als Träger für cyto-toxische Arzneimittel vorgeschlagen wurden (vgl. beispielsweise Isliker et al. in Chemotherapy of Cancer, Seiten 278 bis 288, 1969 bei Elsevier Publishing Co., Amsterdam erschienen, und Hurwitz et al., Cancer Res., Bd. 35, Seiten 1175 bis 1181, 1975, und die darin zitierten Literaturstellen).
Die für die Herstellung der kovalenten Verbindungen verwendeten Chemikalien und Reagenzien wurden aus verschiedenen Quellen erhalten. Das Antibiotikum, nämlich Dauno-mycin-Chlorhydrat, wurde als Cerubidin von der Firma Specia, Paris, Frankreich, erhalten. Die Verbindung 5-[3H]-Uridin mit einer spezifischen Aktivität von 25 C/mM und 125 J wurde von der Firma Radiochemical Center, Amersham, England, erworben. Natriumperjodat und Natriumborhydrid wurden bei der Firma British Drug Houses, Poole, England, bezogen. Biogel® P-60 wurde bei der Firma Bio-rad, Los Angeles, Kalifornien, USA, gekauft. Porapak® Q mit einer Teilchengrösse von 0,177 bis 0,297 mm wurde bei Waters Associates, Boston, Massachusetts, USA, und Sephadex® G-200 bei Pharmacia, Uppsala, Schweden, bezogen.
Die verwendeten Tumorzellen und Antiseren wurden wie folgt hergestellt:
Tumorzellen, ein durch Maloney-Virus erzeugtes Lymphom (Yac), wurde nach der Methode von Klein et al. in J. Nati. Cancer Inst., Bd. 32, Seiten 547 bis 568, 1964 in A/J-Mäuse transplantiert. Das Antiserum gegen Rinder-Serumalbumin (BSA) wurde durch zweimalige subkutane Injektionen von 2 mg BSA, emulgiert in einem vollständigen Freunds-Ad-juvans, im Abstand von einer Woche bei Kaninchen erzeugt. Das Antiserum gegen Kaninchen-(Fab')2 wurde entsprechend bei Ziegen erzeugt. Die Antiseren gegen Yac-Zellen wurden durch fünf intravenöse Injektionen von 108 Zellen in 5tägigen Abständen hergestellt. Die Immunglobulinfraktionen dieser Antiseren wurden durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat bei 33 %iger Sättigung hergestellt. Beliebiges Antitumor-IgG oder -(Fab')2 wurden für die Anwendung in vivo von normalen Zellen der Milz, der Thymusdrüse, der Leber und von Erythrocy-ten absorbiert. Die Absorption wurde in Zeitabständen von jeweils 30 Minuten bei 37° C so lange wiederholt, bis keine restliche in vitro-Aktivität gegen normale Milz beobachtet werden konnte.
Die pharmakologische Aktivität von Daunomycin wurde primär durch die Hemmung der cellulären RNA-Synthese gemessen. Angaben über die Messung der Hemmung finden sich in der Veröffentlichung von Hurwitz et al., in Cancer Research Bd. 35, Seiten 117 bis 1181, 1975.
Das Dimere von antigenbildenden Fragmenten, (Fab')2, wurde wie folgt hergestellt: Immunglobulinfraktionen wurden bei einem Gewichtsverhältnis von Enzym zu Protein von 1/50 in einer 0,1 molaren Natriumacetatpufferlösung bei einem pH-Wert von 4,5 während 16 Stunden bei 37° C mit Pepsin gespalten. Dieser Abbau wurde durch Neutralisieren auf einen pH-Wert von 7,4 abgebrochen, worauf das Reaktionsgemisch extensiv gegen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) dialysiert wurde.
Die Jodierung von IgG von Ziegen-Antikaninchen-(Fab')2 erfolgte in folgender Weise: Die Immunglobulinfrak-tion aus Ziegenantiserum gegen Kaninchen-(Fab')2 wurde gemäss McConahey et al., Int. Arch. Allergy, Bd. 29, Seite 185, 1966, jodiert. Die spezifische Aktivität des Präparates betrug 1 x 108 cpm/mg Protein.
Die kovalente Bindung von Daunomycin an (Fab'Ja-Präparate erfolgte in folgender Weise: Die Bindung von Daunomycin an (Fab')2 erfolgte dadurch, dass das mit Natriumperjodat oxydierte Arzneimittel unter Bildung einer Schiffschen Base an die freien Äminogruppen des Proteins gebunden wurde. Diese Bindungen wurden hierauf durch Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert. Ausführliche Angaben für die Durchführung dieser Arbeitsweise finden sich mutatis mutan-dis bei Erlanger et al. in Proc. Nati. Acad. Sei., U.S., Bd. 52, Seiten 68 bis 74, 1964, und bei Hurwitz et al. in Cancer Res., Bd. 35, Seiten 1175 bis 1181, 1975. Der Substitutionsgrad kann in verschiedenen Präparaten von mindestens 1 Mol Arzneimittel pro Mol Dimer und üblicherweise von 2 bis 10 Mol Arzneimittel pro Mol Antikörper u. dgl. schwanken.
Das Messen der Antikörperaktivität erfolgte in folgender Weise: Die Antikörperaktivität von (Fab')2 aus Anti-BSA wurde mit dem BAS-T4-Bacteriophagen-System gemäss Hai-movich et al. in Biochem. Biophys. Acta., Bd. 207, Seiten 115 bis 124, 1970, gemessen. Das Anti-Yac-(Fab')2 wurde aufgrund seiner Bindung an Yac-Tumorzellen gemessen. Yac-Zellen (2 x 106) in 0,2 ml minimalem essentiellem Medium (Mem), welches 10% dekomplementiertes fötales Kälberserum (FCS) enthielt, wurden mit verschiedenen Konzentrationen von vollständigem IgG oder (Fab')2 aus Anti-Yac-Seren während 1 Stunde bei 0° C auf einer Schüttelvorrichtung bebrütet. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Zellen (bei lOOOx g) zentrifugiert und dreimal mit Mem gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen in 0,1 ml eines Mediums dis-pergiert, welchem 10% FCS zugegeben worden waren. Dann wurde jedes Glas mit einer Lösung von 5 mg/ml 125J-IgG von Ziegen-Antikaninchen-(Fab')2 versetzt. Das Gemisch wurde hierauf unter den gleichen Bedingungen wie oben erneut bebrütet und dann zentrifugiert und dreimal gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen in 0,5 ml Mem dispergiert und die gebundene Radioaktivität in einem Autogammazähier der Firma Hewlett-Packard Corp., Palo Alto, Kalifornien, USA, bestimmt.
Die Herstellung von (Fab')2 aus Anti-BSA- und Anti-Yac-Immunglobulinen erfolgte in folgender Weise: Mittels Ammoniumsulfat ausgefällte IgG-Fraktionen von Anti-BSA und Anti-Yac wurden mit Pepsin in der oben erwähnten Weise gespalten. Eine Probe eines jeden der gespaltenen Immunglobuline wurde auf eine (27 x 2 cm) Sephadex G-200-Säule gegeben und mit dem vollständigen (nicht gespaltenen) IgG-An-satz auf der gleichen Säule verglichen, wobei man die in Fig. 1 ersichtlichen Werte erhielt. Die Pepsinspaltung wurde bis zum
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Ende durchgeführt, was man daraus erkennen kann, dass die Reduktion und anschliessende Alkylierung des (Fab')2-Präparates ausschliesslich das Fab'-Monomer ergab, wie auf der gleichen Sephadex G-200-Säule festgestellt wurde. In Fig. 1 wird die Herstellung von Anti-Yac-(Fab')2 durch einen hellen Kreis (O) und diejenige von Anti-BSA-(Fab')2 durch einen ausgefüllten dunklen Kreis (•) dargestellt. Fig. 1 zeigt ferner die Gelfiltration über Sephadex G-200 (23 x 2 cm) der (Fab')2-Fraktionen im Verhältnis zum vollständigen IgG (X).
Die pharmakologische Aktivität des an Protein gebundenen Arzneimittels wurde in folgender Weise bestimmt: Die Hemmung des [3H]-Uridin-Einbaus wurde benützt, um die Arzneimittelaktivität quantitativ zu bestimmen. Die Aktivität von freiem Daunomycin und von zwei verschiedenen Präparaten von an (Fab')2 gebundenem Daunomycin findet sich in der unmittelbar folgenden Tabelle I. Die Resultate zeigen, dass die kovalente Bindung von Daunomycin an (Fab')2 keinerlei Verlust der pharmakologischen Aktivität des Arzneimittels mit sich brachte.
Tabelle I
Pharmakologische Aktivität von an (Fab')2 kovalent gebundenem Daunomycin
Daunomycin c'c Hemmung des [3H]-Uridineinbaus
Hg/ml Daunomycin Daunomycin- Daunomycin-
Anti- Anti-
BSA(Fab')2 Yac(Fab')2
13 43 58 56
33 64 74 80
66 80 84 85
Die Antikörperaktivität von daunomycinsubstitutiertem (Fab')2 ergibt sich aus Fig. 2. Die Fig. 2 zeigt die Antikörperaktivität von (Fab')2-Anti-BSA, bestimmt aus der prozentualen Inaktivierung von BSA-T4-Bacteriophagen nach der Methode von Haimovich et al. in Biochim. Biophys. Acta., Bd. 207, Seiten 115 bis 124, 1970. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, ergibt sich eine nur sehr geringe Reduktion der Antikörperaktivität der kovalenten Verbindung, verglichen mit unsubstitu-iertem (Fab')2. Die Antikörperaktivität bleibt sowohl in einem nur schwach substituierten Präparat (4 Mol/Mol) als auch in einem hochsubstituierten Präparat (14 Mol/Mol) in gleicher Weise erhalten. In Fig. 2 wird das Anti-BSA-(Fab')2 durch dunkle Kreise (•), Daunomycin-Anti-BSA-(Fab')2 15 Mol/Mol durch helle Dreiecke (A) und Daunomycin-Anti-BSA—(Fab')2 4 Mol/Mol durch helle Kreise (O) bezeichnet.
Die Aktivität des (Fab')2 aus Anti-Yac, gemessen auf Grund seiner Bindungsaktivität an die Target-Zellen, ist aus Fig. 3 ersichtlich. Daraus ist ersichtlich, dass die Antikörperaktivität der Daunomycin-(Fab')2-Verbindung, gemessen aufgrund der Bindung von jodiertem Ziegen-Antikaninchen-(Fab)2. verglichen mit dem vollständigen IgG oder mit nicht substituiertem (Fab')2, um 23 bis 27% abgenommen hat, wobei aber eine signifikante Bindungskapazität von über 70% erhalten bleibt. Die beobachtete Reduktion der Bindung von (Fab')2 an die Zellen, bezogen auf das vollständige IgG, mag dem Herstellungsverfahren zuzuschreiben sein. In Fig. 3 wird die Bindung von Anti-Yac-IgG durch helle Kreise (O), von
(Fab')2 durch Kreuze (X) und von Daunomycin-(Fab')2 durch helle Dreiecke (A) wiedergegeben, wobei die Bindung von Anti-Yac-IgG an Yac-Zellen durch eine Doppelbindungstechnik mittels mit 12SJ markiertem Ziegen-Antikaninchen-(Fab')2 gemessen wurde.
Die spezifische Cytotoxizität von Daunomycin-Anti-Yac-(Fab')2-Verbindungen wurde wie folgt bestimmt: Die Vorteile von an spezifisches Anti-Yac-(Fab')2 gebundenem Daunomycin gegenüber unbehandeltem Antikörper, wie Anti-BSA -(Fab')2, wurde in vitro dadurch getestet, dass man Tumorzellen an Arzneimittel gebundenen (Fab')2-Fraktionen oder aber dem freien Arzneimittel während nur 5 Minuten aussetzte. Die Zellen wurden hierauf gewaschen, um nicht an die Zellen gebundene Reaktionsteilnehmer zu entfernen. Die Toxizität des mit den Zellen in Kontakt bleibenden Daunomycins wurde aufgrund der Hemmung des [3H]-Uridin-Einbaus festgestellt. Wie aus den in der Tabelle II ersichtlichen Resultaten hervorgeht, war Daunomycin-Anti-Yac zweimal so wirksam wie unbehandeltes (Fab')2 von Anti-BSA oder das freie Arzneimittel.
In der beiliegenden Zeichnung zeigen:
Fig. 1 die Herstellung von Anti-Yac-(Fac')2 (O) und Anti-BSA-(Fab')2 (•). Gelfiltration auf Sephadex G-200 (23 x 2 cm) der (Fab')2-Fraktionen im Verhältnis zum vollständigen IgG (X).
Fig. 2 die Wirkung der Arzneimittelbindung auf die Anti-BSA-(Fab')2-Antikörperaktivität, gemessen durch BSA-Bac-teriophagen-T4-Inaktivierung, wobei Anti-BSA-(Fab')2 durch •, Daunomycin-Anti-BSA-(Fab')2 14 Mol/Mol durch A und Daunomycin-Anti-BSA-(Fab')2 4 Mol/Mol durch O wiedergegeben wird.
Fig. 3 die Wirkung der Arzneimittelbindung, die sich aus der Anti-Tumor-(Fab')2-Antikörperaktivität ergibt. Die Bindung von Anti-Yac-IgG (O), von (Fab')2 (X) und von Dau-nomycin-Anti-(Fab')2 (A) an Yac-Zellen wurde durch eine Doppelbindungstechnik mittels mit 125J markiertem Ziegen-Antikaninchen-(Fab')2 gemessen.
Tabelle II
Spezifische Cytotoxizität von an Anti-Yac-(Fab')2 gebundenem Daunomycin
Yac-Zellen, bebrütet % Hemmung des mit [3H]-Uridineinbaus
Daunomycin-Anti-Yac 60,56
Daunomycin-Anti-BSA 36,34
freiem Daunomycin 33, 16
Ähnliche Resultate können mit anderen Arten von Antitumorverbindungen, welche erfindungsgemäss kovalent an Fab'-Dimere gebunden sind, erhalten werden.
Dabei ist es klar, dass die an Antitumorverbindungen gebundenen Fab'-Dimeren eine erhöhte und verbesserte Aktivität gegenüber gewissen Tumorarten aufweisen, wobei sich diese Verbindungen an den Tumorstellen konzentrieren. Die erfindungsgemäss erhältlichen neuen Präparate sind daher für die Behandlung von verschiedenen Arten von Tumoren brauchbar.
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2 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von kovalent an Dimere von antigenbindenden Fragmenten gebundenen Antitumorverbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Antitumorver-bindung mit Natriumperjodat oxydiert, die oxydierte Antitu-morverbindung unter Bildung einer Schiffschen Base an freie Äminogruppen des Proteins bindet und die gebildete Bindung durch Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Dimeres von antigenbindenden Fragmenten ein solches verwendet, das sich von Anti-BSA- oder von Anti-Yac-Antikörpern, wobei BSA Rinder-Serumalbumin und Yac durch Maloney-Virus erzeugtes Lymphom bedeuten, ableitet.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Dimeres von antigenbindenden Fragmenten ein solches verwendet, das sich von Antilymphom-Antiserum ableitet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Antitumorverbindung Daunomycin, Adriamycin, Methotrexat, Mithramycin, Cytosin-arabinosid oder 6-Azau-ridin verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Daunomycin mit Natriumperjodat oxydiert, das oxydierte Daunomycin unter Bildung einer Schiffschen Base an freie Äminogruppen des Proteins bindet und die gebildete Bindung durch Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert.
Daunomycin ist ein starkes Antitumormittel und gilt als ein Beispiel von verschiedenen Mitteln, die auf neoplastische Zellen (bösartige Gewebsneubildungen) eine abtötende Wirkung ausüben. Die Verwendung solcher Verbindungen ist aber wegen ihrer Toxizität für das normale Gewebe nur beschränkt möglich. Die Selektivität der Toxizität solcher Mittel für Tumorzellen kann dadurch gesteiert werden, dass man ihre Verteilung im Körper derart steuert, dass das Arzneimittel am Ort der Tumorzellen konzentriert wird. Dies gelingt durch Anwendung von selektiven Antitumorantiseren als Träger für das Arzneimittel.
In den letzten Jahren wurde berichtet, dass gewisse Antitumormittel kovalent an Makromoleküle gebunden werden können, ohne dass gleichzeitig ein Aktivitätsverlust eintritt. Es wurde auch festgestellt, dass nicht kovalente Komplexe oder Mischungen von Arzneimitteln und Antitumorantikörpern unter gewissen Umständen bei der Behandlung von Krebs wirksamer sein können als das Arzneimittel allein. In früheren Studien wurde festgestellt, dass Daunomycin und Adriamycin kovalent an Immunglobulin gebunden werden können. Die cyto-toxische Aktivität von aus Arzneimittel und Antikörper gebildeten Verbindungen, Komplexen oder Mischungen, welche in vitro an Tumor- und normalen Zellenkulturen geprüft wurde, hat sich als ähnlich erwiesen wie die Aktivität des freien Arzneimittels, wobei eine signifikante Antikörperaktivität erhalten blieb. Werden aus Daunomycin und Immunglobulinen gebildete Verbindungen, Komplexe oder Mischungen, die eine gegen zwei Lymphtumoren gerichtete Wirkung haben, hinsichtlich ihrer toxischen Wirkungen auf verschiedene Tumor-Target-Zellen getestet, so konnte festgestellt werden, dass das Arzneimittel vorzugsweise solche Target-Zellen angriff, welche die Antikörper erkennen konnten.
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