CH620520A5 - Reagents for detecting antinuclear factors - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft Reagenzien zum Nachweis von antinukleären Faktoren, ein Verfahren zur Herstellung dieser Reagenzien sowie deren Verwendung in der klinischen Diagnostik.
Antikörper gegen die als Nuklearfaktoren bezeichneten Kernsubstanzen werden bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen des Bindegewebes, insbesondere bei Kollagen-Krankheiten wie Polyarthritis rheumatica, Sklerodermie, Lupus erythematodes visceralis (LE), Dermatomyositis und Periarteriitis nodosa, gefunden.
Diese Antikörper können gegen verschiedene Antigene wie Desoxyribonukleinsäure (DNS), Nukleoproteine, DNS-Histone (oft als Nukleoproteine angesehen), die Ribonukleinsäure (RNS) in den Nukleolen oder gegen Antigene gerichtet sein, die mit physiologischer Kochsalzlösung aus den Zellkernen extrahierbar sind (Sm-Antigen).
Zu ihrem Nachweis werden unterschiedliche Methoden wie Anti-Globulin-Konsumptionstest, Komplementbindungsreaktion, Präzipitationsreaktion, passive Hämagglutinationsreak-tion, Latex-Teste, immunhistologische und immunzytologische Verfahren angewandt.
Von den vorstehend aufgeführten Nachweismethoden von Antikörpern gegen Kernsubstanzen haben sich die immunhisto-logischen und die immunzytologischen Tests, insbesondere jene, die zur Sichtbarmachung der positiven Reaktion Fluoreszenzfarbstoffe verwenden, aus folgenden Gründen besonders bewährt:
a) Sie zeichnen sich durch hohe Sensibilität und Spezifität aus.
b) Sie erfassen Antikörper gegen alle o.a. Kernantigene und erlauben daher eine Differenzierung nach dem Muster und dem Grad der Fluoreszenz.
c) Die Tests können realtiv leicht durchgeführt werden.
In den bekannten Verfahren werden als Antigene verwendet:
1. Frische Kryostatschnitte von Versuchstierorganen oder menschlichem Gewebe.
2. Frische menschliche Zellen, z.B. Buccalzellen, Leukozyten und dergleichen.
3. Gewebekulturzellen menschlichen oder tierischen Ursprungs.
4. Stabilisierte Kalb-Thymozyten.
Um eine Extraktion wasserlöslicher Nukleoproteine (Sm-Protein) zu vermeiden, werden die Organschnitte oder Zellen in der Regel auf dem Objektträger nach geeigneten Methoden, z.B. mit Aceton, fixiert. Bei der Durchführung der Tests geht man im allgemeinen so vor, dass man das auf Antikörper zu untersuchende Patientenserum in unterschiedlichen Verdünnungen auf die Präparate aufträgt, inkubiert und abwäscht, danach mit einem mit fluoreszierendem Farbstoff, beispielsweise Fluoreszein-Isothiocyanat-(FITC)- oder Peroxydase-markiertem Antiserum gegen menschliche Immunglobuline überschichtet, erneut inkubiert und auswäscht. Die spezifisch gebundenen Antikörper werden durch Untersuchungen der Präparate auf Fluoreszenz oder histochemische Farbreaktion bei mikroskopischer Beobachtung erkannt.
Ein wesentlicher Nachteil bei der Verwendung der frisch zuzubereitenden Antigene ist ihre geringe Haltbarkeit bei Raum- oder kühlschrank-Temperatur. Der Untersucher ist damit gezwungen, sich stets frisches Material zu beschaffen oder eine Lagerung bei Temperaturen zwischen - 20 bis-30° C oder tiefer vorzunehmen. Die Nachteile wirken sich insbesondere bei der kommerziellen Herstellung entsprechender Reagenzien aus, da der Versand bei Gefriertemperaturen erfolgen muss, um die Antigenität nicht zu beeinträchtigen.
Die Verwendung von Gewebekulturzellen hat gegenüber anderem Antigenmaterial gewisse Vorteile, da die Einheitlichkeit des Antigenmaterials gut zu gewährleisten ist. Die Gewebekulturzellen sind in jeder gewünschten Menge herstellbar. Die Züchtung kann auf Objektträgern direkt vorgenommen werden. Nachteilig ist auch hier, dass diese Zellen bei Temperaturen unter 0° C gelagert werden müssen. In bestimmten Fällen wird zusätzlich die Aufbewahrung in Glyzerin empfohlen. Das Glyzerin ist vor der Verwendung der Objektträger als Reagenzien abzuwaschen. Dabei hat sich gezeigt, dass das Sm-Antigen, welches zum Nachweis der sogenannten gesprenkelten Fluoreszenz erforderlich ist, verloren geht.
Es wurde nun gefunden, dass die Haltbarkeit des Antigenmaterials in den Gewebekulturzellen entscheidend verlängert werden kann, wenn das Gewebekulturpräparat zusammen mit einem Trockenmittel in einem luftdichten Behälter verschlossen aufbewahrt wird.
Gegenstand der Erfindung sind demnach Reagenzien der in Patentanspruch 1 definierten Art sowie weiterhin ein Verfahren wie in Patentanspruch 5 definiert.
Die Fixierung erfolgt dabei zweckmässigerweise mit an sich bekannten, dafür verwendeten flüchtigen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, in an sich bekannter Weise. Die anschliessende Trocknung wird zweckmässigerweise bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter Temperatur bis etwa 50° C an der Luft oder im Vakuum ausgeführt.
Als Trockenmittel kommen allgemein die in der chemischen Technik zur Wasserdampfbindung verwendeten Stoffe in Frage, insbesondere solche, deren Wasserpartialdruck über dem frischen Trockenmittel bei 25° C weniger als 2 X10-1 Torr beträgt, beispielsweise CaCl2, CaO, A1203, Anhydrit oder P2Os. Ein direkter Kontakt der Präparate mit dem Trockenmittel ist dabei zu vermeiden.
Als Zellen können alle Zellarten verwendet werden, die dem Fachmann als Reagenzien zum Nachweis der Antinuklear-faktoren geeignet erscheinen und die bislang dafür in frischer Form zubereitet und auf Objektträger fixiert wurden. Besonders geeignet sind für die beispielhaft herausgegriffene Diagnose der Lupus erythematodes-Erkrankung Nierenzellen von
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jungen Hamstern, sogenannte BHK-Zellen, Kaninchennierenzellen, menschliche Amnionzellen, HeLa-Zellen oder andere permanente Zell-Linien bzw. in Kultur gehaltene Zellstämme. Bevorzugt werden BHK-21 -Zellen verwendet, die im einzelnen von N. Stoker und I. Macpherson beschrieben wurden (Nature 203, (1964), 1355 bis 1357).
Die erfindungsgemässen Reagenzien sind bei Kühlschranktemperaturen lagerfähig; bei 4° C wird innerhalb von etwa 12 Monaten keine Wertminderung der Reagenzien beobachtet, wohingegen nicht erfindungsgemäss haltbar gemachte Gewebekulturzellen schon nach wenigen Tagen bei gleicher Lagertemperatur keine oder nur eine schwache Fluoreszenz mit antikör-perhaltigen Seren erkennen lassen.
Die Erfindung soll am nachstehend aufgeführten Beispiel näher erläutert werden.
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Beispiel
BHK-Zellen werden nach I. Macpherson u. M. Stoker, Virology 16, (1962), 147 bis 151, auf Objektträgern mit markierten Reaktionsfeldern vermehrt. Nach 24 Stunden werden die zellbeladenen Objektträger aus dem Nährmedium entfernt und mit physiologischer Kochsalzlösung abgespült, danach 10 Sekunden in physiologische Kochsalzlösung eingestellt und mit 5 50%igem (verdünnt mit physiologischer Kochsalzlösung) Aceton und anschliessend mit unverdünntem Aceton abgespült. Die Objektträger werden 2mal je 10 Sekunden in frisches Aceton gestellt und dann 10 Minuten in frischem Aceton fixiert. Nach kurzer Trocknung an der Luft werden die Objektträger einzeln io in Seidenpapier verpackt und in einen durch Verschrauben abzuschliessenden Behälter der Abmessungen 18 X 8 X10 cm eingebracht. Der Boden ist in einer Höhe von 2,5 cm mit Phosphor-Pentoxid bedeckt und das Phosphor-Pentoxid seinerseits zur Vermeidung eines Kontaktes mit den Objektträgern 15 mit Zellullosemull abgedeckt.
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Claims (9)
1. Reagenzien zum Nachweis von antinukleären Faktoren enthaltend auf Objektträgern fixierte Gewebezellen, eingeschlossen in einem Behälter mit einer wasserdampfarmen Atmosphäre.
2. Reagenzien nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebezellen Gewebekulturzellen sind.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Reagenzien nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebekulturzelle die BHK-21-Zelle ist.
4. Reagenzien nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich in dem Behälter ein Trockenmittel, dessen Wasserpartialdruck bei 25° C weniger als 2 X10"1 Torr beträgt, befindet.
5. Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gewebekulturpräparat schonend auf Objektträgern fixiert, trocknet und zusammen mit einem Trockenmittel in einem luftdichten Behälter einschliesst.
6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Gewebekulturpräparat die BHK-21-Zelle verwendet.
7. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Trockenmittel mit einem Wasserpartialdruck bei 25° C von weniger als 2 X10"1 Torr verwendet.
8. Verwendung von Reagenzien nach Patentanspruch 1 in der klinischen Diagnostik.
9. Verwendung nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man zum Nachweis von Lupus erythematodes visceralis ein Reagenz nach Patentanspruch 3 verwendet.
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