CH621148A5 - Process for obtaining bacterial strains and their use for the preparation of an optically active carboxylic acid - Google Patents
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Description
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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Gewinnung von Bakterienstämmen, welche in möglichst kurzer Zeit einen maximalen Anteil der vorgelegten Kohlenstoffquelle in D(- > 3-Hydroxybuttersäure umzusetzen vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Buttersäure oder D(- > 3-Hydroxybuttersäure ausscheidenden oder Poly4D-3-hydroxybuttersäure) aufspeichernden Bakterienstamm der Einwirkung von mutagenen Agenzien unterwirft, unter den entstandenen Mutanten jene auswählt, welche D(- > 3-Hydroxybuttersäure nicht zu assimilieren vermögen und von diesen wiederum jene auswählt, welche - gegebenenfalls nach erneuter Mutation - bei Züchtung in einem wässrigen Nährmedium, welches als Kohlenstoffquelle ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe Glucose, Saccharose und Lactose, einen assimilierbaren Alkohol aus der Gruppe Menthol und Äthanol,
oder die Ablauge der Caprolactamsynthese nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 40 "C und einem pH-Wert von 6 bis 8, mehr D(- > 3-Hydroxybuttersäure als der der Mutation unterworfene Ausgangsstamm produzieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Buttersäure ausscheidenden Bakterienstamm einen solchen von Clostridium butyricum ATCC 19398 und als Poly4D-3-hydroxybuttersäure) aufspeichernden Bakterienstamm einen solchen von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azoobacter chroococcum DSM 281, Bacillus megatherium DSM 32, Zoogloea ramigera ATCC 19623 oder Mycoplana rubra CBS 38576 einsetzt.
3. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 gewonnen Bakterienstämme zur Herstellung der D(- > 3-Hydroxybuttersäure, dadurch gekennzeichnet, dass man einen besagten Bakterienstamm in einem wässrigen Nährmedium, welches als Kohlenstoffquelle ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe Glucose, Saccharose und Lactose, einen assimilierbaren Alkohol aus der Gruppe Methanol und Äthanol, oder die Ablauge der Caprolactamsynthese nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 40 "C und einem pH-Wert von 6 bis 8 züchtet und die gebildete optisch aktive Carbonsäure aus der Kulturbrühe isoliert.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bakterienstamm die D(- > 3-Hydroxybuttersäure ausscheidenden Mutanten von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, z. B. die Mutante CBS 381 76; von Azotobacter chroococcum DSM 281, z. B. die Mutante CBS 383 76; von Bacillus megatherium DSM 32, z. B. die Mutante CBS 382 76; von Zoogloea ramigera ATCC 19623, z. B. die Mutante CBS 384 76; von Clostridium butyricum ATCC 19398, z. B. die Mutante CBS 380 76; und ferner Mycoplana rubra CBS 38576 und seine entsprechenden Mutanten verwendet.
5. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt der Nährlösung an Kohlenstoffquelle 2 bis 25 Gew.-% Glucose, Saccarose, Lactose, Melasse oder Molke berechnet als reines Kohlehydrat, 1 bis 10 Gew.-% Methanol oder Äthanol, oder 1 bis 10 Gew.-% Ablauge der Caprolactam- synthese - berechnet als die gesamten darin enthaltenen Carbonsäuren, beträgt.
6. Verwendung nach Anspruch 3,4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung unter aeroben oder anaeroben Bedingungen durchgeführt wird, je nachdem ob es sich bei dem verwendeten Bakterienstamm um einen Aerobier oder Anaerobier, z. B. die Gattung Clostridium, handelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Bakterienstämmen, welche D(- > 3-Hydroxy- buttersäure produzieren, und die Verwendung derart gewonnener Bakterienstämme zur Herstellung der erwähnten Säure.
Da in der Literatur sich widersprechende Angaben über die Bezeichnung optisch aktiver 3-Hydroxybuttersäuren vorliegen, gelten für die vorliegende Erfindung die nachfolgenden Definitionen.
Die in der Natur vorkommende bzw. physiologische 3-Hydroxybuttersäure oder D(- > 3-Hydroxybuttersäure (oder auch D(- > beta-Hydroxybuttersäure) hat bei einer Konzentration von 5 g pro 100 ml Wasser eine spezifische Drehung La]25 von -24,5 , während die in der Natur nicht vorkommende 3-Hydroxybuttersäure oder L(+ > 3-Hydroxybuttersäure bei einer Konzentration von 2,226 g pro 100 ml Wasser eine spezifische Drehung []d von +24,3 aufweist.
Im folgenden handelt es sich ausschliesslich um die bei der Natrium-D-Linie negativ drehende 3-Hydroxybuttersäure, welche der Einfachheit halber hinfort mit der Abkürzung HB bezeichnet wird.
Zur Herstellung der racemischen DL-3-Hydroxybuttersäure bestehend verschiedenen Verfahren; siehe unter anderem Deutsche Offenlegungsschrift 441 003 und Wislicenus, Ann. 149 (1869), 207. Ferner gelang es McKenzie und Harden, aus DL-3 Hydroxybuttersäure mittels Aspergillus niger die optisch aktive reine L(+ > 3-HydroxybuUersäure herzustellen [J. Chem.
Soc.83 (1903),430}.
In Mensch, Tier und Pflanzen kommt ausschliesslich die D(- > 3-hydroxybuttersäure, nämlich als unentbehrlicher Stoff im Fetthaushalt, vor [Edström et al., Acta Obstet. Gynecol.
Scand. 54(1975), 347; Moore et al., Am. J. Physiol. (1976), 619]. Eben zufolge dieses natürlichen Vorkommens und dieser physiologischen Funktion dürfte der Verbindung grosse Bedeutung unter anderem bei der parenteralen Ernährung und als Ausgangsstoff zur Herstellung für den menschlichen Organismus gut verträglichen chemischen Verbindungen zukommen.
Es ist dem um so erstaunlicher, dass es bis heute - im Gegensatz zu geschilderten Verhältnissen in bezug auf die racemische und die rechtsdrehende, nicht natürliche 3-Hydroxybuttersäure - noch kein Verfahren gibt, welches eine technisch durchführbare Herstellung der D(- > 3-Hydroxybuttersäure ermöglicht, Insbesondere waren bisher keine Mikroorganismen bekannt, welche die gewünschte Carbonsäure ausscheiden.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass unter den Mikroorganismen, welche zur Klasse der Schizomycetes von Naegeli (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, edit. R. S. Breed et al., 7. Auflage, The Williams and Wilkins
Company, Baltimore 1957) gehören, solche gewonnen werden können, welche ausgehend von äusserst billigen Kohlenstoffquellen hohe Konzentrationen von D(- > 3-Hydroxybuttersäure ausscheiden und sich bezüglich dieser Fähigkeit stets verbessern lassen. Die Mikroorganismen können von irgendeiner Kulturensammlung bezogen, oder aber aus natürlichem Material, wie Boden, Wasser, Luft, Jauche, nach bekannten Methoden leicht isoliert werden. Besonders geeignet sind Mikroorganismen, welche imstande sind, selbst Buttersäure oder Poly < D-3- hydroxybuttersäure) zu synthetisieren, wie z. B.
Angehörige der Familien Azotobacteraceae, Bacillaceae, Pseudomonadaceae, Methanomonadaceae, Spirillaceae, Achromobacteraceae und Enterobacteraceae.
Bekannte Poly(D-3-Hydroxybuttersäure) aufspeichernde Bakterienstämme, wie z. B. Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azotobacter chroococcum DSM 281, Bacillus megatherium DSM 32, Zoogloea ramigera ATCC 19623 und ein bisher unbekannter, aus Luft isolierter Methanolverwerter, der als
Mycoplana rubra-Stamm erkannt wurde, werden auf Fruktose als einziger Kohlenstoffquelle submers angezüchtet. Nach Entfernung der Kohlenstoffquelle werden die Mikroorganismen in ein Medium gebracht, welches als einzige Kohlenstoffquelle racemische 3-Hydroxybuttersäure, sowie ein die aktiven bzw.
wachsenden Zellen abtötendes Antibiotikum enthält. Die ruhende bzw. nicht wachsenden, überlebenden Zellen, die das Enzym 3-Hydroxybuttersäuredehydrogenase (= EC 1.1.1.30) nicht bilden und folglich ss-HB nicht assimilieren können, werden isoliert und auf ihre Fähigkeit zur Bildung von ss-HB geprüft. Zu diesem Zwecke wird in aliquoten Teilen der Kulturflüssigkeit gemäss der enzymatischen Methode von Williamson und Mellanby (Methods of Enzymatic Analysis, Verlag Chemie GmbH, Weinheim und Academic Press, Inc., New York 1974, Seite 1883), die Konzentration an HB quantitativ bestimmt.
Die so gewonnenen ss-HB-ausscheidenden Bakterienstämme werden mit bekannten mutagenen Agenzien behandelt, um Mutanten zu erzeugen, unter welchen diejenigen ausgesucht werden, welche pro Volumeneinheit der Kulturflüssigkeit noch höhere Konzentrationen an frHB als ihr Ausgangsstamm erzeugen.
Andererseits werden von Mikroorganismen, welche keine Poly4D-3-hydroxybuttersäure) aufspeichern, sondern Buttersäure bilden, wie die Clostridiumarten, z. B. das bekannte Clostridium butyricum ATCC 19398, in analoger Weise jene Abkömmlinge gesucht, welche keine 3-Hydroxybuttersäurehydrogenase bilden und folglich HB nicht mehr assimilieren können. Solche Stämme werden auf Agarplatten als Streukolonien angezüchtet. Nach erfolgtem Wachstum werden die Agaroberflächen mit einem Gemisch von 3-Hydroxybuttersäuredehydrogenase, Nicotin-adenin-dinucleotid in der oxydierten Form (NAD) und einem aus Methylenblau oder Triphenyltetrazoliumchlorid bestehenden Redoxindikator überschichtet und nach Kolonien gesucht, welche eine Verfärbung des Redoxindi kators bewirken.
Solche wurden isoliert und auf die Fähigkeit ss-HB zu produzieren untersucht. ss-HB-erzeugende Stämme werden dem erwähnten Mutationsverfahren unterworfen, um Abkömmlinge mit gesteigerter Produktivität für ss-HB zu erhalten.
Bakterienstämme, welche in möglichst kurzer Zeit einen maximalen Anteil der vorgelegten Kohlenstoffquelle in D(- > 3- Hydroxybuttersäure umsetzen, werden also erfindungsgemäss dadurch gewonnen, dass man einen Buttersäure oder D(- > 3- Hydroxybuttersäure ausscheidenden oder eine Poly4D-3- Hydroxybuttersäure) aufspeichernden Bakterienstamm der Einwirkung von mutagenen Agenzien unterwirft, unter den entstandenen Mutanten jene auswählt, welche D(- > 3-Hydroxybuttersäure nicht zu assimilieren vermögen und von diesen wiederum jene auswählt, welche - gegebenenfalls nach erneuter Mutation - bei Verwendung der nachstehend erwähnten Koh- lenstoffquellen und Züchtungsbedingungen mehr D(- > 3 Hydroxybuttersäure als der der Mutation unterworfene Ausgangsstamm produzieren.
Auf diese Weise sind als besonders ergiebige Quellen die D(- > 3-Hydrnxybuttersäure ausscheidenden Mutanten von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, z. B. die Mutante CBS 381 76; von Azotobacter chroococcum DSM 281, z. B. die Mutante CBS 383 76; von Bacillus megatherium DSM 32, z. B.
die Mutante CBS 382 76; von Zoogloea ramigera ATCC 19623, z. B. die Mutante CBS 384 76; von Clostridium butyrium ATCC 19398, z. B. die Mutante CBS 380 76; und ferner Mycoplana rubra, CBS 38576 und seine entsprechenden Mutanten gewonnen worden. Selbstverständlich lassen sich die erwähnten Bakterienstämme durch Anwendung der oben beschriebenen Methode in ihrer Produktivität weiterhin verbessern. Die genannten Stämme sind deponiert bei American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville (Maryland, USA), und Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM), München (BRD); die mit CBS angeführten Mutantenstämme sind am 4.8. 1976 bei Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn (Niederlande), deponiert worden.
Kreuzreferenz der Stammnummern für ATCC/NCIB/DSM:
DSM ATCC NCIB Bacillus megatherium 32 14581 9376 Alcaligenes eutrophus 10442 23440 428 Zoogloea ramigera 10340 19623 287 Clostridium butyricum - 19398 552
Die ss-HB-erzeugenden Bakterienstämme werden in der Folge nach bekannten Methoden daran gewöhnt, in hohen Konzentrationen von spezifischen Kohlenstoffqellen, nämlich Glucose, Saccharose, Lactose, Melasse, Molke, Methanol, Äthanol und der Ablauge von der Caprolactamsynthese, zu wachsen und HB zu produzieren, wobei NH4-lonen oder Harnstoff als Stickstoffquelle dienen und die üblichen Spurenelemente beigegeben werden.
Die Abkömmlinge von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 können nebst organischen Kohlenstoffquellen wie die oben erwähnten auch Kohlendioxyd assimilieren, wenn die Atmosphäre gleichzeitig molekularen Wasserstoff und Sauerstoff enthält, um a-HB zu produzieren.
Der Gehalt der Nährlösung an Kohlenstoffquelle beträgt mit Vorteil etwa 2 bis 25% Glucose, Saccharose, Lactose, Melasse oder Molke - berechnet als reines Kohlehydrat, etwa 1 bis 10% Methanol oder Äthanol, oder etwa 1 bis 10% Ablauge der Caprolactamsynthese - berechnet als die gesamten darin enthaltenen Carbonsäuren.
Obwohl all die erhaltenen Bakterienstämme p-HB auf festen Nährmedien produzieren, sind flüssige Medien für die Produktion vorzuziehen. Dafür werden in bekannter Weise wässerige Nährlösungen von der erwähnten Konzentration an Kohlenstoffquellen und mit einer assimilierbaren Stickstoffquelle sowie den notwendigen Spurenelementen bereitet. Die sterilen Nährmedien werden mit 0,1-10 Volumen-% einer Vorkultur beimpft und bei etwa 25-40 "C in stehender Kultur oder unter Luftausschluss - für die anaeroben Mikroorganismen, z. B. die Clostridiumarten, bzw. unter Rühren oder Schütteln und gegebenenfalls unter Zufuhr von Luft oder einem Gemisch von Kohlendioxyd, Wasserstoff und Sauerstoff (oder Luft) - für die aeroben Mikroorganismen, während 8 bis 72 Stunden inkubiert.
Um eine möglichst hohe Ausbeute an der gewünschten Carbonsäure zu erhalten, wird der pH-Wert der beimpften Lösung durch Zugabe steriler Alkalilösung bei 6 bis 8 gehalten.
Während des Wachstums der Biomasse kann laufend frische Kohlenstoffquelle beigefügt werden, um davon eine konstante Konzentration aufrecht zu erhalten und eine maximale Produktion von HB zu erreichen.
Die erfindungsgemässe Verwendung besteht also darin, dass man einen verfahrensgemäss gewonnenen D(- > 3-Hydroxybuttersäure produzierenden Bakterienstamm in einem wässerigen Nährmedium, welches als Kohlenstoffquelle ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe Glucose, Saccharose, Lactose, Melasse und Molke, einen assimilierbaren Alkohol aus der Gruppe Methanol und Äthanol, oder die Ablauge der Caprolactamsynthese nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 40 "C und einen pH-Wert von 6 bis 8 züchtet und die gebildete optisch aktive Carbonsäure aus der Kulturbrühe nach bekannten Methoden isoliert.
Nach Abschluss des Fermentationsansatzes, d. h. wenn die maximale ss-HB-Konzentration erreicht ist, kann die HB gegebenenfalls nach Abtrennung der Biomasse aus der Gärlösung mittels lonenaustauschern, oder nach Ansäuerung der Gärlösung auf etwa pH 1,5 bis 2,5 mittels mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie z. B. Äther, Chloroform oder anderen chlorierten Kohlenwasserstoffen, Äthylacetat oder anderen Estern, Isopropanol, Butanol und anderen Alkoholen, extrahiert werden. Aus den organischen Lösungsmitteln kann HB als Salz mit metallischen Kationen, wie z. B. Lithium, Kalium, Natrium, Calcium und Barium oder Nickel, gefällt oder in konzentrierte wässerige Lösungen übergeführt werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
Beispiel 1
Es wird zuerst eine Nährlösung bereitet, welche 0,9% NaHPO' 12 H2O, 0,15% KH2PO4, 0,1% NH4Cl, 0,04% MgSO- 7 H20, 0,0195% Eisen(II)-NH-citrat 6 H20, 0,00133% CaC12, sowie pro Liter Lösung 1 ml einer Spurenelementlösung mit 0,01% ZnSO4- 7 H2O, 0,003% MnCk-4 zu4 H2O,0,03% Borsäure, 0,02% CoClz.6 zu6 H2Q. 0,0001 CuCk- H2Q,'0,002 NiG .6 6 H2O, 0,003% Na2MoO4- 2 H20 enthält.
In 250 ml Erlenmeyerflaschen werden mit je 30 ml der Nährlösung Schüttel- bzw. Standkulturen bei 30 C während 16 bis 24 Stunden angezüchtet. Der bei 121 C während 20 Minuten sterilisierten Lösung werden pro 980 ml 20 ml sterilfiltrierte Fruktoselösung, enthaltend 10 g dieses Kohlehydrats, beigegeben. Die Beimpfung erfolgt mittels einer Öse ab 24-stündiger Schrägagarkultur.
Die Schüttelkultur wird auf einer Zentrifuge sedimentiert und die Biomasse mit Wasser gewaschen und in etwa 4 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Nach etwa 1 Stunde werden 4 ml 0,6-n Natriumacetat-Puffer von pH 4,6 und 4 ml einer 0,05-n Natriumnitritlösung zur Mutationserzeugung beigegeben und für wenige Minuten inkubiert. Nach Waschen wird die Biomasse eines jeden Mikroorganismus (siehe nachstehende Tabelle) auf etwa 10 Erlenmeyerflaschen zu 250 ml verteilt, welche mit obigem Medium beschickt sind und statt der Fruktose 2% DL-3-Hydroxybuttersäure enthalten.
Nachdem die Trübung in den Kolben sichtlich zunehmend ist, wird je nach Organismus pro Kolben je 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 2 mg/ml K-Penicillin G, bzw. 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 30 mg/ml Bacitracin, bzw. 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 2 mglml Colostin-Sulfat beigegeben oder je 0,5 ml von zwei verschiedenen Antibiotikalösungen zugefügt. Nach verschiedener Inkubationsdauer, d. h. nach 1 bis 16 Stunden, werden die Antibiotika ausgewaschen oder mit Penicillinase zerstört. Die überlebenden Mikroorganismen werden mit Wasser gewaschen und auf das Fruktosemedium verimpft.
Nach 16 bis 36 Stunden werden von jedem Kolben Verdünnungsreihen hergestellt und von jenen Verdünnungen, welche pro ml etwa 50 bis 1000 Keime enthalten, werden 0,1 ml auf Agarplatten ausgestrichen, um einzelstehende Streukolonien zu erhalten. Dieser Agar enthält als Kohlenstoffquelle 2% DL3-Hydroxybuttersäure-Natriumsalz sowie 0,008% Fruktose.
Nach etwa 48 Stunden haben sich viele sehr kleine, unterschiedlich aussehende Kolonien von etwa · bis 1 mm Durchmesser, sowie Kolonien von normaler Grösse gebildet. Von allen kleinen Kolonievarianten werden nun mittels sterilen Zahnstochern aus Holz Inokula übertragen, erstens auf einen bestimmten Platz einer Agarplatte mit DL-3-Hydroxybuttersäure-Natriumsalz als einziger Kohlenstoffquelle und zweitens sofort danach auf den entsprechenden Platz einer Agarplatte mit Fruktose als einziger Kohlenstoffquelle. Etwa 10 bis 30% der so geprüften Kolonien vermögen auf DL-3-Hydroxybuttersäure nicht zu wachsen. Diese werden auf das bekannte Fruktosemedium ausgebreitet, welchem 3% fein disperses CaCO3 (trocken sterilisiert) beigemengt worden sind, so dass die Platten milchig trüb aussehen.
Von allen Kolonien, welche den Kalk zu lösen vermögen, kann angenommen werden, dass sie eine Säure produzieren. Von diesen werden Schüttelkulturen im Fruktosemedium gemacht, um deren Fähigkeit zur Produktion von HB gemäss der enzymatischen Methode von Williamson und Mellanby (siehe oben) zu prüfen.
Bei den Arbeiten mit Clostridium butyricum wird unter strikten Anaerobie-Verhältnissen gemäss Schocher [ Ein Betrag zur Kenntnis der Wachstums- und Gärungsphysiologie der saccharolytischen Clostridien , Dissertation, Laboratorium voor Microbiologie, Technische Hochschule Delft (Nieder lande), 1959] gearbeitet. Die folgende Tabelle illustriert den Erfolg der angewendeten Technik.
Erzeugung von p-HB-produzierenden Mikrobenstämmen
Pro Art wurden etwa 100 000-1 000 000 Stämme auf Säurebildungsfähigkeit untersucht.
Bakterienstamm Antibiotika- Anzahl säure- Anzahl ss-HB-produzie- Stämme mit maximaler
Behandlung produziern- render Stämme ss-HB-Produktion mit der Kolonien bis bis bis in Bezeichnung des I mg/L 10 mg/L 95 mg/L mg/L besten Stammes Alcaligenes eutrophus ATCC23440 - ca. 10000 0 0 0 - und Mutanten davon Colistin/ ca. 10000 ca. 800 6 1 74 GA-3
Bacitracin (CBS 381 76) Bacillus megatherium DSM 32 - ca.8000 0 0 0 - und Mutanten davon Penicillin ca. 000 ca. 600 15 2 95 GB-1 (CBS38276) Azotobacter chroococ cum DSM 281 - ca.7000 0 0 0 - und Mutanten davon Bacitracin ca. 000 ca.
700 7 3 86 GC-7 (CBS 383 76) Zoogloea ramigera ATCC 19623 - ca.11 000 0 0 0 - und Mutanten davon Colistin ca. 12000 ca. 500 17 1 51 GZ-1 (CBS 384 76) Bakterienstamm Antibiotika- Anzahl säure- Anzahl ss-HB-produzie- Stämme mit maximaler
Behandlung produziern- render Stämme (1-1 B-Produktion mit der Kolonien bis bis bis in Bezeichnung des I mg/L 10 mg/L 95 mglL mg/L besten Stammes
Clostridium butyricumATCC19398 - ca. 16000 0 0 0 - und Mutanten davon Bacitracin/ ca.
16000 ca. 100 3 1 76 GC1-2
Penicillin (CBS 380 76)
Mycoplana rubra
CBS 38576 ca.5000 0 0 0 - und Mutanten davon Bacitracin ca. 000 ca. 300 21 4 67 GM-1 (CBD 385 76)
Beispiel 2 Die ss-HB-Produzenten GA-3, GB-1, GC-7, GZ-1, GCl-1,GC-2und GM-1 werden dem im Beispiel 1 beschriebenen Mutationserzeugungsverfahren unterworfen und analog auf Agarplatten ausgestrichen. Nach beendetem Wachstum werden die Kolo nien mittels Samtstempeln auf frische Agarplatten gebracht, welche solche Mengen von sterilem Bromkresolgrün oder Bromkresolpurpur als pH-Indikator enthalten, dass der Agar blau bzw. purpur angefärbt ist.
Nach kurzen Inkubationszeiten, d. h. schon nach 5 bis 6 Stunden, können zum Teil schon Verfärbungen des pH-Indikators festgestellt werden, wodurch Kolonien lokalisiert werden, welche schnell wachsen und viel Säure bilden. Solche werden ausgewählt und submers gezüchtet, um ihre ss-HB-Produktivität zu erfassen. Weitaus die meisten Abkömmlinge der eingesetzten p-HB-Produzenten produzieren weniger oder zum Teil gar keine B-HB. Doch werden unter Tausenden von mutativ erhaltenen Abkömmlingen ab und zu einer oder wenige wahrgenommen, welche mehr ss-HB produzieren als der Ausgangsstamm.
Solche werden einem erneuten Mutations-/Selektionszyklus unterworfen, um erneut die Stämme zu erfassen, welche noch höhere Konzentrationen von frHB produzieren können.
Aus den erhaltenen Gärlösungen wird die Biomasse abzentrifugiert und der pH-Wert vor oder nach dem Zentrifugieren mit verdünnter Säure auf etwa 1,5 bis 2,5 eingestellt. Die
Lösung wird mit Äthyläther mehrmals extrahiert, das Lösungsmittel mit Säure gewaschen und im Vakuum bei etwa 30 "C abgedampft. Dem konzentrierten Extrakt wird Petroläther oder Cyclohexan beigemischt, wodurch ss-HB ausfällt und abfiltriert werden kann. Die Extraktion kann auch mit Chloroform durchgeführt werden.
Auf diese Weise wurde vom Stamm GA-3 die Mutante GA-113 abgeleitet, welche innert 48 Stunden 1375 mg ss-HB/ Liter; vom Stamm GZ-l die Mutante GZ-317, welche 1980 mg p-HB/Liter; vom Stamm GC1-2 die Mutante GCI-138, welche
1670 mg ss-HB/Liter, sowie von Stamm GM-1 die Mutante GM-97, welche 1475 mg ss-HB/Liter produzierte, abgeleitet.
Durch weitere Mutationen/Selektionen können die p-HB- Ausbeuten noch weiter erhöht werden.
Beispiel 3
500 ml Erlenmeyerkolben, welche 100 ml der Nährlösung von Beispiel 1 enthalten, wobei jedoch an Stelle von Fruktose 6% neutralisierte, sterile Ablauge der Caprolactamsynthese (welche ein Gemisch von Mono- und Dicarbonsäuren enthält) verwendet wird und die NH4Cl-Menge um 50% herabgesetzt ist, werden mit einer Kultur des Azotobacter chroococcum DSM 281, Abkömmling GC-183 CAL, beimpft und in Gegenwart von Luft bei 30 bis 32 "C exzentrisch geschüttelt.
Analog zu Beispiel 2 wird p-HB mit Äthylacetat extrahiert und aus dem nativen Extrakt durch Beigabe von konzentrierten
Lösungen von NaOH, Ca(OH)2 bzw. KOH ausgefällt und durch
Abfiltrieren als Na-, Ca- bzw. K-Salz gewonnen. An Stelle des Äthlacetats kann auch n-Butanol oder Isopropanol verwendet werden. Nach 46 Stunden enthält die Gärlösung etwa 1600 mg ss-HB pro Liter.
Beispiel 4
Analog zum Beispiel 3 wird mit dem Abkömmling GC-157 MEL von Azotobacter chroococcum DSM 281 gearbeitet, wobei jedoch anstelle von Ablauge der Caprolactamsynthese
12 Gew.-% Rübenzuckermelasse verwendet werden. Nach 36
Stunden erreicht die Gärlösung eine ss-HB-Konzentration von
1780 mg/L.
Beispiel 5
In Analogie zu Beispiel 3 wird mit dem Stamm GB-257 CAL, welcher ein Abkömmling von Bacillus megatherium
DSM 32 ist, verfahren, und innert 36 Stunden 2100 mg ss-HB/
Liter erhalten.
Beispiel 6
Analog zu Beispiel 4 wird mit dem Stamm GB-312 MEL, einem anderen Abkömmling von Bacillus megatherium DSM 32, verfahren und in 48 Stunden 2670 mg ss-HB pro Liter erhalten.
Beispiel 7
Analog zum Beispiel 3 produziert GZ-253 Cal, eine Mutante von Zoogloea ramigera ATCC 19623, 1400 mg ss-HB pro Liter.
Beispiel 8
Analog zu Beispiel 4 synthetisiert GZ-301 MEL, eine andere Mutante von Zoogloea ramigera ATCC 19623,2030 mg ss-HB/ Liter.
Beispiel 9
Unter anaeroben Bedingungen wird die Mutante GCI-112 von Clostridium butyrium ATCC 19398 in einem Medium von 4% Saccharose, 0,3% NH4-Acetat, 0,178% Na2HPO4 2H2O, 0,136% KH2PO4, 0,042% Mg SO4.7 zu7 HzO, 0,00025% FeSO- 7 H2O, 0,00013% MnClz. 4 H2O, sowie 1 ,ug (+ > Biotin pro 1000 ml während 48 Stunden inkubiert, wonach das Gärmedium eine Konzentration von 1710 mg ss-HB/Liter aufweist.
Beispiel 10
Um Methanol verwertende Mikroorganismen zu finden, wird ein 500 ml Becherglas mit etwa 100 ml der Nährlösung von Beispiel 1, welche jedoch als einzige Kohlenstoffquelle 1 % Methylalkohol enthält, im Laboratorium offen aufgestellt.
Nach einigen Tagen ist die Lösung trüb, und es können daraus nach entsprechenden Verdünnungen mit Wasser auf Agarplatten mit dem Medium von Beispiel 1 einzelstehende Streukolonien erzeugt werden. Mit ausgewählten Kolonien werden im erwähnten Methylalkoholmedium Schüttelkulturen gezüchtet, welche gemäss Law & Slepecky [J. Bact. 82(1961), 33] auf die Produktion von Polybetahydroxybuttersäure untersucht werden. Auf diese Weise wird ein stäbchenförmiger Mikroorganismus erhalten, welcher bis zu 50 Gew.-% seiner Zellmasse Polybetahydroxybuttersäure bildet und als Mycoplana rubra Stamm erkannt wurde.
Beispiel 11
Mit dem Abkömmling GM-37 des aus Luft neu isolierten Methanol-verwertenden, stäbchenförmigen Mikroorganismus Mycoplana rubra (CBS 385 76) wird analog zu Beispiel 3 verfahren, jedoch wird die Ablauge der Caprolactamsynthese durch 2,5% Methylalkohol ersetzt. Nach 48stündiger Inkuba tionszeit bei 31 "C enthält die Gärlösung 536 mg 2-HB/Liter.
Beispiel 12
Mit GA-97 CAL, einer Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 abgeleiteten Mutante, wird analog zu Beispiel 3 verfahren, und 1050 mg ss-HB/Liter erhalten.
Beispiel 13
Mit dem Stamm GA-113, der von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 gewonnen wurde, wird unter Bedingungen und im Medium gemäss Volker Öding (Gesellschaft für Strahlenforschung, Bericht M 109, Göttingen 1972) in rein mineralischer Nährlösung und in Gegenwart einer aus Wasserstoff, Kohlendioxyd und Sauerstoff bestehenden Atmosphäre bei 30 "C während 48 Stunden angezüchtet.
Das Überstehende der Gärlösung wird mit einem Anionenaustauscher in der OH-Form behandelt. Durch Eluierung des Austauschers mit verdünnter Natronlauge wird das Natriumsalz der 2-HB erhalten. Ausbeute: 1250 mg ss-HB/Liter.
Claims (7)
- PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Gewinnung von Bakterienstämmen, welche in möglichst kurzer Zeit einen maximalen Anteil der vorgelegten Kohlenstoffquelle in D(- > 3-Hydroxybuttersäure umzusetzen vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Buttersäure oder D(- > 3-Hydroxybuttersäure ausscheidenden oder Poly4D-3-hydroxybuttersäure) aufspeichernden Bakterienstamm der Einwirkung von mutagenen Agenzien unterwirft, unter den entstandenen Mutanten jene auswählt, welche D(- > 3-Hydroxybuttersäure nicht zu assimilieren vermögen und von diesen wiederum jene auswählt, welche - gegebenenfalls nach erneuter Mutation - bei Züchtung in einem wässrigen Nährmedium, welches als Kohlenstoffquelle ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe Glucose, Saccharose und Lactose, einen assimilierbaren Alkohol aus der Gruppe Menthol und Äthanol,oder die Ablauge der Caprolactamsynthese nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 40 "C und einem pH-Wert von 6 bis 8, mehr D(- > 3-Hydroxybuttersäure als der der Mutation unterworfene Ausgangsstamm produzieren.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Buttersäure ausscheidenden Bakterienstamm einen solchen von Clostridium butyricum ATCC 19398 und als Poly4D-3-hydroxybuttersäure) aufspeichernden Bakterienstamm einen solchen von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azoobacter chroococcum DSM 281, Bacillus megatherium DSM 32, Zoogloea ramigera ATCC 19623 oder Mycoplana rubra CBS 38576 einsetzt.
- 3. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 gewonnen Bakterienstämme zur Herstellung der D(- > 3-Hydroxybuttersäure, dadurch gekennzeichnet, dass man einen besagten Bakterienstamm in einem wässrigen Nährmedium, welches als Kohlenstoffquelle ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe Glucose, Saccharose und Lactose, einen assimilierbaren Alkohol aus der Gruppe Methanol und Äthanol, oder die Ablauge der Caprolactamsynthese nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 40 "C und einem pH-Wert von 6 bis 8 züchtet und die gebildete optisch aktive Carbonsäure aus der Kulturbrühe isoliert.
- 4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bakterienstamm die D(- > 3-Hydroxybuttersäure ausscheidenden Mutanten von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, z. B. die Mutante CBS 381 76; von Azotobacter chroococcum DSM 281, z. B. die Mutante CBS 383 76; von Bacillus megatherium DSM 32, z. B. die Mutante CBS 382 76; von Zoogloea ramigera ATCC 19623, z. B. die Mutante CBS 384 76; von Clostridium butyricum ATCC 19398, z. B. die Mutante CBS 380 76; und ferner Mycoplana rubra CBS 38576 und seine entsprechenden Mutanten verwendet.
- 5. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt der Nährlösung an Kohlenstoffquelle 2 bis 25 Gew.-% Glucose, Saccarose, Lactose, Melasse oder Molke berechnet als reines Kohlehydrat, 1 bis 10 Gew.-% Methanol oder Äthanol, oder 1 bis 10 Gew.-% Ablauge der Caprolactam- synthese - berechnet als die gesamten darin enthaltenen Carbonsäuren, beträgt.
- 6. Verwendung nach Anspruch 3,4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung unter aeroben oder anaeroben Bedingungen durchgeführt wird, je nachdem ob es sich bei dem verwendeten Bakterienstamm um einen Aerobier oder Anaerobier, z. B. die Gattung Clostridium, handelt.Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Bakterienstämmen, welche D(- > 3-Hydroxy- buttersäure produzieren, und die Verwendung derart gewonnener Bakterienstämme zur Herstellung der erwähnten Säure.Da in der Literatur sich widersprechende Angaben über die Bezeichnung optisch aktiver 3-Hydroxybuttersäuren vorliegen, gelten für die vorliegende Erfindung die nachfolgenden Definitionen.Die in der Natur vorkommende bzw. physiologische 3-Hydroxybuttersäure oder D(- > 3-Hydroxybuttersäure (oder auch D(- > beta-Hydroxybuttersäure) hat bei einer Konzentration von 5 g pro 100 ml Wasser eine spezifische Drehung La]25 von -24,5 , während die in der Natur nicht vorkommende 3-Hydroxybuttersäure oder L(+ > 3-Hydroxybuttersäure bei einer Konzentration von 2,226 g pro 100 ml Wasser eine spezifische Drehung []d von +24,3 aufweist.Im folgenden handelt es sich ausschliesslich um die bei der Natrium-D-Linie negativ drehende 3-Hydroxybuttersäure, welche der Einfachheit halber hinfort mit der Abkürzung HB bezeichnet wird.Zur Herstellung der racemischen DL-3-Hydroxybuttersäure bestehend verschiedenen Verfahren; siehe unter anderem Deutsche Offenlegungsschrift 441 003 und Wislicenus, Ann. 149 (1869), 207. Ferner gelang es McKenzie und Harden, aus DL-3 Hydroxybuttersäure mittels Aspergillus niger die optisch aktive reine L(+ > 3-HydroxybuUersäure herzustellen [J. Chem.Soc.83 (1903),430}.In Mensch, Tier und Pflanzen kommt ausschliesslich die D(- > 3-hydroxybuttersäure, nämlich als unentbehrlicher Stoff im Fetthaushalt, vor [Edström et al., Acta Obstet. Gynecol.Scand. 54(1975), 347; Moore et al., Am. J. Physiol. (1976), 619]. Eben zufolge dieses natürlichen Vorkommens und dieser physiologischen Funktion dürfte der Verbindung grosse Bedeutung unter anderem bei der parenteralen Ernährung und als Ausgangsstoff zur Herstellung für den menschlichen Organismus gut verträglichen chemischen Verbindungen zukommen.Es ist dem um so erstaunlicher, dass es bis heute - im Gegensatz zu geschilderten Verhältnissen in bezug auf die racemische und die rechtsdrehende, nicht natürliche 3-Hydroxybuttersäure - noch kein Verfahren gibt, welches eine technisch durchführbare Herstellung der D(- > 3-Hydroxybuttersäure ermöglicht, Insbesondere waren bisher keine Mikroorganismen bekannt, welche die gewünschte Carbonsäure ausscheiden.Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass unter den Mikroorganismen, welche zur Klasse der Schizomycetes von Naegeli (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, edit. R. S. Breed et al.,
- 7. Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore 1957) gehören, solche gewonnen werden können, welche ausgehend von äusserst billigen Kohlenstoffquellen hohe Konzentrationen von D(- > 3-Hydroxybuttersäure ausscheiden und sich bezüglich dieser Fähigkeit stets verbessern lassen. Die Mikroorganismen können von irgendeiner Kulturensammlung bezogen, oder aber aus natürlichem Material, wie Boden, Wasser, Luft, Jauche, nach bekannten Methoden leicht isoliert werden. Besonders geeignet sind Mikroorganismen, welche imstande sind, selbst Buttersäure oder Poly < D-3- hydroxybuttersäure) zu synthetisieren, wie z. B.Angehörige der Familien Azotobacteraceae, Bacillaceae, Pseudomonadaceae, Methanomonadaceae, Spirillaceae, Achromobacteraceae und Enterobacteraceae.Bekannte Poly(D-3-Hydroxybuttersäure) aufspeichernde Bakterienstämme, wie z. B. Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azotobacter chroococcum DSM 281, Bacillus megatherium DSM 32, Zoogloea ramigera ATCC 19623 und ein bisher unbekannter, aus Luft isolierter Methanolverwerter, der als **WARNUNG** Ende CLMS Feld konnte Anfang DESC uberlappen**.
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