CH622436A5

CH622436A5 -

Info

Publication number: CH622436A5
Application number: CH582675A
Authority: CH
Inventors: Harold Stern; Milan Bier
Original assignee: Harold Stern
Priority date: 1974-05-06
Filing date: 1975-05-06
Publication date: 1981-04-15
Also published as: ES437483A1; JPS50153696A; DE2519909A1; FR2270267B1; CA1043703A; US3972791A; NL7505304A; GB1496726A; FR2270267A1; BE828752A; BR7502739A; ZA752829B; IT1032822B

Description

La présente invention est relative à la séparation de mélanges de protéines complexes pour utilisations non pharmaceutiques, plus particulièrement au fractionnement et à la résolution partielle de mélanges de ce genre par la mise en œuvre d'une électrodialyse. Il est possible de combiner ce procédé à l'une des étapes suivantes: électrophorèse à passage forcé, électrodécantation et précipitation à l'alcool.

Les liquides biologiques contiennent habituellement un mélange de plusieurs protéines et l'un des objectifs principaux de la biochimie moderne réside dans la mise au point de procédés nouveaux permettant de les séparer. Des exemples de liquides biologiques sont constitués par le sérum et le plasma sanguin par le lait, le petit-lait, le liquide rachidien, l'urine, le blanc d'œuf, etc.

Aux fins de la présente invention, il est utile de définir la nomenclature suivante à propos des protéines, la classification étant fondée sur leur solubilité dans divers solvants : 1) l'albumine est le constituant protéinique principal du plasma, du sérum et du blanc d'œuf et se caractérise par le fait d'être soluble à la fois dans du sulfate d'ammonium semi-saturé et dans de l'eau distillée; 2) les globulines sont les protéines du plasma ou d'autres liquides biologiques qui précipitent dans du sulfate d'ammonium semi-saturé; 3) les euglobulines sont les globulines qui précipitent non seulement dans du sulfate d'ammonium semi-saturé, mais également dans de l'eau désionisée, étant donné qu'elles exigent apparemment la présence de certains sels pour se solubiliser. Il est manifeste que cette classification est arbitraire, bien que très largement utilisée dans la chimie des protéines, étant donné que la solubilité de toutes les protéines dépend également du pH de la solution, de la température et d'autres solutés présents, comme l'alcool; 4) les matières analogues aux euglobulines. L'expression «analogue aux euglobulines» est utilisée dans le présent brevet pour définir les protéines qui ne précipitent dans des solutions aqueuses désionisées qu'en présence de diverses quantités d'alcool seulement. Ces protéines ne sont pas des euglobulines vraies, car elles sont solubles dans l'eau désionisée en présence d'alcool, mais elles possèdent certaines des caractéristiques des euglobulines, notamment par le fait qu'elles sont solubilisées même par de faibles concentrations de sels.

Il est également intéressant de définir, aux fins de la présente invention, les procédés à membranes électriques suivants :

1) L'électrodialyse est principalement utilisée pour le dessalage de solutions aqueuses. Habituellement, cela s'effectue à l'aide de membranes ionosélectives, lesdites membranes tolérant le passage préférentiel d'ions chargés positivement ou négativement, comme décrit dans divers brevets des Etats-Unis d'Amérique, notamment les brevets Nos 2694680,2848402,2860091,2777811. L'intérêt de cette technique pour la séparation de protéines n'a pas encore été reconnu antérieurement. Les membranes ionosélectives peuvent également être remplacées par des membranes sensiblement électriquement neutres, avec l'inclusion de polyélectrolytes dans certains compartiments, ces polyélectrolytes devenant polarisés le

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long des membranes sous l'influence d'un champ électrique, de manière à transporter un élément à ionosélectivité vers les membranes neutres, de la manière décrite dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N05 3677923 et 3725235. Dans d'autres procédés à membranes électriques, décrits dans les deux paragraphes suivants, une certaine électrodialyse se superpose inévitablement à d'autres effets recherchés, par le fait qu'elle est le résultat direct du passage de courant électrique. Aux fins de la présente invention, le terme électrodialyse sera réservé aux procédés électriques dont le but principal est le dessalage, réalisé de préférence soit avec l'emploi de membranes ionosélectives, soit avec l'utilisation de polyélectrolytes.

2) L'électrodécantation est un procédé électrique pour la concentration et la séparation de toute une variété de colloïdes, y compris des protéines, comme l'enseignent les brevets des Etats-Unis d'Amérique N°s 2057156,2292608, 2762770,2800448 et 2801962. Ces brevets décrivent des dispositifs qui contiennent une multitude de membranes sensiblement électriquement neutres disposées parallèlement les unes aux autres, les colloïdes ou protéines s'accumulant sous l'influence du courant ou des champs électriques au voisinage immédiat des membranes en question et pouvant être décantés le long de ces membranes à la suite de l'existence de gradients de densité. Un procédé analogue est parfois appelé convection par électrophorèse (dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N" 2758966), procédé selon lequel on n'utilise habituellement qu'une seule paire de membranes électriquement neutres dans le but de provoquer une électrodécantation dans la solution de protéines. Ces techniques ont été très largement utilisées pour le fractionnement des protéines, principalement pour la préparation de y-globulines, étant donné que ces protéines du plasma sont isoélectriques et ne décantent pas. Cette technique n'a pas été décrite pour la préparation d'albumine sérique, la plus mobile des protéines du plasma (en termes d'élec-trophorèse). L'un des objets de la présente invention réside dans l'utilisation de ces techniques de fractionnement pour la préparation d'albumine sérique.

3) L'électrophorèse à passage forcé comprend l'emploi de dispositifs similaires à ceux utilisés pour l'électrodécantation et fait également appel à un agencement en parallèle de membranes électriquement neutres, mais les fractions séparées sont situées entre des paires de membranes voisines. Ces fractions séparées permettent un meilleur réglage des modes d'écoulement dans l'appareil et servent également de barrières de diffusion. Deux dispositifs d'électrophorèse de ce genre sont décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 2878178 et 3079318 et la technique est également décrite dans l'article «Forced-flow elec-trophoresis» par M. Bier, «Electrophoresis», Academic Press, 1959, p. 295.

Les procédés d'électrodécantation et d'électrophorèse à passage forcé sont similaires dans leur principe et leurs résultats et, pour des raisons de commodité, on s'y référera souvent dans le présent mémoire sous le nom de séparations par champs électriques. Comme on le décrit dans la suite du présent brevet, on peut utiliser ces procédés de manière interchangeable.

Deux protéines obtenues au départ de sérum ou de plasma humain ou animal, à savoir l'albumine sérique et les y-globulines seront utilisées comme exemples principaux, mais il est évident que la portée de la présente invention s'étend également à d'autres liquides biologiques ou à d'autres protéines sans que le procédé qui en fait l'objet doive être modifié. Les procédés industriels actuels d'obtention de ces fractions sont fondés sur un fractionnement par l'alcool, c'est-à-dire un procédé mis au point par Cohn et coll. et décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N1* 2390074 et 2770616. Cette technique est essentiellement fondée sur la précipitation séquentielle de diverses fractions de protéines par l'alcool, sous des conditions réglées de température, de teneur en alcool, de pH et de teneur en sel, comme résumé par C.A. Janeway dans l'ouvrage «Internal Med.», 3,295, 1949. Cette technique exige la mise en œuvre d'une importante installation, le rendement en certaines fractions est faible, et la mise en œuvre de ce procédé exige une exposition prolongée des protéines à une forte proportion d'alcool, ce qui a un effet dénaturant sur certaines fractions de protéines. La technique est également limitée à la production de certaines fractions du plasma seulement;

d'autres fractions de protéines ne sont pas récupérables à des états de pureté suffisants.

L'objet de la présente invention est donc un procédé de fractionnement de solutions liquides de mélanges de protéines par électrodialyse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a) soumettre des solutions de ce genre à une électrodialyse dans une gamme de pH de 4,8 à 6 ; b) effectuer ladite électrodialyse à des températures inférieures à 15°C; c) poursuivre ladite électrodialyse jusqu'à ce que la résistance spécifique du mélange obtenu excède 1000 fì.cm et jusqu'à la précipitation d'une fraction du mélange de protéines en question; d) séparer le précipité de la solution de protéines solubles surnageante, et e) récupérer ladite solution de protéines solubles surnageante, que l'on isole.

Le programme de fractionnement conforme à la présente invention permet une bien plus grande souplesse, en termes de fractions pouvant être obtenues, étant donné que les procédés électriques peuvent remplacer certaines ou toutes les étapes de fractionnement mises en œuvre lors de la réalisation d'un fractionnement par l'alcool, ce qui se traduit par des économies substantielles d'argent, de temps, de frais d'installation et donne des rendements en produits accrus.

Ces objets et d'autres encore de la présente invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description détaillée qui suit des modes de réalisation illustratifs des procédés conformes à l'invention.

A. L'électrodialyse est très largement utilisée pour le dessalage de solutions aqueuses. Dans le domaine des protéines, on a appliqué l'électrodialyse pour le dessalage du lait, du petit-lait (brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3433726, 3447930, 3595766, 3757005 et 3754650), mais ces brevets n'ont rien de commun avec les objets de la présente invention, étant donné qu'ils ne concernent que la réduction de la teneur en sel du petit-lait, plutôt que l'incorporation du procédé de dessalage dans un programme complexe de fractionnement.

Il est également bien connu que le dessalage provoque la précipitation d'euglobulines. Les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 2669559, 2761809, 2761811, 3234199 et 3429867 décrivent l'application du dessalage à l'aide de lits de résines échangeuses d'ions, à des fins de fractionnement du plasma, mais ce procédé a une souplesse trop limitée, en termes de produits pouvant être obtenus, pour avoir une valeur pratique importante. Au surplus, des colonnes échangeuses d'ions sont difficiles à conserver dans un état de propreté et de stérilité convenables nécessaire au fractionnement de protéines.

La présente invention est fondée sur le fait que l'on a découvert que le dessalage électrodialytique pouvait être un outil de grande valeur dans un programme global de fractionnement de plasma, s'il était utilisé en combinaison avec d'autres techniques, parce que les résultats de la combinaison de diverses techniques accroît l'utilité de chacune d'elles d'une manière antérieurement insoupçonnée. Plus spécifiquement, l'addition de diverses quantités d'alcool à des protéines dessalées provoque la précipitation supplémentaire de protéines instables ou analogues aux euglobulines. Le procédé en question n'est pas tout à fait identique au fractionnement de protéines par l'alcool, parce que la qualité et la composition de la fraction précipitée sont excessivement sensibles à la température, au pH et aux plus petites quantités d'électrolyte, caractéristiques de tous les fractionnements d'euglobulines. La valeur de cette découverte est particulièrement importante dans la mesure où le programme de fractionnement par l'alcool permet de séparer, au cours de la première étape, une fraction dite de Cohn II et III, le précipité comprenant la plupart des y-globu-

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lines. La couche surnageante comprend déjà approximativement 20% de l'alcool et, si elle est alors dessalée, on obtient une précipitation d'une fraction analogue aux euglobulines qui contient la plupart des globulines résiduelles du plasma (appelées a- et ß-globulines) qui sont indésirables pour la préparation d'albumine sérique. Par conséquent, l'utilisation du dessalage électrodialy-tique s'adapte au programme de fractionnement conforme à l'invention en fournissant une y-globuline préparée par des procédés actuellement acceptables et offrant au surplus une préparation d'albumine raccourcie.

Au surplus, en raison de la sensibilité extrême à la température, au pH et de la résistance ionique de la composition de la fraction d'euglobulines, cette fraction peut aisément être utilisée pour fournir une variété de sous-fractions, engendrant des produits intéressants pour la préparation d'autres fractions de plasma.

La fraction analogue aux euglobulines obtenue à une teneur en alcool de 20% contient également une quantité importante d'albumines que l'on peut récupérer par dissolution sélective décrite dans les exemples. Ici encore, à partir d'une telle source, on peut obtenir une série supplémentaire de fractions diverses. Il n'est pas nécessaire de séparer d'abord la fraction analogue aux euglobulines de sa couche surnageante pour effectuer la dissolution sélective, mais le pH, la température, la conductibilité ou la teneur en alcool du mélange de protéines dessalé peuvent être ajustés selon une multitude de manières également expliquées dans les exemples, montrant que l'on obtient ainsi un nouvel outil souple de fractionnement lorsque l'on combine les facteurs susmentionnés de teneur en alcool, de pH, de conductibilité et de température.

Il n'est pas non plus nécessaire que la première étape du fractionnement soit une étape de précipitation à l'alcool, à savoir la séparation en fraction de Cohn II et III. Ce mode opératoire ne fait seulement que s'adapter le mieux au programme de préparation de y-globulines conforme à l'invention. Mais il est également possible de dessaler d'abord le plasma, de séparer ou de ne pas séparer ces euglobulines formées et d'ajouter ensuite l'alcool au plasma dessalé, de façon à réaliser une précipitation supplémentaire de la fraction analogue aux euglobulines. Cette fraction analogue aux euglobulines précipite déjà à une teneur en alcool de 10%, tandis que le fractionnement de Cohn exige une teneur en alcool de 20% pour sa première étape, si bien que des quantités importantes d'alcool peuvent être économisées. Ce programme de fractionnement est tout particulièrement attrayant si l'on ne désire obtenir que des albumines et non des y-globulines, comme c'est le cas avec de nombreux sérums d'animaux dont l'albumine constitue le produit commercial le plus important. Ce procédé est également intéressant si l'on souhaite opérer une séparation des substances appelées macroglobulines ou immunoglobulines IgM. Ces substances sont actuellement perdues dans le programme de fractionnement à l'alcool de Cohn, mais peuvent aisément être récupérées dans la première fraction d'euglobulines, étant donné qu'elles sont insolubles même en l'absence d'alcool.

La précipitation optimale d'euglobulines ou de protéines analogues aux euglobulines s'opère à leurs points isoélectriques qui sont les points de leurs solubilités les plus faibles. Il est caractéristique des procédés de dessalage électrolytiques effectués de manière appropriée que le mélange final parvienne automatiquement au pH correspondant au point isoélectrique moyen des protéines dans le mélange, étant donné que tous les ions libres sont éliminés et que seules sont retenues des protéines. Dans le cas du plasma, cela correspond à un pH de 5,3 ±0,2 unités du pH. Etant donné l'interaction protéine-protéine, il se produit une coprécipitation de plusieurs protéines, mais la composition du précipité peut être altérée et modifiée en ajustant le pH dans une gamme de valeurs de pH variant de 6 à 4,8, en modifiant ainsi de manière importante la composition du précipité et en permettant une précipitation de certaines protéines, y compris les macroglobulines susmentionnées.

La précipitation d'euglobulines dans le plasma débute à une résistance spécifique supérieure à 1000 fi.cm, mais s'accroît progressivement jusqu'à un dessalage maximum. Pour le meilleur fractionnement d'euglobulines ou de fractions analogues aux euglobulines, une résistance supérieure à 50000 il cm est nécessaire, la plupart des fractionnements en question étant mis en œuvre dans la gamme de 50000 à 200000 Q.cm.

La température joue un rôle important pour la préparation de la fraction analogue aux euglobulines. La plus grande partie du fractionnement s'effectue dans une zone de températures inférieures à 5°C, mais le subfractionnement de la fraction analogue aux euglobulines peut s'effectuer à des températures égales ou inférieures à environ 15°C.

Pour résumer, le fractionnement optimal des protéines par dessalage électrodialytique est obtenu dans les étroites limites de conditions suivantes: température inférieure à 15°C, pH de 5,3±0,2, résistance supérieure à 100000 ß.cm. L'influence de ces paramètres sera rendue plus spécifique et plus apparente dans les exemples de fractionnement réel.

L'équipement pour réaliser le fractionnement électrodialytique n'est pas d'un modèle critique et plusieurs instruments du commerce peuvent être mis en œuvre. La plupart des expériences relatées dans le présent mémoire ont été effectuées avec des instruments obtenus à la société Ionics Corp., B Watertown, Mass., Etats-Unis. Il est important de choisir de manière appropriée des membranes échangeuses d'ions appariées qui provoquent l'élimination proportionnelle d'ions chargés positivement et négativement de la solution, en évitant ainsi les changements excessifs des valeurs du pH. Cela a été obtenu avec des membranes provenant également de la société Ionics Corp. susmentionnée. D'autres instruments donneront, sans nul doute, des résultats également bons et, pour certains des travaux, on a utilisé un appareil d'autofabrication, similaire à celui décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3079318 et 3677923. Le dessalage peut également être effectué en mettant en œuvre le procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique précité N° 3677923, de façon à éviter la nécessité d'utiliser des membranes échangeuses d'ions.

La solution de protéines est amenée à circuler continuellement à travers l'appareil d'électrodialyse, réfrigéré à l'aide d'échangeurs de chaleur, un champ électrique provoqué par un courant continu étant superposé en travers des membranes afin de provoquer l'électrodialyse. La solution d'électrolyte baigne les côtés alternés des membranes et sa concentration en sel s'accroît graduellement au fur et à mesure qu'elle reçoit les sels du plasma. La solution d'électrolyte peut présenter n'importe quelle composition habituelle convenable. Ni sa composition ni sa conductibilité ne sont critiques pour la mise en œuvre du composé conforme à l'invention. Pour la plupart des fractionnements faisant appel à des membranes échangeuses d'ions, on a utilisé une solution contenant environ 0,5 g de chlorure de sodium par litre. D'autres solutions d'électrolyte sont tout aussi acceptables.

Dans les expériences fondées sur des membranes électriquement neutres, la solution d'électrolyte était constituée par une solution à 0,2% d'acide polyacrylique dont le pH avait été ajusté à 6 à l'aide d'hydroxyde de sodium. Pour obtenir le meilleur réglage de température, les solutions d'électrolyte doivent également être refroidies par des moyens de refroidissement comme des échangeurs de chaleur.

En se servant d'un système convenablement équilibré, le pH du plasma diminue graduellement vers son point isoélectrique moyen correspondant à un pH de 5,2 ±0,2. La précipitation s'amorce à une résistance spécifique d'environ 1000 fl.cm et à un pH d'environ 5,6. Si le produit de départ n'est pas du plasma, mais une fraction qui en dérive par précipitation à l'alcool, la précipitation s'opère lorsque l'on atteint une résistance d'environ 6000 fi.cm, étant donné que certaines des euglobulines ont déjà été éliminées. Dans chaque cas, la précipitation est la plus com4

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plète au dessalage le plus élevé possible, lorsque la résistance est supérieure à 100000 Q.cm.

Les protéines doivent vigoureusement circuler à travers les chambres appropriées de l'appareil d'électrodialyse, afin d'obtenir une turbulence maximale dans l'appareil. Cela est une caractéristique bien connue des techniciens de l'électrodialyse. Une pression de circulation de 1,75 kg/cm2 a été utilisée dans la plupart des expériences. Cette turbulence est également nécessaire pour éviter le dépôt dans l'appareil de protéines précipitantes, ce qui obstruerait ses canaux d'écoulement.

Afin de minimiser le problème de l'obstruction ou du colmatage, il est également possible d'installer une centrifugeuse continue dans le circuit d'écoulement de la solution de protéines.

La précipitation des euglobulines est rapide et leur centrifuga-tion complète est obtenue à des vitesses de centrifugation peu élevées, 2000 t/mn suffisant à cette fin. Cet artifice comporte certains avantages, étant donné qu'il permet le fractionnement des euglobulines au fur et à mesure de leur formation, en recueillant et en opérant une ségrégation des précipités aux différentes valeurs du pH ou de la résistance. Il est également avantageux d'introduire dans le trajet de circulation des protéines des instruments de contrôle convenables permettant la commande automatique ou par opérateur du pH, de la résistance et de la température au cours de la mise en œuvre du procédé de dessalage.

Si un colmatage d'une quelconque partie de l'appareil venait à se produire, comme indiqué par un soudain accroissement des pressions, on peut aisément y remédier en ajoutant un agent d'alcalinisation convenable, comme une solution d'hydroxyde de sodium, en quantités telles qu'elles élèvent le pH de la solution de protéines au-dessus de 6. Cela provoque une dissolution rapide de tous les précipités. Ce décolmatage n'entraîne pas de grand retard dans le processus global de dessalage. L'électrodialyse d'ions sodium est beaucoup plus rapide que celle de nombreux autres ions dans la solution de protéines. La durée globale nécessaire pour obtenir un dessalage complet est principalement limitée par la présence de ces ions à électrodialyse plus lente et non par les ions sodium. Ainsi, il est possible de complètement dessaler le mélange de protéines, puis d'ajouter une quantité suffisante d'un alcali pour redissoudre tous les précipités (ce qui bien évidemment diminue la résistance) et d'obtenir un produit final au cours d'une passe supplémentaire finale à travers l'appareil d'électrodialyse, passe finale au cours de laquelle on élimine l'hydroxyde de sodium ajouté. Cela évite l'accumulation du précipité dans l'appareil. La plus grande partie de la précipitation étant suffisamment retardée, elle ne se produit qu'après la sortie du dialyseur.

Un autre procédé pour éviter la précipitation et le colmatage de l'appareil consiste dans l'inversion périodique de la polarité du courant.

En raison de l'exigence de nombreux recyclages du plasma à travers l'appareil avant d'obtenir un dessalage complet, le procédé en question est essentiellement un procédé discontinu. Cependant, il peut être rendu semi-continu par la mise en œuvre d'un mode opératoire séquentiel, selon lequel un récipient intermédiaire reçoit une fraction de la solution de protéines totale, cette fraction étant ensuite complètement dessalée par des recyclages répétés à travers l'appareil d'électrodialyse et ensuite remplacée par une nouvelle fraction, comme le savent parfaitement bien les techniciens s'occupant de l'automation. En rendant séquentiel le passage de la solution de protéines à travers les chambres de dialyse successives, la teneur en sel dans chaque chambre successive est réduite jusque dans la chambre finale où la teneur en sel se trouve à un minimum.

La puissance nécessaire à l'électrodialyse n'est pas critique. La plupart des expériences ont été entamées avec une densité de courant d'environ 0,03 A/cm2, nécessitant la mise en œuvre de moins de 25 V/cm. Au fur et à mesure de l'élévation progressive de la résistance de l'appareil d'électrodialyse, élévation due à une augmentation de résistance de la solution de protéines, on élève graduellement la tension jusqu'à 100 V/cm. La densité de courant finale est faible, habituellement inférieure à environ 0,03 A/cm2. La principale limite imposée à la puissance est celle causée par le chauffage de la solution que cette puissance provoque. Le réglage de la puissance totale entrante est fondé sur le contrôle de la température des efïluents. La température peut être maintenue en dessous de n'importe quelle valeur désirée, compatible avec la stabilité et les précautions sanitaires relatives aux solutions de protéines, c'est-à-dire que cette température doit être maintenue, au cours de la totalité de l'expérience, à une valeur inférieure à environ 5 ou 10°C.

L'assainissement est de la plus haute importance lors du fractionnement des protéines. L'appareil d'électrodialyse complet, toutes les connexions, la tuyauterie, les pompes, etc., subissent un assainissement in situ par des procédés classiques comme le rinçage à l'aide d'une solution diluée d'hydroxyde de sodium, d'acide chlorhydrique, d'hypochlorite ou de tous autres agents convenables. On préfère utiliser un rinçage à l'hydroxyde de sodium, étant donné qu'il constitue le moyen le plus efficace pour éliminer des protéines précipitées.

B. On a utilisé à la fois l'électrophorèse à passage forcé et l'électrodécantation pour réaliser le fractionnement de protéines du plasma, comme le décrivent les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 2801962, 2878178 et 3079318. L'objectif usuel était " l'isolement des y-globulines. La raison de cette focalisation sur les y-globulines réside dans le fait que ces procédés sont aisément et directement applicables parce que les y-globulines sont isoélectriques ou voisines du point isoélectrique sur une gamme de pH relativement large autour de la neutralité. Les deux procédés susmentionnés n'établissent essentiellement qu'une différence entre les constituants isoélectriques et mobiles. Dans les deux procédés, les constituants mobiles sont amenés à subir une électrodécantation et la couche surnageante est principalement composée de constituants isoélectriques ou proches du point isoélectrique qui (par définition, l'expression isoélectrique se rapporte à des composés à charge positive et négative égale, c'est-à-dire dont la charge nette est égale à zéro) ne sont pas affectés par le champ électrique appliqué. La fraction qui décante contient la plus grande partie des albumines qui constitue le constituant principal le plus électrophorétiquement mobile du plasma. Les albumines ainsi fractionnées sont cependant lourdement contaminées par des globulines de mobilité intermédiaire grosso modo appelées a- et ß-globulines.

Ces procédés d'électrophorèse à passage forcé ou d'électrodé-cantation n'ont jusqu'à présent pas trouvé application pour la production industrielle de y-globulines ou de toutes autres fractions de plasma. Les raisons en étaient nombreuses et, parmi ces raisons, on peut citer les suivantes :

1. On ne manque pas de y-globulines. On a davantage besoin d'albumines que de y-globulines.

2. Le procédé de fractionnement à l'alcool de Cohn donne un produit exempt d'agents de l'hépatite infectieuse. Il n'est pas certain que d'autres procédés, comme les procédés électriques susmentionnés, donneraient de manière constante un produit de sécurité égale. Il en résulte que de nombreuses réglementations légales exigent la mise en œuvre du procédé de fractionnement à l'alcool. En raison de l'abondance de ce produit, il n'y a que peu de stimulants poussant à changer le mode opératoire en question.

Sont cependant également importants certains inconvénients purement techniques de ces deux procédés électriques, auxquels la présente invention obvie :

1. Le plasma contient un certain nombre de protéines relativement instables qui précipitent aisément, soit par suite de leur solubilité inhérente faible, soit par suite de dénaturation. Il s'ensuit que, lorsque l'on utilise du plasma, la longévité des ensembles à membranes multiples, utilisés pour la mise en œuvre de ces deux procédés électriques, est limitée parce qu'un encrassement des membranes se produit par suite de la précipitation qui s'opère.

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Etant donné qu'un ensemble à membranes multiples est un élément dont le coût est important, cet encrassement rend le procédé coûteux. La réalisation du procédé conforme à l'invention permet d'éliminer complètement ce problème par la mise en œuvre des deux traitements décrits plus haut: a) préfractionnement à l'alcool ayant pour résultat l'apparition d'une couche surnageante dite fraction de Cohn 11 +III, ou b) dessalage électrodialytique. L'une ou l'autre de ces étapes de fractionnement initiales élimine l'apparition de protéines instables et on ne peut plus observer d'encrassement des membranes.

2. Bien que les membranes utilisées pour la mise en œuvre de ces deux procédés d'électrophorèse et d'électrodécantation soient sensiblement électriquement neutres, leur caractère est altéré à la suite de la polarisation de protéines le long des membranes, polarisation provoquée par le champ électrique, comme le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3677923 le fait observer et l'explique. Un élément d'électrodialyse se superpose par conséquent au procédé de fractionnement et il y a un dessalage partiel de la fraction isoélectrique, provoquant une précipitation prématurée. Les euglobulines tendent par conséquent à précipiter et apportent ainsi leur contribution au problème d'encrassement des membranes susmentionnées. Il est manifeste que ce problème est évité grâce à la présente invention, étant donné que toutes les euglobulines ont été éliminées au cours du dessalage électrodialytique.

3. Le plasma est d'une haute salinité, correspondant approximativement à une concentration de chlorure de sodium d'approximativement 0,9%. Cela limite gravement le champ électrique qui peut être appliqué, parce que le chauffage dû à l'effet Joule provoqué par le champ électrique est proportionnel à la conductibilité, c'est-à-dire à la teneur en sel, du liquide traité. Il en résulte que les vitesses de traitement sont faibles (étant également proportionnelles au champ appliqué) et, au mieux, marginales du point de vue industriel. On a tenté de recourir à une dilution pour remédier à la teneur élevée en sel (voir l'exemple 3 du brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 2878178), mais cette façon de pratiquer n'a, au mieux, qu'un effet palliatif et elle accroît de manière considérable les volumes de liquide à traiter.

La mise en œuvre du procédé selon l'invention permet d'éliminer totalement ce problème. L'effluent du dessalage électrodialytique ne comporte pas de sels résiduels et, par conséquent, on évite le chauffage excessif dû à l'utilisation du champ électrique. Le chauffage est évidemment nuisible en raison de considérations purement sanitaires comme aussi en raison de la dégradation chimique qu'il provoque. On peut appliquer des champs électriques plus élevés lors de la mise en œuvre du procédé conforme à l'invention et obtenir ainsi des vitesses de production plus rapides, rendant par là le procédé conforme à l'invention économiquement plus attrayant.

4. La plus grande partie de la teneur en sel du plasma est réellement constituée de chlorure de sodium qui n'a aucun effet de tampon dans la gamme des pH où l'on effectue le fractionnement des protéines. Par conséquent, le pH du liquide traité n'est que médiocrement réglé avec une incertitude concomitante en ce qui concerne la précision réelle du fractionnement, étant donné que la mobilité électrophorétique des protéines dépend fortement du pH. L'addition de tampons convenables au plasma non traité peut améliorer la situation, mais elle favorise également la conductibilité globale de la solution, ce qui, comme on l'a mentionné plus haut, est fortement indésirable. Le dessalage préalable du liquide en cours de traitement permet l'addition appropriée de n'importe quel nombre de tampons, comme des tampons au phosphate, au tris(hydroxyméthyl)aminométhane, à la glycine et d'autres encore, qui exercent leur effet tampon maximal dans la gamme des pH souhaitée, tout en maintenant la conductibilité du milieu à un ordre de grandeur inférieur à celui du plasma non traité. A cette fin, conviennent tout particulièrement bien et sont par conséquent préférés des sels tampons amphotères, par exemple la glycine, qui, tout en stabilisant le pH, n'apportent pas de contribution importante à la conductibilité du milieu. D'autres substances amphotères sont les divers autres aminoaeides, comprenant l'alanine, ou des di- ou tripeptides, y compris la glycylglycine et la glycylglycyl-glycine. On peut aisément se procurer de tels produits dans le commerce et assurer ainsi l'existence d'une gamme appropriée de points isoélectriques,

5. Les chercheurs antérieurs n'ont pas été capables d'utiliser des techniques comme l'électrophorèse à passage forcé ou l'élec-trodécantation pour la production de n'importe quelles autres fractions de plasma, à l'exception des y-globulines. En particulier, aucun des chercheurs antérieurs n'a réussi à préparer de l'albumine d'une pureté suffisante pour lui permettre de servir d'agent d'allongement du plasma. Le procédé conforme à la présente invention obvie à ce défaut, grâce aux caractéristiques suivantes :

a) élimination du précipité des étapes de fractionnement de Cohn II et III;

b) la précipitation d'euglobulines ou de substances analogues aux euglobulines par dessalage électrodialytique;

c) conditions régnant au cours du fractionnement améliorées par suite de la faible teneur en sel et de l'introduction d'un tampon approprié dans le liquide subissant le traitement, comme expliqué dans les paragraphes 3 et 4 susmentionnés, et d) finalement, utilisation de conditions spéciales au cours du fractionnement lui-même.

Ces conditions spéciales — d)— méritent une plus ample description:

Au cours de l'électrodécantation ou de l'électrophorèse à passage forcé, le courant entrant est divisé en deux fractions. Les constituants les plus mobiles sont séparés dans la fraction décantée, au fond des compartiments définis par les membranes, qui comprennent la fraction d'albumine souhaitée. Les constituants les moins mobiles ou isoélectriques sont séparés au sommet des compartiments définis par les membranes. La répartition relative des constituants dans les deux efïluents, que l'on appellera dans la suite du présent brevet, pour des raisons de brièveté, efïluent supérieur et efïluent inférieur, dépend de nombreux facteurs, y compris le champ appliqué, la conductibilité, la température, les concentrations relatives et la mobilité de chaque constituant du mélange.

A titre de règle générale, pour un écoulement supérieur constant, plus faible est l'écoulement inférieur, plus élevée est sa teneur totale en protéines. On a découvert, à présent qu'en parallèle de cette concentration accrue en protéines, il existe également une pureté accrue de la fraction albuminique, récupérée dans l'effluent inférieur. Pour obtenir une concentration optimale en protéines, il est nécessaire de maintenir l'effluent inférieur à une concentration en protéines totales variant de 15 à 25%. Cela s'obtient de préférence en maintenant des rapports d'écoulement supérieur à inférieur de 8:1 à 15:1, en fonction de la concentration de la substance de départ.

L'électrophorèse à passage forcé et l'électrodécantation conformes à la présente invention ont été réalisées en utilisant l'équipement tel que décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3079318. On a mis en œuvre avec succès trois modes opératoires différents. Ces modes opératoires sont schématique-ment illustrés dans les figures du dessin ci-annexé qui constituent des représentations schématiques des vues en élévation latérale des membranes et des filtres utilisés pour ce type d'appareil. Les figures ne représentent pas les entretoises maintenant les organes à leur place appropriée, entretoises qui peuvent comprendre des moyens d'entrée et de sortie. Les lignes en trait plein représentent des membranes qui sont du type généralement mis en œuvre pour procéder à une dialyse passive, c'est-à-dire des membranes électriquement neutres, comme des membranes de cellulose régénérée vendue sous la marque de fabrique Visking par la société Union Carbide. Les lignes en traits interrompus représentent des filtres. Ces derniers peuvent être de nombreux types différents, et peuvent comprendre des filtres en papier (par exemple du papier

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

622 436

Whatman N° 54), des filtres microporeux comme ceux vendus par la Millipore ou Gelma Corp., ou bien ces filtres peuvent être constitués de certains types d'éléments séparateurs de batteries,

tels que ceux utilisés par la société Mallory Corp.

La différence essentielle existant entre les filtres et les membranes, décrite plus haut, réside dans le fait que les filtres sont perméables aux protéines et tolèrent un gros écoulement de liquide à travers eux-mêmes. D'autre part, les membranes retiennent les protéines et ne permettent pas de gros écoulements de liquide à travers elles et tolèrent seulement une lente ultrafiltra-tion. Les flèches indiquent la direction d'écoulement des liquides à travers l'appareil.

La fig. 1 illustre le mode d'électrodécantation, tandis que les fig. 2 et 3 illustrent deux modes d'électrophorèse à passage forcé, différents par'l'endroit où se situe l'entrée d'alimentation. Ces deux modes ne diffèrent que peu par les résultats obtenus et peuvent être utilisés de manière interchangeable.

Les figures illustrent également la différence essentielle existant entre l'électrodécantation et l'électrophorèse à passage forcé. Au cours de l'électrophorèse à passage forcé, les filtres séparent chaque compartiment électrophorétique en deux subcompartiments. Les filtres servent essentiellement de frontières de friction entre les fractions de liquide coulant vers le haut et vers le bas et apportent par conséquent une sensible contribution à l'efficacité du procédé. Tandis que par conséquent l'électrophorèse à passage forcé constitue la technique préférée, on peut obtenir des résultats sensiblement similaires à l'aide de l'électrodécantation.

Un élément désirable du procédé conforme à l'invention, bien que non essentiel, réside dans la séparation des compartiments électrophorétiques individuels les uns des autres par des canaux pour l'écoulement de l'électrolyte convenable. L'électrolyte assure principalement un refroidissement interne maximal de l'appareil et, à cette fin, on fait circuler l'électrolyte à travers un échangeur de chaleur réfrigérant externe.

Il est préférable que l'électrolyte soit un tampon et les mêmes considérations s'appliquent à cet électrolyte comme on l'a décrit plus haut à propos du tamponnement de la solution de protéines en cours de traitement. Ainsi, on peut se servir de tampons au phosphate, à la glycine, à l'octanoate de sodium ou d'autres tampons. La conductibilité électrique du tampon doit être du même ordre de grandeur que la conductibilité de la solution de protéines soumise au traitement, afin d'assurer l'existence d'un champ électrique relativement uniforme à travers l'appareil. Ce tampon joue également un rôle supplémentaire important lors du fractionnement de solutions de protéines contenant de l'alcool. Par diffusion à travers les membranes, une partie substantielle de l'alcool peut être éliminée des solutions de protéines effluentes où il est indésirable.

Les exemples qui suivent illustrent la présente invention sans pour autant limiter cette dernière.

Exemple I:

Cet exemple démontre la différence existant entre des euglobulines et des matières analogues aux euglobulines, c'est-à-dire la différence entre la précipitation de protéines dessalées en l'absence ou en présence de 10% d'alcool. 21 de plasma bovin sont dessalés dans une cellule d'électrodialyse constituée de deux paires de membranes cationiques et anioniques de 22,9 x 25,4 cm, jusqu'à atteindre la résistance électrique spécifique de 200000 fî.cm, à un pH de 5,2. On a obtenu un volumineux précipité que l'on a centrifugé à 0°C. L'analyse de la couche surnageante a révélé la présence de 84% d'albumines avec encore environ 4% de y-globulines. L'addition à 0°C de 10% en volume d'alcool à la couche surnageante a provoqué une seconde précipitation, précipité que l'on a séparé par centrifugation à la même température. La couche surnageante ainsi obtenue contenait alors, ainsi que l'a révélé l'analyse, 95% d'albumines et moins de 0,5% de y-globulines.

Exemple II:

Cet exemple démontre la récupération à travers le dessalage d'une fraction enrichie en albumines à partir de la fraction surnageante dite de Cohn II + III, obtenue par précipitation de plasma avec 18% d'alcool. Il démontre également l'avantage de la redissolution sélective d'une partie des albumines, précipitées avec la fraction analogue aux euglobulines, ainsi que les effets de la résistance électrique et du pH sur la pureté des fractions ainsi obtenues. On a dessalé 21 de la couche surnageante de Cohn 11+III de la manière décrite dans l'expérience I et on les a séparés en parties aliquotes de 100 ml. On a traité séparément chaque partie aliquote, tous les liquides étant maintenus tout le temps à 0°C, même au cours de la centrifugation. Après un dessalage intense, la résistance de la solution de protéines était de 240000 Q.cm à un pH de 5,2. Dans certains échantillons, on a diminué la résistance par l'addition d'une solution concentrée de chlorure de sodium qui avait un effet négligeable sur le pH. Dans deux échantillons, on a élevé le pH par l'addition d'hydroxyde de sodium. Cela a également donné un abaissement important de la résistance. Après ces ajustements, on a centrifugé toutes les parties aliquotes, on les a décantées et on a lavé les précipités dans la moitié du volume original d'eau distillée ou d'une solution d'alcool de concentration indiquée. On a remis vigoureusement le précipité en suspension dans cette liqueur de lavage et on a à nouveau centrifugé la suspension ainsi obtenue. La couche surnageante est l'albumine récupérable, tandis que le résidu est le précipité. Les données du tableau I montrent la teneur en albumines obtenue dans toutes les fractions.

Tableau I (figurant à la fin du présent brevet)

On peut aisément voir que la pureté de l'albumine récupérée est fortement influencée par la teneur en alcool du milieu de suspension. Bien que certains précipités puissent toujours posséder une teneur relativement élevée en albumines, la perte d'albumines, considérant le faible poids du précipité, est inférieure à 8% des albumines totales, la récupération excédant 90% dans tous les cas.

Exemple III:

Cet exemple illustre l'effet de la température au cours de la séparation du précipité analogue aux euglobulines à partir du plasma contenant l'alcool. La matière de départ était la même que celle utilisée au cours de la mise en œuvre de l'expérience II, c'est-à-dire la couche surnageante de Cohn II + III vigoureusement dessalée. On a partagé cette matière en parties aliquotes de 100 ml et on a centrifugé ces fractions aliquotes aux températures indiquées dans le tableau II (figurant à la fin du présent brevet). On a remis tous les précipités en suspension dans un égal volume d'alcool à 10% dans de l'eau distillée et on a procédé à une seconde centrifugation. On a répété cette étape de lavage une seconde fois, de manière à obtenir une seconde fraction d'albumines récupérables et le précipité final. Toutes ces étapes ont été effectuées sous contrôle strict de la température, comme indiqué, les données figurant dans le tableau II.

Exemple IV:

Cet exemple illustre l'application du procédé conforme à l'invention à la préparation d'un produit concentré d'albumines, en utilisant les étapes de dessalage d'une fraction de protéines de plasma contenant de l'alcool, de séparation d'un précipité de protéines analogues aux euglobulines, de récupération d'albumines partiellement précipitées par un procédé de lavage dans de l'alcool à 10% et finalement de concentration et de purification plus poussée en utilisant une électrophorèse à passage forcé des couches surnageantes combinées provenant de la première précipitation des substances analogues aux euglobulines et des protéines récupérées.

s io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

622 436

8

La matière de départ était constituée de 101 de la couche surnageante de la fraction de Cohn IV-1 qui constitue une étape intermédiaire ultérieure du programme courant de fractionnement à l'alcool. La matière de départ a d'abord été dessalée de la façon décrite à l'exemple I, en utilisant un ensemble de cinq cellules à paires de membranes. On a centrifugé la fraction analogue aux euglobulines précipitée et on a ensuite procédé à un double lavage avec des parties aliquotes de 11 d'une solution à 10% d'alcool dans de l'eau distillée. On a réuni les couches surnageantes de cette étape de récupération d'albumines avec la couche surnageante provenant de la première centrifugation. On a réglé les couches surnageantes réunies à un pH de 7,5 en se servant d'hydroxyde de sodium et on les a concentrées par électrophorèse à passage forcé, en utilisant un ensemble de cinq cellules du type illustré sur la fig. 2, en obtenant un concentrât d'albumines inférieur et une fraction effluente supérieure. Les résultats du fractionnement sont relatés dans le tableau III.

Tableau III (figurant à la fin du présent brevet)

Le concentré d'albumines n'avait une teneur en alcool que de 5% seulement, tandis que la substance d'alimentation d'origine, à

Tableau I:

Effet du pH, de la résistance et de la teneur en alcool sur la pureté des fractions de protéines

Echantillon N"

Résistance pH

Couche

Liqueur de

Récupération

% d'albumines

spéc.

surnageante lavage d'albumines précipitées

(ohms-cm)

alb.

(%)

(% d'alcool)

(%)

1

240000

5,2

95,5

15

93,1

70,5

2

240000

5,2 "

95,3

10

95,9

62,5

3

240000

5,2

95,8

5

91,0

35,0

4

240000

5,2

97,0

0

85,2

37,4

5

100000

5,3

94,2

0

81,4

35,4

6

45000

5,3

96,0

0

83,5

33,4

7

21000

5,3

92,8

0

79,5

27,5

8

10000

5,3

92,1

0

71,2

2,5

9

6300

5,3

96,2

0_

62,4

9,2

10

58000

5,4

94,9

0

74,6

3,1

11

30000

5,7

91,2

0

60,2

3,2

Tableau II:

% d'albumines aux températures indiquées

Echantillon

(0°C)

(5°C) (10° C)

(15°C)

lre couche surnageante 97,7

94,0 91,8

85,5

lre récupération

94,1

91,2 90,1

85,5

2e récupération

89,2

82,3 78,1

78,0

Précipité

17,5

10,2 5,5

5,0

Tableau III:

Préparation du concentré d'albumines de la fraction de Cohn IV-1

Echantillon

Volume

Concentration

Albumines Protéines

Albumines

Rendement

. (1)

de protéines

(g)

totales totales en albumines

(g/1)

(g)

ï

(g)

(%)

Alimentation

10

23,2

90,6

232

210

__

Albumines

1,25

167,5

96,5

209,4

200,8

95,7

Précipité

0,4

54,6

40,3

21,9

8,8

4,2

Efïluent

12

0,3

40,0

3,6

1,4

0,7

savoir la fraction de Cohn IV-1 avait une teneur en alcool de 40%. Par conséquent, la concentration à passage forcé a permis d'obtenir une diminution importante de la teneur en alcool grâce ' à la dialyse opérée. Le dessalage n'altère pas la teneur en alcool.

5

Exemple V:

Cette expérience illustre la nouvelle méthodologie utilisée pour récupérer les fractions intéressantes de matières rejetées jusqu'à l'heure actuelle. La matière de départ était constituée de 2000 g de io précipité humide provenant de l'étape dite IV-4 du programme de fractionnement à l'alcool de Cohn. Cette matière contient principalement des a- et ß-globulines, mais contient également de 40 à 50% d'albumines qui étaient jusqu'à présent jetées. Ce précipité a été mis en suspension dans 101 d'eau et intimement dessalé, 15 conformément au mode opératoire illustré à l'exemple I. On y a ensuite ajouté 1 1 d'alcool, tout en maintenant la solution à 0° C. Cela a entraîné la formation d'un copieux précipité. On a clarifié la couche surnageante par centrifugation et on a constaté qu'elle contenait environ 1,6% d'albumines, d'une pureté de 90,5%. On a 20 récupéré un total de 180 g d'albumines à partir des 2000 g de pâte, contenant un total d'environ 320 g d'albumines. Ainsi, on a récupéré plus de 50% des albumines normalement jetées.

R

1 feuille dessins

Claims

622 436

2

REVENDICATIONS

1. Procédé de fractionnement de solutions liquides de mélanges de protéines par électrodialyse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à a) soumettre des solutions de ce genre à une électrodialyse dans une gamme de pH de 4,8 à 6;

b) effectuer ladite électrodialyse à des températures inférieures à 15°C; c) poursuivre ladite électrodialyse jusqu'à ce que la résistance spécifique du mélange obtenu excède 1000 fl.cm et jusqu'à la précipitation d'une fraction du mélange de protéines en question ; d) séparer le précipité de la solution de protéines solubles surnageants, et e) récupérer ladite solution de protéines solubles surnageante, que l'on isole.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la résistance spécifique du mélange obtenu à l'achèvement de l'élec-trodialyse varie de 50000 à 200000 fl.cm et en ce qu'on maintient la température à une valeur inférieure à 5°C.
3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'on effectue l'électrodialyse de dessalage jusqu'à atteindre un pH final de 5,3 ±0,2, ce dernier étant le point isoélectrique des euglo-bulines et/ou des protéines analogues aux euglobulines.
4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la solution de protéines solubles surnageante dessalée récupérée en e) est traitée par de l'alcool de façon à en précipiter ses protéines, constituées principalement d'albumines.
5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la solution électrodialysée est ajustée à une teneur en alcool de 10 à 20%.
6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la solution de protéines solubles surnageante récupérée de l'étape e) est traitée par tamponnement à une gamme de pH correspondant à la mobilité électrophorétique optimale des protéines et en ce qu'elle est ensuite traitée par une étape de séparation sous champ électrique.
7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape de séparation sous champ électrique est une électrodécantation.
8. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape de séparation sous champ électrique est une étape d'élec-trophorèse à passage forcé.
9. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la fraction précipitée séparée en d) est redissoute par addition d'une solution d'alcali de façon à élever le pH jusqu'à environ 6 et en ce que l'on procède ensuite à une nouvelle électrodialyse de la fraction précipitée redissoute.
10. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la solution de protéines solubles surnageante récupérée en e) est amphotère et est traitée par des tampons amphotères possédant un pouvoir de tamponnement élevé et ne contribuant que peu à accroître la conductibilité électrique spécifique de la solution.
11. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le tampon amphotère en question est choisi dans le groupe formé par le tris(hydroxyméthyl)aminométhane, la glycine, l'alanine, la glycylglycine et la diglycylglycine.
12. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le produit tamponné en question de l'étape de dialyse est divisé au cours du procédé de séparation sous champ électrique précité en effluents supérieur et inférieur comme résultat du procédé de séparation en question et en ce que les rapports d'écoulement de l'effluent supérieur et de l'effluent inférieur sont maintenus entre 8:1 et 15:1.
13. Procédé selon la revendication 1 de fractionnement de mélanges de protéines, caractérisé en ce que, dans l'étape a), l'électrodialyse est exécutée à un pH ne s'écartant que de ±0,2 du point isoélectrique des mélanges et que la résistance spécifique du dialysat dans l'étape c) est jusqu'au-dessus de 50000 îlcm.
14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que le mélange des protéines en solution est choisi dans le groupe formé par le lait, le petit-lait, l'urine, le liquide rachidien, le blanc d'œuf, le plasma et le sérum sanguin et leurs mélanges.
15. Application du procédé suivant la revendication 1 à la séparation d'une fraction du plasma, obtenue par un procédé de fractionnement à l'alcool, ladite fraction contenant au moins 20% d'alcool.
16. Application selon la revendication 15, caractérisée en ce que les euglobulines ou la matière analogue aux euglobulines récupérées est partiellement redissoute dans une solution contenant de 5 à 15% d'alcool et en ce que la solution de protéine surnageante ainsi obtenue est réunie à la fraction de protéines solubles contenant des albumines récupérées.