CH622672A5

CH622672A5 -

Info

Publication number: CH622672A5
Application number: CH1288976A
Authority: CH
Inventors: Hans-Harald Dr Sedlacek; Roloff Dr Johannsen; Fritz Dr Seiler; Hermann Dr Karges
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1975-10-15
Filing date: 1976-10-12
Publication date: 1981-04-30
Also published as: JPS5247916A; LU75987A1; NL7611152A; DE2546166A1; FR2328189A1; GB1554886A; FR2328189B1; BE847354A; CA1077394A; ATA765676A; IT1069039B; AU511176B2; SE7611505L; DK463776A; AU1869476A; US4157383A; AT355228B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von modifizierten Thrombozyten und ihre Verwendung zum Nachweis von Thrombozyten-Antikörpern oder -Antigenen.

Thrombozyten sind 1 bis 3 /im grosse ovale Blutzellen mit einem eigenen Stoffwechsel und schwach basophilem Protoplasma. Synonyma für Thrombozyten sind Blutplättchen und Gerinnselzellen. Zu ihren physiologischen Bedeutungen gehört ihre Wirksamkeit bei der Einleitung der Blutgerinnung.

Auf der Oberfläche der Thrombozyten befinden sich Antigene, die zur Ausbildung von gegen diese Antigene gerichteten Antikörpern führen können. Die Thrombozyten-Antigene haben demnach diagnostische Bedeutung. Zum Nachweis von Antikörpern gegen Thrombozyten-Antigene bediente man sich bisher eines aus Blut frisch gewonnenen Thrombozyten-Präpa-rates.

Ziel der Erfindung ist es, Thrombozyten über einen längeren Zeitraum zu stabilisieren, ohne dass die auf der Thrombo-zyten-Oberfläche befindlichen Antigene in ihren immunologischen Eigenschaften wesentlich verändert werden.

Dies wird gemäss der Erfindung dadurch erreicht, dass Thrombozyten mit einem Gerbstoff in einer Konzentration zwischen 0,002 und 5,0 Gew./Vol. % in wässriger Lösung behandelt werden.

Gerbstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Stoffe, die geeignet sind und in der Praxis dafür verwendet werden, die Überführung von tierischen Häuten in Leder zu bewirken.

Man unterscheidet organische Gerbstoffe, die pflanzlichen 5 oder synthetischen Ursprungs sein können, und mineralische Gerbstoffe. Die bekanntesten organischen Gerbstoffe pflanzlichen Ursprungs leiten sich von der Gallussäure ab. Als solche sind beispielsweise das türkische und das chinesische Tannin zu nennen. Die synthetischen organischen Gerbstoffe sind io meist Derivate von ein- oder mehrwertigen Phenolen. Andere organische Gerbstoffe sind Aldehyde und ungesättigte Fettsäuren. Von den anorganischen Gerbstoffen sind die wasserlöslichen 2- und 3wertigen Chromsalze, insbesondere das Chrom (III)-Chlorid, zu nennen.

15 Bei dem Verfahren zur Herstellung der modifizierten Thrombozyten ist mit besonders gutem Erfolg die 5-Sulfosali-zylsäure oder der Glutardialdehyd einzusetzen.

In dem Verfahren ist jede Thrombozyten-Präparation verwendbar, in der Thrombozyten im Vergleich zu anderen 20 partikulären Blutbestandteilen angereichert sind. Hierzu gehört beispielsweise der bei der Zentrifugation von Blut in bekannter Weise zu gewinnende thrombozytenreiche Plas-ma-Überstand. Zweckmässig wird dieser vor Umsetzung mit dem Gerbstoff durch wiederholte Zentrifugation und Resus-25 pension in einer isotonischen, ggf. einen Metall-Chelatbildner wie beispielsweise Äthylendiamintetraessigsäure enthaltenden Lösung, gewaschen.

Die Umsetzung der Thrombozyten mit Gerbstoff erfolgt in einem isotonischen wässrigen Milieu, das vorteilhaft ein 30 Schutzkolloid enthält.

Geeignete Schutzkolloide sind die für wässrige Systeme als besonders wirksam bekannten lyophilen Kolloide, beispielsweise diejenigen, die bei der Emulsionspolymerisation verwendet werden wie Polyvinylalkohol und Polyacrylderivate; 35 sowie Polyvinylpyrrolidon, das sich im Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders bewährt hat.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die mit einem Gerbstoff modifizierten Thrombozyten wie folgt hergestellt:

40 Zunächst wird Blut auf bekannte Weise durch einen geeigneten Zusatz, z. B. mittels einer mit Calcium einen Komplex bildenden Substanz oder eines Chelatbildners wie Äthylendiamintetraessigsäure oder einer anderen gerinnungshemmenden Substanz wie Heparin, ungerinnbar gemacht. Aus diesem 45 Blut wird sodann durch Sedimentation oder durch Zentrifugation bis zu etwa 300 x g der thrombozytenreiche Plasma-Überstand gewonnen. Die Thrombozyten werden durch Zentrifugation bei 100 x g bis 300 x g im Zentrifugensediment angereichert, wonach die Thrombozyten in einer isotonischen, 50 physiologisch verträglichen wässrigen Salzlösung, beispielsweise einer 0,9%igen Kochsalzlösung, die ggf. 0,0001 M bis 0,0005 M eines Metallchelatbildners wie Äthylendiamintetraessigsäure enthalten kann, resuspendiert und zentrifugiert. Für die Umsetzung werden die Thrombozyten in einer Konzentra-55 tion von IO5 bis 109, vorzugsweise 3 x 106 pro ml eingesetzt. Die Zählung der Thrombozyten erfolgt mit Hilfe einer Zählkammer, z. B. der nach Thoma. Als Suspensionsmittel dient eine wässrige Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 8, die 0,01 bis 5 % eines lyophilen Kolloids, vorzugsweise Polyvinylpyrrolidon 60 und ggf. einen Chelatbildner im oben bezeichneten Konzentrationsbereich enthält.

Die Suspension wird mit Sulfosalizylsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,002 bis 4%, vorzugsweise 1%, bei 0 bis 37°, vorzugsweise 18 bis 22°, versetzt und mindestens 15 65 Minuten, vorzugsweise etwa 1 Stunde, unter diesen Bedingungen belassen. Danach werden die Thrombozyten durch Zentrifugation bei 100 x g bis 300 x g gewonnen, mit einer neutralen Pufferlösung resuspendiert, abermals zentrifugiert und

3

622 672

schliesslich in einer wässrigen, vorzugsweise Polyvinylpyrrolidon enthaltenden Lösung resuspendiert. In dieser Lösung können die gegerbten Thrombozyten gefriergetrocknet werden. Das gefriergetrocknete Produkt ist homogen in Wasser resuspendierbar.

Gemäss einem weiteren bevorzugt durchzuführenden Verfahren werden die Thrombozyten mit Glutardialdehyd in einer Endkonzentration von 0,002 bis 4%, vorzugsweise 0,5%,

unter sonst gleichen Bedingungen wie für die Sulfosalizylsäure beschrieben behandelt. Auch diese Präparation lässt sich mit einer ein Schutzkolloid wie Polyvinylpyrrolidon enthaltenden Lösung resuspendieren und, falls dies gewünscht wird, gefriertrocknen.

Die modifizierten Thrombozyten sind kugelrund, lichtmikroskopisch von homogener Struktur und formstabil. Sie zeigen keine mit blossem Auge oder lichtmikroskopisch erkennbare, spontane oder durch unspezifische Antikörper ausgelöste Aggregation.

Die in Schutzkolloid enthaltenden Lösungen suspendierten gegerbten Thrombozyten sind bei Kühlschranktemperatur (ca. 4°) über mehrere Monate ohne Veränderung ihrer Eigenschaft haltbar. Die noch wesentlich länger lagerfähigen gefriergetrockneten Präparation zeigen nach Resuspension die gleichen Eigenschaften, die sie vor der Trocknung hatten.

Die erfindungsgemäss hergestellten Produkte sind wertvolle Mittel zum Nachweis von Thrombozyten-Antikörpern in Serum oder Serumpräparationen. Es können beispielsweise folgende Testprinzipien eingesetzt werden:

Thrombozyten mit darauf befindlichen bekannten Antigenen werden mit Flüssigkeiten, die Antikörper gegen diese bekannten Antigene enthalten, in Kontakt gebracht. Die sich bildenden Immunkomplexe werden mit der dem Fachmann geläufigen Coombs-Reaktion nachgewiesen, d. h. mit einem Antikörper, der gegen die zu prüfenden Antikörper gerichtet ist und in irgendeiner bekannten Weise markiert ist, umgesetzt und durch die verwendete Markierung sichtbar gemacht.

Alternativ zum Coombs-Test kann ein Nachweis der Thrombozyten-Antigen-Antikörper-Immunkomplexen durch die ebenfalls geläufige Komplementbindungsreaktion erfolgen. Das Testprinzip ist auch anwendbar, wenn die Antigene auf den Thrombozyten unbekannt sind und mit bekannten gegen Thrombozyten gerichteten Antikörpern reagieren. Es kann hierbei folgendes Testsystem zur Anwendung gelangen:

Das Dediment von ca. 1 x 106 erfindungsgemäss stabilisierten Thrombozyten wird mit 0,1 ml der auf das Vorhandensein von Thrombozyten-Antikörpern zu prüfenden Flüssigkeit, z. B. Serum, ggf. in mehreren Stufen verdünnt, überschichtet und resuspendiert. Nach einer Inkubation von etwa 30 Min. Dauer bei ca. 20° C werden die Thrombozyten mit einer physiologischen Salzlösung, die ggf. 0,0001 M bis 0,0005 M eines Me-tallchelatbildners wie Äthylendiamintetraessigsäure enthält, dreimal gewaschen. Nachfolgend wird das Thrombozytensedi-ment mit 0,1 ml eines Antiserums, welches Antikörper gegen die zu prüfenden Thrombozyten-Antikörper enthält, die mit einem Markierungsmittel (z.B. einem fluoreszierenden Stoff wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Tetramethylrhoda-minisothiocyanat (TRITC) oder einem Enzym wie Peroxydase gekoppelt sind, überschichtet und resuspendiert, und zwar in einer Verdünnung, die selbst nicht mehr (unspezifisch) mit den stabilisierten Thrombozyten reagiert. Nach einer Inkubation von 30 Min. Dauer bei 20° und nach erneuter dreimaliger Waschung wird das Thrombozytensediment in 0,02 ml einer proteinhaltigen Lösung (z. B. Albumin oder fetales Kälberserum) resuspendiert. Die Suspension wird auf einem Objektträger ausgestrichen. Nach Lufttrocknung wird je nach Markierungsart das Präparat direkt im Fluoreszenzmikroskop beurteilt oder es wird nachfolgend einer der bekannten cyto-chemischen Reaktionen auf das Markerenzym unterzogen und dann lichtmikroskopisch ausgewertet. Sind in der zu prüfenden Flüssigkeit Antikörper gegen Thrombozyten, sind diese Partikel je nach der gewählten Methode markiert und erkennbar.

Die Erfindung soll mit Hilfe des nachstehenden Ausführungsbeispiels näher erläutert werden.

Beispiel

100 ml menschliches Blut, das während der Gewinnung mit 0,005 g EDTA pro ml gemischt wurde, wird in einer Zentrifuge bei 1500 U./min (Rotordurchmesser 21 cm) zentrifugiert. Der sogenannte Thrombozytenreiche Überstand wird abgehebert, der Rest verworfen. Der Überstand wird bei 1200 U./min zentrifugiert und in 0,9%iger Kochsalzlösung enhal-tend 0,01 g EDTA pro 100 ml resuspendiert. Die Zentrifugation und Resuspension wird insgesamt 5mal wiederholt, wobei jeweils der Überstand verworfen und das Thrombozytensediment gewonnen wird.

Schliesslich wird das Thrombozytensediment in 25 ml einer phosphatgepufferten Lösung folgenden Rezeptes, deren pH 7,2 Wert beträgt und die mit 1 % Polyvinylpyrrolidon versetzt ist, resuspendiert:

NaCl 8 g

KCl 0,2 g

MgCl2 • 6H20 0,1g

CaCl2 • 2H20 0,132 g

Na2HP04 • 12H20 2,9 g

KH2P04 0,2 g

Aqua bid. ad 1000 ml

Zu der Thrombozytensuspension werden 25 ml einer 2%igen 5-Sulfosalizylsäurelösung gelöst in der oben genannten Phosphatpufferlösung mit einem Gehalt von 1 Gew. % Polyvinylpyrrolidon gegeben. Danach rührt man eine Stunde bei Raumtemperatur, zentrifugiert die chemisch modifizierten Thrombozyten bei 180 x g ab, wäscht wie anfänglich beschrieben mit Phosphatpufferlösung, die pro 100 ml 0,01 g EDTA enthält, insgesamt 5mal, wofür insgesamt 40 ml der Waschflüssigkeit verwendet werden. Schliesslich werden die Thrombozyten durch Zentrifugation gewonnen und in 30 ml der beschriebenen Phosphatpufferlösung, die 1 g Polyvinylpyrrolidon pro 100 ml enthält, resuspendiert.

Die Suspension stellt in dieser Form ein diagnostisch anwendbares Mittel zum Nachweis von Thrombozyten-Antikörpern dar. Zur Haltbarmachung kann der Suspension ein antimikrobiell wirksames Agens wie z. B. Natriumtimerfonat in einer Konzentration von 0,001 g pro 100 ml zugesetzt werden. Die erhaltene Suspension kann in bekannter Weise gefriergetrocknet werden. Zweckmässig werden hierbei Portionen von 10 ml abgefüllt und gefriergetrocknet.

In gleicher Weise wie in dem vorbeschriebenen Beispiel lassen sich gegerbte Thrombozyten mit Glutardialdehyd herstellen, wobei statt 2%iger Sulfosalizylsäure l%ige Glutardial-dehyd-Lösung verwendet wird.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Claims

622 672

1. Verfahren zur Herstellung modifizierter Thrombozyten, dadurch gekennzeichnet, dass man Thrombozyten mit einem Gerbstoff in einer Konzentration zwischen 0,002 und 5,0 Gew./Vol.% in wässriger Lösung behandelt.

2. Verfahren zur Herstellung modifizierter Thrombozyten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man frisch gewonnene Thrombozyten in einer isotonischen, ein Schutzkolloid enthaltenden, annähernd neutralen, gegebenfalls einen Chelatbildner enthaltenden, wässrigen Lösung suspendiert, mit einem Gerbstoff behandelt, die gegerbten Thrombozyten gewinnt und gegebenenfalls gefriertrocknet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine aus frischem Blut gewonnene thrombozytenrei-che Fraktion in einem wässrigen, ein Schutzkolloid enthaltenden, Medium bei pH 6 bis 8 mit einem Gerbstoff wenige Minuten bis zu mehreren Stunden bei 0 bis 37 ° C behandelt und danach die gegerbten Thrombozyten gewinnt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung in Gegenwart eines lyophilen Kolloids durchführt.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung in Gegenwart des lyophilen Kolloids Polyvinylpyrrolidon in einer Endkonzentration von 0,01 bis 5 % durchführt.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung mit 5-SuIfosalizyl-säure als Gerbstoff in einer Endkonzentration von 0,002 bis 4% durchführt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung mit Glutardialdehyd als Gerbstoff in einer Endkonzentration von 0,002 bis 4% durchführt.

8. Modifizierte Thrombozyten, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.

9. Verwendung der modifizierten Thrombozyten nach Anspruch 8 zum Nachweis von Thrombozyten-Antikörpern oder Thrombozyten-Antigenen.