CH622788A5 - Process for obtaining carrier-bound gibberellins - Google Patents

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CH622788A5
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CH
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carrier
activated
primary amino
amino group
gibberellins
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CH989276A
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Inventor
Robert Kramell
Peter Dr Mueller
Hans-Dieter Dr Knoefel
Original Assignee
Akad Wissenschaften Ddr
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08BPOLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0036Galactans; Derivatives thereof
    • C08B37/0039Agar; Agarose, i.e. D-galactose, 3,6-anhydro-D-galactose, methylated, sulfated, e.g. from the red algae Gelidium and Gracilaria; Agaropectin; Derivatives thereof, e.g. Sepharose, i.e. crosslinked agarose

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung trägerfixierter Gibberelline, wobei unter Trägerfixierung das chemische Verknüpfen des niedermolekularen Phytohormons mit hochmolekularen, zumeist unlöslichen Trägern, z.B. Polysacchariden, zu verstehen ist.
Derartige aus Träger und Ligand bestehende Materialien haben aufgrund ihrer biologischen Aktivität in letzter Zeit zunehmend an Bedeutung gewonnen. Das gilt vor allem für die Affinitätschromatographie, bei der die spezifische Wechselwirkung zwischen Ligand und ligandaffinen Substanzen zur Abtrennung letzterer benutzt wird. Es ist bekannt, dass die Trägerfixierung tierischer Hormone zur Auffindung hormonspezifischer Rezeptorproteine führte und damit grundlegende Teilschritte der Wirkungsweise jener Hormone aufgeklärt werden konnten. Entsprechende Ergebnisse hinsichtlich Wirkungsmechanismus und Stoffwechsel sind beim Einsatz trägerfixierter Phytohormone ebenfalls zu erwarten. Trägerfixierte Gibberelline sind jedoch bisher noch nicht bekannt.
1) Allgemeine Angaben über die Trägerfixierung finden sich bei:
Axén, R., J. Porath u. S. Ernbeck - Nature 214,1302-1304 (1967)
Chemical Coupling of peptides and proteins to Polysaccharides by means of cyanogen halides.
Axén, R. u. P. Vretblad - Acty Chem. Scand. 25, 2711-2716
(1971)
Binding of proteins to Polysaccharides by means of cyanogen halides. Cyanogen bromide - treated Sephadex.
Baum, G. - Enzyme Engineering, Vol. 2 (eds, E. K. Pye u. L. B. Wingard, Jr.) - Plenum Press, New York - London 1974, pp. 63-64
Derivatives of controlied pore glass for affinity chromatogra-phy.
Cuatrecasas, P. - J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970) Protein purification by affinity chromatography . Derivatiza-tions of agarose and Polyacrylamide beads.
Cuatrecasas, P. u. J. Parikh - Biochemistry 11, 2291—2299
(1972)
Adsorbents for affinity chromatography. Use of N-hydroxysuc-cinimide esters of agarose.
Turkovâ, J., O. Hubalkovâ, M. Krivakova u. J. (5oupek -
Biochim. Biophys, Acta 322,1-9 (1973)
Affinity chromatography on hydroxyalkylmethacrylate gels.
2) Angaben über die Trägerfixierung und den Einsatz der Adsorbentien in der Affinitätschromatographie finden sich bei: Cuatrecasas, P. - Advan. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 36, 29-89 (1972)
Affinity chromatography of macromolecules.
Weetall, H. H. - Separation and Purification Methods 2,199-
229 (1973) - Affinity Chromatography.
Methods in Enzymology, Vol. 34 (eds. W. B. Jacoby u.
M. Wilchek), Academic Press, New York 1974 - Affinity
Techniques.
3) Angaben über Rezeptorproteine tierischer Hormone finden sich bei:
Cuatrecasas, P. - Proc. Nat. Acad. Sei. USA 69,1277-1281, (1972)
Affinity chromatography and purification of the insulin reeep-tor of liver cell membranes.
Dufau, M. L., D. W. Ryan, A. J. Baukai and K. J. Catt - J. Biol. Chem. 250,4822-4824 (1975) - Gonadotropin reeep-tors.
Solubilization and purification by affinity chromatography. Ludens, J. H., J. R. De Vries u. D. D. Fanestil - J. Biol.
Chem. 247,7533-7538 (1972)
Criteria for affinity chromatography of Steroid binding macromolecules.
Sica, V., J. Parikh, E. Nola, A. G. Puca u. P. Cuatrecasas - J. Biol. Chem. 248, 6543-6558 (1973)
Affinity chromatography and the purification of estrogen receptors.
4) Angaben über die Herstellung und den Einsatz trägerfixierter Phytohormone finden sich bei:
Venis, M. A. - Proc. Nat. Acad. Sei. USA 68,1824-1827 (1971)
Stimulation of RNA transcription from pea and com DNA by protein retaines on Sepharose coupled to 2,4-di-chlorphen-oxyacetic acid.
Venis, M. A. -Biochem. J. 127, 29 P (1972)
Promotion of deoxyribonucleic acid - dépendent ribonucleic acid synthesis by protein isolated on an plant hormone affinity column.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung trägerfixierter Gibberelline zu entwik-keln.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Gibberelline in Form ihrer Anhydride oder ihrer Aminogruppen enthaltenden Derivate mit einem Träger unter Bildung einer Säureamidgruppierung umsetzt. Als Träger verwendet man vorzugsweise ein hochmolekulares Polysaccharid.
Die Säureamidgruppierung lässt sich auf verschiedene Weise
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herstellen. Wie gefunden wurde, besteht eine Möglichkeit darin, dass ein Anhydrid eines Gibberellins mit einem Träger, der primäre Aminogruppen enthält, z.B. einer Aminoalkylaga-rose, umgesetzt wird. Man gelangt ebenfalls zum Ziel, wenn ein Gibberellin-Derivat mit primärer Aminogruppe direkt mit s einem aktivierten Träger umgesetzt wird; diese Aktivierung kann z.B. mittels Bromcyan oder durch Verwendung eines Imidocarbonat-Strukturen enthaltenden Polysaccharids erfolgen. Schliesslich führt auch die Umsetzung eines Gibberellin-Derivates mit primärer Aminogruppe mit am Träger (z.B. 10 einem Polysaccharid) gebundenen und mit N-Hydroxysuccini-mid aktivierten Carboxylgruppen zu trägerfixierten Gibberellinen. Bei den beiden zuletzt genannten Verfahren kann man als Gibberellin-Derivat z.B. ein Gibberellinaminoalkylamid und als Träger durch Bromcyan aktivierte Agarose bzw. Carboxyl- is gruppen, die über eine Aminoalkylgruppierung an Agarose gebunden und mit N-Hydroxysuccinimid aktiviert sind, verwenden.
Durch Variation der Alkylkettenlängen [—(CH2)n—] können die Gibberellinmoleküle über unterschiedlich lange Sei- 20 tenarme (Spacer) mit der hochmolekularen Polysaccharid-Matrix der Agarose verknüpft werden, was für affinitätschro-matographische Zwecke von grosser Wichtigkeit ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht erstmals die Gewinnung trägerfixierter Gibberelline. Sie sind für eine 25 gezielte pflanzliche Stoffproduktion von technischer Bedeutung; denn damit werden bisher nicht realisierbare Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus der in entscheidende Differenzierungs- und Entwicklungsprozesse bei Pflanzen eingreifenden Gibberelline möglich. 30
Das Verfahren soll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen mit Reaktionsschemata erläutert werden.
Beispiel 1
Umsetzung von Gibberellinsäureanhydrid 35
mit Aminopentylagarose 1,4 ml Aminopentylagarose (Formel 1; n = 5) wurden in
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4 ml 0,1 m-Natriumboratpuffer pH 8,5 suspendiert und mit 25,8 mg Gibberellinsäureanhydrid (Formel 2) 30 Stunden lang bei 4°C umgesetzt. Das erhaltene Reaktionsprodukt (Formel 3; n = 5) wurde nacheinander mit 0,1 n-Natriumhydrogencar-bonat und Wasser gewaschen. Die quantitative Bestimmung ergab einen Gehalt von 2,46 |xM Gibberellinsäure pro ml Agarosegel.
Beispiel 2
Umsetzung durch Bromcyan aktivierter Agarose mit Gibberellinsäure-4-amino-n-butylamid 15 ml Agarosegel (Formel 4) wurden mit 3 g Bromcyan aktiviert und in 15 ml 0,1 n-Natriumhydrogencarbonat mit 162,7 mg Gibberellinsäure-4-amino-n-butylamid (Formel 5; n = 4) 20 Stunden lang bei 4°C umgesetzt. Nach dem Auswaschen des überschüssigen Amides wurde das Gel mit 10 ml einer 1 n-Äthanolaminlösung in 0,1 n-Natriumhydrogencarbonat umgesetzt. Anschliessend erfolgte das Waschen mit 0,1 n-Natriumhydrogencarbonat und Wasser. Aus der Analyse des Reaktionsproduktes (Formel 3; n = 4) ergab sich ein Gehalt von 10,9 (ÎM Gibberellinsäure pro ml Agarosegel.
Beispiel 3
Umsetzung des N-Hydroxysuccinimidesters der Carboxyäthylagarose mit Gibberellinsäure-4-amino-n-butylamid 1 ml Agarosegel (Formel 6; m = 2), das im Spacerteil durch N-Hydroxysuccinimid aktivierte Carboxylgruppen enthält, wurde in 3 ml 0,1 m-Natriumacetatpuffer pH 6,3 mit 20 mg Gibberellinsäure-4-amino-n-butylamid (Formel 5; n = 4)
über 15 Stunden bei 4°C umgesetzt. Nach dem Waschen des Reaktionsproduktes (Formel 7; m = 2, n = 4) mit 0,1 m-Natriumacetatpuffer pH 6,3 und Wasser wurde ein Gehalt von 0,56 [xM Gibberellinsäure pro ml Agarosegel ermittelt.
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1 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

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1. Verfahren zur Gewinnung trägerfixierter Gibberelline, dadurch gekennzeichnet, dass man Gibberelline in Form ihrer Anhydride oder ihrer Aminogruppen enthaltenden Derivate mit einem Träger unter Bildung einer Säureamidgruppierung umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Träger ein hochmolekulares Polysaccharid verwendet.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Anhydrid eines Gibberellins mit einem Träger, der primäre Aminogruppen enthält, umsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gibberellin-Derivat mit primärer Ami-nogruppe direkt mit einem aktivierten Träger umsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gibberellin-Derivat mit primärer Ami-nogruppe mit am Träger gebundenen und mit N-Hydroxysuc-cinimid aktivierten Carboxylgruppen umsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Gibberellinsäureanhydrid mit einer Amino-alkyl-agarose umsetzt.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gibberellin-Derivat mit primärer Aminogruppe mit einem durch Bromcyan aktivierten Polysaccharid oder mit einem Imidocarbonat-Strukturen enthaltenden Polysaccharid umsetzt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gibberellinaminoalkylamid, das eine primäre Aminogruppe enthält, mit durch Bromcyan aktivierter Agarose umsetzt.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gibberellin-Derivat mit primärer Aminogruppe mit an einem Polysaccharid gebundenen und durch N-Hydro-xysuccinimid aktivierten Carboxylgruppen umsetzt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gibberellinaminoalkylamid, das eine primäre Aminogruppe enthält, mit Carboxylgruppen, die über eine Aminoalkylgruppierung an Agarose gebunden und mit N-Hydroxysuccinimid aktiviert sind, umsetzt.
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