CH625272A5

CH625272A5 -

Info

Publication number: CH625272A5
Application number: CH1628576A
Authority: CH
Inventors: Joachim Dr Ziegenhorn; August Wilhelm Dr Wahlefeld; Alexander Dr Hagen; Hans Ulrich Prof Dr Bergmeyer
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1975-12-24
Filing date: 1976-12-23
Publication date: 1981-09-15
Also published as: AU511225B2; IT1064332B; HU174894B; DE2558536B2; DE2558536A1; GB1571899A; FI763653A7; JPS5934116B2; DE2558536C3; BE849804A; AU2083276A; NL7613819A; SE441364B; DD127909A5; US4229527A; FI60887C; SE7614226L; SU1055346A3; CA1100022A; FR2336682B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kinetischen Bestimmung von Enzymsubstraten mittels gekoppelter Reaktionen und ein zur Durchführung dieses Verfahrens geeignetes Reagens.

Die gebräuchlichste Methode der enzymatischen Substratbestimmung ist die sogenannte Endwertmethode. Hierbei wird das zu bestimmende Substrat einer enzymatischen Reaktion gemessen, indem die Reaktion bis zum Stillstand ablaufen gelassen wird, also das gesamte Substrat umgesetzt wird. Bei zahlreichen gebräuchlichen Endwert-Methoden für die Substratbestimmung, insbesondere auch an Analysenautomaten, liegt der Zeitbedarf pro Analyse gegenwärtig bei 10 bis 20 Minuten. Dieser Zustand ist unbefriedigend, weil der Zeitbedarf zu hoch ist und die optimale Ausnutzung der Messgeräte und Analysenautomaten verhindert wird.

Es ist bekannt, dass durch Anwendung des kinetischen Verfahrens, bei dem die Substrat-Konzentration durch Messung der Geschwindigkeit der Bestimmungsreaktion ermittelt wird, eine drastische Verringerung der üblichen Analysenzeit erzielt werden kann. Dazu trägt nicht zuletzt auch der Umstand bei, dass bei diesem Verfahren im Gegensatz zur Endwert-Methode die Ermittlung von Probenleerwerten im allgemeinen entfällt.

Die theoretischen Grundlagen der kinetischen Substratbestimmung wurden ausführlich in Anal. Chem. 43,697 und Advan. Anal. Chem. Instrum. 7,141 behandelt. Daraus ist es bekannt, dass von besonderer Bedeutung Reaktionen erster oder pseudoerster Ordnung sind, da sich diese im Analysenautomaten messtechnisch besonders einfach nach dem sogenannten «fixed-time»-Prinzip verfolgen lassen.

Bei den «fixed-time»-Verfahren misst man die Konzentrationsänderung der zu bestimmenden Substanz oder eines Folgeprodukts innerhalb eines festen Zeitintervalls. Läuft die Bestimmungsreaktion im gewählten Zeitabschnitt nach erster oder pseudo-erster Ordnung ab, dann gilt die Beziehung:

c

Hier bezeichnet k die Geschwindigkeitskonstante der Reaktion, Co die Anfangskonzentration der zu bestimmenden Substanz und Ac die Konzentrationsänderung derselben im Messzeitintervall At = fa-ti. Der Gleichung ist zu entnehmen, dass die gemessene Konzentrationsänderung der gesuchten Anfangskonzentration direkt proportional ist, wenn k, ti und t2 konstant gehalten werden. Letztere Bedingungen lassen sich an Analysenautomaten leicht einhalten, weshalb dieses Verfahren an derartigen Geräten besonders vorteilhaft eingesetzt werden kann.

Es ist auch schon bekannt, die Verfahrensbedingungen so zu wählen, dass eine Reaktion pseudonullter Ordnung erhalten

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wird. Eine quantitative Bestimmung ist dann aber nur über Unter einer Überdosierung wird hier der Einsatz einer

Näherungsverfahren möglich, welche häufig die Aufstellung wenigstens doppelt so grossen Enzymmenge, vorzugsweise von Eichkurven erforderlich machen. einer vielfach grösseren Enzymmenge, als sie an sich für den raschen Ablauf der Reaktion erforderlich wäre, verstanden. In den oben zitierten Veröffentlichungen und in anderen 5 Durch entsprechende Mengen der für die Teilschritte einge-Arbeiten, die sich bisher mit der kinetischen Substratbestim- setzten Enzyme lassen sich ja, wie oben erwähnt, die Geschwin-mung befassten, wird in erster Linie die Anwendbarkeit des digkeiten der einzelnen Teilreaktionen erheblich variieren, so Verfahrens auf einstufige Reaktionen diskutiert. Derartige dass auf relativ einfache Weise diejenige Reaktion geschwin-Reaktionen sind jedoch nur von begrenzter Bedeutung. Es ist digkeitsbestimmend gemacht werden kann, welche den spezinämlich häufig erforderlich, die Testsysteme im Interesse einer 10 fischsten Verlauf zeigt.

ausreichenden Spezifität und Praktikabilität aus mehreren Teil- Die Art der eingesetzten Enzyme kann verändert werden, reaktionen zusammenzusetzen. Andererseits ist nicht bekannt, indem man ein Enzym ganz bestimmter Herkunft, je nach der wie derartige gekoppelte Testsysteme so aufzubauen sind, so gewünschten Michaelis-Konstante, auswählt. Denn Enzyme dass man mit ihnen unter Routinebedingungen Substrat-Kon- verschiedener Herkunft, welche die gleiche Reaktion katalysie-zentrationen auf kinetischer Basis bestimmen kann. Ganz im 15 ren, können unterschiedliche Michaelis-Konstanten haben, je Gegenteil wird noch in jüngster Zeit darauf hingewiesen, dass nachdem ob sie z. B. aus Mikroorganismen oder aus Säugetiergekoppelte Reaktionen kinetische Bestimmungen problema- leber gewonnen werden.

tisch machen (Chem. Rundschau 26,24 (1973)), da beispiels- Eine künstliche Veränderung der Michaelis-Konstante lässt weise ein Aktivitätsverlust von beteiligten Enzymen das Ver- sich z. B. erreichen durch Änderung des Metallatoms im akti-

fahren rasch unbrauchbar macht. Daher war man bisher der 20 ven Zentrum des Enzyms. Eine andere Möglichkeit besteht in Ansicht, dass ein einstufiges Verfahren gerade bei enzymkineti- der partiellen Spaltung des Enzyms, entweder durch Dissozia-

schen Substratmessungen dem zweistufigen (und dementspre- tion in seine Untereinheiten, wenn das Enzym aus solchen chend überhaupt mehrstufigen) vorzuziehen sei. Dies erklärt, besteht, oder durch proteolytische Abspaltung eines Teils der warum bisher gekoppelte Testsysteme, mit denen man unter Peptid-Kette. Eine weitere Möglichkeit besteht in der chemi-

Routinebedingungen Substratkonzentrationen kinetisch 25 sehen Modifizierung des aktiven Zentrums. Diese kann z. B.

bestimmen kann, sich nicht in der Praxis bewährt haben. erfolgen durch Veränderung einzelner reaktiver Gruppen von

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Ver- Aminosäuren des Zentrums wie der Oxydation seiner SH-

fahren zur Bestimmung von Substrat-Konzentrationen mittels Gruppe oder dergleichen. Weitere Möglichkeiten zur künstli-

gekoppelter Reaktionen auf kinetischer Basis zu beschaffen, chen Änderung der Michaelis-Konstante bestehen in einer welches sich unter Routinebedingungen durchführen lässt und 30 Konformationsänderung des Enzyms durch Zusatz eines allo-

bei dem die Teilschritte der mehrstufigen Testsysteme ganz sterischen Effektors, durch Zusatz bestimmter Ionen, durch oder teilweise unter Enzymkatalyse ablaufen. geeignete Auswahl der Art des Puffers, durch Einstellung

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein bestimmter Salzkonzentrationen in der Lösung und derglei-

Verfahren zur kinetischen Bestimmung von Enzymsubstraten chen.

mittels gekoppelter Reaktionen, welches dadurch gekennzeich- 35 Eine Änderung des Substrats selbst kann erfolgen durch net ist, dass die Reaktionsparameter so gewählt werden, dass Komplexierung bei Zusatz geeigneter Komplexbildner, durch die spezifischste Teilreaktion der Reaktionskette geschwindig- Mizellbildung, beispielsweise durch Detergenszusatz oder der-

keitsbestimmend für die ganze Reaktionskette wird und der gleichen.

geschwindigkeitsbestimmende Schritt nach erster oder pseu- Auch mit dem pH-Wert lässt sich eine Beeinflussung der doerster Ordnung abläuft. 40 Reaktionsgeschwindigkeit im erfindungsgemässen Sinne

Unter gekoppelten Reaktionen wird hier eine Folge von bewirken. So kann das Enzym derjenigen Teilreaktion, die mindestens zwei Teilreaktionen verstanden, von denen wenig- geschwindigkeitsbestimmend gemacht werden soll, unter stens eine enzymatisch katalysiert wird und bei denen die einem nicht optimalen pH-Wert, der zu einer Erhöhung der

Umsetzung des Substrates und die eigentliche Messreaktion Michaelis-Konstante dieses Enzyms führt, eingesetzt werden.

(Indikatorreaktion) in verschiedenen Reaktionsschritten ablau- 45 In gleicher Weise lässt sich auch die Temperaturabhängigkeit fen. von Enzymen ausnutzen, obwohl dies nicht bevorzugt wird, da

Zu den Möglichkeiten, die spezifischste Teilreaktion so zu die allgemeine Bestrebung dahingeht, die Temperatur enzyma-

gestalten, dass sie geschwindigkeitsbestimmend ist und nach tischer Bestimmungsreaktionen zu vereinheitlichen,

pseudoerster Ordnung abläuft, gehören geeignete Auswahl der Weitere Mittel zur Beeinflussung der Geschwindigkeit der

Art der eingesetzten Enzyme, künstliche Veränderung der 50 Teilreaktionen im erfindungsgemässen Verfahren sind der

Michaelis-Konstante eines oder mehrerer der eingesetzten Zusatz von Reaktionsteilnehmern und Reaktionsprodukten,

Enzyme, Änderungen des Substrats, geeignete Auswahl der welche die Michaelis-Konstante eines Enzyms echt oder

Konzentrationen der beteiligten Enzyme und Reagentien, der scheinbar verändern. Im gleichen Sinne können auch Inhibito-Temperatur, des pH-Wertes, Einsatz von Cofaktoren, Beschleu- ren verwendet werden. Letzteres ist beispielsweise aus der nigern und Hemmstoffen. 55 DT-OS 23 49 819.3 bekannt. Schliesslich lässt sich die

Vorzugsweise wird die weniger spezifische Teilreaktion Geschwindigkeit einer nichtenzymatischen Teilreaktion durch bzw. werden die weniger spezifischen Teilreaktionen durch Zusatz eines Katalysators oder eines Hemmstoffes beeinflus-

eine Überdosierung der in diesen Teilreaktionen wirksamen sen.

Enzyme beschleunigt. Diese Ausführungsform hat den zusätzli- Unter der spezifischsten Teilreaktion der Reaktionskette chen Vorteil, dass eine Aktivitätsänderung dieser Enzyme 60 wird diejenige Teilreaktion verstanden, welche die grösste Spe-

durch Lagerungseinflüsse kompensiert wird. Beim Enzym der zifität hinsichtlich der Ausgangssubstanz der Reaktion zeigt spezifischsten Teilreaktion dagegen spielt eine Aktivitätsab- und ausserdem durch entsprechende Auswahl der Reaktions-

nahme keine wesentliche Rolle, da die Michaelis-Konstante im parameter geschwindigkeitsbestimmend gestaltet werden allgemeinen hierdurch ja nicht beeinflusst wird. Natürlich muss kann. Diese Teilreaktion kann enzymatisch katalysiert sein, sie aber verhindert werden, dass die Aktivität dieses Enzyms völlig 65 muss es aber nicht. Ein Beispiel einer nichtenzymatischen verloren geht, wozu die üblichen Methoden der Enzymstabiii- Reaktion pseudoerster Ordnung mit sehr hoher Spezifität ist sierung angewandt werden können, die dem Fachmann die Mutarotation zwischen a- und ß-Glucose. Wenn die an sich bekannt sind. spezifischste Teilreaktion nicht geschwindigkeitsbestimmend

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gemacht werden kann, z. B. bei zu geringer echter oder scheinbarer Michaelis-Konstante des Enzyms, so gilt die nächstspezifischste Teilreaktion, die geschwindigkeitsbestimmend gestaltet werden kann, als die spezifischste Teilreaktion im Sinne der Erfindung.

Ein weiteres wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt so gestaltet werden muss, dass er nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft. Wenn die spezifischste Teilreaktion, die geschwindigkeitsbestimmend gestaltet wird, ohnehin nach erster Ordnung abläuft, so sind besondere Massnahmen in dieser Hinsicht nicht erforderlich. Anders bei Reaktionen zweiter und höherer Ordnung. Hier muss eine pseudoerste Ordnung herbeigeführt werden. Dies lässt sich dadurch erreichen, dass die Konzentration des zweiten oder weiteren Reaktionspartners, der nicht das zu bestimmende Substrat oder ein Folgeprodukt desselben ist, durch entsprechende Dosierung während der Reaktion praktisch konstant gehalten, also im Überschuss eingesetzt wird. Ausserdem muss, wenn es sich um eine enzy-matische Reaktion handelt, die Michaelis-Konstante so hoch gewählt werden, dass sie gross ist gegenüber der Obergrenze der in Betracht kommenden Substratkonzentration im Test.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur kinetischen Bestimmung von Enzymsubstraten mittels gekoppelter enzymatischer Reaktionen. Ein derartiges Reagens ist erfindungsgemäss dadurch gekennzeichnet, dass es solche Enzyme und Reaktionsteilnehmer und diese in einer solchen Dosierung enthält, dass die spezifischste Teilreaktion der bei

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Zugabe des Substrats zu einer wässrigen Lösung des Reagens ablaufenden Reaktionskette geschwindigkeitsbestimmend für die ganze Reaktionskette ist und nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dies erreicht, indem das Reagens das Enzym oder die Enzyme der weniger spezifischen Teilreaktion oder Teilreaktionen überdosiert enthält.

Die Erfindung ermöglicht es, enzymkinetische Substratmessungen in gekoppelten Testsystemen durchzuführen und damit die zur Durchführung derartiger Bestimmungen erforderliche Zeit erheblich zu verringern. Gleichzeitig wird dadurch weitgehende Unabhängigkeit von der Aktivität der beteiligten Enzyme erreicht, so dass die Präzision des Verfahrens auch dann voll gegeben ist, wenn durch Lagerung schon ein wesentlicher Aktivitätsverlust bei den beteiligten Enzymen aufgetreten ist. Weiter ermöglicht es die Erfindung, derartige mehrstufige enzymkinetische Substratmessungen auf allen gängigen Analysenautomaten durchzuführen, wobei es anhand der Lehren der Erfindung ohne Schwierigkeiten möglich ist, die quantitative Zusammensetzung der Reagentien jedem beliebigen Analysenautomaten anzupassen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1

Blutzuckerbestimmung nach der GOD/PAP-Methode

Die Bestimmung verläuft gemäss folgender Gleichung:

°^-D-Glucose; 37%

^ß-D-Glucose 63%

ß-D-Glucose + H„0 + 0„ GOD x D-Gluconsäure + Ho0o

2 2 EC.1.1.3J 2 2

H2°2 + Phenol + 4-Aminoantipyrin

POD » chinoider Farbstoff

EC.1.11,1.7 + 2H20

Das Enzym Peroxydase (POD) wird soweit überdosiert, dass die streng nach pseudoerster Ordnung ablaufende Mutarotation zwischen a- und ß-Glucose oder die wegen der hohen Km bezüglich Glucose ebenfalls nach pseudoerster Ordnung ablaufende Glucoseoxydase (GOD)-Reaktion zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt wird.

Dies wird erreicht durch ein Reagens nachstehender Zusammensetzung:

80-120 mM Phosphatpuffer pH 7,0 0,8 U/ml oder mehr POD 12 U/ml oder mehr GOD 0,60-1,80 mM 4-Aminoantipyrin 3,0-13,5 mM Phenol

Vorstehendes Reagens eignet sich besonders zur Durchführung des Verfahrens an centrifugai fast analyzern. Die erste 45 Ablesung erfolgt ca. 35 Sekunden nach Mischen des Reagens mit der zu untersuchenden Probe, die zweite Ablesung 1,5 bis 3,5 Minuten später. Mit 500 bis 600 jal des Reaktionsgemisches und 5 bis 20 p.1 Probe können bis zu 1000 mg Blutzucker/100 ml bestimmt werden.

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Beispiel 2

T riglyceridbestimmung

Die Triglyceride werden enzymatisch zu Glycerin und Fettsäure gespalten.

55 Die Bestimmung des Glycerins erfolgt gemäss den folgenden gekoppelten Reaktionen:

Glycerin + ATP Glycerokinase EC2.7.1.30 v Glycerin-3-Phosphat +

ADP

ADP + Phosphoenolpyruvat Pyruvatkinase EC2.7.1.4Q^ ATP + Pyruvat Pyruvat + NADH + H+ Lactat-Dehydrogenase ECI.1.1.27^ Lactat + NAD+"

Das Verfahren wird kinetisch mit folgenden Reagentien durchgeführt:

Reagens 1:

45-55 mmol/1 Phosphatpuffer pH 7,0

4,6-3,1 mmol/1 Magnesiumsulfat

300-400 (imol/l Natriumdodecylsulfat

2,3-3,5 mmol/1 ATP

280-420 (imol/l Phosphoenolpyruvat

120-230 p.mol/1 NADH; 7,7x 10" U/1 oder mehr Lipase

5.8 x 102 U/1 oder mehr Esterase

9,6 x 102 U/1 oder mehr Pyruvatkinase

5,3 x 103 U/1 oder mehr Lactatdehydrogenase

Reagens 2:

2.9 x 103 U/1 oder mehr Glycerokinase

Die Reaktion wird am centrifugai fast analyzer bei 340 nm und 25 °C gemessen. Durch Erhöhung der ATP-Konzentration im Test wird die Michaelis-Konstante der Pyruvatkinase scheinbar so weit erhöht, dass sie gross ist gegenüber der Gly-cerin-Obergrenze im Test. Die anderen Enzyme werden überdosiert. Dadurch wird die Pyruvatkinase-Reaktion geschwindigkeitsbestimmend und die Glycerinkonzentration kann aus der Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt werden.

Zur Durchführung der Bestimmung wurden 10 jxl der zu untersuchenden Serumprobe mit 30 bis 50 (il physiologischer Kochsalzlösung und 500 bis 600 |il des Reagens, welches die Glycerokinase noch nicht enthielt, gemischt und 10 Minuten stehen gelassen. Dann wurde die Glycerokinase zugesetzt und nach 50 Sekunden die erste, nach 150 bis 200 Sekunden die zweite Ablesung durchgeführt.

Die Methode erfasst einen Konzentrationsbereich von 500 bis 9000 mg Triglycerid pro Liter.

Regressionsvergleich y = 0,99x0,51 Korrelationskoeffizient r = 0,999

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Beispiel 2a

Bestimmung von Glycerin

Das Verfahren wird kinetisch mit folgenden Reagentien durchgeführt:

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Reagens 1 :

45-55 mmol/1 Phosphatpuffer pH 7,0 4,6-3,1 mmol/1 Magnesiumsulfat 300-400 (xmol/1 Natriumdodecylsulfat io 2,3-3,5 mmol/1 ATP

280-420 ia.mol/1 Phosphoenolpyruvat

120-230 |4.mol/l NADH

9,6 x 102 U/1 oder mehr Pyruvatkinase

5,3 x 103 U/1 oder mehr Lactatdehydrogenase

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Reagens 2:

2,9 x 103 U/1 oder mehr Glycerokinase

Die Reaktion wird am centrifugai fast analyzer bei 340 nm und 25 °C gemessen.

20 Durch Erhöhung der ATP-Konzentration im Test wird die Michaelis-Konstante der Pyruvatkinase scheinbar soweit erhöht, dass sie gross genug ist gegenüber der Glycerin-Obergrenze im Test. Die anderen Enzyme werden überdosiert. Dadurch wird die Pyruvatkinase-Reaktion geschwindigkeitsbestimmend und 25 die Glycerin-Konzentration kann aus der Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt werden.

Zur Durchführung der Bestimmung wurden 100 |xl der zu untersuchenden Serumprobe mit 100 jxl physiologischer Kochsalzlösung und 500 bis 600 (_tl des Reagens, welches die Glycero-30 kinase noch nicht enthielt, gemischt. Dann wurde die Glycerokinase zugesetzt und nach 50 Sekunden die erste, nach 150 bis 200 Sekunden die zweite Ablesung durchgeführt.

Die Methode erfasst einen Konzentrationsbereich von 50 bis 900 mg Glycerin pro Liter.

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Beispiel 3

Gesamtcholesterin

Die Bestimmung verläuft gemäss folgender Gleichung:

Cholesterinester + Choiesteìrln-Esteras^ Cholesterin +

^EC 3.1.1.13 Fettsäure

Cholesterin + 02 Choies terin-Oxydase^ Cholestenon + H202

H2°2 + CH30H Katalase v h9C0 + 2H,0 EC 1.11.1.6 2

= 412 nm max

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Durch Überdosierung der Enzyme Cholesterinesterase und Cholesterinoxydase wird die nach pseudoerster Ordnung ablaufende Farbreaktion geschwindigkeitsbestimmend. Das Verfahren wird beispielsweise am Eppendorf 5032- oder Braun Syste Matik-Automaten mit nachstehendem Reagens durchgeführt:

0,45-0,75 mol/1 Ammoniumphosphatpuffer pH 7,0 1,36-2,04 mol/1 Methanol 16-24 mmol/1 Acetylaceton 0,79-1,19 g/1 Hydroxypolyäthoxydodecan 500 kU/I Katalase oder mehr 20 U/1 Cholesterinesterase oder mehr 20 U/1 Cholesterinoxydase oder mehr

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Ein in gleicher Weise zusammengesetztes Leerwertreagens enthält die Cholesterinoxydase nicht.

Zur Durchführung der Bestimmung am Eppendorf 5032-Automaten werden 0,01 ml der zu untersuchenden Probe mit 5 1,0 ml des Reagens gemischt und bei 37 °C 20 Minuten inkubiert. Dann wurde bei Hg 405 mnm die Extinktion abgelesen.

In einem Leerwertansatz mit gleicher Zusammensetzung, der die Cholesterinoxydase nicht enthielt, wurde genauso vorgegangen. Aus der Extinktionsdifferenz zwischen Proben-io ansatz und Leerwertansatz errechnet sich die Cholesterin-menge.

Regressionsgerade y = 0,98 + 1,98;

Korrelationskoeffizient r = 0,997

Claims

625272 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur kinetischen Bestimmung von Enzymsubstraten mittels gekoppelter Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsparameter so gewählt werden, dass die spezifischste Teilreaktion der Reaktionskette geschwindigkeitsbestimmend für die ganze Reaktionskette wird und die geschwindigkeitsbestimmende Teilreaktion nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die kinetische Bestimmung durch Messung einer Veränderung in einem vorgegebenen Zeitintervall durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischste Teilreaktion durch Überdosierung des Enzyms oder der Enzyme der anderen Teilreaktion bzw. Teilreaktionen geschwindigkeitsbestimmend gestaltet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischste Teilreaktion durch geeignete Auswahl der Art des eingesetzten Enzyms, je nach seiner Michaelis-Konstante, durch künstliche Veränderung der Michaelis-Kon-stante oder durch künstliche Veränderung des Substrats, so gestaltet wird, dass sie geschwindigkeitsbestimmend ist und nach pseudoerster Ordnung abläuft.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die künstliche Veränderung der Michaelis-Konstante durch Änderung des Metallatoms im aktiven Zentrum, durch partielle Spaltung des Enzyms, durch chemische Modifizierung des aktiven Zentrums oder/und durch Konformationsänderung erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Veränderung des Substrats durch Komplexierung oder Mizellbildung erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Reaktionsablauf nach der pseudoersten Ordnung hergestellt wird, indem der zweite oder weitere Reaktionspartner, der nicht das zu bestimmende Substrat oder ein Folgeprodukt desselben ist, im Überschuss zugegeben wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Reaktionsablauf nach pseudoerster Ordnung durch echte oder scheinbare Erhöhung der Michaelis-Konstante des Enzyms der geschwindigkeitsbestimmenden Teilreaktion eingestellt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die scheinbare Erhöhung der Michaelis-Konstante durch Zusatz eines Reaktionsnebenproduktes oder durch Inhibitorzugabe erfolgt.

10. Reagens zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es solche Enzyme und Reaktionsteilnehmer und diese in einer solchen Dosierung enthält, dass die spezifischste Teilreaktion der bei Zugabe des Substrates zu einer wässrigen Lösung des Reagens ablaufenden Reaktionskette geschwindigkeitsbestimmend ist und nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft.

11. Reagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es das Enzym oder die Enzyme der weniger spezifischen Teilreaktion oder Reaktionen überdosiert enthält.

12. Reagens nach Anspruch 11 zur Bestimmung von Blutzucker, bestehend aus 80 bis 120 mM Phosphatpuffer pH 7,0,0,8 U/ml oder mehr POD, 12 U/ml oder mehr GOD, 0,60 bis 1,80 mM 4-Aminoantipyrin, 3,0 bis 13,5 mM Phenol.

13. Reagens nach Anspruch 11 zur Bestimmung von Triglyceriden, bestehend aus: Reagens 1,45 bis 55 mmol/1 Phosphatpuffer pH 7,0,4,6 bis 3,1 mmol/1 Magnesiumsulfat, 300 bis 400 (j.mol/1 Natriumdodecylsulfat, 2,3 bis 3,5 mmol/1 ATP, 280 bis 420 (xmol/l Phosphoenolpyruvat, 120 bis 230 p.mol/1 NADH ; 7,7 x 104 U/1 oder mehr Lipase,.5,8 x 102 U/1 oder mehr Esterase, 9,6 x 102 U/1 oder mehr Pyruvatkinase, 5,3 x 103 U/1 oder mehr Lactatdehydrogenase; Reagens 2,2,9 x 103 U/1 oder mehr Glycerokinase.

14. Reagens nach Anspruch 11 zur Bestimmung von Glyce-rin, bestehend aus: Reagens 1,45 bis 55 mmol/1 Phosphatpuffer pH 7,0,4,6 bis 3,1 mmol/1 Magnesiumsulfat, 300 bis 400 |i.mo!/l Natriumdodecylsulfat, 2,3 bis 3,5 mmol/1 ATP, 280 bis 420 jj.mol/1 Phosphoenolpyruvat, 120 bis 230 p.mol/1 NADH ; 9,6 x 102 U/1 oder mehr Pyruvatkinase, 5,3 x 103 U/1 oder mehr Lactatdehydrogenase; Reagens 2,2,9 x 103 U/1 oder mehr Glycerokinase.

15. Reagens nach Anspruch 11 zur Bestimmung von Gesamtcholesterin, bestehend aus 0,45 bis 0,75 mol/1 Ammoniumphosphatpuffer pH 7,0,1,36 bis 2,04 mol/1 Methanol, 16 bis 24 mmol/1 Acetylaceton, 0,79 bis 1,19 g/1 Hydroxypolyäthoxydode-can, mindestens 500 kU/1 Katalase, mindestens 20 U/1 Choleste-rinesterase, mindestens 20 U/1 Cholesterinoxydase.