CH626263A5 - - Google Patents
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Description
La presente invenzione ha per oggetto un procedimento per isolazione di componenti ad attività anticoagulante «in vivo» dal veleno di serpenti. Più in particolare l'invenzione riguarda un procedimento per ottenere allo stato di grande purezza i componenti enzimatici anticoagulanti «in vivo» dal veleno di serpenti mediante tecniche chimiche di separazione per via cromatografica dei componenti del veleno applicando per eluizione soluzioni a pH diverso.
Come è ben noto il veleno di numerose specie di serpenti contiene enzimi che hanno la proprietà di catalizzare «in vitro» la gelificazione del fibrinogeno del plasma dei mammiferi e quindi determinare la coagulazione del sangue, del plasma o di soluzioni di fibrinogeno. Alcuni di questi enzimi, se impiegati «in vivo», hanno però la proprietà di indurre una sensibile diminuzione del fibrinogeno e provocare l'incoagulabilità del sangue. Ad esempio è caratteristico il caso del veleno di Ancistrodon rhodostoma avente proprietà coagulanti «in vitro» e anticoagulanti «in vivo». Questo fatto trova spiegazione nella presenza nel veleno di serpenti, oltre ad altri componenti proteinici, di due tipi di enzimi dotati entrambi di attività coagulante «in vitro», uno dei quali però, se iniettato nel sangue di animali, esplica una azione del tutto opposta, provocando l'incoagulabilità del sangue.
E' evidente quindi l'importanza di procedimenti, come quello dell'invenzione, destinati a separare i componenti del veleno di serpenti e a isolare, allo stato di grande purezza, il componente ad azione anticoagulante «in vivo» impiegabile, con ottimi risultati, nella produzione di preparati ad azione farmacologica.
Fino al giorno d'oggi l'operazione di separazione dei costituenti enzimativi del veleno di serpenti è stata eseguita per cromatografia su resine scambiatrici ioniche e/o con tecniche di frazionamento per precipitazione con sali o solventi idonei.
Queste tecniche non assicurano però né un soddisfacente grado di purezza nel prodotto, né tempi di lavoro adeguatamente brevi.
È pertanto scopo principale di questa invenzione attuare un procedimento di separazione di detti enzimi che garantisca insieme e la purezza dell'enzima anticoagulante «in vivo» e la rapidità delle tecniche operative.
Il procedimento secondo l'invenzione prevede l'impiego di una colonna cromatografica riempita con un materiale di supporto insolubile in solventi acquosi, destinato all'assorbimento selettivo dell'enzima anticoagulante «in vivo», al quale è legato stabilmente su substrato o un inibitore di detto enzima. Quando il veleno di serpente, preventivamente preparato per il trattamento cromatografico, viene fatto passare attraverso la colonna, in opportune condizioni di pH e forza ionica, si attua sostanzialmente l'assorbimento in colonna del solo enzima anticoagulante «in vivo», mentre gli altri componenti del veleno non vengono assorbiti. Successivamente per eluizione del sistema supporto-enzima con soluzioni a pH diverso da quello iniziale o con soluzioni che contengono libero un substrato o inibitore dell'enzima, si allontana il voluto enzima dalla colonna allo stato di grande purezza.
È pertanto oggetto specifico di questa invenzione un procedimento per estrarre e isolare dal veleno di serpenti il componente enzimatico anticoagulante «in vivo» dagli altri componenti ad azione coagulante «in vitro» e da quelli proteinici, caratterizzato dal far passare il veleno del serprente, disciolto in un mezzo idoneo ad un trattamento cromatografico di separazione, attraverso una colonna riempita con un supporto solido di assorbimento selettivo di detto enzima anticoagulante «in vivo», insolubile in solventi acquosi, legato a un substrato o un inibitore di detto enzima, far passare poi attraverso detto riempimento un primo mezzo di eluizione a pH 6-7 e molarità eguale o minore di 0,05M, raccogliere l'eluato in porzioni successive sino ad ottenere l'eluizione di più del 95 % dei componenti proteinici del veleno e di una frazione di attività coagulante in «vitro», far
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passare un secondo mezzo di eluizione con pH di valore anche superiore a 9 e molarità eguale o maggiore a 0,3M e raccogliere l'eluato in porzioni successive sino ad ottenere sostanzialmente l'intera quantità dell'enzima anticoagulante «in vivo» assorbito dalla colonna insieme a meno del 5 % dei componenti proteinici.
Per la preparazione di un prodotto idoneo ad un uso farmacologico si procede poi a diluire detto secondo eluato con acqua fino ad un contenuto di unità trombiniche (NIH) pari a 25 unità per mi, sterilizzare per filtrazione attraverso filtri porosi, aggiungere al filtrato un supporto per liofilizzazione e liofilizzare il materiale così ottenuto suddiviso in dosi da 1 o 2 mi (25-50 unità NIH) distribuite in ampolle.
Nel caso di veleno di Ancistrodon Rhodostoma al supporto solido del riempimento della colonna viene legato, secondo linvenzione, con legame covalente, l'amminoacido ar-ginina in qualità di inibitore dell'enzima anticoagulante «in vivo». Per quanto riguarda il materiale di supporto esso viene preparato secondo uno dei metodi generali già noti per legare a matrici insolubili di diverso tipo, sostanze contenenti gruppi amminici. Sono risultate particolarmente adatte sostanze polimeriche dotate di caratteristiche di insolubilità in solventi acquosi, contenenti gruppi ossidrile, come gel di destrano o cellulosa che siano state trattate con bromuro di cianogeno.
A tali sostanze attivate con bromuro di cianogeno si aggiunge poi come è stato detto, una soluzione di arginina con formazione di un composto tra la matrice solida (resina) e il residuo di arginina.
Particolarmente adatto è risultato, come supporto, il gel di destrano fornito dalla ditta Pharmacia con il marchio di fabbrica «Sepharose».
Seguono ora alcuni esempi illustrativi, ma non limitativi del procedimento secondo l'invenzione, relativamente al veleno di Ancistrodon rhodostoma (esempio I) e di isolamento di tale enzima anticoagulante «in vivo», oltre che di preparazione di un prodotto farmacologico ad azione anticoagulante (esempio II).
Esempio I
Purificazione dell'attività coagulante del veleno di Ancìstrodoma Rhodostoma
Viene preparata una colonna per cromatografia del diametro di cm. 0,7 contenente 10 mi di gel impaccato rappresentato da «Sepharose» legato con arginina. La colonna viene equilibrata con tampone di Tris (idrossimetilaminometa-no)-fosfato, detto in seguito per brevità Tris-fosfato, pH 7, 0,05 M.
50 mg di veleno liofilizzato di Ancistrodon Rhodostoma vengono sciolti in 1 mi dello stesso tampone usato per equilibrare la colonna. La soluzione di veleno viene applicata sulla colonna che viene successivamente eluita con il tampone tri-fosfato pH 7,0, 0,05 M. Viene raccolto l'eluato in frazioni di circa 2 ml. I primi 30 mi di eluato contengono più del 90% delle proteine totali presenti nel veleno applicato alla colonna e circa 180 unità di attività coagulanti «in vitro». (1 unità arbitraria di attività coagulante viene definita, per lo scopo dei seguenti esperimenti, come quella quantità di enzima che produce la formazione iniziale, visibile, di fibre di fibrina, sotto agitazione, in 15 secondi, a temperatura ambiente, in una soluzione di fibrinogeno umano allo 0,5%; questa unità è diversa dall'unità N.I.H. già menzionata più avanti definita come unità trombinica secondo lo standard N.I.H.). Dopo il passaggio dei primi 30 mi di eluato, la soluzione eluente viene cambiata con un tampone di Tris-HCl 0,2 M a pH 9,3. Si raccoglie quindi l'eluato dal nuovo tampone sempre in porzioni di 2 mi. Nei primi 20 mi di questo nuovo eluato è contenuto meno del 10% delle proteine presenti nei 50 mg di veleno applicati alla colonna e circa 420 unità coagulanti.
È da osservare che:
a) il secondo eluato contiene perciò la maggior parte dell'attività coagulante e solo una piccola frazione delle proteine del veleno di Ancistrodon Rhodostoma.
b) L'attività coagulante presente nel primo eluato è diversa e non convertibile in quella presente nel secondo eluato come è evidente dalla prova seguente.
Le frazioni più attive in senso coagulante del primo eluato, in tampone di tris-fosfato pH 7, 0,05M, vengono di nuovo applicate alla stessa colonna, già descritta in questo esempio, di nuovo equilibrate con tampone 0,05 M, pH 7,0. L'eluizione viene effettuata con lo stesso tampone; nei primi 20 mi viene ora eluita tutta l'attività coagulante applicata sulla colonna; il successivo eluato con tampone tris-HCl pH 9,3, 0,2 M non mostra questa volta significativa attività coagulante.
Risultati simili a quelli sopra riportati, sono stati ottenuti in numerosissime prove eseguite con le stesse modalità della prova già descritta, in cui però veniva variata la composizione dei tamponi usati per la prima e la seconda eluizione. Per la prima eluizione, in cui viene trattenuta sulla colonna la maggior parte dell'attività coagulante «in vitro», sono stati usati tamponi di tris-fosfato di pH tra 6 e 7, a molarità eguale o più bassa di 0,05M. Per la seconda eluizione, che rimuove dalla colonna la maggior parte dell'attività coagulante «in vitro» sono stati usati tamponi di pH tra 6 e 7 a molarità eguale o maggiore di 0,3 M, o di pH superiore a 9. Un esempio specifico di diverse modalità di adsorbimento ed eluizione, rispetto alla prova già descritta, viene riportato in appresso.
Esempio II
Purificazione di una attività coagulante «in vitro» del veleno di Ancìstrodoma Rhodostoma ed allestimento di una preparazione avente proprietà anticoagulante «in vivo» ed adatta ad essere impiegata in terapia
Come nell'esempio precedente viene preparata una colonna per cromatografia del diametro di 0,7 cm., contenente 10 mi di gel impaccato, rappresentato da «Sepharose» reagito con arginina. La colonna è equilibrata con tampone tris-fosfato pH 6,0, 0,01 M. 500 mg di veleno liofilizzato di Ancistrodon Rhodostoma vengono sciolti in 5 mi dello stesso tampone (Tris-fosfato pH 6, 0,01 M) e la soluzione viene fatta passare attraverso la colonna.
Si lava quindi la colonna facendo passare su di essa 30 mi di tampone Tris-fosfato 0,01 M pH 6,0. L'eluato viene raccolto in frazioni di 2 mi. Si cambia quindi la soluzione eluente con una consistente di tampone tris-fosfato pH 6,0, 0,3 M. Si fanno passare attraverso la colonna 75 mi di questa ultima soluzione e si raccoglie l'eluato in frazioni di 2 mi.
Il primo eluato (Tris-fosfato pH 6, 0,01 M) contiene più del 95 % delle proteine inizialmente presenti nei 500 mg di veleno e circa 2 200 unità di attività coagulante. Il secondo eluato (Tris-fosfato pH 6,0 0,3 M) contiene meno del 5%
delle proteine inizialmente presenti nel veleno e 6 000 unità di attività coagulante (unità arbitrarie) «in vitro». Il materiale proteico presente in esso, concentrato per ultrafiltrazione, risulta essenzialmente omogeneo all'analisi con ultracentrifuga e con elettroforesi su gel.
Questo secondo eluato viene diluito con H20 fino a contenere 25 unità N.I.H. (unità trombiniche N.I.H.) per mi. È quindi sterilizzato per filtrazione attraverso filtri di porosità opportuna, addizionato di adatto materiale che serve come supporto per la liofilizzazione e liofilizzato. È convenien5
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te liofilizzare il materiale dopo averlo distribuito in ampolle nelle quantità di 1 o 2 mi per ampolla corrispondenti a 25
0 50 unità N.I.H.
Il materiale così liofilizzato, una volta ridisciolto per aggiunta di H20, risulta possedere invariata l'attività coagulante «in vitro» anche dopo diversi mesi di conservazione a temperatura ambiente. Iniettato per via endovenosa a conigli nella quantità di 1 unità N.I.H. per Kg di peso corporeo, induce una fortissima diminuzione o scomparsa del fibrinogeno del sangue, entro poche ore, in assenza di significativi fenomeni collaterali ed effetti secondari.
Ciò è messo in evidenza dalle seguenti prove:
Sono stati stabulati 8 conigli, pesati e suddivisi in 4 gruppi di 2 animali ciascuno. Ad ogni animale sono state iniettate per via endovenosa dosi di materiale purificato pari a
1 unità N.I.H. per Kg. di peso corporeo, secondo l'attività precedentemente determinata in vitro. Il sangue prelevato
2 ore dopo l'iniezione si presentava incoagulabile.
Altri prelievi di sangue sono stati effettuati ai tempi 24h, 48h, 72h, 96h secondo il seguente schema:
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48 h
96 h
3
24 h
72 h
7
24 h
72 h
4
48 h
96 h
8
48 h
96 h
Sui campioni di sangue prelevato è stata determinata la fibrinogenemia mediante metodo gravimetrico. I dati ottenuti sono stati i seguenti, espressi in mg di fibrinogeno per mi di plasma.
Coniglio No.
Tempo mg fibrinogeno/ml plasma
1
24 h assente
3
24 h assente
5
24 h inizio formazione fibrinogeno: non dosabile
7
24 h inizio formazione fibrinogeno: non dosabile
2
48 h
6,2
4
48 h
/
6
48 h
4,1
8
48 h
4,3
Coniglio No.
Tempo mg fibrinogeno/ml plasma
1
72 h
8,1
3
72 h
/
5
72 h
7,7
7
72 h
/
2
96 h
10,5
4
96 h
15,6
6
96 h
8,8
8
96 h
/
Su altri conigli non trattati sono stati effettuati prelievi di sangue di cui è stata determinata la fibrinogenemia ottenendo i seguenti dati:
mg fibrinogeno/ml plasma
1
10
2
16
3
8,4
4
s io
15
20
25
30
35
40
45
V
Claims (10)
1. Procedimento per estrarre ed isolare dal veleno di serpenti il componente enzimativo ad attività coagulante «in vitro» ed anticoagulante «in vivo» dagli altri componenti ad azione coagulante «in vitro» e da quelli proteinici, caratterizzato dal far passare il veleno del serpente, disciolto in un mezzo idoneo ad un trattamento di separazione cromatografica, attraverso una colonna riempita con un supporto solido di assorbimento selettivo per detto enzima anticoagulante «in vivo», insolubile in solventi acquosi, legati ad un substrato o inibitore di detto enzima, far passare attraverso detto riempimento cui è stato applicato detto veleno un primo mezzo di eluizione a pH 6-7 e molarità eguale o minore a 0,05 M, raccogliere l'eluato in porzioni successive fino ad ottenere l'eluizione di più del 95% dei componenti proteinici del veleno e una frazione coagulante in vitro diversa da quella presente nel secondo eluato, far passare un secondo mezzo di eluizione a pH di valore anche maggiore di 9 e molarità eguale o maggiore a 0,3 M, racogliere l'eluato in porzioni successive fino ad ottenere sostanzialmente l'eluizione dell'enzima anticoagulante «in vivo» assorbito in colonna, insieme a meno del 5 % dei componenti proteinici.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto supporto del riempimento di detta colonna è una sostanza polimerica suscettibile di essere legata a gruppi amminici.
2
RIVENDICAZIONI
3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detta sostanza polimerica contiene gruppi ossidrile, attivata con bromuro di eianogeno.
4. Procedimento secondo le rivendicazioni 2 e 3, caratterizzato dal fatto che detta sostanza polimerica è gel di destrano o cellulosa.
5. Procedimento secondo ognuna delle rivendicazioni 2-4, caratterizzato dal fatto che detto substrato o inibitore dell'enzima anticoagulante «in vivo» è un derivato di un am-mino-acido organico.
6. Procedimento secondo la rivendicazione 5 per estrarre ed isolare dal veleno di Ancistrodon rhodostoma il componente enzimatico ad azione anticoagulante «in vivo» caratterizzato dal fatto che detto amminoacido è arginina.
7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto veleno di Ancistrodon rhodostoma viene liofilizzato e disciolto nello stesso mezzo liquido adoperato per la eluizione della colonna.
8. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto mezzo liquido impiegato per la prima eluizione è un tampone di tris-(idrossimetilamminometano)--fosfato con pH 7 e molarità 0,05 M o pH 6 e molarità
0,01 M.
9. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto secondo mezzo di eluizione è un tampone di tris-HCl con pH 9,3 e molarità 0,3 M o di tris-fosfato con pH 6 e molarità 0,3 M.
10. Procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che produrre un preparato farmacologico ad azione anticoagulante «in vivo» diluire detto enzima disciolto con acqua fino ad un contenuto di 25 unità NIH per mi, sterilizzare detto liquido per filtrazione attraverso filtri porosi, aggiungere un supporto per liofilizzazione e liofilizzare detto materiale dopo averlo distribuito in ampolle in quantità di 1 o 2 mi per ampolla (25 o 50 unità NIH).
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