CH626629A5 - - Google Patents

Description

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REVENDICATION

Procédé de préparation de la 2-(p-aminophényl-2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyrannosyl)-D-propionyl-L-analyl-D-isoglutamine, composé qui, sous sa forme glucoside ß, répond à la formule:

CH20H

0 0 O6H4hh2

OH, - OH

m - co cil

CO - UH - CH - CO - NH - CH

(A)

COEH,

CH^

(çh2)2

COOH

caractérisé en ce que l'on effectue le couplage du p-nitrophényl-2-acétamido-4,6-0-benzylidène-3-0-(D-l-carboxyéthyl)-2-déoxy-|3-D-glucopyrannoside, les groupes hydroxylés étant bloqués, par l'intermédiaire du groupe carboxyle, soit avec la chaîne peptidique L-Ala-D-iso-Gln préparée au préalable, et dont le groupe carboxylique est également bloqué, soit avec deux couplages consécutifs, en premier avec la L-alanine, puis le composé formé avec la D-isoglutamine, en

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D

bloquant à chaque couplage les groupes fonctionnels de chaque aminoacide à l'exception de ceux formant la liaison peptidique, et en ce que l'on réduit catalytiquement le groupe nitro en groupe amino en éliminant les groupes de blocage.

L'invention est relative à la préparation d'un nouvel agent soluble 35 L'agent adjuvant préparé selon l'invention est le 2-(p-amino-dans l'eau, efficace comme adjuvant immunologique pour stimuler, phényl-2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyrannosyl)-D-propionyl-chez un hôte, les réponses immunitaires. L-alanyl-D-isoglutamine, et, plus particulièrement, sa forme ß gluco side répondant à la formule:

CH2OH

* -0 0 - C6H4nh2

2_VL

H

NH - CO CIL

ch3 - CH - co - m - çh - co - m - çh - coïïh2

(A)

CIL

(CH )

I

COOH

On le désignera, ci-après, par l'abréviation p-aminophényl-Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln.

Pour préparer le composé (A), on procède, dans un premier temps, à la synthèse du fragment correspondant à la chaîne peptidique L-Ala-D-iso-Gln et à celle du fragment désigné par l'abréviation p-aminophényl-Mur-NAc, les groupes fonctionnels ne devant pas réagir étant protégés au préalable puis, selon l'invention, dans un deuxième temps, on effectue le couplage de ces deux fragments, pour réaliser, enfin, la réduction catalytique du groupe nitro en groupe amino dans le temps même où tous les groupements protecteurs sont hydrolysés.

V

D

Il est également possible d'effectuer la synthèse du composé (A) en réalisant le couplage séparé d'un dérivé du p-aminophényl-Mur-60 NAc avec un dérivé de la L-alanine, puis de coupler le produit résultant avec un dérivé adéquat de la D-isoglutamine, suivant les procédés traditionnellement utilisés en synthèses peptidiques.

Les compositions médicamenteuses contenant ledit agent servent, notamment, à renforcer l'action des immunogènes faibles. Des 65 compositions contenant ledit agent sont utilisables pour l'immunisation de l'homme et des animaux à sang chaud contre des infections bactériennes, virales ou parasitaires, et contre différents antigènes tissulaires d'origine normale ou pathologique.

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Le produit obtenu selon l'invention peut être administré de différentes façons mais, de préférence, il est injecté ou administré par scarification locale. A cet effet, on utilise avantageusement des compositions médicamenteuses constituées par des émulsions de doses efficaces du produit, selon l'invention, dans un milieu pharma-ceutiquement acceptable. On utilise, en particulier, des milieux contenant une phase huileuse et, notamment, des émulsions eau dans l'huile. Pour réaliser ces émulsions, on peut utiliser des huiles de paraffine ou des huiles analogues mais, de préférence, on choisit des huiles végétales métabolisables, telles que celles décrites dans la demande de brevet français N° 75.04003, ou toute autre composition à base d'huile végétale permettant l'obtention de résultats équivalents.

Le produit obtenu selon l'invention présente la particularité, lorsqu'il est administré, de ne pas être pyrogène. Cette propriété, qui le distingue de certains composés antérieurs connus, autorise en particulier l'administration par voie intraveineuse sans risque de choc hyperthermique chez le patient.

Pour permettre la préparation extemporanée des compositions médicamenteuses et notamment des émulsions, l'agent adjuvant peut être encore sous forme lyophilisée.

Une forme pharmaceutique avantageuse comprend des doses unitaires d'environ 25 à 100 mg du produit adjuvant selon l'invention et de préférence d'environ 50 mg.

Le produit obtenu peut servir à la préparation de compositions médicamenteuses dans lesquelles le p-aminophényl-Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln est associé à un agent immunogène, notamment à un antigène vaccinant faible.

Outre son utilisation comme adjuvant dans les compositions de vaccins, le composé (A) est utile comme réactif de laboratoire. Il est, par exemple, applicable soit comme amplificateur des réponses immunitaires, plus particulièrement lorsque l'immunogénicité des antigènes est faible, soit comme antagoniste de l'action immuno-suppressive éventuelle de produits testés en tant qu'immuno-suppresseurs dans les tests biologiques couramment étudiés.

D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description d'un exemple de préparation du produit selon l'invention, ainsi que des essais mettant en évidence les propriétés pharmacologiques de ce produit.

1) Exemple de synthèse de 2-(p-aminophènyl-2-acëtamido-2-dèoxy-3-0-$-D-glucopyrannosyl) -D-propionyl-L-alanyl-D-isoglutamine a) p-nitrophényl-2-acétamido-4,6-0-benzylidène-3-0-(D-1 -carboxy-éthyl)-2-déoxy-3-D-glucopyrannoside (I)

A 1,72 g (4 mmol) de p-nitrophényl-2-acétamido-4,6-0-benzylidène-2-déoxy-p-D-glucopyrannoside, obtenu selon la méthode décrite par Jeanloz R.W., Walker E. et Sinay P. dans «Carbohydr. Res.» (1968), 6,184, en solution dans 11 de dioxanne anhydre, on ajoute, à 68°C, 1,36 g (28 mmol) d'une suspension à 50% d'hydrure de sodium dans l'huile. Après une agitation de 15 min sont ajoutés 6,8 ml (90 mmol) d'acide chloropropionique. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 68° C. Après une nouvelle addition de la suspension d'hydrure de sodium (18 g, 375 mmol) et une agitation de 10 min, le mélange réactionnel est porté à 50°C, sous agitation, pendant environ 14 h.

L'excès d'hydrure de sodium est détruit, à 0°C, par addition de 100 ml d'eau. Deux phases se forment. La phase supérieure est séparée, filtrée et concentrée. Le résidu obtenu est dissous dans 200 ml d'eau. Cette phase aqueuse est alors extraite par quatre fois 100 ml de chloroforme, puis filtrée et acidifiée par HCl 2,5N (pH3), à 0°C. Il se forme un précipité qui est extrait par 500 ml de chloroforme. Après séchage sur sulfate de magnésium, le chloroforme est évaporé. Le résidu obtenu est dissous dans 50 ml de méthanol chaud et le produit est précipité par addition d'eau. On obtient ainsi 1 g du produit recherché, soit un rendement de 50%. Son point de fusion est 220-222°C et son pouvoir rotatoire [a] y = + 8° (diméthylformamide). L'analyse élémentaire de ce produit est la suivante:

Analyse pour C24H26010N2(502,48):

Calculé: C 57,37 H 5,22 N5,57%

Trouvé: C 57,01 H 6,02 N5,0 %

b) Ester benzylique de 2-(p-nitrophényl-2-acétamido-4,6-0-benzylidène-2-déoxy-3-0-(3-D-glucopyrannosyl)-D-propionyl-L-alanyl-D-isoglutamine (II)

408 mg (1 mmol) de l'ester benzylique de BOC*-L-alanyl-D-isoglutamine, obtenu selon la méthode décrite par Lefrancier P. et E. dans «Bull. Soc. Chim. Biol.» (1967), 49,1257, sont traités par 3 ml d'une solution normale d'acide chlorhydrique dans l'acide acétique glacial. Après 30 min, le mélange réactionnel est concentré à sec et séché.

L'huile obtenue est reprise dans 10 ml de diméthylformamide contenant 0,11 ml (1 mmol) de N-méthylmorpholine. On ajoute, alors, à — 15°C, une solution, préalablement préparée à cette même température, de 502 mg (1 mmol) de (I), de 0,11 ml (1 mmol) de N-méthylmorpholine et de 0,13 ml (1 mmol) d'isobutylchloroformate.

Le mélange réactionnel est agité 4 h à — 15°C, puis 1,7 ml d'une solution 2,5M de KHC03 sont ajoutés à 0°C. Après 30 min, le produit est précipité par addition d'eau distillée, puis filtré, lavé à l'eau et séché. On obtient ainsi 554 mg (soit un rendement de 87%) du produit recherché qui est homogène et peut être utilisé sans autre purification.

c) 2-(p-amino-phényl-2-acétamido-2-déoxy-3-0-p-D-gluco-pyrannosyl)-D-propionyl-L-alanyl-D-isoglutamine(III)

550 mg (0,7 mmol) de (II), en solution dans 150 ml d'acide acétique glacial, sont hydrogénés, pendant 46 h, en présence de 550 mg de palladium 5% sur charbon. Après filtration du catalyseur et concentration à sec, le produit est précipité à partir du mélange méthanol/acétone/éther. On obtient 350 mg de produit, soit un rendement de 86%.

Une fraction de 180 mg du produit est chromatographiée sur une colonne (22 x 1,7 cm), chargée d'une résine échangeuse d'ions commercialisée sous le nom AG1X 2 par la Société Biorad, sous sa forme acétate, et équilibrée avec une solution 0,002N d'acide acétique. Le produit est élué avec une solution 0,02N d'acide acétique. Les fractions intéressantes sont réunies, concentrées, et le produit est reprécipité, comme précédemment, d'un mélange méthanol/acétone/éther. On obtient 98 mg (soit 55% de rendement) du produit final recherché, dont le pouvoir rotatoire est [a]^j= +32,7° (méthanol absolu). L'analyse élémentaire du produit donne le résultat suivant:

Analyse pour C25H37011N5(583,62):

Calculé: C 51,45 H 6,39 N 12,00%

Trouvé: C 51,51 H 6,54 N 11,52%

2) Propriétés pharmacologiques

Caractère adjuvant en présence d'une phase huileuse

Dans ces essais, on suit l'accroissement du taux d'anticorps spécifique d'un antigène donné, lorsque ce dernier est injecté, avec ou sans le composé adjuvant selon l'invention, au sein d'une émulsion eau dans l'huile.

Les essais sont effectués sur des cobayes Hartley femelles de 350 g. L'administration est faite par injection intradermique dans le coussinet plantaire de chacune des pattes postérieures. L'ovalbumine (constituant l'antigène), à raison de 0,5 mg, est préparée dans 0,1 ml d'une émulsion de solution isotonique saline, dans une phase huileuse constituée soit par l'adjuvant incomplet de Freund (FIA), soit par l'adjuvant complet (FCA) formé par le FIA auquel est ajouté 0,1 mg de cellules entières de Mycobacterium smegmatis. Le composé selon l'invention est administré à raison de 0,1 mg additionné dans l'émulsion contenant le FIA.

18 j après cette immunisation, on recherche d'éventuelles réac

*BOC = ter-butyloxycarbonyle.

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tions d'hypersensibilité retardée à l'antigène, en injectant par voie intradermique 0,005 mg d'ovalbumine sur le flanc des animaux, et l'on observe, 48 h après, la réaction au point d'injection. On mesure le diamètre en millimètres de la réaction ainsi provoquée.

21 j après l'injection, les animaux sont saignés. Sur le sérum recueilli, on mesure la teneur en anticorps spécifiques de l'ovalbu-mine par précipitation du complexe anticorps/antigène dans la zone d'équivalence. La quantité d'azote protéique contenue dans ce précipité est évaluée suivant la méthode de Folin. Les valeurs moyennes des teneurs en anticorps sont indiquées dans le tableau de résultats. Ces valeurs expriment la quantité, en microgrammes, d'azote précipitable par l'antigène, par millilitre de sérum.

Les résultats de ces essais sont reportés dans le tableau suivant:

Composition de l'émulsion contenant l'antigène

Anticorps sériques (lAg/ml)

Test cutané (0 mm)

FIA

< 500

0

FCA (100 rxg)

2000

9 + 2,7

FIA + p-aminophényl-Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln (100 i/.g)

3500

19,5 ± 4,5

Ces résultats montrent que le p-aminophényl-Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln, administré dans une émulsion huileuse, favorise nettement l'accroissement du taux d'anticorps à l'antigène administré et qu'il induit une réaction d'hypersensibilité du type retardé vis-à-vis du même antigène.

Toxicité

On a étudié la toxicité du produit selon l'invention au moyen d'injection intraveineuse à des souris âgées de 2 mois. En accroissant progressivement les doses administrées, on a montré que la dose létale (DLS0), c'est-à-dire la dose pour laquelle la mortalité des animaux — à la suite de l'injection — est de 50%, est d'un ordre de grandeur très supérieur à celui des doses auxquelles le produit s manifeste ses propriétés adjuvantes.

Pyrogënicité

On étudie l'effet pyrogène du produit selon l'invention sur des lapins, en suivant le protocole de la «Pharmacopée française», 9e io édition, 11-235.

Chaque essai est effectué sur un lot de trois lapins. L'administration a d'abord été réalisée par voie sous-cutanée, puis par voie intraveineuse. Les résultats de ces essais, c'est-à-dire l'élévation de température chez les animaux traités, sont les suivants:

Le produit selon l'invention est donc apyrogène aux doses où il manifeste ses propriétés adjuvantes.

25 On obtient donc des compositions adjuvantes apyrogènes dépourvues de toxicité et qui peuvent être utilisées pour accroître l'efficacité de vaccins d'origine bactérienne ou virale, notamment quand ceux-ci sont faiblement immunogènes.

Elles peuvent être utilisées notamment pour favoriser l'immunisa-30 tion de l'hôte (patients humains ou animaux) à l'égard des infections d'origine bactérienne ou virale, des antigènes des tumeurs, etc. Elles sont également efficaces pour la fabrication de sérums contenant des anticorps actifs à l'égard de ces antigènes.

Administration

Dose (mg/kg)

Elévation de température CQ

Sous-cutanée

0,500

0

0,2

0,1

Sous-cutanée

0,100

0

0

0,1

Intraveineuse

1,0

0

0,4

0,6

R